JPS6324886A - 菌体または酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、菌体又は酵素の固定化方法に関し、特に菌体
又は酵素を親水性高分子で包括固定化する方法に関する
。

［従来の技術］ 近年、高濃度の菌体又は酵素を担体に固定化し、各種の
反応を行なう装置が例えば医薬品工業や食品工業等の分
野で使用されており、特に最近では廃水処理の分野にお
いても採用されはじめている。

菌体又は酵素の固定化方法としては、従来より担体結合
法、架橋法、包括法等が知られているが、その中でも包
括法は菌体の漏出が少なく、かつ菌体又は酵素自身と担
体との結合がないことから固定化による菌体又は酵素の
活性低下が少ないこと、また様々な物との同時固定化が
可能である等の利点があり、広く使用されている。

菌体の包括固定化に使用される担体としては、アルギン
酸カラギーナン、寒天等の天然高分子、ポリビニルアル
コール、アクリルアミド、ウレタンポリマー、光架橋性
ポリマー等の合成高分子が知られている。このうち天然
高分子は強度が弱いと共に耐久性に劣り、かつ微生物に
よる分解がおこる等の問題点がある。それに対して合成
高分子は強度が大きく、耐久性が良く、かつ微生物によ
る分解もされにくい等の利点があるため広く利用されて
おり、゛その中でもアクリルアミドは特に広。

く利用、されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 一方、固定化物の形状としては、球状、膜状、角型、円
柱状等がめるが、好気的廃水処理のように、反応槽中で
激しく撹拌、曝気を行い使用する場合、角型、円柱状等
の形状では、角の部分が摩耗し、固定化物の損失が大き
い。又、流出水が固定化物の破片により汚染される。し
たがって固定化物の形状は、球状が望ましい。

しかし、アクリルアミドのように親水性モノマーを重合
させて得られる親水性高分子では、−般に球状に成形す
ることは困難であり、通常は不定形の塊を切断して使用
するか、あるいは型に入れて作成するため円柱状、角型
等の形状になる。

しかしながら固定化物の形状は上記した理由により球状
が望ましくアクリルアミド等の親水性高分子の場合もそ
の例外ではない。このアクリルアミド等の親水性高分子
を球状に成形する方法として、撹拌している有機溶剤中
、親水性上ツマ−と菌体、架橋剤の混合液を投入し、分
散した状態で固定化する方法（”Ａ　Ｇｅｎｅｒａｌ　
）ｌｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｖｉｔｈ　Ｐｒｅｓｅｒ
ｖｅｄＶｉａｂｉｌｉｔｙ　”　ＥＬＩｒ、Ｊ、Ａｌ）
ｐｌ、）１ｉＣｒＯｂｉＯ１，Ｂ１０ｔｅＣｈｎＯ１゜
１７、３１９（１９８３）　）が知られている。

しかし、この方法では得られる粒状固定化物の大きさが
一定せず、大部分は有機溶剤の下方にたまり、塊となっ
てしまうので回収率が悪いと共に得られる固定化物に較
べて多量の体積の有機溶剤及び反応槽が必要であり、実
用的でない等の欠点がある。

また、アクリルアミドと菌体、架橋剤の混合液にアルギ
ン酸を混合し、金属塩水溶液中に滴下し、アルギン酸の
固定化により、あらかじめ球状に成形し、続いて、有機
溶剤中に移し、アクリルアミドを固定化する方法（特開
昭６０−１５３７９４号公報）も知られている。しかし
この方法でｉｔ、アルギン酸で固定化する手間及び費用
がかかり、また金属塩水溶液中にアクリルアミドモノマ
ーが流出する等の問題点がおる。

本発明の目的は前記従来技術の問題点を解消し、効率良
く、簡単に、球状のアクリルアミド等の親水性高分子に
よる固定化菌体または固定化酵素を作成する固定化方法
を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、濃縮菌体または酵素と親水性高分子
単体を混合して混合液とする工程と、この混合液を有機
溶剤中に滴下して有機溶剤中に混合液滴を形成する工程
と、チューブ中に前記混合液滴含有有機溶剤を移送させ
て前記混合液滴を固定化させる工程と、この固定化物を
前記有機溶剤から分離・回収する工程とを含むことを特
徴とする菌体または酵素の固定化方法でおる。

すなわち、本発明は、チューブ中を循環する有機溶剤中
でアクリルアミド等の親水性高分子単体、架橋剤、菌体
又は酵素の混合液を重合させることを特徴とするもので
おり、チューブ中で重合、固定化させることにより人３
きざのほぼ均一な球状固定化物が効率よく得られる。

本発明において固定化する菌体は任意の株を純粋培養し
たものでも良いし、あるいは活性汚泥のような混合菌体
でも良く、また親水性高分子としてはアクリルアミドが
望ましい。

固定化する菌体又は酵素は、親水性高分子単体の水溶液
と混合し、必要に応じて、架橋剤を混合する。親水性高
分子としてアクリルアミドを使用する場合には、架橋剤
が必要であり、架橋剤としては、Ｎ、Ｎ’　−メチレン
ビスアクリルアミド、Ｎ、Ｎ’　−プロピレンビスアク
リルアミド等を使用することが出来る。これらの混合液
中の高分子単体濃度は、使用する高分子により異なるが
、アクリルアミドを使用する場合、単体濃度で１０〜３
５％、架橋剤濃度は０．５〜６％が望ましい。菌体又は
酵素の濃度は、任意に選択する。混合液は次いで有機溶
剤中に滴下する。−度に滴下する量は作成する固定化物
の大きざによるが、例えば直径約２Ｉｒａの球状固定化
物を作成したい場合には、−回に約１０戒の混合液を滴
下するのが良い。有機溶剤としては、ベンゼン、トルエ
ン等の炭化水素系溶剤、エーテル、エステル及び、大豆
油、サラダ油等が使用できる。

滴下された混合液は有機溶剤中で球状になり、次いでチ
ューブ状配管中に移送され、この移送中に重合が行われ
る。ここで混合液を滴下する時には、ある程度の間隔を
おいて、滴下する必要があり、間隔が短いと、チューブ
中で前後の混合液が接触し、融合したまま重合すること
がある。

チューブの材質としては、シリコン、テフロン、塩化ビ
ニール等の疎水性の材質がよく、ガラス管のような親水
性の材質はチューブ内面に混合液が付着してしまうこと
があるので適さない。チューブの内径は、作成する固定
化物の大きざによって選択し、例えば、直径２＃の球状
固定化物を作成したい場合には、内径２ｍｍ強のチュー
ブ、直径５履の球状固定化物を作成したい場合には内径
５ｍｍ強のチューブを使用する。

チューブの長さは、固定化に要する反応時間と、有機溶
剤の循環速度によって変わるが、長いチューブ中を速く
循環させるよりも短いチューブ中を、ゆっくりと循環さ
せて固定化した方が得られる固定化物の形が、崩れない
。しかし、この場合には、チューブ中に流入させる混合
液の間隔を保つために、単位時間当りに、混合液滴下槽
に混合液を滴下する回数を減らさなければならない。

従って、単位時間当りに出来る固定化物の量は少なくな
る。この場合には、チューブを複数用意し、並行して固
定化を行うと良い。重合した固定化物は次いで適当な手
段によって有機溶剤と分離する。

アクリルアミドの固定化反応においては、重合開始剤、
および、重合促進剤が必要となる。重合開始剤としては
、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等、重合促進剤
としては、テトラメチルエチレンジアミン、β−ジメチ
ルアミンプロピオニトリル等が使用される。これらは、
有機溶、剤に一緒に添加するか、もしくは、一方を有機
溶剤に、もう一方を混合液に添加する。

［実施例］ 次に本発明を実施例によって説明する。

第１図は本発明の方法を実施するための装置の一例を示
す概略図でおる。

親水性高分子単体、および必要に応じて架橋剤は、必ら
かしめ水に溶かし、単体水溶液として七ツマー槽１に貯
えられている。一方、高濃度に濃縮した菌体又は酵素は
、濃縮菌体槽２に貯えられており、単体水溶液と、濃縮
菌体又は酵素は、混合槽３に送られて混合され、混合液
となる。

混合液は次いで混合液滴下槽４に送られ、循環する有機
溶剤６中に滴下される。

滴下された混合液は有機溶剤６中で球状になり、混合液
滴下槽４の下部に接続されているチューブ５に、有機溶
剤６にはさまれた状態で、球状のまま流入する。

チューブ５に流入した混合液は、チューブ中を循環する
有機溶剤６とともに移動しながら重合し、球状の固定化
物１０となる。

重合した固定化物１０は、チューブ５中を移動し、有機
溶剤分離槽７に到達する。ここでは、槽下部が水層にな
っており、固定化物１０は水層に移行する。固定化物１
０を分離した有機溶剤６は、返送有機溶剤９として、混
合液滴下槽４に返送され、再びチューブ５を循環する。

有機溶剤分離槽７で水層に移行した固定化物１０は有機
溶剤分離槽７から流出する水と共に、固液分離槽８に送
られる。ここで固定化物１０は、フィルター１５によっ
て水層から分離され、分離された水は循環水１４として
有機溶剤分離槽７に返送される。

さらに、重合開始剤および／または重合促進剤を使用す
る場合であって、これらを有は溶剤と一緒に添加する場
合には、添加剤槽１２にこれらの薬剤を貯えておき、有
機溶剤槽１３において、有機溶剤に添加混合すればよい
。また一方を混合液に、もう一方を有機溶剤に添力旧昆
合する場合には、−方を添加剤槽１２に貯え、有機溶剤
槽１３において添加混合し、もう一方は添加剤１ｇ１１
に貯え、混合槽３において添力旧昆合すればよい。

次にこの装置を用いた菌体の固定化方法の−実施例につ
いて）ホベる。

硝化菌であるニトロソモナス・エウロパエア（Ｎｉｔｒ
ＯＳＯｍＯｎａＳ　　ｅｔＪｒＯｐａｅａ＞を培養集菌
し、濃縮菌液（０，２（］／ｄ）を得た。この濃縮菌体
液ｉｏｏｍｆ！と、アクリルアミド２０％、Ｎ、Ｎ’　
−メチレンビスアク−リルアミド３％を含む七ツマー水
溶液４００ｄを混合槽３に流入し混合液とした。この混
合液に添加剤槽１１より重合開始剤過硫酸アンモニウム
を０．１％になるように添加した。

この混合液を混合液滴下槽４において２０ｄずつ、３０
秒間隔で滴下した。有機溶剤として大豆油を使用し、チ
ューブとして内径３．１４＃のタイゴンチューフ（ツー
トン社製、ｒｙｅｏ＃ｒｕＢＩＮＧ＞　４ｍを使用した
。有機溶剤の循環速度は２００ｍ／ｍｉｎで、混合液滴
下槽４から有機溶剤分離槽７までの到達時間は、約２０
分であった。

重合促進剤は、テトラメチルエチレンジアミンを用いて
、有機溶剤に対して１％になるように、添加剤槽１２よ
り有機溶剤槽１３に添加した。重合した固定化菌体は直
径約３＃の球状であり、有機溶剤分離槽７で水層に移行
させ、固液分離槽８より回収した。

以上の様にして１ｑられた固定化菌体を洗浄後、体積２
００（７！の曝気槽に投入し、約３０　ｍｃ＋＃！のア
ンモニア態窒素を含む合成廃水を、滞留時間６時間で通
水し連続好気処理を行った。その結果を第１表に示す。

表かられかるように始めの数日は、アンモニア態窒素の
除去率は低かったが、その後約２ケ月間は、高い除去率
を示す。また処理期間中、固定化菌体の摩耗はほとんど
見られず懸濁物質の増加も認められなかった。

第１表 比較のため、同様の組成の混合液を塊として固定化し、
−辺が３ｍｍの立方体に切断したアクリルアミド固定化
菌体を使用して、同様の処理を行ったところ、アンモニ
ア態窒素除去率は同じ様な結果を得たが、固定化菌体の
破片流出による懸濁物質の増加がみられた。又、固定化
菌体の一部は処理中に崩壊したものもあった。

［発明の効果］ 以上詳述したように、本発明によれば球状で強度の大き
い固定化物が得られるため、反応槽中で使用した場合に
摩耗が少なく、固定化物の崩壊もおこりにくいという利
点を有する。また、固定化物の塊を切断して使用する場
合に比べて、無駄になる部分がないと共に、有機溶剤や
水は循環して使用するため経済上の利点も大きい。ざら
に、チューブの内径、及び−回に滴下する混合液の量を
調整することにより、任意の大きざの球状固定化物を作
成することができ、必要とする大きさに応じて最適なも
のを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための装置の一例を示
す構成図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）濃縮菌体または酵素と親水性高分子単体を混合し
   て混合液とする工程と、この混合液を有機溶剤中に滴下
   して有機溶剤中に混合液滴を形成する工程と、チューブ
   中に前記混合液滴含有有機溶剤を移送させて前記混合液
   滴を固定化させる工程と、この固定化物を前記有機溶剤
   から分離・回収する工程とを含むことを特徴とする菌体
   または酵素の固定化方法。
2. （２）親水性高分子がポリアクリルアミドである特許請
   求の範囲第１項記載の菌体または酵素の固定化方法。