CN114774464A - 一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法，属于组织培养领域。本发明通过增强根癌农杆菌Vir基因诱导活化水平和甘蔗愈伤组织的菌液浸染力度，大幅提高了转基因事件发生频率；在后续共培养、筛选和分化培养基中添加抗氧化剂抑制农杆菌强化浸染引起的愈伤褐化，明显提高了浸染后愈伤的存活率和分化能力；采用同时带有绿色荧光蛋白标记EGFP基因和除草剂草铵膦抗性标记Bar基因的双标记筛选系统，利用EGFP标记可视化无损筛选阳性转基因愈伤，利用Bar标记抗性筛选阳性转基因分化苗，显著提高了转基因事件筛选的准确性，最终实现了根癌农杆菌介导甘蔗愈伤组织的高效遗传转化。

Description

一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法
技术领域
本发明涉及组织培养领域，特别是涉及一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法。
背景技术
甘蔗是我国和世界最为主要的糖料作物和重要的生物乙醇来源。甘蔗品种的持续遗传改良，是产业健康发展的基础和关键。然而，甘蔗是高度杂合的异源多倍体和非整倍体无性繁殖作物，遗传背景复杂，基因组巨大，常规杂交育种十分困难。同时，甘蔗亲本开花诱导困难、花期不遇等问题，更进一步限制了杂交育种的性状改良效率。相比之下，基因工程育种可在不引起大范围遗传重组的基础上实现植物性状的定向遗传改良，是一种更为高效的育种手段。
遗传转化是甘蔗基因工程育种的核心工作，目前其主要方法包括基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法在转化效率方面具有优势，但其需要昂贵的专用设备、使用和维护成本高、转基因拷贝数高，限制了其在甘蔗育种中的应用。农杆菌介导法无需额外设备、成本低廉、转基因拷贝数低，成为甘蔗基因工程育种的首选遗传转化方法。
转基因研究中，通常以如下公式计算转化效率：
转化效率＝独立转化株系/浸染愈伤数×100％
其中，从同一愈伤组织分化产生的所有转基因阳性苗，均视为同一个独立转化株系。目前常规农杆菌介导甘蔗遗传转化技术的转化效率通常约为2-5％，即在所有投入转基因实验的甘蔗愈伤中，仅有约2-5％能够最终分化产生转基因苗。较低的转化效率限制了农杆菌介导法在甘蔗基因工程育种中的应用。因此，有必要对现有技术体系进行优化，提高农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化效率。
在完成植物愈伤组织诱导和工程菌制备(植物双元表达载体遗传转化农杆菌)后，即为农杆菌介导植物愈伤遗传转化的核心步骤：工程菌浸染─转基因愈伤筛选─转基因苗分化。在此步骤中，首先需要将工程菌活化，以菌液浸染植物愈伤组织；随后，利用选择标记筛选的转基因愈伤组织；最后，在相应的选择压下分化形成抗性苗。在这一过程中，提高农杆菌浸染水平、准确筛选抗性愈伤、确保抗性愈伤分化，是提高农杆菌介导植物愈伤遗传转化效率的关键。然而，片面的、单项的改变难以提升整体转化效率，反而容易适得其反。例如，农杆菌浸染水平过高，会引起后续过程中农杆菌过度增长、植物愈伤受害死亡；过分强调抗性愈伤筛选而提高抗生素或除草剂选择压强度，会抑制愈伤分化；为提高愈伤分化而降低选择压，又会极大增加工作量，且容易产生嵌合体。因此，通过综合考量、协调优化获得整体的效率提升，才是这一问题的根本解决方法。
发明内容
本发明的目的是提供种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法，以解决上述现有技术存在的问题。通过构建EGFP-Bar双标记筛选系统、改良农杆菌工程菌活化方式、强化愈伤组织、浸染力度、改善浸染愈伤分化筛选培养条件等措施，对现有技术体系进行综合优化，最终显著提高根瘤农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法，包括以下步骤：
步骤1，甘蔗愈伤组织诱导；
步骤2，EGFP-Bar双标记筛选系统工程菌构建：将pCambia3301载体与pOsActin1::EGFP序列分别用限制性内切酶Hind III和BstE II双酶切后，连接，构建携带EGFP-Bar双标记的重组载体；将所述重组载体遗传转化EHA105根癌农杆菌感受态细胞，筛选携带EGFP-Bar双标记的重组载体的阳性单菌落，即得工程菌；
步骤3，工程菌活化培养：将工程菌先于含抗生素的YEP液体培养基中黑暗震荡培养，获取工程菌液；再将所述工程菌液涂布于含有抗生素和乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)的YEP固体培养基，黑暗倒置培养，之后刮取工程菌菌体，并用浸染培养基重悬，再于黑暗条件震荡培养，得到浸染液；
所述浸染培养基包括以下浓度组分：1/2MS+2,4-D 2.0-3.5mg/L+蔗糖10-20g/L+葡萄糖10-20g/L+AS 40mg/L，pH 5.2；
步骤4，甘蔗愈伤强化浸染：将步骤1诱导得到的甘蔗愈伤组织移入步骤3得到的浸染液中，进行强化浸染：于黑暗条件下震荡培养5-15min，再于室温下依次40kHz超声波水浴3-10min，28-44kPa真空处理5-15min，黑暗静置5-15min；
步骤5，转基因愈伤与抗性苗分化筛选：经过上述浸染的愈伤组织再依次用CCM培养基共培养，CSM培养基进行转基因愈伤组织筛选，以及含有草铵膦(phosphinothricin，PPT)的CDM培养基进行抗性分化筛选，获取抗性分化苗；所述CCM培养基为1/2MS+2,4-D2.0mg/L+柠檬酸200mg/L+蔗糖10g/L+葡萄糖20g/L+AS 20mg/L，pH 5.2；CSM培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸200-300mg/L+蔗糖30g/L+Tim(Timentin，特美汀)200mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；CDM培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+柠檬酸200-300mg/L+蔗糖30g/L+Tim200mg/L+PPT 1.0-2.0mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；
步骤6，所述抗性分化苗经生根、炼苗、假植、PCR鉴定后，得到阳性转基因甘蔗苗，然后进行定植。
优选的是，步骤1中，所述甘蔗愈伤组织诱导具体包括以下步骤：
取甘蔗顶端生长点以上1-5cm区段，逐层剥除外层成熟叶片，无菌消毒，留取内部直径1cm嫩叶卷柱，切为1-2mm厚叶盘，接种于愈伤诱导培养基，28℃暗培养，每2-3周继代1次，获取愈伤组织；所述愈伤诱导培养基为MS+2,4-D 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8，121℃高压湿热灭菌。
优选的是，步骤2中，所述pOsActin1::EGFP序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的是，步骤3中，所述黑暗震荡培养为：28℃、200rpm黑暗震荡培养48-72h；所述黑暗倒置培养为：28℃黑暗倒置培养16-24h。
优选的是，步骤3中，所述抗生素为利福平和卡那霉素，在震荡培养时，所述利福平和卡那霉素的浓度分别为50mg/L和50mg/L；在倒置培养时，所述利福平和卡那霉素的浓度分别为20mg/L和50mg/L，所述乙酰丁香酮的浓度为20mg/L。
优选的是，步骤4中，在强化浸染之后，黑暗条件下震荡培养之前还包括：向所述浸染液中加入体积百分比0.1％的吐温-20；
所述黑暗条件下震荡培养为：28℃、100rpm黑暗震荡培养5-15min。
优选的是，步骤5中，利用所述CCM培养基共培养的条件为：20-24℃黑暗静置培养72h；经共培养得到的愈伤组织移至所述CSM培养基，于28℃暗培养2-3周后，筛选出带有荧光信号的愈伤组织；将带有荧光信号的愈伤组织再移至所述CDM培养基，于28℃光照培养，光强80μmol/m2/s，光周期16h光照/8h黑暗，每3-4周继代一次，获得所述抗性分化苗。
优选的是，所述抗性分化苗再炼苗之前，还包括移至SRM培养基培养的步骤，所述SRM培养基包括以下浓度组分：1/2MS+NAA 1.0mg/L+活性炭0.75g/L+蔗糖40g/L+Tim200mg/L+PPT 0.5mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；所述SRM培养基培养的条件同所述CDM培养基的培养条件。
本发明公开了以下技术效果：
本发明针对常规农杆菌介导法效率低下的问题，开发了优化的技术方法，大幅提高了转化效率。具体地，在农杆菌工程菌活化培养阶段，以涂板法取代常规的液体摇菌法，同时添加乙酰丁香酮保证菌体活力、延长活化时间，诱导菌体Vir基因表达，提高菌体转化活性；甘蔗愈伤浸染阶段，以超声波处理-真空渗透-黑暗静置方式取代常规的仅做黑暗静置浸染，增强工程菌液向甘蔗愈伤的渗透；在后续共培养、筛选和分化培养基中添加抗氧化剂抑制农杆菌强化浸染引起的愈伤褐化，明显提高了浸染后愈伤的存活率和分化能力；转基因事件筛选阶段，EGFP标记可视化无损筛选阳性转基因愈伤，利用Bar标记抗性筛选阳性转基因分化苗，提高转基因事件筛选的准确性。使用本发明方法，根瘤农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化效率最高可达14％以上，远高于常规的2-5％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EGFP-Bar双筛选标记系统pBS载体图谱；
图2为实施例3浸染甘蔗品种云蔗0551愈伤EGFP信号检测(红色箭头指示绿色荧光)；
图3为实施例3遗传转化甘蔗品种0551愈伤抗性筛选分化诱导；左：本发明实施例3的方法产生大量抗性分化苗；右：对比例5常规方法仅产生少数抗性分化苗；
图4为实施例3中ROC22和云蔗0551转基因苗PCR鉴定结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
发明人研究的思路：
发明人长期专门从事甘蔗基因工程和遗传转化研究。对植物遗传转化有着较为深刻的认识。技术层面上，遗传转化即为转基因事件的诱导和筛选过程。转基因事件的高频诱导、充分保留和准确筛选，是提高根瘤农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化的关键。相较于常规方法，本发明通过增强根癌农杆菌Vir基因诱导活化水平和甘蔗愈伤组织的菌液浸染力度，大幅提高了转基因事件诱导频率；在后续筛选和分化培养基中添加抗氧化剂，抑制了农杆菌强化浸染引起的愈伤褐化，明显提高了含有转基因事件愈伤的存活和分化能力，确保转基因事件得以充分保留；采用同时带有绿色荧光蛋白标记EGFP基因和除草剂草铵膦抗性标记Bar基因的双标记筛选系统，利用EGFP标记可视化无损筛选阳性转基因愈伤，利用Bar标记抗性筛选阳性转基因分化苗，显著提高了转基因事件筛选的准确性。最终，本发明实现了根癌农杆菌介导甘蔗愈伤组织的高效遗传转化。
实施例1
步骤1，甘蔗愈伤组织诱导：
取甘蔗(分别利用甘蔗栽培品种(Saccharum spp.hybrid)ROC22和云蔗05-51两品种)顶端生长点以上1-5cm区段(优选3cm)，逐层剥除外层成熟叶片，于超净工作台中喷施酒精表面消毒，留取内部直径1cm嫩叶卷柱，切为1-2mm(优选1mm)厚叶盘，接种于愈伤诱导培养基。28℃暗培养，2-3周(优选2周)继代1次。取表面干燥、质地紧致、颜色白色至浅黄者用于遗传转化。
上述愈伤诱导培养基为MS+2,4-D 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8，121℃高压湿热灭菌。
步骤2，EGFP-Bar双标记筛选系统构建与工程菌转化：
EGFP-Bar双标记筛选系统骨架载体为pCambia3301。该载体自带的p35S::Bar::tCaMV polyA表达盒提供了Bar选择标记。使用限制性核酸内切酶Hind III和BstE II双酶切pCambia3301载体，回收8496bp条带。带有Hind III和BstE II酶切位点的pOsActin1::EGFP序列(SEQ ID NO:1)由华大基因公司合成，以相同限制性内切酶双酶切后，使用T4 DNA连接酶与前述回收条带于16℃过夜连接。由此，形成pOsActin1::EGFP::tNOS表达盒，提供EGFP选择标记，并与Bar标记构成双标记筛选系统。该载体命名为pBS，在两个标记表达盒间保留了多克隆位点供外源转基因表达盒插入，图谱如图1所示。
pBS载体遗传转化EHA105根癌农杆菌感受态细胞。菌落PCR检测EGFP基因片段(检测引物EGFP-F：5’-TGCAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3’；EGFP-R：5’-ACAGCTCGTCCATGCCGTGAGT-3’，片段长度507bp，退火温度62℃，30个循环)与Bar基因片段(检测引物BAR-F：5’-TCCAGCTGCCAGAAACCCACG-3’；BAR-R：5’-ACCATGAGCCCAGAACGACGC-3’，片段长度503bp，退火温度62℃，30个循环)，选取同时含二者特异条带的单菌落，作为后续使用的工程菌。
SEQ ID NO：1为：
Figure BDA0003652537730000061
Figure BDA0003652537730000071
大写字母为酶切位点及其保护碱基，其中Hind III及BstE II酶切位点以下划线标识。斜体和加粗部分分别为水稻Actin1启动子(pOsActin1)和EGFP序列。
步骤3，工程菌活化培养：
工程菌单菌落接种至500μl含有利福平(Rif)50mg/L和卡纳霉素(Kan)50mg/L的YEP液体培养基，于28℃、200rpm黑暗震荡培养48-72h。取100-150μl工程菌液，涂布于含有Rif 20mg/L、Kan 50mg/L，以及AS 20mg/L的YEP固体培养基，28℃黑暗倒置培养16-24h(优选18h)。刮取工程菌菌体，以浸染培养基充分重悬，并调整浸染液浓度至OD600＝0.3-0.5(优选OD600＝0.4)，于28℃、200rpm黑暗震荡培养1-2h(优选1.5h)。
上述浸染培养基为1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖10g/L+葡萄糖20g/L+AS 40mg/L，pH 5.2。
步骤4，甘蔗愈伤强化浸染：
甘蔗愈伤切至3mm大小，吹干表面，移入浸染液中，进行强化浸染。加入体积比0.1％的吐温-20，于28℃、100rpm黑暗震荡培养5min，于室温下依次40kHz超声波水浴3min，28kPa真空处理12min，黑暗静置15min。
步骤5，共培养与清菌：
浸染后的甘蔗愈伤以无菌滤纸吸去多余菌液，吹干表面，转移至以CCM培养基浸润的无菌滤纸上，20-24℃(优选22℃)黑暗静置培养72h。经过共培养的愈伤在无菌水中震荡清洗数次至水澄清后，移至含Tim 300mg/L和吐温-20 0.1％的无菌水，28-44kPa(优选32kPa)真空处理20min。沥干水分，以无菌滤纸拭干表面，吹至表面皱缩。
上述CCM培养基为1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸200mg/L+蔗糖10g/L+葡萄糖20g/L+AS 20mg/L，pH 5.2。
步骤6，转基因愈伤与抗性苗筛选：
上步甘蔗愈伤移至CSM培养基，于28℃暗培养。2-3周(优选2周)后，使用LUYOR-3415RG便携式激发光源和495nm滤镜筛选带有荧光信号的愈伤，移至CDM培养基。28℃光照培养，光强80μmol/m2/s，光周期16h/8h(光/暗)。每3-4周(优先3周)继代一次，获得抗性分化小苗，移至SRM培养基。如前光照培养，每3-4周(优先3周)继代一次，至小苗长至4cm以上且根系生长充分。
上述CSM培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸200mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
上述CDM培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+柠檬酸200mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+PPT 1.0mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
上述SRM培养基为1/2MS+NAA 1.0mg/L+活性炭0.75g/L+蔗糖40g/L+Tim 200mg/L+PPT 0.5mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
步骤7，生根、炼苗、假植、PCR鉴定与定植
以常规方法进行生根诱导、炼苗、假植、PCR鉴定与定植。抗性小苗经生根诱导和炼苗后，假植于沙床。2周后，喷施0.6-1.2g/L草铵膦溶液(优选1.0g/L草铵膦溶液)，1周后选取存活的抗性蔗苗，提取基因组DNA，PCR检测EGFP和Bar基因特异片段(方法同步骤2菌落PCR)，鉴定阳性转基因蔗苗定植于桶内或大田。
实施例2
步骤1同实施例1的步骤1。
步骤2同实施例1的步骤2。
步骤3与实施例1的步骤3的区别在于：浸染培养基为1/2MS+2,4-D 3.5mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+AS 40mg/L，pH 5.2。
步骤4，甘蔗愈伤强化浸染：
甘蔗愈伤切至5mm大小，吹干表面，移入浸染液中，进行强化浸染。加入体积比0.1％的吐温-20，于28℃、100rpm黑暗震荡培养15min，于室温下依次40kHz超声波水浴10min，44kPa真空处理5min，黑暗静置5min。
步骤5与实施例1的步骤5的区别在于：CCM培养基为1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸300mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+AS 20mg/L，pH 5.2。
步骤6与实施例1的步骤6的区别在于：
CSM培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸300mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
CDM培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+柠檬酸300mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+PPT2.0mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
步骤7同实施例1的步骤7。
实施例3
步骤1同实施例1的步骤1。
步骤2同实施例1的步骤2。
步骤3与实施例1的步骤3的区别在于：浸染培养基为1/2MS+2,4-D 3.0mg/L+蔗糖15g/L+葡萄糖15g/L+AS 40mg/L，pH 5.2。
步骤4，甘蔗愈伤强化浸染：
甘蔗愈伤切至4mm大小，吹干表面，移入浸染液中，进行强化浸染。加入体积比0.1％的吐温-20，于28℃、100rpm黑暗震荡培养10min，于室温下依次40kHz超声波水浴5min，32kPa真空处理10min，黑暗静置10min。
步骤5与实施例1的步骤5的区别在于：CCM培养基为1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸250mg/L+蔗糖15g/L+葡萄糖15g/L+AS 20mg/L，pH 5.2。
步骤6与实施例1的步骤6的区别在于：
CSM培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸250mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
CDM培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+柠檬酸250mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+PPT1.5mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8。
步骤7同实施例1的步骤7。
对比例1
本实施例与实施例3的区别在于：步骤3中，工程菌活化培养为常规方法，即工程菌单菌落接种至500μl含有Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的YEP液体培养基，于28℃、200rpm黑暗震荡培养48-72h；且浸染培养基为MS+蔗糖30g/L+AS 20mg/L，pH 5.8，其余皆同。
对比例2
本实施例与实施例3的区别在于：步骤3中，工程菌活化培养为常规方法，且浸染培养基为MS+蔗糖30g/L+AS 20mg/L，pH 5.8；甘蔗愈伤浸染亦为常规方法，即于农杆菌浸染液中黑暗静置35min；其余皆同。
对比例3
本实施例与实施例3的区别在于：用于共培养的CCM培养基、用于愈伤筛选的CSM培养基、用于分化筛选的CDM培养基中均未添加柠檬酸，其余皆同。
对比例4
本实施例与实施例3的区别在于：使用常规的Bar基因单一筛选标记，并使用相应的常规筛选方法进行愈伤筛选，即浸染愈伤置于含有PPT 2.0mg/L的CSM培养基暗培养2-3周，从存活愈伤中挑选长势较好者转入下步分化筛选，其余皆同。
对比例5
本实施例与实施例3的区别在于：采用Bar基因单一筛选标记；工程菌活化培养为常规方法；甘蔗愈伤浸染为常规方法；用于共培养的CCM培养基、用于愈伤筛选的CSM培养基、用于分化筛选的CDM培养基中均未添加柠檬酸；其余皆同。
上述实施例1-3以及对比例1-5为本发明遗传转化方法体系中关键技术参数的不同组合，体现了本发明公开的遗传转化方法框架下的参数进一步优选过程。
应用实施例1
以甘蔗栽培品种(Saccharum spp.hybrid)ROC22和云蔗05-51为材料，利用本发明实施例1-3方法进行遗传转化，均以较高的转化效率获得了转基因苗，结果如表1所示。
表1.根癌农杆菌介导甘蔗栽培品种ROC22、云蔗05-51愈伤高效遗传转化
Figure BDA0003652537730000101
注：转化愈伤组织数为经浸染、共培养、脱菌后，接种于CSM培养基的愈伤组织的数量；同一愈伤分化形成的所有阳性苗仅取一棵计阳性苗数；转化效率＝阳性苗数/转化愈伤数×100％。表中数字为3次以上重复的均值及标准差。F实施例、F基因型、F实施例×基因型分别为不同实施例、基因型，以及不同实施例和基因型组合间方差分析结果。ns，*，**分别表示差异不显著(P≥0.05)，差异显著(P<0.05)，差异极显著(P<0.01)。
如表1所示，在各实验组间转化愈伤组织数量较大(平均300以上)且高度一致(无显著性差异)的背景下，阳性苗数在不同实施例和基因型间均产生了显著性差异，相应地，转化效率差异也较大。
与常规的<5％转化效率相比，各实施例的转化效率均有较大幅度提升(8.06-14.89％)。在各实施例间，转化效率差异极显著，实施例3方法的转化效率高于其他二者，是优选的技术体系。各基因型间转化差异亦达到显著水平，在所有实施例中，云蔗05-51转化效率均高于ROC22。转化效率在不同实施例和基因型组合间差异不显著，表明本发明框架下进行的不同参数优化，对于不同甘蔗基因型转化效率的提升效果是较为一致的。因此，本发明遗传转化方法框架下优选的实施例3技术方案，对于其他甘蔗基因型可能亦为较为优选的方案。
应用实施例2
本应用实例部分体现了本方法的发明过程。对比例1-4在本发明方法框架内，部分采用了常规方法，对比例5完全为常规的技术方法。对比例1-5所用材料为云蔗05-51。各方法介导云蔗05-51愈伤遗传转化结果如表2所示
表2.不同方法介导甘蔗栽培品种云蔗05-51愈伤遗传转化结果
方法 转化愈伤组织数 阳性苗数 转化效率(％)
实施例3 331.67a 49.33d 14.89d
对比例1 339.33a 38.33c 11.58c
对比例2 336.67a 37.20c 11.00c
对比例3 316.00a 27.10b 8.57b
对比例4 327.00a 26.62b 8.14b
对比例5 322.00a 10.13a 3.46a
注：转化愈伤组织数、阳性苗数、转化效率定义同表1。表中数字为3次以上重复实验所得均值，不同字母表示在P<0.05水平上差异显著，Duncan法检验。
表2显示，各组实验间转化愈伤组织数量接近，但所得阳性苗数差异较大。对比例5采用了未经任何优化改良的、最为常规的方法，其整体转化效率最低，为3.46％；实施例3采用了本发明方法，且为优选方案，转化效率最高，达14.89％。在云蔗05-51基因型背景下，实施例3转化效率超过对比例5转化效率4.3倍以上，这充分体现了本发明方法，尤其是优化方案，在提高农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化效率方面的强大功效。
在本发明的遗传转化方法框架内(对比例1-4)，与实施例3相比，使用Bar基因单标记的对比例4转化效率较为低下(8.14％)，表明本方法发明中使用EGFP-Bar双标记筛选系统，通过绿色荧光信号对转基因愈伤进行精确无损的可视化筛选，对甘蔗愈伤遗传转化具有较大的提升作用。对比例3未使用柠檬酸抑制浸染后愈伤褐化，其转化效率与对比例4相近，亦较低(10.86％)。这表明在提升了工程菌活性并强化了菌液浸染力度之后，必须抑制由此引起的甘蔗愈伤褐化死亡，由此令转基因事件得以充分保留。对比例1和2使用了常规的农杆菌活化培养和浸染方法，与实施例3相比，差距也十分显著，这表明提高工程菌转化活力和浸染强度，以提高转基因事件发生频率，对提高整体转化效率的重要性。
综上可知，本发明方法具有系统性，在强化浸染增强转化的同时，充分考虑了其对后续愈伤分化活力的负面影响，辅以双标记筛选系统，综合提升了农杆菌介导甘蔗遗传转化过程中转基因事件的诱导、保留和筛选；相对于常规方法，令转化效率得到了显著提高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 云南省农业科学院甘蔗研究所
<120> 一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaagcttaa aaaaaaaata gatcgaggtc attcatatgc ttgagaagag agtcgggata 60
gtccaaaata aaacaaaggt aagattacct ggtcaaaagt gaaaacatca gttaaaaggt 120
ggtataagta aaatatcggt aataaaaggt ggcccaaagt gaaatttact cttttctact 180
attataaaaa ttgaggatgt tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt 240
ttttaagttt attcgcgatt tggaaatgca tatctgtatt tgagtcggtt tttaagttcg 300
ttgcttttgt aaatacagag ggatttgtat aagaaatatc tttaaaaaac ccatatgcta 360
atttgacata atttttgaga aaaatatata ttcaggcgaa ttccacaatg aacaataata 420
agattaaaat agcttgcccc cgttgcagcg atgggtattt tttctagtaa aataaaagat 480
aaacttagac tcaaaacatt tacaaaaaca acccctaaag tcctaaagcc caaagtgcta 540
tgcacgatcc atagcaagcc cagcccaacc caacccaacc caacccaccc cagtgcagcc 600
aactggcaaa tagtctccac ccccggcact atcaccgtga gttgtccgca ccaccgcacg 660
tctcgcagcc aaaaaaaaaa aaagaaagaa aaaaaagaaa aagaaaaaca gcaggtgggt 720
ccgggtcgtg ggggccggaa aagcgaggag gatcgcgagc agcgacgagg cccggccctc 780
cctccgcttc caaagaaacg ccccccatcg ccactatata catacccccc cctctcctcc 840
catcccccca accctatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 900
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 960
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1020
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccttc acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 1080
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 1140
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 1200
gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 1260
aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1320
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1380
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 1440
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 1500
cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactca cggcatggac 1560
gagctgtaca agtaatgtgg tgaccaa 1587

Claims (8)

1.一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，甘蔗愈伤组织诱导；
步骤2，EGFP-Bar双标记筛选系统工程菌构建：将pCambia3301载体与pOsActin1::EGFP序列分别用限制性内切酶Hind III和BstE II双酶切后，连接，构建携带EGFP-Bar双标记的重组载体；将所述重组载体遗传转化EHA105根癌农杆菌感受态细胞，筛选携带EGFP-Bar双标记的重组载体的阳性单菌落，即得工程菌；
步骤3，工程菌活化培养：将工程菌先于含抗生素的YEP液体培养基中黑暗震荡培养，获取工程菌液；再将所述工程菌液涂布于含有抗生素和乙酰丁香酮的YEP固体培养基，黑暗倒置培养；之后刮取工程菌菌体，并用浸染培养基重悬，再于黑暗条件震荡培养，得到浸染液；
所述浸染培养基包括以下浓度组分：1/2MS+2,4-D 2.0-3.5mg/L+蔗糖10-20g/L+葡萄糖10-20g/L+AS 40mg/L，pH 5.2；
步骤4，甘蔗愈伤强化浸染：将步骤1诱导得到的甘蔗愈伤组织移入步骤3得到的浸染液中，进行强化浸染：于黑暗条件下震荡培养5-15min，再于室温下依次40kHz超声波水浴3-10min，28-44kPa真空处理5-15min，黑暗静置5-15min；
步骤5，转基因愈伤与抗性苗分化筛选：经过上述浸染的愈伤组织再依次用CCM培养基共培养，CSM培养基进行转基因愈伤组织筛选，以及含有草铵膦的CDM培养基进行抗性分化筛选，获取抗性分化苗；CCM培养基为1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸200mg/L+蔗糖10g/L+葡萄糖20g/L+AS 20mg/L，pH 5.2；所述CSM培养基为：MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸200-300mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；CDM培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+柠檬酸200-300mg/L+蔗糖30g/L+Tim 200mg/L+PPT 1.0-2.0mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；·
步骤6，所述抗性分化苗经生根、炼苗、假植、PCR鉴定后，得到阳性转基因甘蔗苗，然后进行定植。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述甘蔗愈伤组织诱导具体包括以下步骤：
取甘蔗顶端生长点以上1-5cm区段，逐层剥除外层成熟叶片，无菌消毒，留取内部直径1cm嫩叶卷柱，切为1-2mm厚叶盘，接种于愈伤诱导培养基，28℃暗培养，每2-3周继代1次，获取愈伤组织；所述愈伤诱导培养基为MS+2,4-D 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L，pH5.8，121℃高压湿热灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述pOsActin1::EGFP序列如SEQID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述黑暗震荡培养为：28℃、200rpm黑暗震荡培养48-72h；所述黑暗倒置培养为：28℃黑暗倒置培养16-24h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述抗生素为利福平和卡那霉素，在震荡培养时，所述利福平和卡那霉素的浓度分别为50mg/L和50mg/L；在倒置培养时，所述利福平和卡那霉素的浓度分别为20mg/L和50mg/L，所述乙酰丁香酮的浓度为20mg/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，在强化浸染之后，黑暗条件下震荡培养之前还包括：向所述浸染液中加入体积百分比0.1％的吐温-20；
所述黑暗条件下震荡培养为：28℃、100rpm黑暗震荡培养5-15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，利用所述CCM培养基共培养的条件为：20-24℃黑暗静置培养72h；经共培养得到的愈伤组织移至所述CSM培养基，于28℃暗培养2-3周后，筛选出带有荧光信号的愈伤组织；将带有荧光信号的愈伤组织再移至所述CDM培养基，于28℃光照培养，光强80μmol/m2/s，光周期16h光照/8h黑暗，每3-4周继代一次，获得所述抗性分化苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗性分化苗再炼苗之前，还包括移至SRM培养基培养的步骤，所述SRM培养基包括以下浓度组分：1/2MS+NAA 1.0mg/L+活性炭0.75g/L+蔗糖40g/L+Tim 200mg/L+PPT 0.5mg/L+琼脂粉8.0g/L，pH 5.8；所述SRM培养基培养的条件同所述CDM培养基的培养条件。
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