CN107779446B - 固定化赖氨酸脱羧酶、其制备、1,5-戊二胺制备方法及产品 - Google Patents

固定化赖氨酸脱羧酶、其制备、1,5-戊二胺制备方法及产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及固定化赖氨酸脱羧酶、其制备、1,5‑戊二胺制备方法及产品。具体涉及一种包括重氮基修饰的高分子载体和赖氨酸脱羧酶的固定化赖氨酸脱羧酶，及以重氮基修饰的高分子载体制备固定化赖氨酸脱羧酶的方法；及以固定化赖氨酸脱羧酶制备1,5‑戊二胺的方法及其制得的1,5‑戊二胺。该固定化方法对酶的固定化效率高，使用稳定性好，提高酶的使用效率，解决传统工艺中游离态赖氨酸脱羧酶(细胞)使用稳定性差的问题，极大降低载体的使用成本和1,5‑戊二胺生物法生产成本，简化1,5‑戊二胺溶液和酶的分离步骤，加大1,5‑戊二胺生产的自动化程度，推进了生物法生产1,5‑戊二胺的产业化进程。

Description

固定化赖氨酸脱羧酶、其制备、1,5-戊二胺制备方法及产品
技术领域
本发明涉及一种固定化赖氨酸脱羧酶及其制备方法以及1,5-戊二胺制备方法及得到的1,5-戊二胺；具体地，涉及一种包括重氮基修饰的高分子载体和赖氨酸脱羧酶的固定化赖氨酸脱羧酶，以及将高分子物质进行化学改造，得到重氮基修饰的高分子载体，并以此重氮基修饰的高分子载体制备固定化赖氨酸脱羧酶的方法。本发明还涉及以该固定化赖氨酸脱羧酶制备1,5-戊二胺的方法及其制得的1,5-戊二胺。
背景技术
生物催化反应具有条件温和、选择性高、反应效率高等特点，因而越来越多地应用于化学合成领域。但由于生物酶在体外工业环境下的稳定性差以及酶制剂的成本过高等缺陷，极大地限制了生物催化在工业领域的实际应用。
固定化酶技术通过将酶分子束缚(或结合)于水不溶性载体上，不仅有效解决了催化剂的重复使用问题，还可显著改善生物酶的稳定性及催化特性(底物亲和力、立体选择性等)。目前，固定化酶研究内容广泛，研究表明：载体的合成、表征、几何参数、表面活性及理化性质等，对于酶的固载量、酶活回收率和稳定性等方面，有很重要的影响。现在，工业上已成功固定化并应用的酶只有青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶等。
1,5-二氨基戊烷(又称1,5-戊二胺，简称戊二胺)是化学工业中重要的C5化合物，主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯、异氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化工原料。迄今为止，工业上二胺类物质主要由石油基原材料经二羧酸中间体或者通过氨基酸的化学脱羧作用进行化学生产(Albrecht，Klaus等人；Plastics；Winnacker-Kuechler(第5版)(2005))。随着生物技术的发展，人类可以利用生物法合成1,5-戊二胺，主要是通过微生物自身或者外源过量表达的赖氨酸脱羧酶催化底物赖氨酸脱羧，得到1,5-戊二胺，以下文献和专利中对此进行了描述：Tabor,Herbert,etal；Journal of bacteriology(1980),144(3),952-956、JP2002-223770、JP2008104453A、CN200810005332、JP2002-223771A、JP2004-000114A、EP1482055B1、JP2005-060447A、CN101578256A、CN102056889A、CN102782146A等。
目前，以生物法生产的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧，生产1,5-戊二胺的工艺中，通常使用游离状态的赖氨酸脱羧酶或赖氨酸脱羧酶细胞，或者使用可同时生产赖氨酸和赖氨酸脱羧酶的菌株，经发酵生产1,5-戊二胺。但以上1,5-戊二胺生产方式导致赖氨酸脱羧酶/赖氨酸脱羧酶细胞的重复利用效率低、产物回收困难、生产成本高，不利于1,5-戊二胺的工业化生产。
在此之后，研究人员采用固定化细胞的方式生产1,5-戊二胺。日本专利申请JP2004298033A中公开了采用角叉菜胶，将产赖氨酸脱羧酶菌株包埋后培养产酶，然后收集培养好的固定化微生物，催化赖氨酸盐脱羧，生产1,5-戊二胺，246g/L的赖氨酸盐酸盐经过固定化细胞150h的催化，生成的1,5-戊二胺浓度为40g/L，赖氨酸盐酸盐的摩尔转化率约为30％。
文献“用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1，5-戊二胺”(蒋丽丽等，精细化工，2007，24(11)，1080-1084)中报道：采用3wt％的海藻酸钙固定含有赖氨酸脱羧酶的细胞，此固定化细胞稳定性很差，第2批转化时酶活就发生显著下降，到第4批时酶活降低到约为第1批酶活的38％。
综合文献和专利报道可看出，目前现有的含有赖氨酸脱羧酶活性的固定化细胞，多以天然高分子凝胶为载体，在实际操作中存在着强度不高，易被微生物分解，在转化过程中变形、破碎或者溶解、引起酶或细胞的渗漏、固定化细胞重复使用效率低等问题。因此，本领域需要一种更简单、经济，可显著提高赖氨酸酶法脱羧稳定性的方法。
目前，对固定化赖氨酸脱羧酶的制备及稳定性研究的报道较少，且对价格低廉的载体进行化学改造而使之适用于固定化赖氨酸脱羧酶的制备均未见报道。
发明内容
为克服赖氨酸脱羧酶在生物化工生产领域存在的稳定性低、重复使用率低等缺陷，本发明提供以下技术方案。
本发明的一个方面提供一种固定化赖氨酸脱羧酶。
本发明的另一方面提供一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法。
本发明的另一方面提供一种1,5-戊二胺制备方法。
本发明的另一方面是提供上述制备方法制得的1,5-戊二胺。
以下，对上述技术方案，进行详细和优选说明：
本发明的一个方面是提供一种固定化赖氨酸脱羧酶，所述固定化赖氨酸脱羧酶包括：重氮基修饰的高分子载体和赖氨酸脱羧酶；其中，所述赖氨酸脱羧酶通过与所述重氮基修饰的高分子载体上的重氮基反应形成共价键，固定于所述高分子载体之上，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
在一些技术方案中，所述重氮基修饰的高分子载体，由含苯胺基的高分子物质和/或含胺基的高分子物质与重氮基化试剂经重氮化反应得到。
在一些技术方案中，所述重氮化反应为所述含苯胺基的高分子物质上的苯胺基与重氮化试剂的反应；和/或，所述含胺基的高分子物质上的胺基与重氮化试剂的反应。
在一些技术方案中，所述含苯胺基的高分子物质可以包括：含羟基的高分子物质与含苯胺基的醚化剂经醚化反应得到的物质；
在一些技术方案中，所述含胺基的高分子物质可以包括：含羟基的高分子物质与含胺基的醚化剂经醚化反应得到的物质。
在一些技术方案中，所述含胺基的高分子物质也可以包括以下物质中的一种或多种：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物。所述含胺基的高分子物质可以为纤维状或颗粒状，优选为纤维状；所述颗粒状优选为多孔颗粒状。
上述两类含胺基的高分子物质，都可实现相应的技术效果。
在一些技术方案中，所述含羟基的高分子物质可以包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或其组合。
在一些技术方案中，所述含苯胺基的醚化剂包括对β-硫酸酯乙砜基苯胺。
在一些技术方案中，所述含胺基的醚化剂包括硅烷化试剂。
在一些技术方案中，所述重氮基化试剂包括亚硝酸，或，亚硝酸盐和强酸的混合物。
在一些技术方案中，所述亚硝酸以亚硝酸溶液的形式加入。所述亚硝酸溶液的浓度优选0.4-0.75mol/L，更优选0.55-0.65mol/L。
在一些技术方案中，所述亚硝酸盐优选包括亚硝酸钠和/或亚硝酸钾。
在一些技术方案中，所述强酸优选包括硫酸和/或盐酸。
在一些技术方案中，所述亚硝酸盐以亚硝酸盐溶液的形式加入。所述亚硝酸盐溶液的浓度优选0.4-0.75mol/L，更优选0.55-0.65mol/L。
在一些技术方案中，所述强酸以强酸溶液的形式加入。所述强酸溶液的浓度优选为1-10mol/L，更优选1.5-5mol/L，最优选2-3mol/L。当所述的强酸为盐酸时，所述亚硝酸盐与所述盐酸的摩尔比优选1：(1-10)，更优选1：(2-8)。当所述的强酸为硫酸时，所述亚硝酸盐与所述硫酸的摩尔比优选1：(0.5-8)，更优选1：(1-4)。
本发明的另一方面是提供固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可。
本发明的一些优选的技术方案涉及一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将含苯胺基的高分子物质和/或含胺基的高分子物质与重氮化试剂经重氮化反应得重氮基修饰的高分子载体；
(2)将所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可。
本发明的一些优选的技术方案涉及一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将含羟基的高分子物质与含苯胺基的醚化剂经醚化反应得到含苯胺基的高分子物质；优选的，所述含羟基的高分子物质包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或其组合；(2)将含苯胺基的高分子物质与重氮化试剂经重氮化反应得重氮基修饰的高分子载体；
(3)将所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可。
本发明的一些优选的技术方案涉及一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将含羟基的高分子物质与含胺基的醚化剂经醚化反应得到含胺基的高分子物质；优选的，所述含羟基的高分子物质包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或其组合；
(2)将含胺基的高分子物质与重氮化试剂经重氮化反应得重氮基修饰的高分子载体；
(3)将所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可。
本发明的一些优选的技术方案涉及一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将含胺基的高分子物质与重氮化试剂经重氮化反应得重氮基修饰的高分子载体；其中，所述含胺基的高分子物质包括：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物中的一种或多种；
(2)将所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可。
在一些技术方案中，所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述重氮基修饰的高分子载体优选1500-4000U，更优选2000-3500U，最优选2500-3000U。
在一些技术方案中，所述含苯胺基的醚化剂包括对β-硫酸酯乙砜基苯胺。
在一些技术方案中，所述含胺基的醚化剂包括硅烷化试剂。
在一些技术方案中，所述重氮化反应的温度优选0-50℃，更优选0-30℃，更优选0-15℃，更优选0-7℃，更优选0-4℃，最优选0-1℃。
在一些技术方案中，所述重氮化反应的时间优选1-60min，更优选2-30min，最优选5-20min。
在一些技术方案中，所述缓冲溶液的pH值优选5-11。
在一些技术方案中，所述缓冲溶液的离子浓度优选0.01-2.0mol/L，优选0.02-0.5mol/L，最优选0.05-0.15mol/L。
在一些技术方案中，所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度优选0℃-30℃，可以为：0℃，1℃，2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，10℃，11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，16℃，17℃，18℃，19℃，20℃，21℃，22℃，23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃。
在一些技术方案中，所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间优选为0.5-48h，可以为：0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h，10h，11h，12h，13h，14h，15h，16h，17h，18h，19h，20h，21h，22h，23h，24h，25h，26h，27h，28h，29h，30h，31h，32h，33h，34h，35h，36h，37h，38h，39h，40h，41h，42h，43h，44h，45h，46h，47h，48h。
本发明的另一方面是提供1,5-戊二胺制备方法，其包括以下步骤：将上述的固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应；
或者，将上述的固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法制得的固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应。
在一些技术方案中，所述赖氨酸盐包括赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐、赖氨酸磷酸盐、赖氨酸己二酸盐和赖氨酸癸二酸盐中的一种或其组合。
在一些技术方案中，所述固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应时的反应的温度为10-50℃，可以为10℃，11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，16℃，17℃，18℃，19℃，20℃，21℃，22℃，23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃。
在一些技术方案中，所述固定化赖氨酸脱羧酶溶液的pH值可以为5-7，例如可以为：5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0。
本发明的另一个方面是提供上述的1,5-戊二胺的制备方法制得的1,5-戊二胺。
换言之，本发明公开了一种利用含羟基的高分子物质，或，经过化学反应(例如水解，包括酸水解及碱水解)可使分子中含有羟基的高分子物质，通过醚化剂的醚化作用，得含苯胺基和/或含胺基的高分子物质，再经重氮基化等化学反应后，获得重氮基，得到重氮基修饰的高分子载体。
本发明还公开了一种含胺基的高分子物质，例如：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物等，经重氮化反应，获得重氮基，得到重氮基修饰的高分子载体。
目前采用共价键法对赖氨酸脱羧酶进行固定化尚未见研究报道，且未有将固定化赖氨酸脱羧酶应用于1,5-戊二胺生产的报道。本发明的固定化赖氨酸脱羧酶及其制备方法，以及，由此衍生出的1,5-戊二胺及其制备方法，开创了现有技术的空白，具有以下优异的效果：
1、本发明中，特定的重氮基修饰的高分子载体上的重氮基团，反应活性强，可以直接与特定的酶蛋白上的多个活性基团反应形成共价键，实现酶蛋白的固定化，制备获得固定化赖氨酸脱羧酶。所制备的固定化赖氨酸脱羧酶可用于酶催化生产1,5-戊二胺。
2、本发明通过对现有高分子物质进行修饰来使其含有较高活性的重氮基基团，通过重氮基可与赖氨酸脱羧酶进行共价键结合，从而形成稳定的固定化赖氨酸脱羧酶，固定化效率及固定化赖氨酸脱羧酶的活力高，且所得酶的稳定性也显著高于游离态赖氨酸脱羧酶、游离态赖氨酸脱羧酶细胞、固定化赖氨酸脱羧酶细胞等，可极大提高酶的使用效率，解决了游离态赖氨酸脱羧酶细胞或赖氨酸脱羧酶的使用稳定性均较差的问题，固定化赖氨酸脱羧酶对于液体酶的活力回收率高，使用稳定性好，且回收方便，多次重复使用仍能保持较高的酶活力。
3、采用低成本的高分子材料作为原始载体，显著降低了载体成本，成本低廉，而且，载体的修饰过程工艺简单、制备效率高。
4、本发明通过活化载体，极大降低了载体的使用成本。在通过固定赖氨酸脱羧酶催化生产1,5-戊二胺的方法中，显著降低了1,5-戊二胺的生物法生产成本，简化了1,5-戊二胺溶液和酶的分离步骤，加大了1,5-戊二胺生产的自动化程度，推进了生物法生产1,5-戊二胺的产业化进程。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种固定化赖氨酸脱羧酶，其包括重氮基修饰的高分子载体以及赖氨酸脱羧酶，其中，所述赖氨酸脱羧酶通过与所述重氮基修饰的高分子载体上的重氮基反应形成共价键，固定于所述高分子载体之上。
用于本发明的赖氨酸脱羧酶(L-Lysine decarboxylase，简称LDC)可特异性地将L-赖氨酸及其盐类，脱去一分子的二氧化碳得到1,5-戊二胺。没有任何特别限制地，赖氨酸脱羧酶可以来自公知的生物。更具体而言，赖氨酸脱羧酶可以来自野生菌株，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、毛链霉菌(Streptomycespilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenellacorrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacteriumacidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等。赖氨酸脱羧酶也可以来自基于上述菌株诱导突变后的菌株、基因工程菌。
基因工程方法中，对于重组细胞，没有特别限制，例如可来自微生物、动物、植物或昆虫的重组细胞。更具体而言，例如，当使用动物时，可以为小鼠、大鼠或其培养细胞等；另外，当使用植物时，可以为拟南芥、烟草或其培养细胞等；另外，当使用昆虫时，可以为蚕或其培养细胞等；当使用微生物时，可以为大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌等。
对于培养上述重组细胞的方法，没有特别限制，可采用任何公知的方法。更具体而言，例如，当培养微生物时，对于培养基，可使用含有碳源、氮源及无机离子的培养基。
作为碳源，可例如但不限于：葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖或淀粉的水解物等糖类；甘油、甘露醇或山梨糖醇等醇类；葡糖酸、富马酸、柠檬酸或琥珀酸等有机酸类等。优选葡萄糖、蔗糖和淀粉水解物等作为碳源。上述碳源可单独使用或两种以上并用。
作为氮源，可例如但不限于：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐；大豆水解物等有机氮源。上述氮源可单独使用或并用两种以上。
作为无机离子，可例如但不限于：钠离子、镁离子、钾离子、钙离子、氯离子、锰离子、铁离子、磷酸根离子、硫酸根离子等。培养基中可添加一种或多种上述无机离子。
另外，根据需要，也可向培养基中添加其它微量营养素，例如各种氨基酸和维生素等。
作为上述培养基，更具体而言，例如可以为LB培养基，如包含蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、pH值为7.0的LB培养基。
作为培养条件，没有特别限制，例如，当培养蜂房哈夫尼野生菌时，在需氧条件下，培养温度例如为20-45℃，优选为25-38℃；培养pH值例如为5.0-8.5，优选为5.5-7.5；培养时间例如为10-50h。
本发明中所述赖氨酸脱羧酶在固定化赖氨酸脱羧酶制备过程中对赖氨酸脱羧酶的形式没有任何的限定，赖氨酸脱羧酶可以是包含赖氨酸脱羧酶的发酵液、含有较多杂质的粗酶或者纯度较高的精制酶。
用于本发明的高分子载体为固体形态，可使负载的赖氨酸脱羧酶便于从反应体系中分离处理。在一个优选的实施方式中，本发明的高分子载体可以为纤维状(丝状)或颗粒状，更优选为纤维状(丝状)。
用于本发明的高分子载体经处理前可以是天然高分子化合物，也可以是合成高分子化合物，只要其分子结构能够进行重氮基化修饰即可。
在一个优选的实施方式中，本发明中的高分子物质可以为分子结构中含有苯胺基和/或胺基的高分子物质。
在一个优选的实施方式中，所述含有苯胺基的高分子物质可以通过醚化反应得到的高分子物质；所述醚化反应优选为：将含羟基的高分子物质与含苯胺基的醚化剂通过醚化反应得到含苯胺基的高分子物质。
其中，可适用于本发明的含羟基的高分子物质包括但不限于：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物和含胺基的聚酯的水解产物(优选含胺基的聚酯纤维的水解产物)、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆、羊毛、兔毛等。所述高分子物质可以单独使用，也可组合使用。
以下以醋酸纤维素水解产物为例进行说明。
在一个优选的实施方式中，醋酸纤维素，可以是二醋酸纤维素(简称DAC)，也可以是三醋酸纤维素(简称TAC)，还可以是两者的混合物。醋酸纤维素通过水解，使醋酸纤维素上的羟基裸露并活化，然后再通过醚化反应(苯胺基/胺基化反应)，使纤维素含有胺基/苯胺基基团，通过苯胺基/胺基基团与重氮基化试剂反应从而可使所的载体具备重氮基基团。
上述醋酸纤维素可采用氢氧化钠溶液进行水解，所采用的氢氧化钠溶液浓度可以为0.1-2mol/L，优选可以为0.2-0.5mol/L。氢氧化钠用量通常为醋酸纤维素的2-8％(W/W)，优选为3-4％。在水解过程中，水解时间可以为0.5-2h，水解温度可以为60-100℃。可优选在沸水浴的条件下保温水解1h左右。当水解反应结束时，醋酸纤维素的水解液的pH值优选为7-8左右。
以下，再以聚乙烯醇(简称PVA)为例进行说明。
聚乙烯醇外观为白色丝状，是一种用途相当广泛的水溶性高分子聚合物，其性能介于塑料和橡胶之间。PVA分子结构中含有羟基，可按照前述醋酸纤维素相同的过程，经水解、再通过醚化反应(苯胺基/胺基化反应)引入苯胺基/胺基，然后再进行重氮基化处理，得到含有重氮基活化基团的重氮基修饰的高分子载体，该高分子载体表面具有的重氮基可与酶蛋白质分子上的功能基团以共价键形式结合形成固定化赖氨酸脱羧酶。
在本发明中，对可引入苯胺基/胺基的试剂不做限定，任何可向含羟基的高分子物质进行苯胺基/胺基化反应从而引入苯胺基/胺基的试剂即可。
在一些实施例中，采用带有苯胺基基团的醚化剂与含羟基的高分子物质，通过醚化反应，向含羟基的高分子物质中引入苯胺基基团，得到含苯胺基的高分子物质。例如可采用对β-硫酸酯乙砜基苯胺(简称SESA，一种染料中间体)。在一些实施例中，将SESA用含2wt％碳酸钠的0.1N NaOH的溶液配制成10wt％的溶液，过滤除渣，取清液使用。
在一些实施例中，采用带有胺基基团的醚化剂与含羟基的高分子物质，通过醚化反应，向含羟基的高分子物质中引入胺基基团，得到含胺基的高分子物质。例如可以采用：硅烷化试剂。在本发明中，对醚化反应的各条件参数不做限定。
醚化试剂的浓度和用量，没有特别的限定，只要醚化试剂能够将含羟基的高分子物质安全醚化即可。
醚化试剂可以为浓度1-40wt％的溶液形式，优选浓度可以为5-20wt％。
醚化试剂的用量可以为含羟基的高分子物质的质量的1-5倍，优选为1.5-3倍。
醚化反应的温度可以为50-100℃，优选可以为80-100℃。
醚化反应的pH值可以为4-12，优选可以为7-11。
醚化反应的固液比可以为5-50W/V，优选可以为10-20W/V。
醚化反应的时间可以为0.5-3h，优选可以为1h-2h。
醚化反应过程中，水浴保持反应温度50℃-100℃，滴加2N的NaOH或碳酸钠以控制醚化液的pH在4-12的范围内，当溶液pH不再下降时，采用沸水浴继续保温30分钟后，倾出醚化液，得到含苯胺基/胺基的高分子物质；用热的0.1N的NaOH洗涤含苯胺基/胺基的高分子物质两遍，再用水洗涤至中性，甩干。
例如，以纤维素水解产物为含羟基的高分子载体，经β-硫酸酯乙砜基苯胺醚化剂的上述醚化反应后，可得ABSE-C载体(β-乙砜基苯胺纤维素)。
醚化处理得到的含苯胺基/胺基的高分子物质，可以在干燥状态下长期保存。至此，含羟基的高分子物质经醚化反应，得到含苯胺基/胺基的高分子物质。
本发明优选所采用的另一种原始载体为含胺基的高分子载体，例如可以为：聚丙烯腈纤维。聚丙烯腈纤维分子结构中含有-CN，依次经过水解、重排处理后，分子结构中含有胺基，得到含有胺基的高分子物质，再经醛基化处理，可得到修饰后含有醛基的载体，再与赖氨酸脱羧酶共价结合，形成固定化赖氨酸脱羧酶。
在聚丙烯腈纤维的水解过程中，采用酸或碱都可以对聚丙烯腈纤维进行水解。所述的酸包括但不限于：硫酸、盐酸、硝酸中的任一种或其组合。所述的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾等中的任一种或其组合。在一些实施例中，采用硫酸对聚丙烯腈纤维进行水解，向硫酸溶液中投入聚丙烯腈纤维，可以在60-90℃保温水解3-6小时，优选可以在70-80℃水解4-5小时。水解时间与硫酸溶液的浓度相关。在一些实施例中，硫酸的浓度可以为50％左右。聚丙烯腈纤维对50％的硫酸溶液的比可以为5-20W/V，优选可以为10-15W/V。
水解所得的聚丙烯腈纤维在重排液中进行重排反应。在本发明中，可采用次氯酸钠溶液作为重排液，次氯酸钠的浓度范围可以为0.2-1％。在一些实施例中，用NaOH溶液将市售的次氯酸钠溶液(浓度为3-5％)稀释至0.2-1％作为重排液，其中NaOH溶液浓度可以为0.1-1mol/L，优选可以为0.2-0.6mol/L。在进行重排反应时，将重排液冷却至4℃左右后，投入上述水解得到的聚丙烯腈纤维。其中，聚丙烯腈纤维与重排液的反应比可以为5-20W/V，优选可以为6-15W/V。重排反应结束后，将反应所得的载体用水洗涤至洗涤水为pH中性。经上述处理的载体可以在4℃左右保存适当时间。
本发明中，所述重氮基化试剂可选用常见的任意重氮基化试剂种类，只要能够与含苯胺基的高分子物质上的苯胺基，发生重氮化反应，使其含有重氮基即可。
优选地，本发明采用的重氮基化试剂可以为亚硝酸。所述亚硝酸可以以亚硝酸溶液的形式加入。所述亚硝酸溶液的浓度优选0.4-0.75mol/L，更优选0.55-0.65mol/L。
优选地，本发明采用的重氮基化试剂也可以为亚硝酸盐和强酸的混合物。所述亚硝酸盐优选为亚硝酸钠和/或亚硝酸钾；所述强酸优选为硫酸和/或盐酸。所述亚硝酸盐以亚硝酸盐溶液的形式加入。所述亚硝酸盐溶液的浓度优选0.4-0.75mol/L，更优选0.55-0.65mol/L。所述强酸以强酸溶液的形式加入。所述强酸溶液的浓度优选为1-10mol/L，更优选1.5-5mol/L，最优选2-3mol/L。
当所述的重氮基化试剂为亚硝酸盐和强酸的混合物时，将所述醚化处理的含苯胺基的高分子物质加入到亚硝酸盐溶液中后，再加入强酸(盐酸和/或硫酸)溶液后搅拌，获得含有重氮基活化基团的重氮基修饰的高分子载体，可用于制备固定化赖氨酸脱羧酶。
当所述的强酸为盐酸时，所述亚硝酸盐与所述盐酸的摩尔比优选1：(1-10)，更优选1：(2-8)。当所述的强酸为硫酸时，所述亚硝酸盐与所述硫酸的摩尔比优选1：(0.5-8)，更优选1：(1-4)。
该含苯胺基的高分子物质可用重氮基化试剂进行重氮化反应，获得重氮基，得到重氮基修饰的高分子载体，用于固定化赖氨酸脱羧酶的制备。在本发明的固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法中，赖氨酸脱羧酶相对于重氮基修饰的高分子载体的用量可调，所得的固定化赖氨酸脱羧酶都能保持很高的酶活力。在一些实施方式中，赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述重氮基修饰的高分子载体优选1500-4000U，更优选2000-3500U，最优选2500-3000U。
在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶液的活力浓度可控制在100-1000U/mL。
在一些实施例中，用于所述重氮基化处理和固定化赖氨酸脱羧酶制备过程的缓冲溶液可选用的醋酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液等，可优选使用磷酸盐缓冲溶液。
在一些实施例中，缓冲溶液的pH值优选5-11，更优选为6-10，最优选7-9。
在一些实施例中，缓冲溶液的离子浓度优选0.01-2.0mol/L，更优选0.02-0.5mol/L，最优选0.05-0.15mol/L。
在一些实施例中，所述重氮化反应的反应温度优选0-50℃，更优选0-30℃，更优选0-15℃，更优选0-7℃，更优选0-4℃，最优选0-1℃。
在一些实施例中，所述重氮化反应的反应时间优选1-60min，更优选2-30min，最优选5-20min。
在一些实施例中，所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶于缓冲溶液中进行反应时，该反应温度优选0℃-30℃，更优选在10℃-30℃，更优选15℃-30℃，最优选20℃-30℃。
在一些实施例中，重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶的反应时间优选0.5-48h，更优选2-8h，更优选2-7h，最优选3-6h。
在一些实施例中，反应过程中还可进行搅拌，搅拌速度优选50-200rpm，更优选80-160rpm。
所述制备过程还可以进一步包括：分离反应后所得的固定化赖氨酸脱羧酶，并洗涤除去固定化赖氨酸脱羧酶所残留的酶液，所得的固定化赖氨酸脱羧酶可冷藏备用。
本发明还提供了一种1,5-戊二胺制备方法，通过如上所述的固定化赖氨酸脱羧酶，与，赖氨酸或其盐反应制备，即可；
或者如上所述的固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法制得的赖氨酸脱羧酶，与赖氨酸或其盐反应制备，即可。
本发明对赖氨酸或其盐的形式没有特别的要求，可以为赖氨酸或赖氨酸盐或赖氨酸发酵原液。所述的赖氨酸盐，包括但不限于赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、氨酸碳酸盐、赖氨酸磷酸盐、赖氨酸己二酸盐、赖氨酸癸二酸盐等。所述的赖氨酸发酵原液是指生物法制备赖氨酸的发酵液。
在本发明的一些实施例中，固定化赖氨酸脱羧酶，与，赖氨酸或赖氨酸盐的溶液反应时，该反应的温度可以为10-50℃；固定化赖氨酸脱羧酶溶液的pH值优选5-7。
在本发明的方法中，所使用的赖氨酸或赖氨酸盐的浓度没有限定，在某些实施例中，赖氨酸或其盐的浓度优选6-30wt％，更优选为8-20wt％。
在本发明的一些实施例中，固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐接触时，可同时加入辅酶。所述的辅酶，优选包括吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺中的一种或多种，更优选包括5'－磷酸吡哆醛，辅酶的浓度可以为0.1-0.5mmol/L。
下面通过实施例，对本发明的技术方案进一步具体的说明。
以下实施例中一些定义如下：
酶活定义：以赖氨酸盐为底物，赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧，以每分钟生成1umol的1,5-戊二胺所需的酶量定义为酶的1个活力单位U。
半衰期检测定义：取制备的固定化赖氨酸脱羧酶4g，处理浓度为12％的赖氨酸溶液200mL，在37℃震荡反应2h左右，直至结束反应并分离固定化赖氨酸脱羧酶。重复上述操作(30次检测固定化赖氨酸脱羧酶活力，计算固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期)，直至与初始酶活力相比，酶活力降低50％，记录重复次数。
以下实施例中，聚乙烯醇和醋酸纤维素为市售材料，赖氨酸盐或者赖氨酸发酵液为购买，赖氨酸脱羧酶为自制。所述浓度如无特别说明均为质量浓度。
制备实施例 赖氨酸脱羧酶的制备
将表达赖氨酸脱羧酶的微生物甘油保存菌液接种于装有100mL液体培养基(LB培养基，包含蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH7.0)的500毫升种子瓶内，在37℃，200rmp摇床培养15h，得到种子液。在5L发酵罐内，加入3升LB培养基，121℃灭菌20分钟后接入上述种子液开始发酵(发酵培养基配方为LB培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH7.0)，于30℃、300转/分钟下开始发酵，控制通风量为0.3vvm，罐压为0.04MPa；发酵过程中控制发酵液pH值为7.0，发酵25h后停止发酵。发酵结束后在6000r/min离心10min收集菌体(即湿菌体)，或采用超声破碎或高压破碎等方式破碎细胞，离心收集酶液，冷藏备用。
实施例1
聚乙烯醇载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)取SESA(β-硫酸酯乙砜基苯胺)，加入至2％浓度的碳酸钠水溶液中，加入氢氧化钠至终浓度为到0.1mol/L，研磨溶解，待稳定后，用滤纸过滤，取清液为醚化液，醚化液的浓度为20wt％。
(2)取100g聚合度为3000的丝状聚乙烯醇(PVA)，加入300g步骤(1)制得的醚化液，在60℃的水浴加热条件下，进行醚化反应，反应同时滴加4mol/L的氢氧化钠溶液，手动搅拌，直至pH为11左右，停止加碱，继续搅拌反应1h。反应结束后，用低于60℃热碱水(0.1N的NaOH)清洗经过醚化的聚乙烯醇，然后用温水反复清洗至中性。
(3)配制0.4mol/L亚硝酸钠溶液和2.5mol/L盐酸，将醚化后的PVA丝投入亚硝酸钠溶液，再加入盐酸(PVA丝、亚硝酸钠溶液、盐酸三者用量比例为1g：10mL：6mL)在冰水浴条件下进行重氮化反应，控制反应时间为10min。
(4)准备酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液，pH值为5.0，将经过醚化和重氮基化的丝状PVA100g加入至此酶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1.0mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.0)，在300振荡搅拌进行固定化赖氨酸脱羧酶制备，制备约1h后，将PVA和酶液分开，用缓冲溶液洗涤PVA丝，得到固定化赖氨酸脱。
测定酶活为800U/g载体。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用90次以上。
实施例2
聚乙烯醇载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)取SESA(β-硫酸酯乙砜基苯胺)，加入至2％浓度的碳酸钠水溶液中，加入氢氧化钠至终浓度为到0.1mol/L，研磨溶解，待稳定后，用滤纸过滤，取清液为醚化液，醚化液的浓度为10wt％。
(2)取100g聚合度为3000的丝状聚乙烯醇，加入300g步骤(1)制得的醚化液，在60℃的水浴加热条件下，进行醚化反应，反应同时滴加4mol/L的氢氧化钠溶液，手动搅拌，直至pH为11左右，停止加碱，继续搅拌反应1h。反应结束后，用低于60℃热碱水(0.1N的NaOH)清洗经过醚化的PVA(聚醋酸乙烯酯)丝，然后用温水反复清洗至中性。
(3)配制0.4mol/L亚硝酸钠溶液和2.5mol/L盐酸，将醚化后的PVA丝投入亚硝酸钠溶液，再加入盐酸(PVA丝、亚硝酸钠溶液、盐酸三者用量比例为1g：9mL：7mL)在冰水浴条件下进行重氮化反应，控制反应时间为10min，得重氮基修饰的高分子载体。
(4)利用制备实施例制备的赖氨酸脱羧酶准备酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液，pH值为5.0，将经过醚化和重氮基化的丝状PVA(重氮基修饰的高分子载体)100g加入至此酶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克重氮基修饰的高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为0.15mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 8.0)，在300rpm振荡搅拌，进行固定化赖氨酸脱羧酶制备，制备约1h后，将PVA和酶液分开，用缓冲溶液洗涤PVA丝，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
测定酶活为600U/g。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用90次以上。
实施例3
聚乙烯醇载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)取SESA(β-硫酸酯乙砜基苯胺)，加入至2％浓度的碳酸钠水溶液中，加入氢氧化钠至终浓度为到0.1mol/L，研磨溶解，待稳定后，用滤纸过滤，取清液为醚化液，醚化液的浓度介于1-40wt％之间均可，在本实施例中为30wt％。
(2)取100g聚合度为3000的丝状聚乙烯醇，加入300g步骤(1)制得的醚化液，在60℃的水浴加热条件下，进行醚化反应，反应同时滴加4mol/L的氢氧化钠溶液，手动搅拌，直至pH为11左右，停止加碱，继续搅拌反应1h。反应结束后，热水清洗经过醚化的PVA丝，反复清洗至中性。
(3)配制0.4mol/L亚硝酸钠溶液和2.5mol/L盐酸，将步骤(2)制得的醚化后的PVA丝投入亚硝酸钠溶液，再加入盐酸(PVA丝、亚硝酸钠溶液、盐酸三者用量比例为1g：10mL：6mL)在冰水浴条件下进行重氮化反应，控制反应时间为10min，得重氮基修饰的高分子载体。
(4)利用制备实施例制备的赖氨酸脱羧酶，准备酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液，pH值为5.0，将经过醚化和重氮基化的丝状PVA(重氮基修饰的高分子载体)100g加入至300g此酶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克重氮基修饰的高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为0.05mol/L的柠檬酸盐缓冲液，pH 7.0)，在300rpm振荡搅拌，进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应约1h，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
(5)分离固定化赖氨酸脱羧酶与残留酶液，用缓冲溶液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶。
测定固定化赖氨酸脱羧酶的酶活为500U/g。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用90次以上。
实施例4
醋酸纤维素水解产物载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)将10g醋酸纤维素加入到200mL浓度为0.8mol/L的NaOH溶液中沸水浴保温水解60min后倾出水解液。
(2)按照实施例1中的工艺对水解后的醋酸纤维素进行醚化和重氮化改造，得重氮基修饰的高分子载体。
(3)将重氮基修饰的高分子载体加入至30g，pH值为5.0，酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克重氮基修饰的高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为0.15mol/L的磷酸盐缓冲液，pH8.5)，在300rpm振荡搅拌，进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应约3h，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
(4)分离固定化赖氨酸脱羧酶与残留酶液，用缓冲溶液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶。
测得所得固定化赖氨酸脱羧酶的酶活为900U/g。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用80次以上。
实施例5
醋酸纤维素水解产物载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)将20g醋酸纤维素加入到200mL浓度为0.8mol/L的NaOH溶液中沸水浴进行水解，水解60min后倾出水解液。
(2)按照实施例2中的工艺过程对水解后的醋酸纤维素进行醚化和重氮化改造，得重氮基修饰的高分子载体。
(3)将重氮基修饰的高分子载体加入至60g，pH值为5.0，酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克重氮基修饰的高分子载体为2000U，溶液为离子浓度为0.1mol/L的柠檬酸盐缓冲液，pH7.5)，在300rpm振荡搅拌，进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应约3h，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
(4)分离固定化赖氨酸脱羧酶与残留酶液，用缓冲溶液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶。
测得所得固定化赖氨酸脱羧酶的酶活为600U/g。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用80次以上。
实施例6
醋酸纤维素载体改造及制备固定化赖氨酸脱羧酶
(1)将10g醋酸纤维素加入到200mL浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中沸水浴进行水解，水解60min后倾出水解液。
(2)按照实施例3中的工艺过程对水解后的醋酸纤维素进行重氮化改造，得重氮基修饰的高分子载体。
(3)将重氮基修饰的高分子载体加入至60g，pH值为5.0，酶活为1000U/g的赖氨酸脱羧酶溶液中(赖氨酸脱羧酶的量基于每克重氮基修饰的高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为0.05M的醋酸盐缓冲液，pH 7.0)，在300rpm振荡搅拌，进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应约8h，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
(4)分离固定化赖氨酸脱羧酶与残留酶液，用缓冲溶液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶。
测得所得固定化赖氨酸脱羧酶的酶活为500U/g。
用该固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，脱羧率达99.5％以上。
经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用80次以上。
用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶可从溶液中经固液分离回收。在进行固定化赖氨酸脱羧酶的回收时，对固液分离的方式没有特别的要求，例如离心、过滤等方式，本领域技术人员可以容易地确定具体的设备和工艺参数，通常只需采用简单的自然过滤，如在反应设备中加1片筛板即可回收，在回收过程中不需消耗动力，且设备投资成本很低。
经脱羧反应后从溶液中回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。本发明中的固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用80次以上，有些能达到90次以上。其中，采用聚乙烯醇固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧，考察固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期为重复使用90次，采用醋酸纤维素固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧，考察固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期为重复使用80次。
与本发明的固定化赖氨酸脱羧酶相比，当采用游离酶进行赖氨酸脱羧时，游离酶只能使用1次而不能回收并进行重复使用。而当采用游离细胞进行赖氨酸脱羧时，游离细胞虽可以回收并重复使用3-5次，但每次使用后，游离细胞的回收需通过离心或膜过滤，在回收细胞的过程中，动力消耗大，设备投资成本高。
虽然本发明实施例中仅对重氮化改造原始载体制备赖固定化赖氨酸脱羧酶的方法进行了说明，但本领域技术人员能够理解，本发明方法不局限于此，同样可用于其它原始载体和包含赖氨酸的其它溶液。
以上描述了本发明的可选实施方式，以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。在阅读本发明说明书之后，本领域技术人员根据化学领域中的公知常识可以容易地想到可以达到本发明目的的本发明技术方案的变型或替代方式，本发明本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替代方式将落在本发明的范围内。

Claims (15)

1.一种固定化赖氨酸脱羧酶，其特征在于，包括重氮基修饰的高分子载体和赖氨酸脱羧酶；其中，所述赖氨酸脱羧酶通过与所述重氮基修饰的高分子载体上的重氮基反应形成共价键，固定于所述高分子载体之上；其中，所述重氮基修饰的高分子载体由含苯胺基的高分子物质与重氮基化试剂经重氮化反应得到；其中，所述重氮化反应为所述含苯胺基的高分子物质上的苯胺基与重氮化试剂的反应；其中，所述含苯胺基的高分子物质为含羟基的高分子物质与含苯胺基的醚化剂经醚化反应得到的物质；其中，所述含羟基的高分子物质为选自由聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物组成的组的一种或其组合；其中，所述重氮基化试剂为亚硝酸，或，亚硝酸盐和强酸的混合物；并且其中，所述固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法包括以下步骤：将重氮基修饰的高分子载体与赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应；其中，所述缓冲溶液的离子浓度为0.01-2.0mol/L，所述缓冲溶液的pH值为7-11。
2.根据权利要求1所述的固定化赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述含苯胺基的醚化剂为对β-硫酸酯乙砜基苯胺。
3.根据权利要求1所述的固定化赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述亚硝酸盐为亚硝酸钠和/或亚硝酸钾。
4.根据权利要求1所述的固定化赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述强酸为盐酸和/或硫酸。
5.一种固定化赖氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将重氮基修饰的高分子载体与赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应即可；其中，将含苯胺基的高分子物质与重氮化试剂经重氮化反应得重氮基修饰的高分子载体；其中，将含羟基的高分子物质与含苯胺基的醚化剂经醚化反应得到含苯胺基的高分子物质；其中，所述含羟基的高分子物质为选自由聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物组成的组的一种或其组合；其中，所述重氮基化试剂为亚硝酸，或，亚硝酸盐和强酸的混合物；并且其中，所述缓冲溶液的离子浓度为0.01-2.0mol/L，所述缓冲溶液的pH值为7-11。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述重氮基修饰的高分子载体为1500-4000U。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述重氮基修饰的高分子载体为2000-3500U。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述重氮基修饰的高分子载体为2500-3000U。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶在缓冲溶液中反应的反应温度为0-30℃；
和/或，所述重氮基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为0.5-48h。
10.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述含苯胺基的醚化剂为对β-硫酸酯乙砜基苯胺；
和/或，所述重氮化反应的反应温度为0-50℃；
和/或，所述重氮化反应的反应时间为1-60min。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸盐为亚硝酸钠和/或亚硝酸钾，所述强酸为盐酸和/或硫酸。
12.一种1,5-戊二胺的制备方法，其包括以下步骤：将权利要求1-4任一项所述的固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应；
或，将如权利要求5-11任一项所述的制备方法制得的固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，赖氨酸盐包括赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐、赖氨酸磷酸盐、赖氨酸己二酸盐和赖氨酸癸二酸盐中的一种或其组合。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于，所述固定化赖氨酸脱羧酶与赖氨酸或赖氨酸盐反应时的反应的温度为10-50℃。
15.根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于，所述固定化赖氨酸脱羧酶溶液的pH值为5-7。
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