CN106536722A

CN106536722A - 用于快速制备感染性rna病毒的方法

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Publication number: CN106536722A
Application number: CN201580033090.7A
Authority: CN
Inventors: F·奥布里; A·努加德雷; G·奎拉特; X·德朗巴勒瑞; E·A·古德; L·德法布里图斯
Original assignee: National Medical And Health Research Institute; Universite de Provence Aix Marseille I
Current assignee: National Medical And Health Research Institute; Aix Marseille Universite
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: EP3158060A1; US10407667B2; JP2017518056A; WO2015193472A1; US20180208907A1; CA2952724A1; CN106536722B; ES2717253T3; JP6747983B2; CN112501138A; EP3158060B1; HUE043096T2

Abstract

本发明涉及用于快速制备感染性RNA病毒的方法，其完全不需要构建覆盖整个病毒基因组的全长cDNA、克隆和繁殖该全长cDNA。

Description

用于快速制备感染性RNA病毒的方法

技术领域

本发明涉及用于快速制备感染性RNA病毒的方法，其完全不需要构建全长cDNA、克隆并繁殖该全长cDNA。

背景技术

通过允许“反向基因组学”(即，研究具体突变对病毒的生物学性质的影响)的发展，能够从其基因组的DNA拷贝产生感染性病毒的分子学方法的发展极大地提高了我们对RNA病毒的生命周期和发病机制的理解。

然而，目前用于构建感染性cDNA克隆的方法是不可预料且费力的方法，其常常与细菌中不期望的突变或不稳定/有毒的克隆有关。

这产生了对制备RNA病毒的其他方法的极大兴趣。已经提出了各种方法改进，例如使用可选择的宿主、低拷贝数的质粒、粘粒载体、细菌人工染色体、具有降低的隐藏细菌启动子活性的修饰启动子或修饰病毒基因组序列。

Gritsun和Gould于1995年用蜱传播脑炎(TBEV)，以及Edmonds等和Siridechadilok等于2013年分别用西尼罗病毒(WNV)和登革病毒(DENV)发展了不含细菌的方法。

尽管他们代表显著的进步，这些方法对研究的各个病毒需要实质性的优化，且没有提供统一的方法论过程。

因此，对于有效、精确且快速的用于制备感染性RNA病毒的其他方法存在长期未满足的需要。

发明简述

发明人已经表明，各自覆盖RNA病毒基因组的一部分的重叠cDNA片段能够产生复制型病毒而不使用全长cDNA或含有该全长cDNA的质粒或载体。

因此，发明人公开了各自覆盖病毒基因组的一部分的重叠双链DNA片段能够在细胞中自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。

因此，在第一个方面，本发明涉及用于制备感染性RNA病毒的方法，包含以下步骤：

a)将DNA依赖性RNA聚合酶的启动子引入RNA病毒的整个基因组的5’位，和任选地将终止子和RNA聚腺苷酸序列引入RNA病毒的整个基因组的3’位；

b)在至少2个、优选至少3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段中扩增步骤a)制备的整个病毒基因组，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列；

c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

d)孵育步骤c)的宿主细胞；和

e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

在第二个方面，本发明涉及在此公开的用于制备感染性RNA病毒的方法，和/或根据所述方法获得的RNA病毒用于反向基因组学分析的用途。

在第三个方面，本发明涉及在此公开的用于制备感染性RNA病毒的方法，和/或根据所述方法获得的RNA病毒用于安全有效地运送感染性RNA病毒的用途。

发明详述

发明人发现，各自覆盖病毒基因组的一部分的重叠双链DNA片段能够在转染后自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。基于这一出乎意料的发现，发明人开发了用于制备感染性RNA病毒的新方法，其不需要将全长cDNA克隆并繁殖入细菌。

c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

d)孵育步骤c)的宿主细胞；和

e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

基于他们的深入研究，发明人通过开发一种方法克服了技术偏见，所述方法避免了：

-构建覆盖整个病毒基因组的全长cDNA；和/或

-使用包含这种全长cDNA的质粒或载体；和/或

-在感染入宿主细胞前重构建全长cDNA或整个病毒基因组的需要；和/或

-修饰病毒基因组，例如引入非天然存在的重组或限制性酶切位点；和/或

-使用帮助病毒或其他病毒蛋白。

因此，本发明的方法，也称为“感染性亚基因组扩增子”或“ISA”是能够在几天内加快制备感染性RNA病毒的非常简单的方法，其完美控制病毒序列，并从包括以下的各种初始来源开始：预先存在的感染性克隆、病毒RNA或从头合成的DNA基因组序列。与现有技术中其他不包含细菌的方法不同，本发明的方法除了制备cDNA片段外不需要任何额外步骤。在转染前，构建体的组装不是在体外通过Gibson组装或环形聚合物延伸克隆来进行，而是通过直接在细胞内发生的重组过程来进行，其极大地促进并缩短了方法。

如本文所用，表述“制备感染性RNA病毒”是指根据本发明的方法，产生野生型或基因修饰型的RNA病毒。术语“感染性病毒”是指具有繁殖能力，即能够在宿主细胞中扩增病毒基因组、在细胞中包装病毒基因组和/或从细胞释放感染性病毒颗粒的病毒。值得注意的是，病毒可以是致病的或非致病的且仍是感染性的。

如本文所用，表述“非天然存在的重组位点”是指允许位点特异性重组(例如Cre-Lox或FLP-FRT重组系统)的序列。限制性酶切位点是指允许限制性酶(例如NotI或AluI内切酶)位点特异性切割双链DNA的序列。

优选的，本方法意图制备的感染性RNA病毒(本文也称为“目标病毒”)是单链正链或负链RNA病毒。更优选的，所述病毒是单链正链RNA病毒。更优选的，所述病毒选自黄病毒、甲病毒和肠道病毒。

黄病毒的非限制性列表包括登革病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)、圣路易斯型脑炎(SLEV)、日本脑炎病毒(JEV)、墨累谷脑炎(MVEV)、西尼罗河病毒(WNV)、Rocio(ROCV)、蜱传播脑炎病毒(TBEV)、鄂木斯克出血热(OMSKV)、Kyasanr Forrest病(KFDV)、Powassan(POWV)。优选的，所述黄病毒选自：

-日本脑炎病毒(JEV)，例如基因型I菌株(JEV I)或基因型III菌株(JEV III)，

-西尼罗河病毒(WNV)，例如基因型2菌株；

-登革病毒(DENV)，例如血清型4菌株；

-黄热病病毒(YFV)，例如南美野生型菌株；和

-蜱传播脑炎病毒(TBEV)，例如远东亚型菌株。

更优选的，所述黄病毒是登革病毒。

甲病毒的非限制性列表包括基孔肯雅病毒(CHIK)、东方马脑炎(EEE)、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、马亚罗病毒(MAY)、O′nyong′nyong病毒(ONN)、辛德华斯病毒、西门利克森林病毒、巴马森林病毒、罗斯河病毒、乌纳病毒、托纳特病毒。优选的，所述甲病毒是基孔肯雅病毒。

肠道病毒的非限制性列表包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒和鼻病毒。优选的，所述肠道病毒是柯萨奇病毒，更优选柯萨奇B病毒。

或者，所述病毒是单链负链RNA病毒。更优选的，所述病毒是副粘病毒、沙粒病毒、丝状病毒、弹状病毒、本雅病毒或流感病毒。

本发明的方法包含步骤a)将DNA依赖性RNA聚合酶的启动子引入RNA病毒整个基因组的5’位。任选地，所述步骤a)进一步包含将终止子和RNA聚腺苷酸序列引入RNA病毒整个基因组的3’位。

值得注意的是，当目标病毒的基因组是聚腺苷酸化的，例如甲病毒基因组，步骤a)是将DNA依赖性RNA聚合酶的启动子引入RNA病毒整个基因组的5’位并将终止子和RNA聚腺苷酸序列引入RNA病毒整个基因组的3’位的步骤。6

通过在5’末端包括第一cDNA片段(DNA依赖性RNA聚合酶的启动子)和在3’末端包括最后的cDNA片段(核酶序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列)，将cDNA片段转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA基因组。

优选的，所述在5’位的DNA依赖性RNA聚合酶的启动子是SEQ ID NO：1所示的人巨细胞病毒启动子(pCMV)。优选的，所述终止子和RNA聚腺苷酸序列分别是丁型肝炎核酶和猿猴病毒40聚腺苷酸信号(HDR/SV40pA)。HDR/SV40pA的序列如SEQ ID NO：2所示。

因此，步骤a)提供了待制备的感染性RNA病毒的完整病毒基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)(SEQ ID NO：1)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(SEQ ID NO：2)。

本发明的方法包含扩增在几个重叠cDNA片段中的整个病毒基因组的步骤b)。

在步骤b)中，整个病毒基因组对应于步骤a)中制备的整个病毒基因组，即，其包括所述启动子和任选的所述终止子和RNA聚腺苷酸序列。

如本文所用，表述“重叠cDNA片段”、“cDNA片段”，也称为“扩增子”或“DNA亚基因组片段”或“亚基因组扩增子”是仅覆盖RNA病毒的病毒基因组的一部分的双链DNA片段。这种片段对应于“亚基因组片段”。本发明人发现，当将这种片段转染入细胞，它们出乎意料地在细胞中自发重组以重构整个病毒基因组。即使病毒基因组没有经过基因修饰以引入额外的且不是天然存在的重组位点，所述重组也发生。换言之，所述重组在野生型病毒基因组中发生。

根据本发明的cDNA片段包含：

-通过扩增获得的DNA片段，例如通过PCR；以及

-从头合成获得的DNA片段。

通常，所述cDNA片段可以是感染性的或非感染性的。

如本文所用，表述“全长cDNA”是指在单段中包含病毒的整个病毒基因组的DNA。

如本文所用，表述“覆盖整个病毒基因组的一部分的cDNA片段”是指包含整个病毒基因组的一部分的DNA片段。通常，根据本发明的cDNA片段在转染细胞后自发重组以构成整个病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。该构建体通过细胞机制转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA基因组。

与此相反，“覆盖整个病毒基因组的全长cDNA”是编码病毒基因组整体的单一cDNA。

优选的，本发明方法的步骤b)允许产生2-15个重叠的cDNA片段，优选3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段。通常，所述cDNA片段为约2kb至约6kb，优选为约4kb且各cDNA片段具有70-100bp的重叠区。

优选的，步骤b)的所述重叠cDNA片段是：

-不是通过PCR扩增的感染性克隆的片段；

-通过PCR扩增的感染性克隆的片段；

-不是通过PCR扩增的非感染性克隆的片段；

-通过PCR扩增的非感染性克隆的片段；

-不是通过PCR扩增的从头合成的片段；

-通过PCR扩增的从头合成的片段；和

-通过从病毒基因组的反转录PCR获得的片段。

在一个优选的实施方案中，根据待制备的目标病毒，所述重叠cDNA片段可以借助下表公开的引物来获得：

所述引物可用于通过PCR获得重叠cDNA片段。

因此，在一个实施方案中，本发明方法的步骤b)是扩增步骤a)制备的整个病毒基因组的步骤：

-当所述感染性RNA病毒是JEV I，使用如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：8所示的引物扩增3个重叠cDNA片段，或使用SEQ ID NO：39-50所示的引物扩增6个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是JEV II，使用如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：14所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是WNV，使用如SEQ ID NO：15-SEQ ID NO：20所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是TBEV，使用如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：26所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是YFV，使用如SEQ ID NO：27-SEQ ID NO：32所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是DENV-4，使用如SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：38所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是CHIKV，使用如SEQ ID NO：51-SEQ ID NO：56所示的引物扩增3个重叠cDNA片段；或

-当所述感染性RNA病毒是CV-B3，使用如SEQ ID NO：57-SEQ ID NO：62所示的引物扩增3个重叠cDNA片段。

本发明方法包含将所述cDNA片段转染入宿主细胞的步骤c)。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸(DNA或RNA)引入真核或原核细胞或生物。摄取外源核酸的细胞称为“宿主细胞”或“转染细胞”。可以通过本领域已知的各种方式完成转染，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪。

优选的，步骤c)的宿主细胞是能够回收感染性病毒的易感细胞。通常，本发明方法中使用的易感细胞是当用cDNA片段转染时，能够实现病毒的完整复制周期(包括产生病毒颗粒)的细胞。优选的，所述宿主细胞选自SW13、BHK-21、HEK 293和Vero细胞系。

在一个优选的实施方案中，步骤c)是直接转染步骤b)获得的cDNA片段的步骤，且步骤c)在步骤b)之后直接进行。在该具体的实施方案中，cDNA片段被转染入宿主细胞。所述片段在细胞中自发重组为整个病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。如上所述，本发明的方法克服了技术偏见，因为它不需要转染全长cDNA，回收整个病毒基因组。此外，该方法不需要使用含有所述全长cDNA的质粒或载体和/或在转染入宿主细胞前重构全部cDNA或整个病毒基因组的需要。

与此相反，该方法是基于转染重叠cDNA片段，其各自包含病毒基因组的一部分。将覆盖RNA病毒的整个基因组的重叠双链DNA片段转染入易感细胞能够在细胞中重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。

在另一个实施方案中，步骤c)是转染各自含有步骤b)获得的cDNA片段的质粒的步骤，其中，将各cDNA片段引入单独且分开的质粒或载体。

在该实施方案中，将各cDNA片段引入单独且分开的质粒或载体。各质粒或载体包含cDNA的单个片段。在该实施方案中，整个病毒基因组在转染后重构。

在一个实施方案中，本发明的方法在步骤b)之后且在步骤c)之前进一步包含纯化重叠cDNA片段的步骤b’)。所述纯化可以通过任何已知技术进行，优选通过色谱柱。

本发明的方法包括孵育宿主细胞的步骤d)，其优选持续3-9天。在该孵育步骤期间，转染的cDNA片段在宿主细胞中自发重组以构成整个病毒基因组的DNA拷贝，其在5’末端的侧翼是DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，在3’末端的侧翼是终止序列和RNA聚腺苷酸化的信号序列。该构建体通过细胞机制转录为具有真正5’和3’末端的全长RNA基因组。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于在体内制备感染性RNA病毒的方法。

在该实施方案中，所述方法包括以下步骤：

c’)将所述cDNA片段接种入动物模型；

e’)从所述动物获得的生物样品中回收感染性RNA病毒。

所有之前公开的技术数据适用于此。

如本文所用，表述“动物模型”是多细胞的异养真核生物，优选哺乳动物，更优选非人哺乳动物。在一个优选的实施方案中，所述动物模型是啮齿类动物，更优选小鼠。

如本文所用，表述“生物样品”是指从动物模型获得的任何生物样品。在本发明的方法中，样品可以包含任何体液。测试样品的实例包括血液、血清、血浆、乳头吸引液、尿液、唾液。或者，所述生物样品是从所述动物模型获得的组织。优选的，所述生物样品选自脂肪组织、系膜组织、肝组织、胰腺组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脑和脾组织。更优选的，所述生物样品是脑和脾组织。

如本文所用，术语“个体”是指动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，在一些实施方案中是指人。

通常，将所述cDNA片段接种入动物模型的步骤c’)是指其中向动物模型施用cDNA片段的步骤。换言之，该步骤优选允许将cDNA片段引入动物模型或所述模型的细胞。可以使用各种方式向受试者或细胞递送或施用cDNA片段，包括但不限于：口服、皮内、经眼、舌下、经颊(buccal)、肌肉内、静脉内、动脉内、经鼻、腹膜内、颅内、侧脑室注射、脑内、阴道内、子宫内、直肠、肠胃外。优选的，步骤c’)通过腹膜注射、皮内注射或脑内注射进行。

本发明的方法可能用于制备设计RNA病毒的大规模反向基因组学实验。它也具有特别是调控从实验程序回收的病毒的特征的能力。此外，因为DNA亚基因组片段可以通过PCR方便地获得，当从病毒RNA开始时，该方法能够保存病毒群的遗传多样性。也可以使用容易出错的PCR来产生人工病毒异质性，例如用于加快选择在各种实验选择条件下适应的病毒，且相反地，可以使用高保真聚合酶和克隆扩增模板来控制产生的病毒的克隆程度。

所有之前公开的技术数据均适用于此。

在第三个方面，本发明涉及在此公开的用于制备感染性RNA病毒的方法，和/或根据所述方法获得的RNA病毒用于安全有效地运送感染性RNA病毒的用途。实际上，本发明的方法极大地改进了RNA病毒交换的安全与保障，例如在科学研究所之间。实际上，该交换可以以室温下简单的非感染性的DNA亚基因组片段的单独运送的形式进行。然后接受的研究所可以组合并转染该片段。因此，该方法能够快速、简单并安全地回收感染性病毒菌株。

所有之前公开的技术数据均适用于此。

以下实施例是为说明本发明的各种实施方案的目的，并不以任何方式限制本发明。

附图说明

图1：拯救感染性单链正链RNA病毒的通用策略。

如示意图所示(黄病毒基因组)，通过PCR扩增在3个重叠cDNA片段中的整个病毒基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)。将PCR产物转染入易感细胞后3-9天允许回收感染性病毒。水平的蓝色箭头表示用于制备3个重叠cDNA片段的引物。

具体实施方式

实施例1：ISA方法

方法

细胞、病毒、感染性克隆和抗体

在含有7％热灭活胎牛血清(FBS；Life Technologies)和1％青霉素/链霉素(PS；5000U/mL and 5000μg/ml；Life Technologies)的最小必需培养基(Life Technologies)中，于37℃、5％CO₂下生长幼仓鼠肾(BHK-21)细胞。在补充有1％非必须氨基酸的与BHK-21细胞相同的培养基(Life Technologies)中，于37℃、5％CO₂下生长人胚肾293(HEK-293)细胞和非洲绿猴肾(VeroE6)细胞。在含有10％FBS和1％PS的RPMI 1640培养基(LifeTechnologies)中，于37℃、5％CO₂下生长人肾上腺癌(SW13)细胞。JEV基因型I菌株JEV_CNS769_Laos_2009(KC196115)于2009年六月分离自患有Laos16的患者的脑脊液；于2009年分离自人血清的YFV菌株BOL 88/1999(KF907504)由国家热带疾病中心(CENETROP)，Santa-Cruz，Bolivia友好提供；分离自人血清的DENV-4菌株Dak HD 34 460(KF907503)由Centerfor Biodefense and Emerging Infectious Diseases-Sealy Center for VaccineDevelopment(University of Texas Medical Branch，Galveston，Texas，USA)的Robert BTesh友好提供；衍生自菌株rp9(DQ648597)的JEV基因型III的感染性克隆由Institute ofBiomedical Sciences，Academia Sinica，Taipei，Taiwan的Yi-Ling Lin友好提供；WNV的感染性克隆衍生自菌株Ouganda 1937(M12294)；TBEV的感染性克隆衍生自菌株Oshima5.10(AB062063)；CV-B3的感染性克隆衍生自菌株2679(KJ489414)。使用JEV-特异性免疫血清(接种JEV后获得)和单克隆DENV-特异性抗体17进行直接的免疫荧光分析。

制备cDNA片段

通过PCR扩增在约为4.8kb、3.0kb和5.3kb(CHIKV为4.8kb、2.9kb和5.2kb，TBEV为4.8kb、4.1kb和3.4kb，CV-B3为2.9kb、2.8kb和2.7kb)的3个重叠cDNA片段中的完整基因组，其在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)(SEQ ID NO：1)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(SEQ ID NO：2)(参见下表1)。

对于WNV、TBEV、JEV III和CHIKV，通过PCR使用感染性克隆获得DNA片段(对于JEVIII，用融合PCR纠正了一个突变)。

对于JEV I(所有DNA片段)、DENV-4(第一和第三片段)和YFV(第一和第三片段)，从头合成(Genscript)DNA片段并通过PCR扩增。使用Platinum PCR SuperMix High Fidelity试剂盒(Life Technologies)制备扩增子。

混合物(最终体积：50μL)由以下组成：45μL的supermix，1ng/μL的2μL DNA模板(感染性克隆或合成的DNA片段)和200nM的各个引物。对于DENV-4和YFV，第二DNA片段通过澄清的细胞上清液的RT-PCR获得。根据制造商的说明，使用EZ1 Virus Mini Kit v2在EZ1Biorobot(两者均来自Qiagen)上提取核酸，并用Superscript IIIOne-Step RT-PCRPlatinum Taq Hifi试剂盒(Life Technologies)扩增。混合物(最终体积：50μL)包含25μL反应混合物、2μL核酸提取物、100nM各引物、1μL酶混合物和20μL不含核酶的水。在BiometraT-professional Standard Gradient热循环仪上用以下条件进行分析：94℃下2min，然后是40个循环的94℃下15s，64℃下30s，68℃下5min，以及RT-PCR的初步步骤50℃下30min。用凝胶电泳确认PCR产物大小，并根据制造商的说明用Amicon Ultra-0.5mL试剂盒(Millipore)纯化。当使用质粒DNA作为模板时，转染前用限制性酶Dpn1(New EnglandBiolabs)的消化步骤来确保完全除去模板。为了控制该额外步骤的效率，本发明人仅转染了两个cDNA片段(第一和第二，最终1μg)作为对照(参见以下)。这些对照不产生任何感染性病毒。

细胞转染

在600μL Opti-MEM培养基(Life Technologies)中，用12μL Lipofectamine 2000(Life Technologies)孵育1μg通过PCR扩增的所有cDNA片段的等摩尔混合物或1μg CV-B3的感染性克隆。根据制造商的说明，将混合物加入12.5cm²的亚融合细胞的培养瓶中，所述培养瓶包括不含抗生素的1mL培养基。孵育4小时后，除去细胞上清液，将细胞洗涤2次(HBSS；Life Technologies)，加入3mL新鲜培养基。当观察到毛细胞病变效应(CPE)(取决于细胞类型和病毒生长速度，3-9天)或在转染后9天(对于非细胞病变的病毒)，收集细胞上清液，离心澄清、分样并储存于-80℃。然后，将各病毒用相同细胞类型传代4次，分别使用VeroE6和HEK-293的DENV-4和YFV除外。通过以下进行传代：将333μL澄清的细胞上清液接种至含有666μL培养基的12.5cm²培养瓶的细胞上：孵育2小时后，将细胞洗涤2次(HBSS)并加入3mL新鲜培养基。2-6天后收集细胞上清液，离心澄清，分样并储存于-80℃。澄清的细胞上清液(病毒母液)用于进行病毒RNA的定量、TCID50分析、直接免疫荧光分析和全基因组测序。

实时PCR和RT-PCR分析

为了评估感染性病毒的产生并确保阳性检测不是由cDNA污染造成，使用含有或不含逆转录酶的Access RT-PCR Core Reagent试剂盒(Promega)定量病毒RNA并与检测的cDNA的含量相比。根据制造商的说明，用EZ1 mini virus 2.0试剂盒和EZ1 Biorobot(均来自Qiagen)提取RNA。混合物(最终体积：25μL)包含标准量的AMV/Tfl 5X反应缓冲液、0.5μM各引物、0.5μL dNTP混合物、0.5mM MgSO4、0.5μL AMV逆转录酶(仅对于RT-PCR)、0.5μL TflDNA聚合酶、15.5μL不含核酶的水和2μL提取的核酸。使用CFX96Touch^TM实时PCR检测系统(Biorad)在以下条件进行分析：50℃下15min，9，5℃下2min，然后是45个循环的95℃下15s，60℃下40s。在60℃步骤期间收集数据。实时PCR和实时RT-PCR分析获得的循环阈值(ct)之差用来评估病毒RNA的产量。此外，从标准曲线计算以剂量检测极限(任意单位，AU)表示的病毒RNA的量(用培养的病毒的细胞上清液的核酸作为标准，合并5个核酸提取物，将10μL分样储存于-80℃)。

组织培养感染剂量50(TCID50)分析

对于每次测定，用50μL 10倍梯度稀释的澄清细胞培养物上清液接种含有20,000个BHK-21细胞的96孔板培养物，每孔含有100μL培养基(就在接种前添加)：每行包括相同稀释的6个孔和2个阴性对照。将板孵育7天，并读取每个孔中CPE的不存在或存在。使用Reed和Muench 18方法测定TCID50/mL。

直接免疫荧光分析(dIFA)

在使用澄清细胞上清液前2天和6天分别感染的SW细胞(用于JEV I和JEV III)和VeroE6细胞的12.5cm²培养瓶中进行直接IFA。除去上清液、将细胞洗涤两次(HBSS；Invitrogen)、用胰蛋白酶处理、收集并用新鲜培养基稀释(1/5)。将150μL的这种细胞悬浮液进行细胞离心(3min，900rpm；Cytospin，Thermo Scientific)后，将玻片干燥、浸入用于固定的冷丙酮中20min、干燥、用适当稀释的JEV特异性免疫血清(参见以上)或单克隆DENV特异性抗体于37℃孵育30min，用PBS洗涤两次、用蒸馏水洗涤一次、干燥、用适当稀释的FITC偶联的第二抗体和伊万斯蓝染液于37℃孵育30min、用PBS洗涤两次、用蒸馏水洗涤一次、干燥、安装(mount)并用荧光显微镜读取。

全长基因组的序列分析

用Ion PGM Sequencer19(Life Technologies)进行全基因组测序，并用CLCGenomics Workbench 6软件进行分析。首先将病毒上清液澄清，并用Benzonase核酶HC＞99％(Novagen)于37℃处理过夜。用EZ1 mini virus 2.0试剂盒和EZ1 Biorobot(两者均来自Qiagen)提取RNA后(不适用RNA载体，参见以上)，如上所述随机扩增核酸。根据制造商的说明，用Ion PGM测序仪分析扩增的DNA。整理获得的读段：授信使用质量分数，然后除去随机扩增期间所用的引物，最后在5’和3’端点系统性除去6个核苷酸。仅使用长度大于29个核苷酸的读段，并将其映射至作为参考的初始基因组序列。简单计算各位置的突变频率(具有突变的病毒基因组的比例)：与参考相比具有突变的读段数除以在该位点的读段总数。

结果

本发明人开发了一种简单且多能的反向基因技术，其加快了从基因组DNA材料回收感染性RNA病毒而不需要克隆、将cDNA繁殖入细菌或体外RNA转录。它们的工作假设是，将覆盖RNA病毒的整个基因组的重叠双链DNA片段转染入易感细胞能够自发重组并合成完整病毒基因组的DNA拷贝。通过在5’末端包括第一(5’)DNA片段(DNA依赖性RNA聚合酶的启动子)和在3’末端包括最后的(3’)DNA片段(核酶序列和用于RNA聚腺苷酸的信号序列)，发明人预期该基因组DNA拷贝将会转录为具有真正的5’和3’末端的全长RNA基因组，且会有效地转运出细胞核(在病毒在细胞质中复制的情况下)。发明人首先用代表主要的黄病毒进化谱系的6个黄病毒(即，在感染细胞的细胞质隔室中复制的具有正极性的单链RNA基因组的节肢动物传播的包膜病毒)测试了该假设：2个日本脑炎病毒(JEV；基因型I(JEV I)和基因型III(JEV III))，1个基因型2西尼罗河病毒(WNV)、1个血清型4登革病毒(DENV-4)、1个黄热病病毒(YFV)的野生型菌株和1个远东亚型蜱传播脑炎病毒(TBEV)(表1)。

在具有70-100bp重叠区的约4kb的3个DNA片段中通过PCR扩增整个基因组。第一个和最后一个片段在5’和3’的侧翼分别为人巨细胞病毒启动子(pCMV)和猿猴病毒40聚腺苷酸信号紧随的丁型肝炎核酶(HDR/SV40pA)(图1)。用柱纯化PCR产物，并将1μg所有片段的等摩尔混合物转染入确保能有效回收黄病毒感染性基因组的SW13和/或BHK-21细胞系。将来自这些感染性培养物的细胞上清液介质用相同细胞类型连续传代4次，使其能够分离JEVI、JEVIII、TBEV和WNV。对于更高要求的病毒，可以通过在其他易感细胞(例如DENV-4：VeroE6细胞；YFV：HEK-293细胞)中传代来实现分离。使用以下标准的组合来说明4次连续传代后的病毒复制：

(i)用实时RT-PCR方法测量细胞上清液介质中病毒基因组的产生，

(ii)用TCID50分析测量细胞上清液介质中感染性颗粒的产生，

(iii)检测细胞病变效应(CPE)，

(iv)用直接免疫荧光分析检测病毒抗原，和

(v)用下一代测序(NGS)方法测序完整的病毒基因组。

如下进一步挑战方法的稳健性、灵活性和多功能性。首先，发明人降低了组合用于转染的重叠片段的大小并增加了其数量。这在JEV I的情况中示出，其中当使用约2kb的多达6个重叠扩增子时，用ISA方法产生感染性病毒。其次，他们将ISA方法应用于属于不同科的具有正极性的单链RNA基因组的病毒：基孔肯雅病毒(CHIKV，包膜病毒，披膜病毒(Togaviridae)科)和柯萨奇病毒B3(CV-B3，非包膜病毒，小核糖核酸病毒(Picornaviridae)科)。再次，可以在转染以及在HEK-293细胞(CHIKV)或BGM细胞(CV-B3)中传代4次后分离感染性病毒(下表2)。此外，发明人用转染质粒携带的感染性基因组后获得的CV-B3作为对照，他们在感染性和序列数据上获得相似的结果(表2)。

表2：回收病毒的特征

该研究中产生的不同病毒的总结：具体的菌株名称，用于产生第一(I)、第二(II)和第三(III)片段的用作模板的初始材料来源(DNS，从头合成；I.C.，感染性克隆；或病毒RNA)，用于转染和传代的细胞系，实时PCR和TCID50分析的在第四次传代时细胞上清液中病毒RNA和感染性滴度含量的相对定量，细胞病变效应(CPE)的存在或不存在，以及通过直接免疫荧光分析(dIFA)的病毒抗原的研究。用NGS技术获得完整的病毒基因组序列。

dN和dS分别对应于每个非同义位点的非同义替换的数量和每个同义位点的同义替换的数量。

*转染6个重叠片段获得的结果。

直接转染CV-B3质粒携带的感染性克隆获得的结果。

N/A和AU分别是指不可获得和任意单位。

第三，发明人说明了ISA方法在几天内制备基因修饰的病毒的能力。这通过用基于PCR的对缺陷JEV III感染性克隆的一个片段中的移码突变(1915del)的校正和随后对应病毒的回收来示出(补充方法)。他们还能够通过交换基因型I和III JEV的第一个DNA片段(编码结构蛋白)来产生嵌合病毒。尽管在前两个片段的重叠区有11个错配，转染产生了基因型间JEV I/JEV III和JEV III/JEV I嵌合体。在第四次传代使用NGS建立的完整基因组序列分析表明，遗传漂变(序列改变的比率)是适度的(当考虑固定突变时，每个位点为1,45E-03至9,00E-05个替换)。基因组(具有热点和高度保守区两者)中大部分非同义突变、不同JEV菌株间共同突变的存在(7/85)和突变的非随机分布(频率大于10％)表明对细胞培养条件的适应。

突变率根据用于分离的细胞而不同，并且如预期的，来自低传代菌株的病毒高于来自适应培养的菌株的那些。总之，ISA方法是非常简单的方法，其在几天内加快产生感染性的基因修饰的RNA病毒，具有对病毒序列的完美控制，并且从各种初始来源(包括预先存在的感染性克隆、病毒RNA或从头合成的DNA基因组序列)开始。在之前没有被考虑的规模上，该技术未来具有用于制备设计大的RNA病毒反向基因组学实验的潜力。它也具有特别是调控从实验程序回收的病毒的特征的能力。此外，由于DNA亚基因组片段可通过PCR方便地获得，当从病毒RNA开始时，该方法具有保存病毒群的遗传多样性的潜力。也可以使用容易出错的PCR来产生人工病毒异质性，例如用于加快选择在各种实验选择条件下适应的病毒，且相反地，可以使用高保真聚合酶和克隆扩增模板来控制产生的病毒的克隆程度。

最后，本发明的方法通过室温下简单的非感染性的DNA亚基因组片段的单独运送，具有彻底改变科学研究所之间未来交换RNA病毒的安全与保障的潜力，然后接受的研究所可以组合并转染所述DNA亚基因组片段，确保感染性病毒菌株的快速、简单和安全的回收。

实施例2：用在单独和分开的质粒中的cDNA片段的ISA方法

发明人进一步在具体的实施方案中说明ISA方法，其中步骤c)是转染含有步骤b)获得的cDNA片段的质粒或载体的步骤，其中各cDNA片段是在单独和分开的质粒或载体中。

该实验用三个质粒进行，所述质粒含有与之前通过ISA方法在PCR扩增后用于回收感染性病毒的日本脑炎病毒基因组(基因型I，Laos菌株)相同的片段。

用限制性酶FseI通过消化将三个质粒线性化，并将其以等摩尔的量(最终1μg)直接转染入SW13细胞(不经过在先PCR扩增)。经过9天和1次传代后，从培养物成功回收病毒。

实施例3：ISA方法在体内的应用

用本发明的方法制备覆盖整个RNA病毒的基因组的重叠片段，其在5’和3’的侧翼分别为DNA依赖性RNA聚合酶的启动子和终止子/RNA聚腺苷酸信号。

将这些DNA片段直接接种入活的动物，并允许从一些动物样品中回收感染性病毒。此外，动物的临床监测(症状表现和明显的体重减轻)允许观察感染的典型体征。

a)实验1：蜱传播脑炎病毒(TBEV；黄病毒)

发明人使用了蜱传播脑炎病毒的野生型菌株(菌株Oshima 5.10(GenBank登录号AB062063))。他们将本发明的方法用于DNA重叠片段。

用三个DNA重叠片段接种5周大的C57B1/6J雌性鼠。

通过跟踪以下监测病毒感染的临床进程：

(i)疾病的临床表现(发抖、驼背、脏眼(dirty eye)、轻偏瘫或四肢轻瘫、半身不遂或四肢瘫痪)；和

(ii)完全如Fabritus L等，2015，Attenuation of Tick-Borne EncephalitisVirus Using Large-Scale Random Codon Re-encoding.PLoS Pathog 11(3)所述的小鼠的体重。

接种14天后，从处死的小鼠收集脑和脾。将脑和脾研磨并离心。用所得的上清液来评估感染性病毒的存在。

用分子学(实时PCR)和经典的细胞培养方法(分离感染性病毒)来评估感染性病毒的存在。

使用初始量为2-5μg的DNA和两种不同的接种途径(腹膜内注射和皮内注射)，从脑和脾中均检测到感染性病毒。也观察到疾病的临床表现(明显的体重减轻和症状)。

b)实验2：乳鼠的脑内接种

发明人使用了蜱传播脑炎病毒的野生型菌株(菌株Oshima 5.10(GenBank登录号AB062063))和日本脑炎病毒(JEV_CNS769_Laos_2009(GenBank登录号KC196115))。他们用本发明的方法制备DNA重叠片段。

将DNA重叠片段稀释于PBS或与转染剂混合使用。

通过脑内注射DNA重叠片段接种乳鼠OF1。通过根据疾病的临床表现(发抖、昏睡)来监测病毒感染的临床进程。接种6-12天后从处死的小鼠收集脑。将脑研磨并离心。用所得的上清液来评估感染性病毒的存在。

使用2μg的DNA，在添加或不添加转染剂的两种病毒(TBEV和JEV)的脑中均检测到感染性病毒。也观察到疾病的临床表现。

序列表

<110> Universite d'Aix-Marseille

<120> 用于快速制备感染性RNA病毒的方法

<130> BCT150167QT

<160> 62

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 781

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 1

gaataagggc gacacggaaa tgtcacccaa ctgatcttca gcatcttcaa tattggccat 60

tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 120

cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat 180

gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 240

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 300

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 360

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 420

atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 480

cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 540

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 600

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 660

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 720

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 780

g 781

<210> 2

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDR - SV40pA

<400> 2

ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacattccg aggggaccgt 60

cccctcggta atggcgaatg ggactcgcga cagacatgat aagatacatt gatgagtttg 120

gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt aagcgctggc 180

attgaccctg ag 192

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 3

Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys

1 5 10 15

Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr

20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 4

gaagaatgat tctgtaagtg tccag 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 5

cgttgccatg ccaatcttag cg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 6

ggtgcttgcg tccttccacc aa 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 7

caaatgagta tggaatgctg gaaaa 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 8

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 9

gcccaccgga aggagctgac 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 10

cagagagcaa atccctatga cga 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 11

cgtcaccatg ccagtcttag cg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 12

gcttggcaat ccagtcagtc ct 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 13

caaacgagta cggaatgcta gaaa 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 14

ctcatgtttg acagcttatc atcg 24

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 15

tcaatattgg ccattagcca tattat 26

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 16

tggattgaac actcctgtag acgc 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 17

tggttggagt tggaagcctc atc 23

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 R

<400> 18

gaccatgccg tggccggcc 19

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 F

<400> 19

tggacaagac caagaatgac attg 24

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

gttacaaata aagcaatagc atcaca 26

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cagggttatt gtctcatgag cgga 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gccacgccca ggaagagcat ga 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gggccctctg gaaatgggga ga 22

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

caacccaggc ttgtcaccat cttt 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gggtgaggtc gtggaccttg ga 22

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

cctaggaatt tcacaaataa agcatttt 28

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gcatggaagt gtcctttgag ttct 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

gacttgcaac gatgctcttt tgca 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gagagagcat cgtcacaatg cc 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gattccatcc agcaccgcac c 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gaataagggc gacacggaaa tgt 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tgaagacagc ttgtcctgca caa 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gatcatggct tggaggacca ttat 24

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

gctactgcat agagcgtcca tg 22

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tttaccaggt aaaaacagaa accac 25

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

catggaacca ttccctatgg act 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

actggattgt gaaccaagga gtg 23

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gaagaatgat tctgtaagtg tccag 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

cgttgccatg ccaatcttag cg 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

aatataaccc cgagcggcga tg 22

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

atgtcaccaa acagggtgcc caa 23

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ggtgcttgcg tccttccacc aa 22

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

caaatgagta tggaatgctg gaaaa 25

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcgccgtgct ccattgattc tg 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

ggctgtgggc acatttgtca cg 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ctgctcgggt gacctgtcct a 21

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

tgagatgttt ttcctattca gcaact 26

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

aacaatgtgt tgacgaacag agtta 25

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ctccctgctg gacttgatag ag 22

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

ctcagggtca atgccagcgc tt 22

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

cacccaactg atcttcagca tct 23

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

ccacacaaca tgcgtaccaa gca 23

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

caggcgctgg cgctccgaca 20

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

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<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 61

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<210> 62

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<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 62

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Claims

1.用于制备感染性RNA病毒的方法，包括以下步骤：

c)将所述cDNA片段转染入宿主细胞；

d)孵育步骤c)的宿主细胞；和

e)从所述孵育的宿主细胞回收感染性RNA病毒。

2.权利要求1所述的方法，其中所述病毒是单链正链RNA病毒，优选选自黄病毒、甲病毒和肠道病毒的病毒。

3.权利要求1或2所述的方法，其中

-所述黄病毒选自日本脑炎病毒(JEV)，优选基因型I菌株(JEV I)或基因型III菌株(JEV III)；西尼罗河病毒(WNV)，优选基因型2菌株；登革病毒(DENV)，优选血清型4菌株；黄热病病毒(YFV)，优选野生型菌株；和蜱传播脑炎病毒(TBEV)，优选远东亚型菌株；

–所述甲病毒优选基孔肯雅病毒；

–所述肠道病毒优选柯萨奇病毒,更优选柯萨奇B病毒。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中：

–所述在5’位的DNA依赖性RNA聚合酶的启动子是人巨细胞病毒启动子(pCMV)；和/或

–所述任选的终止子和RNA聚腺苷酸序列分别是丁型肝炎核酶和猿猴病毒40聚腺苷酸信号(HDR/SV40pA)。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤b)允许产生2-15个重叠cDNA片段，优选3个、4个、5个或6个重叠cDNA片段。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自SW13和BHK-21、HEK 293和Vero细胞系。

7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中：

–步骤c)是直接转染步骤b)获得的cDNA片段的步骤，和

–所述步骤c)在步骤b)之后直接进行。

8.权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤c)是转染含有步骤b)获得的cDNA片段的质粒或载体的步骤，其中各cDNA片段在单独且分开的质粒或载体中。

9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述方法在步骤b)之后且在步骤c)之前进一步包括纯化重叠的cDNA片段的步骤b’)，优选通过色谱柱。

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中步骤d)孵育持续3-9天。

11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中在步骤d)的孵育期间，步骤c)的转染的cDNA片段在宿主细胞中自发重组。

12.权利要求1-11所述的方法用于反向基因组学分析的用途。

13.权利要求1-11所述的方法用于安全运输所述感染性RNA病毒的用途。

14.用于在体内制备感染性RNA病毒的方法，包括以下步骤：

c’)将所述cDNA片段接种入动物模型；和

e’)从所述动物获得的生物样品中回收感染性RNA病毒。