DE4207154A1 - Verfahren zur herstellung von l-lysin durch fermentation - Google Patents

Description

L-Lysin ist eine wichtige Aminosäure, die als Futterzusatz für Haustiere, wie Hühner, Schweine, usw. verwendet wird, da L- Lysin in Futterpflanzen wie Mais in unzureichender Menge enthalten ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation.

Bei üblichen bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation werde Mirkoorganismen des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden (im folgenden als Wildstämme bezeichnet) mit Eigenschaften versehen, die für die L-Lysin- Produktion erforderlich sind, wie Homoserin-Auxotrophie, Resistenz gegen S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder α- Chlorcaprolactam. Die so erhaltenen Mikroorganismen werden in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Medium, gezüchtet, und das gebildete und in der Kulturbrühe angereicherte L-Lysin wird gewonnen, beispielsweise durch Adsorption an einem Harz.

Man hat außerdem weitere Verfahren unter Verwendung verbesserter Stämme dieser L-Lysin produzierenden Mikroorganismen untersucht, beispielsweise unter Verwendung von Stämmen mit L-Alanin-Auxotrophie, Fluorpyruvat-Empfindlichkeit, oder Stämmen mit Resistenz gegen L-Leucin-Analoge; die Ausbeute an L-Lysin mit Hilfe dieser Fermentationsverfahren ist jedoch noch nicht zufriedenstellend. Es ist daher wünschenswert, ein leistungsfähigeres Verfahren zur Herstellung von L-Lysin mit geringeren Kosten als in den herkömmlichen Verfahren zu entwickeln, wobei L-Lysin produzierende Mikroorganismen oder Mutanten dieser verwendet werden, die eine höhere L-Lysin-Produktivität und eine verbesserte Fermentationsausbeute zeigen.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein wirksames Verfahren zur Herstellung von L-Lysin zur Verfügung zu stellen, welches wirtschaftlicher ist als die üblichen Verfahren, in dem die L- Lysin-Produktivität von L-Lysin produzierenden Mikroorganismen oder deren verbesserten Mutanten weiter gesteigert und die Fermentationsausbeute verbessert wird.

Um die L-Lysin-Produktivität der L-Lysin produzierenden Mikroorganismen oder der verbesserten Mutanten derselben weiter zu verbessern und die Fermentationsausbeute zu vergrößern wurden umfassende Untersuchungen durchgeführt und als Ergebnis gefunden, daß L-Lysin bildende Mutanten, welche Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin erlangt haben, für diesen Zweck geeignet sind. Diese Erkenntnis liegt der folgenden Erfindung zugrunde.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, bei dem ein Mikroorganismus vom Genus Brevibacterium oder Corynebacterium mit der Fähigkeit zur L-Lysin-Produktion gezüchtet wird und das gebildete und in der Kulturbrühe angereicherte L-Lysin gewonnen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Mikroorganismus des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium verwendet wird, der Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin aufweist.

Erfindungsgemäß werden unter Acyllysin Verbindungen verstanden, welche einen durch eine Acylbindung an die Aminogruppe in der α- und/oder ε-Stellung des L- oder DL-Lysin gebundenen Fettsäurerest mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen aufweisen. Beispiele für solche Verbindungen schließen N^α-Stearoyl-L- lysin, N^ε-Decanoyl-L-lysin, N^ε-Myristoyl-L-lysin, N^ε-Palmitoyl- L-lysin, N^a,N^ε-Dioctanoyl-L-lysin, N^α,N^εDilauroyl-L-lysin, usw., ein. Unter methyliertem Acyllysin werden an der Aminogruppe in α-Stellung methylierte Acyllysine verstanden. Beispiele für solche Verbindungen schließen N^α-Methyl-N^ε- stearoyl-L-lysin, N^α,N^α-Dimethyl-N^ε-decanoyl-DL-lysin, N^α,N^a- Dimethyl-N^ε-palmitoyl-DL-lysin, N^α,N^α,N^α-Trimethyl-N^ε- myristoyl-DL-lysin, N^α,N^α,N^a-Trimethyl-N^ε-palmitoyl-DL-lysin, usw., ein.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mutanten gehören zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium und besitzen eine Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin, was bedeutet, daß sie in Gegenwart von Acyllysin selbst in einer Konzentration von 25 mg/l und/oder in Gegenwart von methyliertem Acyllysin selbst in einer Konzentration von 25 mg/l gut wachsen können. Darüberhinaus besitzen sie die bekannten Eigenschaften, welche zur L-Lysin-Produktion notwendig sind, wie Homoserin Auxotrophie, Resistenz gegen S­ (2-Aminoethyl)-L-cystein und α-Chlorcaprolactam, usw. oder eine Kombination davon. Hier bedeutet die Eigenschaft "gut wachsen" daß die relative Wachstumsrate mindestens 50 beträgt wenn das relative Wachstum in Abwesenheit von Acyllysin und methyliertem Acyllysin mit 100 festgesetzt wird.

Typische Beispiele für die Mutanten umfassen:

Brevibacterium lactofermentum
AJ 12592 (FERM BP-3239)
Brevibacterium lactofermentum	AJ 12593 (FERM BP-3240
Corynebacterium glutamicum	AJ 12596 (FERM BP-3242)

Die oben beschriebenen Stämme wurden gemäß dem Budapester Vertrag am 24. Januar 1991 beim Fermentation Research Institute, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan hinterlegt.

Als Mutterstämme für diese Mutanten werden bereits als L-Lysin­ bildend bekannte zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehörende Mikroorganismen benutzt. Weiterhin können die im folgenden aufgeführten Wildstämme als Mutterstämme benutzt werden:

Brevibacterium lactofermentum
ATCC 13869
Brevibacterium flavum	ATCC 14067
Brevibacterium divaricatum	ATCC 14020
Corynebacterium glutamicum	ATCC 13032
Corynebacterium acetoacidophilum	ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum	ATCC 15806

Nachdem diesen Wildstämmen die Fähigkeit zur L-Lysin-Produktion verliehen wurde, kann ihnen Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin verliehen werden. Ersatzweise kann ihnen Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin vor der Fähigkeit zur Produktion für L-Lysin verliehen werden.

Für eine Mutationsbehandlung dieser Mutterstämme können übliche Verfahren wie das Kontaktieren mit N-Methyl-N′-nitro-N­ nitrosoguanidin (im folgenden abgekürzt als NG) angewendet werden. Zur Selektion der gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin resistenten Stämme aus diesen Mutanten kann ein Verfahren benutzt werden, bei dem die in einem Medium, welches Acyllysin oder methyliertes Acyllysin in einer Konzentration, die das Wachstum der Mutterstämme merklich hemmt, gut wachsenden Mutanten gewonnen werden. Ein spezielleres Beispiel für die Gewinnung der resistenten Stämme ist weiter unten aufgeführt.

Lebensfähige Zellen des L-Lysin produzierenden und gegen S-(2- Aminoethyl)-L-cystein resistenten Mikroorganismus Brevibacterium lactofermentum AJ 12 435 (FERM BP-2294) wurden mit 250 µg/ml NG bei 30°C 30 Minuten lang behandelt. Zellen, die eine Überlebensrate von 1% aufweisen, wurden in ein Medium auf einer Agarplatte eingeimpft, welches das Minimalmedium gemäß Tabelle 1, mit zusätzlich 50 mg/l des Acyllysins N^α,N^e- Dioctanoyl-L-lysin ist. Nach einwöchiger Züchtung bei 30°C wurde die gewachsene Kolonie gewonnen. Die Konzentration des zum Medium zugegebenen Acyllysins oder des methylierten Acyllysins wurde in Abhängigkeit von der inhibierenden Mindestkonzentration für den verwendeten Mutterstamm entsprechend ausgewählt und so eingestellt, daß die erwünschten resistenten Stämme mit hoher Effizienz gewonnen werden konnten.

Einer dieser resistenten Stämme ist Brevibacterium lactofermentum AJ 12 592 (FERM BP-3239) welcher für das folgende Experiment bereitgestellt wurde. Ebenso wurde Brevibacterium lactofermentum AJ 12 593 (FERM BP-3240) als ein N^α,N^α,N^a- Trimethyl-N^ε-palmitoyl-DL-lysin-resistenter Stamm erhalten.

Verbindung
Konzentration
Glucose|20 g/l
Ammoniumsulfat	10 g/l
KH₂PO₄	1 g/l
MgSO₄·7 H₂O	0,4 g/l
FeSO₄·7 H₂O	10 mg/l
MnSO₄·4 H₂O	10 mg/l
Biotin	50 µg/l
Thiaminhydrochlorid	100 µg/l
Harnstoff	2 g/l
Agar	20 g/l

Weiterhin wurde unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM P-1987) als Mutterstamm als ein N^α,N^α,N^α- Trimethyl-N^ε-palmitoyl-DL-lysin-resistenter Stamm Corynebacterium glutamicum AJ 12 596 (FERM BP-3242) erhalten.

Die Resistenz der so erhaltenen Stämme gegenüber Acyllysin oder methyliertem Acyllysin wird wie weiter unten ausgeführt bestimmt und mit der Resistenz der Mutterstämme verglichen. Das Acyllysin oder methylierte Acyllysin wird in den in Tabelle 3 aufgeführten Konzentrationen zum Medium gemäß Tabelle 2 zugegeben und 4 ml des Mediums werden getrennt davon in ein kleines Teströhrchen gegeben. Der Teststamm wird in das Medium eingeimpft, nachdem dieses sterilisiert worden ist. Nachdem die Kultur bei 30°C 24 Stunden lang geschüttelt wurde, wird die Trübung bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen und eine relative Wachstumsrate im Vergleich zu dem Medium, dem weder Acyllysin noch methyliertes Acyllysin zugegeben worden ist, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgezeigt. Die erfindungsgemäßen Mutanten zeigen eine relative Wachstumsrate von mehr als 50 in Gegenwart von Acyllysin oder methyliertem Acyllysin in einer Konzentration von 25 mg/l, während die Mutterstämme eine sehr geringe relative Wachstumsrate von weniger als 10 zeigen. Wie oben bereits aufgeführt, sind die erfindungsgemäßen Mutanten deutlich verschieden von den Mutterstämmen, da die Mutanten resistent gegen Acyllysin oder methyliertes Acyllysin sind.

Verbindung
Konzentration
Saccharose|20 g/l
Ammoniumsulfat	5 g/l
KH₂PO₄	1 g/l
MgSO₄·7 H₂O	0,4 g/l
FeSO₄·7 H₂O	10 mg/l
MnSO₄·4 H₂O	10 mg/l
Biotin	100 µg/l
Thiaminhydrochlorid	200 µg/l
Nicotinamid	5 mg/l
Proteinhydrolysat (berechnet als Stickstoff)	1 g/l
Harnstoff	3 g/l

Unter Verwendung dieser resistenten Stämme kann L-Lysin in einem gewöhnlichen Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Ionen, Wachstumsfaktoren und Nährstoffe, wie sie von in üblicherweise benutzten Mikroorganismen benötigt werden, durch Fermentation hergestellt werden. Als Kohlenstoffquelle können Zucker wie Glucose, Saccharose, Melassen, Stärkehydrolysate, usw.; organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, usw.; Alkohole wie Ethanol, Propanol, usw., benutzt werden. Als Stickstoffquellen können Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Harnstoff, Ammoniak, usw. benutzt werden.

Die Züchtung der Stämme wird als aerobe Kultur bei einer Fer­ mentationstemperatur von 24 bis 37°C, vorzugsweise 30 bis 34°C durchgeführt. Zur Fermentation werden gewöhnlich 2 bis 7 Tage benötigt. Der pH-Wert zu Beginn und während der Fermentation liegt im Bereich von 5,0 bis 8,5, vorzugsweise bei 6,0 bis 7,5. Zum Einstellen des pH-Wertes können anorganische oder organische saure oder alkalische Verbindungen und darüber­ hinaus Harnstoff, Calciumcarbonat, gasförmiges Ammoniak oder ähnliches benutzt werden.

Tabelle 3

Nach der Fermentation wird das L-Lysin aus der Kulturbrühe durch bekannte Methoden unter Benutzung von Ionenaustauscher­ harzen, der Kristallisation, usw. und Kombinationen derselben gewonnen.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung an Hand von Beispielen genauer beschrieben.

Beispiel 1

Ein Medium, das 36 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumchlorid, 1 g/l KH₂PO₄, 400 mg/l MgSO₄· 7 H₂O, 10 mg/l FeSO₄· 7 H₂O, 8 mg/l MnSO₄· 4 H₂O, 3 mg/l Sojabohnenproteinhydrolysat (berechnet als Stickstoff), 0,1 mg/l Thiaminhydrochlorid und 0,3 mg/l Biotin (pH 7,0) enthielt, wurde in getrennten Anteilen von jeweils 20 ml in einen Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml gegeben. Nach der Sterilisation unter Erhitzen bei 115°C für 10 Minuten, wurde 1 g vorher durch trockenes Erhitzen sterilisiertes Calciumcarbonat zugegeben. Jeder Stamm wurde in das Medium eingeimpft und bei 31,5°C unter Rühren 48 Stunden lang gezüchtet. Die Menge des in der Kulturbrühe angereicherten L-Lysins wurde quantitativ durch Säure-Kupfer-Ninhydrin- Colorimetrie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Bei jedem der resistenten Stämme war die Menge an L- Lysin merklich höher als bei den entsprechenden Mutterstämmen.

Tabelle 4

Beispiel 2

Ein Medium mit einem Gehalt an 80 g/l Melasse (als Zucker berechnet), 50 g/l Ammoniumsulfat, 1 g/l KH₂PO₄ 1 g/l MgSO₄·7 H₂O, 10 mg/l Sojabohnenproteinhydrolysat (berechnet als Stickstoff), 0,1 mg/l Thiaminhydrochlorid und 0,3 mg/l Biotin (pH 7,0) wurde in gesonderten Anteilen mit einem Volumen von jeweils 20 ml in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben. Nach der Sterilisation unter Erhitzen bei 120°C für 10 Minuten, wurde durch trockenes Erhitzen bei 180°C für 2 Stunden vorher sterilisiertes Calciumcarbonat zugegeben. Jeder Stamm wurde in das Medium eingeimpft und unter Rühren bei 31,5°C für 72 Stunden gezüchtet. Die in der Kulturbrühe angereicherte Menge des L-Lysins wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Menge des angereicherten L-Lysins bei jedem der resistenten Stämme war merklich höher als bei den Mutterstämmen.

Tabelle 5

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, welches L-Lysin­ produzierende Mikroorganismen mit Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin benutzt, kann L-Lysin in hoher Ausbeute in hoher Anreicherung hergestellt werden und es wird somit eine Verringerung der Kosten bei der industriellen Herstellung von L-Lysin erreicht.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, bei dem ein Mikroorganismus vom Genus Brevibacterium oder Corynebacterium mit der Fähigkeit zur L-Lysin-Produktion gezüchtet wird und das gebildete und in der Kulturbrühe angereicherte L-Lysin gewonnen wird, dadurch gekennzeich­ net, daß ein Mikroorganismus des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium verwendet wird, der Resistenz gegen Acyllysin und/oder methyliertes Acyllysin aufweist.