KR100646074B1 - 카스파제-8 상호작용 단백질 - Google Patents

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Abstract

카스파제-8와 상호작용할 수 있는 단백질을 제공한다. 이와 같은 단백질을 생산 및 이용하는 방법도 제공한다.

Description

카스파제-8 상호작용 단백질{CASPASE-8 INTERACTING PROTEINS}
본 발명은 일반적으로 시스테인 프로테아제 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 카스파제-8(MACH)과 상호작용하고, CD95(Fas/Apo-1) 또는 CD120a(p55-TNF 수용체)에 의해 매개되는 세포 사멸(또는 아팝토시스)경로에서 이의 기능을 조절하는 단백질에 관한다.
특히, 본 발명은 카스파제-8/MACH와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 단백질에 관한다. 본 발명은 또한, 카스파제-8/MACH 상호작용 단백질의 제조 및 용도에 관한다.
종양 괴사 인자(TNF-알파)와 임파톡신(TNF-베타)(이하 TNF는 TNF-알파와 TNF-베타를 모두를 의미한다)은 단핵 식세포에 의해 주로 만들어지는 다기능 친-염증성 사이토킨으로, 세포에 많은 영향을 준다(Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; and Beutler and Cerami (1987)). TNF-알파와 TNF-베타는 특정 세포 표면 수용체에 결합하여 이런 효과를 나타낸다. 일부 효과는 유기체에 유익하다; 예를 들면, 이들은 종양 세포 또는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하고, 입상세포의 항균 활성을 증가시킨다. 이와 같은 방식으로, TNF는 종양 및 감염성 물질로부터 유기체를 방어하고, 손상으 로부터 회복할 수 있도록 한다. 따라서, TNF는 항-종양 물질로 이용할 수 있는데, 이때, 이것은 종양 세포 표면에 있는 이들 수용체에 결합하고, 따라서, 종양 세포를 죽음에 이르게 한다. TNF는 또한 항-감염성 물질로 이용될 수도 있다.
그러나, TNF-알파 및 TNF-베타는 유해한 효과를 갖는다. 몇 가지 질병에서, TNF-알파의 과도한 생산이 주요 병인 역할을 한다는 증거가 있다. 예를 들면, 맥관 구조에서 TNF-알파의 효과는 폐혈증 쇼크 증상의 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Tracey et al., 1986). 일부 질병에서, TNF는 지방세포의 활성을 억제하고, 식욕감퇴를 유발하여, 과도한 체중감소의 원인(악액질)이 되는데, 이로 인해 TNF-알파는 카테친(cachetin)이라고 하였다. 또한, 류머티스 질환에서는 조직 파괴를 조절물질로(Beutler and Cerami, 1987), 이식편-숙주 반응에서 관찰되는 손상의 주요 조절물질로(Piquet et al., 1987) 기술되었다. 또한, TNF는 염증 과정 및 많은 다른 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다.
독립적으로 발현되는 두 개의 수용체 p55(CD120a) 및 p75(CD120b) TNF-Rs(각각 특이적으로 TNF-알파 및 TNF-베타에 결합됨)는 상기에서 설명하는 TNF의 생물학적 효과를 개시하고 조절한다. 이들 두 개의 수용체는 구조적으로 다른 세포내 도메인을 가지고 있기 때문에 이들은 다른 시그널을 만든다고 한다(Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et al., 1990)). 그러나, 예를 들면, p55 및 p75 TNF-Rs의 세포내 시그날발생에 관계하는 다양한 단백질 및 다른 가능한 인자의 세포내 기작에 대해서는 아 직 밝혀지지 않았다. TNF(α또는 β)와 같은 리간드가 수용체에 결합한 후에 발생하는 세포내 시그널은 일련 반응이 시작되도록 하여 결국 TNF에 대해 세포의 관찰된 반응이 나타나게 하는 것이다.
현재까지 연구된 대부분 세포에서 상기에서 설명하는 TNF의 세포파괴 효과에 있어서, 이와 같은 효과는 주로 CD120a에 의해 촉진되었다. CD120a의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인)에 대한 항체 자체가 세포파괴 효과를 촉진하는데(EP 412486참고), 이는 항체에 의해 수용체 교차 연결의 효과와 관련이 있는 것으로 세포내 시그날발생 과정의 발달의 처음 단계로 보인다. 또한, 돌연변이 연구에 따르면(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993), CD120a의 생물학적 기능은 세포내 도메인의 보전성에 따라 달라지고, 따라서, TNF의 세포파괴 효과를 유도하는 세포내 시그널은 CD120a의 두 개 이상 세포내 도메인이 연합된 결과로 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNF(α및 β)은 동종삼량체로 발생되기 때문에, 수용체 분자에 결합하여, 교차 연결되는 방법(가령, 수용체 응집을 일으키는)으로 CD120a를 통하여 세포내 시그널을 유도하는 것으로 알려져 있다.
TNF/NGF 슈퍼패밀리 수용체의 또 다른 구성원은 FAS/APO1 수용체(CD95)로, 이는 FAS 항원으로 불리기도 하며, 다양한 조직에서 발현되는 세포 표면 단백질로써 TNF-R 및 NGF-R을 포함하는 다수의 세포-표면 수용체와 상동성을 공유한다. CD95는 아팝토시스 형태로 세포 죽음을 중개하고(Itoh et al., 1991), T 세포가 성숙되는 동안에 자가활성을 가지는 T 세포의 네거티브 선택물질로써 작용하는 것으로 보인다. CD95는 자체-항원을 인지하는 T 세포의 아팝토시스성 죽음을 중개한 다. CD95 유전자(lpr)에서 돌연변이는 쥐에서 임파증식 질환을 일으키는 것으로 알려져 있는데, 이 질환은 사람의 자가면역 질환인 전신 홍반성 낭창(SLE)(Watanabe-Fukunaga et al., 1992)과 유사하다. CD95에 대한 리간드는 킬러 T 세포(또는 세포독성 T 임파세포-CTLs)에 의해 운반되는 세포-표면 연합된 분자인 것으로 보이는데, CTLs는 CD95를 가지는 세포와 접촉하여, CD95를 가지는 세포의 아팝토시스성 세포 죽음을 유도할 수 있다. 또한, CD95에 특이적인 단클론항체를 준비하는데, 이런 단클론항체는 사람 CD95를 인코드하는 cDNA에 의해 형질전환된 생쥐 세포를 비롯하여, CD95를 보유한 세포에서 아팝토시스성 세포 죽음을 유도할 수 있다(Itoh et al., 1991).
임파세포의 일부 세포독성 효과는 광범위하게 생성되는 세포 표면 수용체 CD95(CD95)와 임파세포가 생산하는 리간드의 상호작용에 의해 중개되고, 이것은 세포 죽음을 촉진시키는 반면, T 임파세포이외의 다른 다양한 정상 세포가 이들의 표면에 CD95를 발현시키고, 이들 수용체의 자극으로 죽게된다는 것이 밝혀졌다. 특정 질환에서 이와 같은 치사 과정이 무절제하게 유도되어 세포 손상을 시키는 것으로 보이는데, 예를 들면, 급성 간염에서 간세포가 파괴되는 경우이다. 따라서, CD95의 세포 독성 활성을 억제하는 길을 찾는 것이 치료요법적으로 유익하다.
역으로, 특정 악성 종양 세포 및 HIV-감염된 세포는 이들의 표면에 CD95를 가지고 있다는 것을 알려져 있는데, CD95에 대한 항체 또는 CD95 리간드를 이용하면 이들 세포에서 CD95에 의해 중개되는 세포독성 효과를 자극할 수 있어, HIV-감염된 세포 또는 악성 종양 세포와 싸울 수 있는 수단을 제공한다(Itoh et al., 1991). 따라서, CD95의 세포독성 활성을 강화시키는 또 다른 방법을 찾는 것은 치료요법적으로 잠재력이 있다.
TNF (α또는 β) 및 CD95 리간드에 대한 세포 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것은 오랜 숙원 사업이었다. 예를 들면, 상기에서 설명하는 질병상태에서, TNF 또는 CD95가 과다 발현된 경우에, TNF- 또는 CD95 리간드에 의해 유도되는 세포파괴 효과를 저해하는 것이 바람직하고, 다른 상황 가령, 상처 치유 과정에서는 종양 세포 또는 HIV-감염된 세포에서 TNF 효과를 강화하고, CD95의 경우에는 CD95 중개된 효과를 강화시키는 것이 바람직하다.
출원인은 다수의 출원(EP 186833, EP 308378, EP 398327, EP 412486)에서, TNF와 이의 수용체의 결합을 저해하여 TNF의 유해한 효과를 조절하는 방법을 연구하였는데, 여기서, 세포 표면-결합 TNF-Rs와 TNF의 결합과 경쟁하기 위하여 가용성 TNF 수용체(수용체의 가용성 세포외 도메인이 필수적) 또는 항-TNF 항체를 이용하였다. 또한, TNF 수용체와 TNF의 결합이 TNF-유도된 세포효과에 필요하다는 것에 기초하여, 출원인은 TNF-Rs의 활성을 조절함으로써 TNF 효과를 조절하였다(EPO 568925).
가령, EPO 568925는 TNF-Rs에서 시그널 유도 또는 분할을 조절하는 방법에 관하는데, 여기서, 펩티드 또는 다른 분자는 수용체 자체 또는 주효체 단백질과 상호작용할 수 있는 다른 효과물질과 상호작용하여, TNF-Rs의 정상 기능을 조절한다. EPO 568925에서는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 세포내 도메인에 돌연변이를 가지는 다양한 CD120a 돌연변이를 작제하고, 이의 특징을 조사하였다. 이런 방식으 로, CD120a의 상기 도메인내 영역은 수용체의 기능, 다시 말하면, 리간드(TNF)의 결합, 연이은 시그널 유도, 세포내 시그널 전달, 최종적으로 세포에서 관찰되는 TNF 효과의 발생에 필수적이다. 또한, TNF-R의 상기 다양한 도메인에 결합할 수 있는 단백질, 펩티드 또는 다른 인자를 분리 및 확인하는 여러 가지 방법에 대해 설명하는데, 여기서, 단백질, 펩티드, 다른 인자는 TNF-R의 활성 조절 또는 조정에 관계한다. 이와 같은 단백질 및 펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 분리 및 클로닝 방법; 이들 단백질 및 펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터의 작제 방법; CD120a 또는 CD120a의 다양한 부분에 결합하는 상기 단백질 및 펩티드와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법은 EPO 568925에 설명되어 있다. 그러나, EPO 568925에서는 TNF-Rs(예, CD95)의 세포내 도메인(가령 CD120a)에 결합할 수 있는 실제 단백질 및 펩티드를 명시하지 않았고, 또한 TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 이런 단백질 및 펩티드를 분리 및 확인하기 위해 곰팡이 이중-하이브리드 방법에 대해서도 설명하지 않았다. 유사하게, EPO 568925에서, CD95의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 대해서 설명된바 없다.
따라서, TNF 또는 CD95 리간드의 효과를 저해하고자 할 경우에, 세포 표면에서 TNF-Rs 또는 CD95의 양 또는 활성을 감소시키는 것이 바람직한 반면, TNF 또는 CD95의 효과를 강화하고자 할 경우에는 TNF-Rs 또는 CD95의 양 또는활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서, CD120a 및 CD120b의 프로모터를 서열화하고, 분석하여, 다양한 전사 조절 인자에 특이적인 다수의 주요 서열 모티프를 발견하고, 이와 같이 TNF-Rs의 발현은 프로모터 수준, 다시 말하면, 수용체 수를 감소시 키기 위한 프로모터로부터 전사의 억제 및 수용체 수를 증가시키기 위한 프로모터로부터 전사의 강화를 통해 조절할 수 있다(EP 606869 및 WO 9531206).
종양 괴사 인자(TNF) 수용체 및 구조적으로 관련된 수용체 CD95가 백혈구 세포-생산 리간드에 의한 자극직후, 세포를 죽음에 이르게 하는 파괴 활성을 촉진하기 하지만, 이런 자극의 기작에 대해서는 알려지지 않고 있다. 돌연변이 연구에 따르면, 세포 독성을 위한 CD95 및 CD120a 시그널발생에 세포내 도메인내에 별개의 부분이 관여한다는 것을 알수 있다(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). 이들 부분('죽음 도메인')은 유사한 서열을 가진다. CD95 및 CD120a의 '죽음 도메인'은 자체-연합하는 경향이 있다. 이런 자체-연합이 실제 수용체 응집을 촉진시키는데, 응집은 시그널 개시에 필수적이며(Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), 높은 수준의 수용체 발현에서, 리간드-독립된 시그널발생을 야기할 수 있다(Boldin et al., 1995).
임파세포의 일부 세포독성 효과는 세포 표면 수용체인 CD95와 임파세포-생산 리간드의 상호작용에 의해 중개되는데, 상기 수용체는 세포 사멸을 촉진할 수 있다 (Nagata and Golstein, 1995); 단핵 식세포에 의한 세포 죽음은 리간드-수용체 결합, TNF 및 이의 수용체 CD120a와 관련되는데, CD120a는 CD95 및 이의 리간드와 구조적으로 관련이 있다(Vandenabeele et al., 1995). 다른 수용체-유도 효과와 같이, TNF 수용체 및 CD95에 의한 세포 사멸 유도는 일련의 단백질-단백질 상호작용을 통하여 일어나고, 이것은 리간드-수용체 결합부터 효소 주효체 기능의 활성화까지 야기하는데, 이런 경우에 대한 조사에서, 세포 죽음에 대한 시그널을 개시하는 비-효소 단백질-단백질 상호반응: 수용체와 삼량체 TNF 또는 CD95 리간드 분자의 결합, 자체 연합하는 죽음-도메인 모티프의 성질(Boldin et al., 1995a)에 의해 증폭된 세포내 도메인의 결과적인 상호작용(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993), 2개의 세포질 단백질과 수용체의 세포내 도메인-MORT-1(또는 FADD)과 CD95(Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) 및 TRADD와 CD120a(Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996)의 결합 유도가 명료하게 밝혀졌다. 독립적인 상동성 영역의 이형-결합을 통해 수용체에 유도되는 세포 사멸에 관여하고, 독립적으로 세포 죽음을 촉진할 수 있는 '죽음-도메인' 부분에서, CD95와 CD120a의 세포내 도메인과 결합하는 세 가지 단백질은 곰팡이 이중-하이브리드 선별 처리에 의해 동정되었다. 이들 단백질 중에 하나인 MORT-1(Boldin et al. 1995b)은, CD95에 특이적으로 결합하는 FADD(Chinnaiyan et al., 1995)로도 알려져 있다. 두 번째 것인 TRADD(Hsu et al., 1995, 1996)는 Cd120a와 결합하고, 세 번째 것인 RIP(Stanger et al., 1995)는 CD95와 CD120a와 결합한다. CD95 및 CD120a와의 결합이외에도, 이들 단백질은 서로 결합하여, CD95 및 CD120a사이에 기능적으로 "교차-신호전달"을 제공한다. 이들 결합은 수용체 및 결합 단백질에 공통인 보존 서열 모티프 "죽음 도메인 모듈"을 통하여 발생된다. 또한, 곰팡이 이중-하이브리드 테스트에서, MORT-1은 포유류 세포에서 자발적으로 CD95에 결합하긴 하지만, 이런 결합은 수용체 자극이후에만 발생되는데, 이것은 MORT-1이 CD95 시그널발생의 초기 단계에 관여한다는 것을 암시한다. MORT-1에는 효소 활성 특징이 있는 임의 서열 모티프가 없고, 따라 서, 세포 죽음을 촉진시키는 이들의 능력은 MORT-1 자체의 고유 활성이 아닌, 오히려, MORT-1과 결합하는 일부 다른 단백질의 활성화에 관여하여, 시그날발생 캐스케이드의 하류에 작용하는 것으로 보인다. 분자의 N-말단이 없는 MORT-1 변이체를 세포내에 발현시키면, CD95 또는 CD120a에 의한 세포 독성 유도가 차단되는 것을 볼 수 있는데(Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), 이것은 N-말단 영역이 단백질-단백질 상호작용을 통하여 양 수용체의 세포파괴 효과에 대한 시그널을 전달하는 것을 암시한다.
최근 연구에 따르면, 생리학적으로 다양한 세포 죽음 과정의 개시에서 일군의 세포질 티올 프로테아제가 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 프로테아제 CED3 및 포유류 인터루킨-1β전환 효소(ICE)와 구조적으로 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Kumar, 1995 and Henkart, 1996). 또한, 이들 페밀리에 속하는 프로테아제가 CD95 및 TNF-Rs에 의해 유도되는 세포-독성에 참여한다는 것으로 보인다. 프로테아제의 특정 펩티드 저해물질 및 이들의 기능을 차단하는 2개 바이러스-인코드된 단백질 우두 단백질 crmA 및 바쿨로바이러스 p35 단백질은 이런 세포 독성으로부터 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다(Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). CED3/ICE 페밀리의 프로테아제에 의해 매개되는 특정 세포 단백질의 신속한 절단은 CD95 또는 TNF-Rs 자극직후의 세포에서 나타날 수 있다.
MACH(현재, CASP-8)로 알려진 프로테아제 및 이의 다양한 동소체는 MORT-1 결합 단백질이고, MORT-1의 활성을 조절하고, 따라서, MORT-1과는 별개로, 최근에 분리되고, 클론되고, 특성화되었는데, 이의 용도는 현재 공동 출원중인 IL 114615, 114986, 115319, 116588, 117932, PCT출원 PCT/US96/10521, 발명자의 최근 간행물(Boldin et al., 1996)에 제시되어 있다. Mch4(또는 CASP-10)라고 칭하는 또 다른 프로테아제 및 이의 다양한 동소체(저해제 포함) 또한, 본 발명자(비공개) 및 다른 이들(Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996)에 의해 분리되고, 특성화되었다. 카스파제-10은 MORT-1의 활성을 조절하고, 따라서, CD95와 CD120a의 활성을 또한 조절하는 MORT-1 결합 단백질로, MORT-1와는 별개로 작용한다. 따라서, 카스파제-10의 모든 특징, 용도는 상기 간행물에 상세하게 기술되어 있고, 상기 간행물은 여기에 참고문헌으로 한다.
유사한 프로도메인을 보유한 카스파제, 카스파제-8, 카스파제-10(Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997)은 이런 프로도메인을 통하여 MORT-1과 상호작용하는데, 이런 상호작용은 카스파제-8 및 카스파제-10에 중복하여 존재하고, MORT-1의 N-말단에 존재하는 "죽음 도메인 모티프" 또는 "죽음 주효체 도메인", DED를 통하여 이루어진다(Boldin et al., 1995b; Chinnalyan et al., 1995).
이런 프로테아제는 카스파제(시스테인 아스파르트산염-특이적 단백질분해효소)로 알려져 있는데, 몇 가지 공통된 특징을 공유하는 시스테인 프로테아제 페밀리이다. 이런 카스파제 대부분이 예정된 세포 사멸 또는 아팝토시스의 개시와 실행에 참여하는 것으로 밝혀진 반면, 나머지 카스파제는 친염증성 사이토킨의 생산 에 관여하는 것으로 보인다(Nicholson DW et al. 1997, Salvesen GS et al. 1997, Cohen GM 1997). 이들은 촉매불활성 전구물질로 합성되고, 일반적으로 도메인사이 링크에 존재하는 아스파르트산염 잔기뒤에서 분해되어 활성화된다. 카스파제의 분해위치는 테트라펩티드 서열(X-X-X-D)로 정의하고, 분해는 항상 아스파르트산의 하류에서 일어난다(Fernandes-Alnemri T et al. 1996, Srinivasula SM et al. 1996).
예정된 세포 사멸과정의 활성은 일반적으로 특이적이고, 상류 카스파제("개시" 카스파제)에 의한 하류 카스파제의 순차적인 처리("실행")를 포함한다. 2종류 카스파제의 기능특징은 이들의 구조에 의해 반영된다. 실제로, "개시 카스파제"는 "실행"카스파제에 비하여 좀더 긴 프로도메인을 보유한다(Salvesen GS et al. 1997, Cohen GM 1997). 긴 프로도메인은 TNF 수용체 페밀리의 사멸 수용체를 자극하여 개시 또는 "정상(頂上)"카스파제가 활성화되도록 한다. 리간드-유도된 죽음 수용체 삼합체화 직후, 개시 카스파제는 N-말단 프로도메인을 통하여 특정 어댑터 분자와 상호작용하고, 사멸 유도 신호 복합체를 구성한다(Cohen GM 1997, Kischkel FC et al., 1995). 가령, 2개의 사멸 주효체 도메인(DED) 또는 FADD 도메인을 보유한 카스파제-8/MACH와 카스파제-10은 어댑터 분자 FADD/MORT-1에 의해 수용체 복합체로 이동하고, 반면, 카스파제-2는 CRADD/RAIDD와 RIP에 의해 이동된다(Nagata S et al. 1997, MacFarlane M et al. 1997, Ahmad M et al. 1997, Duan H et al. 1997). 활성화된 수용체 복합체의 삼합체 성질로 인해, 2개이상의 카스파제 분자가 각각에 근접하여 위치하게 되고, 따라서, 자가활성과정에 의해 이들이 활성화되게 된다(Yang et al. 1998, Muzio et al. 1998)
카스파제는 3개의 주요 소단위, 즉, N-말단 프로도메인과 2개의 소단위로 이루어지는 전효소로 합성되는데, 이들은 주로 하나의 링크 펩티드에 의해 분리된다. 2개의 소단위는 활성 효소위치를 갖는 "긴" 또는 소단위 1 및 "짧은" 또는 소단위 2로 칭한다. 효소의 완전 활성을 위해, 프로도메인과 2개의 소도메인은 분해된다. 2개의 분해된 소단위는 이형이량체를 구성하는데, 여기서, 긴 도메인은 카스파제 전구물질의 N-말단에서, 짧은 소단위는 이의 C-말단에서 유래한다. 카스파제-3의 3차원 추정 구조에 기초하여, 정확하게 접힌 활성 효소를 만들려면, 짧은 소도메인의 N-말단 및 긴 도메인의 C-말단은 자유로워지고, 짧은 소단위의 C-말단이 긴 소단위의 N-말단에 근접하여 위치해야 한다(Rotonda et al 1996, Mit시 et al. 1997, Srinivasula et al. 1998).
N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소는 글루코사민의 세포내 기작에 관여하는 것으로 알려진 세포내 효소다. N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 함유한 게놈 DNA 단편은 키틴 분해효소-생산 박테리아(Vibrio cholerae)로부터 클론되었다(Yamano et al., Biosci Biotechnol Biochem. 61, p. 1349-53, 1997).
대장균(E. coli) N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 인코드한 nagA 유전자 또한 공지되어 있다[Peri et al., January 1990, 68(1), pp. 123-137]. 하지만, 클론되고 서열분석된 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소는 보고되지 않고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체를 제공하는데, 이들은 카스파제-8의 소단위 1 및/또는 소단위 2와 상호작용할 수 있다.
본 발명은 또한, 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능 유사체, 돌연변이 또는 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명은 도 2, 3, 5B 또는 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 아미노산 94 내지 145를 배출하는 Tip-60 단백질의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.
또한, 클론 P27, P70, P79, L7, L12, M26, B4, B17, J40, B13, B37, B33 또는 P74, 그리고 아래에서 제시한 바와 같은 이의 조각 변이체 P16과 P43에 인코드된 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 단백질을 제공하는데, 이 단백질은 카스파제-8에 의해 in vitro 또는 in vivo에서 분해된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단백질을 코딩한 분리된 DNA 서열을 제공한다. 도2와 도3의 DNA 서열은 이런 범주에 포함된다. 또한, 적당히 엄격한 조건하에서 상기 DNA 서열과 하이브리드를 형성할 수 있는 분리된 DNA 서열이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 DNA 서열로 이루어진 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터를 보유한 진핵 또는 원핵 숙주세포를 제공 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 단백질의 생산이 가능한 조건하에서 본 발명의 숙주세포를 생장시키고, 상기 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체를 얻기 위하여 필요한 번역-후 수식(modification)을 진행시키고, 상기 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체를 분리하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한, 세포가 원핵세포일 때, 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포가 진핵세포일 때, 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포가 포유동물, 곤충 또는 곰팡이 세포일 때, 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포가 HeLa 또는 293 T HEK 세포일 때, 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 사람 CMV 프로모터를 프로모터로 사용할 때, 상기 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명 단백질의 연속된 적어도 4개의 아미노산으로 이루어진 카스파제-8 상호작용 펩티드를 제공한다.
상기 펩티드의 유도체는 본 발명의 범주에 포함된다. 상기 펩티드의 유도체가 또한 본 발명의 범주에 포함되는데, 상기 유도체는 상기 카스파제-8과 접촉한 직후, 카스파제-8과 공유결합을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 리보자임을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA 서열에 상응하는 서열의 적어도 9개의 뉴클레오티드로 이루어진 앤티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명 단백질의 에피토프로 향하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 카스파제-8 상호작용 단백질의 검출을 위한 면역분석법을 제공하는데, 상기 면역분석법은 본 발명의 항체로 이루어진다.
본 발명은 또한, 카스파제-8의 검출을 위한 면역분석법을 제공하는데, 상기 면역분석법은 본 발명의 펩티드로 이루어진다.
본 발명은 또한, 카스파제-8의 검출을 위한 면역분석법을 제공하는데, 상기 면역분석법은 본 발명의 단백질로 이루어진다.
본 발명은 또한, 카스파제-8 상호작용 단백질을 확인하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 이루어진다:
a) DNA 서열 모티프로 이루어진 프로모터에 연결된 리포터 유전자를 보유한 곰팡이 세포를 제공하고;
b) 상기 곰팡이 세포에서, 상기 카스파제-8의 p20 소단위를 발현시키고;
c) 상기 곰팡이 세포에서, DNA 결합 도메인 및 상기 카스파제-8의 p10과/또는 p20 소단위의 융합단백질을 발현시키고, 여기서, 상기 DNA 결합 도메인은 상기 DNA 서열 모티프와 결합할 수 있고;
d) 선택적으로, 상기 곰팡이 세포에서, 상기 카스파제-8의 융합되지 않은 p10 또는 p20 소단위를 발현하고;
e) 발현벡터로 이루어진 라이버러리로 상기 곰팡이 세포의 배양물을 형질전환시켜, cDNA 라이버러리와 전사 활성체로 이루어진 융합 단백질의 발현을 유도하고;
f) 형질전환된 곰팡이 세포의 배양물을 선별하고, 여기서 리포터 유전자는 활성화되고;
g) f) 단계에서 얻은 효모세포를 분리하고, 추가로 카스파제-8 상호작용 단백질을 분리하는데, 상기 단백질은 먹이(prey) 벡터에서 발현된다.
본 발명은 또한, 카스파제-8 활성의 조절에 사용하는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체, 상기 리보자임, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, TNF-수용체 또는 Fas-매개된 효과의 조절에 사용하는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체, 상기 리보자임, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 아팝토시스의 조절에 사용하는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체, 상기 리보자임, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 약물로서 사용하는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소 체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체, 상기 리보자임, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 희돌기글리오패티에 의한 다중 경화증, 자가면역 포도막 망막염, 당뇨병, 루프스, 자가면역 심근염 I, HCV 만성 간염, 만성 위염(예, A 형 위염), 혼성연결 조직 질환(MCTD), 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료약물로 사용하는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이 또는 유도체, 상기 리보자임, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 카스파제-8 상호작용 유전자의 프로모터 영역에서, 퓨린-풍부 서열과 결합할 수 있는 삼중항-형성 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이런 삼중항-형성 올리고뉴클레오티드는 화학적 변형, 예를 들면, 티민 잔기 대신, N,N-디에틸-에틸렌디아민, 우리딘, 벤조[g]-퀴나졸린-2,4-디온-(1H, 3H)-디온 또는 벤조[f]퀴나졸린-2,4-디온-(1H, 3H)-디온 잔기로 변형된 뉴클레오시드간 인산염 결합을 보유한다. 삼중항-형성 올리고뉴클레오티드는 추가로 DNA에 친화성을 갖는 화학물질과 공유결합하는데, 가급적 아크리딘과 프소랄렌 같은 작용제가 DNA사이에 끼여든다.
본 발명의 단백질과 카스파제-8의 상호작용의 측면에서, 본 명세서상의 "끼여듦"에는 결합과 같은 직접적인 상호작용형태, 분리, 어댑터 단백질을 통한 간접적인 상호작용이 포함된다. 이런 상호작용은 선택적으로, 카스파제-8 매개의 신호를 조절한다.
카스파제-8 상호작용 단백질의 결합 측면에서, 본 출원문상의 "결합"은 카스파제-8 상호작용 단백질과 카스파제-8의 물리적 결합을 의미한다. 이런 물리적 결합은 면역분석(예, ELISA 또는 RIA 분석), 이중-하이브리드 실험, 면역침강분석 또는 크기 분리-기초 분석(예, 카스파제-8, 이의 소단위, 본 발명 단백질의 혼합물의 비-변성 아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 크기 배출 겔 크로마토그래피)에서 측정한다. 이중-하이브리드 실험을 이용하는 경우, 카스파제-8 또는 이의 소단위는 DNA 활성화 도메인 융합체로 발현되고, 카스파제-8 상호작용 단백질은 DNA 결합 도메인 융합체등으로 발현된다.
"이중-하이브리드 실험"이란 이중-하이브리드 분석에 관하는데, 여기서 단백질-단백질 상호작용은 제 1 단백질과 DNA 결합 도메인의 융합체를 코딩한 제 1 발현벡터 및 제 2 단백질과 DNA 활성화 도메인의 융합체를 코딩한 제 2 발현벡터를 곰팡이 세포로 도입하여 측정할 수 있다. 곰팡이 세포는 프로모터가 유도하는 하나이상의 리포터 유전자를 보유해야 하는데, 상기 프로모터는 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 DNA 서열 모티프를 보유한다. 일반적으로, 2개의 리포터 유전자, 예를 들면, 히스티딘 합성효소와 베타-갈락토시다제를 사용한다. 이를 이용하면, 돌연변이에 의해 야기된 가양성을 피할 수 있다. 본 출원인은 이런 기술을 변형하고, 개량하여, TNF-R과 Fas 신호를 조절하는 단백질의 선별, 분리, 실험에 이용하였다(WO 97/03998 및 이의 참고문헌). 이중-하이브리드 실험은 양 융합 단백질의 세포핵으로의 국소화에 의존한다.
이 글에서 "이중 하이브리드 실험"은 추가로, 변형된 이중-하이브리드 기술 을 포함하는데, 여기서, 세포 생장신호 단백질, 예를 들면, ras와 sos를 사용한다(Broder et al., CurrentBiol 1998, 8, p. 1121-4, Aronheim et al., Nucleic Acids Res 1997 25, p. 3373-4). 이들 단백질이 기능할려면, 세포막에 재국소화되어야 한다. 이것은 제 1 단백질과의 융합체로 세포 생장신호 단백질을 발현하고, 제 2 단백질과의 융합체로 세포막 국소화 신호(예, 미리스틸레이션(myristilation))를 발현하여 달성한다. 제 1 과 제 2 단백질사이의 상호작용은 세포 생장신호 단백질을 세포막에 재-국소화시키고, 따라서, 세포 생장을 촉진한다. 이후, 다음 연구를 위해 급속하게 생장하는 세포를 선별한다. 이 시스템은 전술한 이중-하이브리드 시스템과 상이한데, 그 이유는 이 시스템이 양 하이브리드의 세포핵으로의 국소화에 의존하지 않기 때문이다.
"미끼"는 전술한 이중-하이브리드 실험에서 단백질을 의미하는데, 상기 단백질은 DNA 결합 도메인과 융합된 단백질로 발현된다.
"먹이"는 전술한 이중-하이브리드 실험에서, DNA 활성화 도메인과 융합체로 발현되는 단백질을 의미한다.
도1은 실시예 1B에서 설명한 이중-하이브리드 선별에서, 미끼로 사용한 카스파제-8의 단일사슬 구조체의 개요도를 보여준다.
도2는 cDNA 클론에서 얻은 것과 동일한 카스파제-8 상호작용 단백질을 인코드한 클론 32의 예비 부분 뉴클레오티드(SEQ ID NO:1)와 추론한 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)이다.
도3은 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소의 사람 뉴클레오티드 추정 전장 서열(SEQ ID NO:3)과 추론한 아미노산 서열(SEQ ID NO:4)을 보여주는데, 상기 서열은 J2의 5'말단, EST 클론 AA460869, 엑손 트랩 클론 L48741로 이루어진다.
도4A는 p55 TNF 수용체 단독, p55 TNFR 수용체 + p35(카스파제의 바쿨로바이러스 저해물질)(p55+p35), p55TNF + 클론 J2(p55+J2), 또는 p55 TNF + 도3의 346번 위치에서 Asp →Glu 치환을 보유한 J2의 비 분리 돌연변이(J*)(p55+J2*)로 HEK-293T 세포를 트랜스펙션시킨후, 아팝토시스 세포의 퍼센트로 표현한 클론 J2의 기능활성을 보여준다. 이 변이체는 in vitro 또는 in vivo에서 분해되지 않는다.
도4B는 아팝토시스 HeLa 세포 단독, 또는 TNF와 사이클로헥사미드를 처리한 p35, J2 또는 J2*로 트랜스펙션시킨후 퍼센트를 보여준다.
도5A는 클론 P74의 5'말단의 1725개 코딩염기쌍을 보여준다(SEQ ID NO:5).
도5B는 도5A의 클론 P74의 서열로부터 추론한 574개 아미노산 서열을 보여준다(SEQ ID NO:6).
도6은 PAC 클론(수탁번호 RPCI5-1057I20)의 추론한 아미노산 서열에서 유래한 개방해독틀의 1428개 아미노산(SEQ ID NO:7)을 보여준다.
도7은 PAC 클론(수탁번호 RPCI5-1057I20)의 추론한 아미노산 서열에서 유래한 개방해독틀의 1428개 아미노산과 비교하여, p74 클론의 추론한 아미노산 서열에 서 유래한 개방해독틀의 574개 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도8은 히스톤 탈아세틸화효소 A의 서열(SEQ ID NO:9)(하부 서열, Genebank 수탁번호 NP-006028.1) 및 PAC 클론(RPCI5-1057I20)의 추론한 아미노산 서열(상부 서열)(SEQ ID NO:8)에서 유래한 개방해독틀의 배열을 보여준다.
도9A는 cDNA 클론 J2, P16, P43, P70,P74 또는 P79에 의해 인코드된 단백질 및 Bid 단백질의 자가방사사진을 보여주는데, 상기 클론은 35S 메티오닌의 존재하에, SDS PAGE 겔상에서 분리된 망상적혈구 용해질에 생성된다.
도9B는 도9A에서와 같이 만들어진 cDNA 클론 J2, P16, P43, P70,P74 또는 P79에 의해 인코드된 단백질 및 Bid 단백질의 자가방사사진을 보여주는데, 2개의 소단위로 이루어진 융합단백질로 박테리아에서 발현되고, GST와 융합하는 카스파제-8과 상기 클론의 결합을 분석하였다. 분자량 마크의 위치는 겔의 왼쪽에 표시한다.
도10은 부분 P43 cDNA에 의해 인코드된 단백질의 카스파제-8, 카스파제-10, 카스파제-3, 카스파제-9, 또는 변형된 카스파제 3, 카스파제-9 또는 카스파제-10에 의한 분해결과를 보여준다. 대장균(E. Coli)에서 발현된 재조합 카스파제의 전체 박테리아 용해질의 부피는 상대적인 단위(RU)로 표시한다. 분자량 마크의 위치는 겔의 왼쪽에 나타낸다. 관심있는 단백질은 별표로 표시한다: 전체 머리화살표는 전체 크기 P43을 가리키고, 열린 머리화살표는 분해산물을 가리킨다.
도11은 클론 J2, P16, P27, P43, P79, P74 또는 P70의 cDNA 삽입체 유무하 에, p55 TNF 수용체와 녹색 형광 단백질(PC)로 HEK-293T를 동시 트랜스펙션시킨후, 아팝토시스가 일어나고 있는 세포의 퍼센트로 단백질의 기능활성을 표현하였는데, 여기서, 상기 단백질은 이중 하이브리드 선별로 확인한 cDNA 클론에 의해 인코드된다.
도12는 p55 TNF 수용체와 녹색 형광 단백질(PC)로 동시 트랜스펙션시킨 HEK-293T에서 Tip60의 야생형과 비분리 변이체의 세포사멸 억제활성 및 N-말단의 첫 32개 아미노산이 결핍된 Δ32-Tip60의 효과를 보여준다. 컨트롤 세포는 pCGN 벡터만으로 트랜스펙션시켰다.
분자생물학의 기존의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에, 여기에 자세히 설명하지 않는다. 이런 방법에는 특정부위-돌연변이 유발, PCR 클로닝, 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA 프로브를 이용한 파아지 라이버러리 선별, 재조합 단백질의 분석, 박테리아와 곰팡이 세포의 형질전환, 포유동물의 트랜스펙션등이 있다. 이런 방법을 설명하는 교재는 다음과 같다: Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory; ISBN: 0879693096, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, by F.M. Ausubel, ISBN: 047150338X, 1988, and Short Protocols in Molecular Biology, by F. M. Ausubel et al. (eds.) 3rd ed. John Wiley & Sons; ISBN: 0471137812, 1995. 이들은 여기에 참고문헌으로 한다.
이중-하이브리드 선별법을 이용하여, 카스파제-8 상호작용 단백질과 잠재적 기질을 확인하기 위해서, 이중 하이브리드 또는 삼중-하이브리드 시스템을 사용한다.
이중-하이브리드 시스템은 Fields와 Song(Nature 340, p. 245, 1989)이 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용한다. 가급적, 매치메이크 이중-하이브리드 시스템의 성분으로(#PT1265-1), Clontech (Palo Alto, USA)에서 얻은 개개 벡터, 곰팡이 균주, 라이버러리를 사용한다.
본 발명의 방법에 사용한 것과 같은 곰팡이 이중-하이브리드의 적절한 구체예는 Boldin et al., Cell. 85, p. 803-15, 1996에서 제시한다. 곰팡이 이중-하이브리드 시스템은 추가로, US 특허 5,580,736, Brent et al에서 제시한다. 이들 간행물은 여기에 참고문헌으로 한다.
삼중-하이브리드 시스템은 Tirode et al., J. Biol. Chem. 272, p. 22995-9, 1997에서 설명한 대로 사용한다. 본 발명에 따른 카스파제-8 상호작용 단백질을 검출하기 위하여, 카스파제-8의 2개의 소단위는 독립적으로 발현되어야 한다. 이런 목적을 위해, 2개의 카스파제-8 소단위는 가급적, 상이한 프로모터의 조절하에 개별적으로 발현시킨다. 적절한 구체예에서, 카스파제-8 p10 소단위(세린 375번 내지 아스파르트산 479번)는 곰팡이에서 작동하는 약한 프로모터의 조절하에, DNA 결합 도메인을 골격으로 발현된다. 가급적, 약한 프로모터는 곰팡이 ADH 프로모터이고, DNA 결합 단백질은 곰팡이 전사 활성체 Gal-4 또는 박테리아 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인이다. ADH 프로모터와 Gal4 DNA 결합 도메인은 pGBD로 존재하며, Clontech, Palo alto, USA에서 구매할 수 있다. 하지만, 당업자에게, 곰팡이 세포 에서 효과적인 다른 프로모터를 사용할 수 있다는 것은 자명하다. 동일한 이유로, 전사 활성체 기능을 갖지 않는 다른 DNA 결합 도메인을 사용할 수 있다.
긴 활성 카스파제-8 p20 소단위(세린 217번 내지 아스파르트산 374번)는 곰팡이 세포에서, 유도성 프로모터의 조절하에 비융합된 단백질로 발현된다. 가급적, 상기 Tirode et al에서 설명한 바와 같이 Met25 메티오닌 억제 프로모터를 사용한다. 유도성 프로모터를 이용하면, 면역침강과 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 p10-p20 복합체를 간단하게 검출할 수 있다. 이런 유도성 프로모터는 곰팡이 세포에 독성을 나타내는 단백질이 곰팡이내에서 발현되도록 한다는 점에서 또 다른 이점을 갖는데, 그 이유는 강력한 독성 단백질이 발현되는 기간을 제한할 가능성이 있기 때문이다.
본 발명의 방법으로 선별되는 단백질은 가급적, cDNA 라이버러리 형태로 제공된다. 하지만, 게놈 라이버러리 또는 조합형 라이버러리를 사용할 수도 있다. 라이버러리는 곰팡이에서 작동하는 전사 활성 도메인의 C-말단에서 클론한다. 가급적, 곰팡이 Gal-4 단백질의 전사활성 도메인을 사용하지만, 다수의 다른 전사 활성체를 사용할 수 있다. 가급적, Clontech에서 구입할 수 있는 pGAD GH 벡터를 라이버러리 클로닝에 사용한다.
선별에 사용한 곰팡이 균주는 프로모터의 조절하에 히스티딘 합성효소와 같은 선택마크를 보유해야 하는데, 상기 프로모터는 전술한 DNA 결합 도메인이 특이적으로 결합하는 DNA 서열로 이루어진다. 가급적, 곰팡이 세포는 또한, 프로모터의 조절하에 리포터 유전자를 보유하는데, 상기 리포터 유전자는 전술한 DNA 결합 도메인이 특이적으로 결합하는 DNA 서열로 이루어진다. Clontech에서 입수한 효모 균주 HF7c는 Gal04 결합 도메인 히스티딘으로 선별하는 경우에 사용한다; 균주 L40은 lexA가 DNA 결합 도메인인 경우, 사용한다. 형질전환후, 곰팡이 세포는 특정 아미노산이 결핍된 활성 배지에 선택적인 조건하에 두는데, 이는 도입된 플라스미드의 안정에 필요하다.
배지는 전술한 선별 마크에 대한 유전자가 활성화되는 곰팡이 세포에 대하여 선택적이다. 가급적, 선별 마크는 히스티딘 합성효소 유전자가 된다. 이런 유전자를 발현하는 곰팡이 세포는 히스티딘이 결핍된 배지에서 배양하여 선별한다. 이런 시스템의 장점은 생장배지에 히스티딘 합성효소 억제물질 3-아미노트리졸을 도입할 수 있다는 점이다. 따라서, 소량의 히스티딘 합성효소가 발현되는 곰팡이 세포는 전술한 DNA 결합도메인이 특이적으로 결합하는 서열을 보유한 프로모터를 결핍시켜 생장을 억제할 수 있다. 일부 클론에서, 카스파제-8 p10과/또는 p20 소단위 및 상기 클론의 약한 비-특이적 상호작용은 상기 프로모터의 의사활성을 야기한다. 따라서, 상호작용 클론의 선별에 사용하는 배지에서 상기 억제물질의 농도를 상승시킴으로써, 특정한 최소 강도로 상호작용하는 클론만을 선별할 수 있다. 3-아미노트리졸의 농도는 가급적 7.5mM가 된다.
히스티딘이 결핍된 배지에서 생장하는 능력으로 확인된 클론은 리포터 유전자 활성을 정량하여 추가로 분석한다. 가급적, lacZ을 리포터 유전자로 사용한다. lacZ 활성의 정량은 가급적, 액체 배지에서 실시한다(Boldin et al., J. Biol. Chem. 270, 7795-8, 1995).
전술한 선별 방법은 이중-하이브리드 실험을 유사하게 이용하여 실시할 수 있다. 카스파제-8의 2개의 소단위가 단일 펩티드 사슬로 발현된다는 점은 상이한데, 상기 펩티드 사슬은 전술한 DNA 결합 도메인과 융합된 단백질이다. p20 소단위는 후술한 바와 같이, 활성 위치(시스테인 360-세린 360)에서 돌연변이된다.
가급적, p10 소단위는 10 내지 50개 아미노산 길이의 링크에 의해 p20 소단위와 분리된다. 상기 링크는 바람직하게는, 비극성 아미노산, 예를 들면, 글리신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린으로 이루어진다. 좀더 바람직하게는, 링크는 세린과 글리세린 잔기로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 글리신 잔기와 세린 잔기의 비율은 3:1 내지 4:1이 된다.
전술한 카스파제-8 미끼로 이중-하이브리드 시스템을 이용한 클론의 획득 방법은 전술한 삼중-하이브리드 시스템을 이용하는 방법과 유사하지만, 소단위중 하나에만 결합하는 클론 및 양 소단위에 결합하거나 또는 결합을 위해 이들의 복합체를 필요로 하는 클론을 쉽게 구분할 수 없다는 점은 예외로 한다. 하지만, 이중-하이브리드 방법에 발견된 임의의 클론은 이중 형질전환체, 다시 말하면, 새로이 확인된 클론 및 p10 또는 p20 카스파제-8 소단위로 형질전환된 곰팡이 세포의 lacZ 활성을 평가하여, 2개의 소단위와 DNA 결합 도메인의 결합을 검사한다. p10과 p20 소단위 복합체와의 결합은 삼중 형질전환체의 lacZ 활성을 결정하여 평가할 수 있는데, 여기서, 카스파제-8 소단위중 하나는 DNA 결합 도메인과 융합된 단백질로 발현되고, 다른 것은 비융합된 단백질로 발현된다. 따라서, 전술한 삼중 하이브리드 시스템은 이중-하이브리드 시스템으로 발견된 클론의 결합특성 결정에도 유 용한데, 그 이유는 여기에 사용한 유도성 프로모터를 이용하면, p10 소단위 또는 p10-p20 소단위 복합체와의 클론을 빠르게 확인할 수 있기 때문이다.
다음 연구를 위하여, 히스티딘이 결핍된 배지에서 생장하고, lacZ 활성을 발현할 수 있는 클론을 선별한다. 먼저, 클론에 의해 인코드된 단백질은 라민과 같은 무관한 단백질과 결합하는 능력을 검사한다. 일반적으로, 라민-결합 클론은 버렸다.
카스파제-8과 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 클론은 이후, 추가 분석하였다. 이것은 전술한 선별방법으로 직접 수득한 부분 클론 및 이의 서열에 기초하여, 수득한 전장 클론에서 잘 이루어진다. 전장 클론을 얻기 위하여, 부분 클론의 서열은 당업자에게 공지된 방법으로, 곰팡이 세포에서 얻은 상기 클론의 DNA를 추출하여 수득한다. 이후, DNA는 박테리아로 형질전환시켜, 다량의 정제된 DNA를 얻는데, 이들 정제된 DNA는 서열분석에 사용할 수 있다. 벡터, 가급적 전술한 pGBD 벡터상의 삽입체는 제한 효소로 절개하고, 서열분석을 위해 다른 벡터, 예를 들면, Strategene에서 입수가능한 pBluescript로 클론시킨다. 서열분석은 사슬-종결방법, 가급적 United States Biochemicals의 서열분석 키트에서 입수가능한 Sequenase2 효소를 이용하여 실시한다.
이렇게 얻어진 서열은 이후, 데이터베이스 조사 프로그램에 집어넣고, 중복된 서열은 컴퓨터 조사로 확인한다. 사용한 프로그램은 당분야에 공지된 것으로, GCG(유전자 컴퓨터 그룹)으로 이루어진다. 가급적, EMBL 서브(e.g., http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2)에서 구할 수 있는 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)과 같은 조사 유틸리티를 이용한다. Blastin 명령어를 이용하여, 확인된 클론과 중복 또는 유사한 뉴클레오티드 서열을 검색한다.
본 발명의 방법으로 확인된 단백질은 DNA 결합 도메인과 융합된 단백질로 제공한다. 따라서, 번역되는 핵산서열의 골격을 알 수 있는데, 그 이유는 DNA 결합 도메인의 코딩서열이 골격이 되기 때문이다. 본 발명에 의해 확인된 클론의 DNA 서열은 아미노산 서열로 확실하게 번역되게 된다. 전술한 EMBL에서 구할 수 있는 Blastp 프로그램을 이용하여, 중복된 단백질 서열 또는 유사단백질을 확인할 수 있다.
대안으로, 또는 전술한 검색 데이터베이스 방법에 더하여, 게놈 라이버러리 또는 cDNA 라이버러리와 같은 라이버러리를 선별하여, 완전 클론을 확인하였다. 이런 선별 방법은 전술한 Sambrook et al과 Ausubel et al에서 제시한다. 대안으로, 또는 이에 더하여, PCR-기초의 클로닝 기술, 예를 들면, cDNA 말단의 급속한 증폭을 이용한다(5'와 3' RACE, Graham et al., Biochem Biophys Res Commun 177, p.8-16, 1991). 본 발명의 선별분석에서 확인된 부분 클론 또는 상기 방법으로 수득한 전장 클론은 이후, 추가로 조사한다. 이것은 활성 카스파제-8을 이용한 단백분해 절단에 대한 이들 클론의 감수성을 검사하여 실시한다. 이런 분석은 in vivo에서 실시할 수 있다. 이를 위해, 포유동물 세포계는 시험할 클론에 의해 인코드된 단백질을 생산하는 발현벡터 및 발현되면 카스파제-8 활성을 유도하는 제 2 단백질을 인코드하는 발현벡터로 트랜스펙션시킨다. 발현벡터는 가급적, 클론과 제 2 단백질의 발현을 위해 강한 프로모터, 예를 들면, 라우스 육종바이러스(RSV, Yamamoto et al. Cell 22, p. 787-97, 1980), 골수증식성 육종 바이러스(MPSV, Artelt P et al., Gene 68 p. 213-9, 1988), 시토메갈로바이러스(CMV, Thomsen, et al. PNAS 81 p. 659-63, 1984), 또는 바이러스 또는 세포기원의 유사한 프로모터를 포함한다.
발현되면 카스파제-8 활성을 유도하는 제 2 단백질은 Fas-세포내 도메인, Mort-1, CD120a 세포내 도메인, 카스파제-8 또는 카스파제-8 활성을 유도할 수 있는 동등 단백질에서 선택된다. 대안으로, 카스파제-8 활성은 TNF 또는 CD95-리간드 처리하여 세포로 도입할 수 있다. 가능기작을 설명하는 실험 및 이런 분석형태의 추가적인 기술사항은 전술한 Boldin et al., Cell 1996에서 찾을 수 있다.
제 2 단백질 및 실험할 단백질을 코딩한 전술한 발현벡터를 포유동물 세포로 도입한후, 세포배양물은 충분한 기간동안 배양하여 단백질을 발현시키고, 카스파제-8을 활성화 또는 발현하고, 시험할 단백질을 분리시킨다. 상기 기간은 일반적으로 4 내지 72시간, 바람직하게는 16 내지 30시간, 가장 바람직하게는 20 내지 24시간이 된다. 분리의 정도를 결정하기 위하여, 전체 세포 용해질을 준비한다. 대안으로, 표지된 단백질은 항-표지 항체 또는 니클-니트릴로트리아세트산 크로마토그래피를 이용하여 정제하는데, 이의 시약 및 상세한 프로토콜은 Qiagen GmbH, Hilden, Germany에서 얻을 수 있다. 면역침강의 기술은 상기 Boldin et al., Cell, 1996에서 설명한다. 면역침강을 위한 시약과 안내서는 키트 형태로 Boehringer MAnnheim, Mannheim, Germany에서 추가로 얻을 수 있다.
정제된 단백질의 전체 세포 용해질은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으 로 크기-분석한다
시험할 단백질 또는 이의 표지된 단편은 항-표지 항체를 이용한 웨스턴 블랏 기술로 시각화할 수 있다. 적절한 표지는 항-폴리히스티딘 항체와 결부된 히스티딘 표지이다. 하지만, 항체가 표지 서열에 특이적인 경우, 다시 말하면 전체 세포 용해질에서 다른 단백질을 인식하지 않는 경우에는, 다르게 결합된 표지 서열과 이에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 분리의 특이성은 컨트롤 반응을 작동시켜 확인할 수 있는데, 여기서 특이적 카스파제 억제물질은 전술한 기간동안 포유동물 세포에 첨가한다. 적절한 억제물질은 zVAD-fmk, zDEVD-fmk, zLETD-fmk에서 선택된다( Keppler-Hafkemeyer et al., Biochemistry 36, p. 16934-42, 1998). 좀더 적절한 억제물질은 zVAD-fmk이다. 사용할 수 있는 다른 억제물질은 Bclx 또는 p35 단백질과 같은 단백질인데, 이들은 카스파제의 세포내 억제물질 역할을 한다. 상기 분석에서 이런 단백질이 공동발현될 때, 분리가 억제된다는 점에서, 이런 분리가 카스파제에 대해 특이적임을 알 수 있다.
시험할 단백질이 카스파제-8에 의해 분리되는 가를 알아보기 위한 제 2 분석은 in vitro 분석으로, 여기서, 시험할 표지된 단백질과 함께, 재조합으로 만들어진 카스파제-8을 효소반응에 사용한다. 시험할 단백질은 강한 프로모터를 보유한 발현벡터로, 이의 코딩 서열을 클론하고, 포유동물 세포로 트랜스펙션시켜, 전술한 바와 같이 만들 수 있다. 시험할 단백질은 전술한 바와 같이 표지하여, 특이적으로 표지서열과 결합할 수 있는 항-표지 항체 또는 다른 시약으로 포유동물 세포로부터 정제한다. 대안으로, 시험할 단백질은 in vitro 번역계를 이용하여, in vitro에서 생산할 수 있다. in vitro 번역기술은 당분야에 공지된 것으로, 이의 시약과 상세한 프로토콜은 Stratagene, La Jolla, USA에 얻을 수 있다. 대안으로, 시험할 단백질은 예를 들면, 방사성동위원소를 이용하여 표지할 수 있다. 동위원소 표지를 이용하는 경우의 장점은 시험할 단백질이 in vitro에서 발현되고, 표지되지 않은 아미노산과 함께, 동위원소 표지된 아미노산이 in vitro 번역반응동안 첨가된다는 점이다. 바람직하게는, 동위원소는 S35이다. 좀더 바람직하게는, 동위원소는 S35-메티오닌이고, 표지된 아미노산과 표지되지 않은 아미노산의 비율은 1:1 내지 1:1000이다.
재조합으로 만들어진 시험 단백질 및 재조합으로 만들어진 카스파제-8 활성효소는 이후, 적당한 버퍼에서 충분한 기간동안 결합시켜, 분리를 유도하였다. 적절한 버퍼와 다른 적절한 분석변수는 상기 Boldin et al., Cell 1996에서 제시한다. 적절한 기간은 일반적으로 10분 내지 수시간이 되고, 바람직하게는 30분 내지 1시간이다.
분리를 유도한 후, 반응물은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 크기-분리한다. 동위원소 표지를 사용하는 경우, 겔은 건조시키고, 동위원소는 사진필름 또는 인산영상장치(Fuji)로 검출할 수 있다. 시험할 단백질은 표지하고, 웨스턴 블랏에서 표지-특이적 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
카스파제-8이 없는 컨트롤 반응에 비하여, 카스파제-8 단백질이 첨가되는 반응에서 추가적인 저분자량 밴드의 출현은 카스파제-8에 의한 시험 단백질의 분해를 암시한다. 저분자량 밴드의 크기는 또한, 대략적인 분해 위치를 나타낸다.
본 발명은 카스파제-8 상호작용 단백질을 코딩한 DNA 서열에 관한다.
또한, 본 발명은 카스파제-8 상호작용 단백질의 생물학적 활성 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 변이체 또는 유도체를 코딩한 DNA 서열에 관하고, 이들에 의해 인코드되는 단백질, 동소체, 이의 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이체 또는 유도체에 관한다. 이런 유사체, 단편, 돌연변이체, 유도체의 제조는 표준 과정(Sambrook et al., 1989)을 따르는데, 이때, 카스파제-8 상호작용 단백질을 인코딩한 DNA 서열에서 하나 또는 복수의 코돈이 결실, 부가 또는 치환되어, 고유 단백질에 비하여 하나이상의 아미노산 잔기가 변화된 유사체가 만들어진다.
카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 대립변이체, 단편, 기능유사체, 돌연변이체 또는 유도체를 인코드한 본 발명의 DNA는 본 발명의 구체예로 고유 카스파제-8 상호작용 단백질의 코딩영역에서 유래한 cDNA 서열과 하이브리드를 구성할 수 있는 DNA 서열이 또한 포함되는데, 여기서, 이런 하이브리드화는 적당히 엄격한 조건하에서 실시되고, 하이브리드화되는 DNA 서열은 생물학적 활성 카스파제-8 상호작용 단백질을 인코드한다. 이들 하이브리드화되는 DNA 서열은 따라서, 고유 카스파제-8 상호작용 단백질 cDNA 서열과 상당히 높은 상동성을 갖는 DNA 서열을 포함하고, 카스파제-8 상호작용 단백질-유사 서열의 전형이 되는데, 이런 단백질-유사 서열은 자연-발생 서열로, 다양한 카스파제-8 상호작용 단백질 동소체를 인코딩한 자연-유래 서열 또는 카스파제-8 상호작용 단백질의 활성을 갖는 단백질을 인코드한 카스파제-8 상호작용 단백질-유사 서열군에 속한다. 또한, 이들 서열에는 고유 카스파제-8 상호작용 단백질 cDNA 서열과 유사하지만, 다수의 원하는 변형을 보유한 비-자연 발생 인공합성 서열이 포함된다. 이런 합성 서열에는 따라서, 카스파제-8 상호작용 단백질의 유사체, 단편, 유도체를 인코드한 모든 가능 서열이 포함된다.
이 글에서, 엄격한 조건은 하이브리드화 실험에 이용된 온도, 1가 양이온의 몰농도, 하이브리드화 용액상의 포름아마이드 퍼센트의 함수이다. 임의의 정해진 조건과 관련된 엄격함의 정도를 결정하기 위하여, 먼저, Meinkoth et al(1984)의 방정식을 이용하여, DNA-DNA 하이브리드의 녹는 온도 Tm의 100% 항등함수로 하이브리드의 안정성을 결정한다: Tm=81.5℃+16.6(LogM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L, 여기서 M은 1가양이온의 몰농도, %GC는 DNA상의 G와 C의 퍼센트, %form은 하이브리드화 용액상의 포름아마이드 퍼센트, L은 염기쌍에서 하이브리드의 길이이다. 100% 항등함수 하이브리드에 대해 계산된 Tm이 1℃인 경우, 허용되는 미스매치 양은 대략 1%이다. 따라서, 정해진 염과 포르아마이드 농도에서, 임의의 하이브리드화 실험에 이용된 Tm이 Meinkoth 방정식에 따라 100% 하이브리드에 대해 계산된 Tm보다 10℃가 낮을 경우, 미스매치는 대략 10%가 된다.
"적당히 엄격한 조건"은 상기 공식으로 계산하거나 또는 실제 특정하는 경우, 표적 서열과 완전한 이중나선으로 존재하는 Tm보다 20℃정도 더 낮은 Tm을 제공하는 조건이다. 제한없이, 적당히 엄격한(하이브리드의 계산 또는 측정된 Tm보다 15-20℃ 낮음)조건에서, 하이브리드의 계산된 Tm이하의 적당한 온도로 2XSSC(표준 식염 시트르산염)과 0.5% SDS(도데실 황산나트륨)을 이용한다. 조건의 최종적 인 엄격함은 특히, 이용된 하이브리드화 조건이 불안한 하이브리드가 좀더 안정한 하이브리드가 되도록 하는 조건인 경우에, 주로 세척 조건에 기인한다. 이후, 좀더 엄격한 세척조건에서, 불안정한 하이브리드를 제거한다. 전술한 적당히 엄격한 세척조건에서 이용할 수 있는 일반적인 하이브리드화 조건은 Tm보다 20°내지 25℃이하 온도로, 6 X SSC(또는 6 X SSPE(표준 식염수-인산염-EDTA)), 5 X 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성물, 단편화된 연어혈청 DNA의 용액상에서 하이브리드화이다. 혼성 프로브를 사용하는 경우, SSC(Ausubel, 1987, 1999)대신, 테트라메틸 암모늄 클로라이드를 이용하는 것이 바람직하다.
전술한 자연-발생 카스파제-8 상호작용 단백질-유사 서열을 얻기 위하여, 자연-유도 DNA 또는 RNA 샘플의 다양한 조직으로부터의 표준 선별과정 및 분리과정은 고유 카스파제-8 상호작용 단백질 cDNA 또는 이의 일부를 프로브로 이용하여 실시할 수 있다(Sambrook et al., 1989).
본 발명은 상기에서 설명하는 선별 방법으로 확인할 수 있는 카스파제-8 상호작용 단백질에 관계한다. 본 발명은 또한, 카스파제-8 상호작용 단백질에 실제 상응하는 폴리펩티드 또는 단백질에 관계한다. 이때 "실제 상응하는"이란 용어에는 카스파제-8 상호작용 단백질뿐만 아니라 이의 유사체인 폴리펩티드 또는 단백질도 포함된다.
카스파제-8 단백질에 상응하는 유사체는 카스파제-8 단백질의 아미노산중 한 가지 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결실되거나 삽입되어 생성된 단백질이 카스파제-8 단백질에 상응하는 생물학적 활성이 동일한 또는 더 큰 단백질이 되어야 한다.
카스파제-8-결합 단백질에 실제 상응하도록 하기 위해서는 동소체와 같은 카스파제-8 단백질의 서열에 만들어지는 변화는 아주 적은 것이다. 변화의 수는 10미만이고 적절하게는 5이하의 변화, 가장 적절한 수는 3이하가 된다. 임의 기술을 이용하여 실제 카스파제-8 단백질에 상응하는 생물학적으로 활성을 가지는 단백질을 만들 수 있는데, 한 가지 기술은 단백질을 인코드하는 DNA에 통상적인 돌연변이 기술을 이용하는 것으로 약간의 변화가 있다. 이와 같은 클론에 의해 발현되는 단백질들은 카스파제-8에 결합하는 능력 또는 상기에서 언급한 것과 같은 세포내 경로의 중개 또는 조절하는 능력에서 카스파제-8을 조절하는 능력등으로 선별한다.
"보존성" 변화는 단백질의 활성에 변화를 주지 않고, 단백질의 크기, 전하, 모양을 변화시키지는 않는 것으로 우선 선별하여 생물학적 활성에 변화를 주지 않는 것이 된다. 카스파제-8 단백질의 보존성 치환체는 폴리펩티드에 있는 적어도 한 개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열로 보존성을 유지하면서 치환된 유사체이다. 이와 같은 치환은 적절하게는 표 1A에서 제시하는 것에 따라 이루어지는데, 치환체는 카스파제-8 단백질의 생물학적 활성 특징을 유지하면서 합성된 폴리펩티드 분자의 변형된 구조적 그리고 기능적 성질을 제공하는 일상적인 실험에 의해 결정한다.
원래 아미노산 예시적인 치환체
Ala Gly; Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Ala; Pro
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Tyr; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
또는 카스파제-8 단백질의 치환체의 또 다른 그룹은 다음의 표 1B에 있는 것과 같이 폴리펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산을 제거하고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이 된다. 폴리펩티드에서 이루어진 이와 같은 치환은 Schulz et al., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 and Figs. 3-9 of Creighton, T.E. Protein; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983의 표 1-2에 제시한 것과 같은 상이한 종간의 단백질 유사성에서 아미노산 변화 빈도를 분석한 결과를 기초로 한 것이다. 이와 같은 분석을 기초로 하여 또 다른 보존성 치환체는 다음의 다섯 가지 그룹중 하나에서 교환이 이루어진 것이다.
1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기; Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)
2. 극성 음전하를 띈 잔기와 이의 아미드; Asp, Asn, Glu, Gln
3. 극성 양전하를 띈 잔기; His, Arg, Lys
4. 큰 지방족 비극성 잔기; Met, Leu, Ile, Val(Cys)
5. 큰 방향족 잔기; Phe, Tyr, Trp
괄호안에 있는 세 가지 아미노산은 단백질 구조에 중요한 역할을 한다. Gly는 어떠한 측쇄도 가지지 않는 유일한 것이고 따라서 사슬에 유연성을 부여한다. 그러나 이는 α사슬이외의 제2차 구조 형성을 촉진시키는 경향이 있다. Pro는 이의 구조적인 특징으로 인하여, 사슬을 단단하게 억압하고 일반적으로 β-회전과 같은 구조를 만드는 경향이 있고, 일부 경우에는 Cys는 단백질의 폴딩에 중요한 역할을 하는 이황화결합에 참가할 수 있다. Schulz et al, supra는 그룹 1과 2를 합쳤다. Tyr은 이의 수소결합 가능성 때문에 Ser, Thr와 상당히 유사한 특징을 가진다.
본 발명에 따른 전술한 것과 같은 보존성 아미노산 치환은 본 기술분야에 공지된 것이고, 아미노산 치환 후에 폴리펩티드의 생물학적 그리고 구조상의 성질을 유지할 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 대부분의 결손 및 치환은 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 특징에 파격적인 변화를 주지는 않는다. " 특징"은 α-사슬, β-쉬트 등의 2차 구조에서의 변화 및 카스파제-8에 결합하는 능력 및 세포 죽음에서 카스파제-8의 효과 조절등의 생물학적 활성에 변화 등을 포함한 포괄적인 것을 의미한다.
본 발명에 이용할 수 있는 카스파제-8 단백질의 유사체를 만들기 위해 이용될 수 있는 단백질에 아미노산 치환체를 만드는 예는 임의 공지의 방법을 포함하는 데 이는 미국 특허 RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585; 4,737,462(Mart et al.,); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,) 및 리신 치환된 단백질은 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에 상술하고 있다.
전술한 카스파제-8 단백질의 활성에 큰 변화를 주지 않는 보존성 치환이외에, 카스파제-8 단백질의 활성이 상당히 증가되도록 하는 보존성이 약한 치환 및 다소 무작위 치환도 본원 발명의 범위에 속한다.
치환 또는 결손의 정확한 효과를 확인하였을 경우에, 당업자는 치환, 결손 등의 효과를 일상적인 결합 및 세포 죽음 검사를 통하여 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 이와 같은 표준 테스트를 이용하는 선별은 과도한 실험을 요하지는 않는다.
수용가능한 카스파제-8 상호작용 유사체는 카스파제-8과 상호작용할 수 있는 능력을 가지기 때문에, 세포내 경로에서 카스파제-8 활성을 중개하거나 자체적으로 카스파제-8 활성을 중개할 수 있다. 이와 같은 방식에서, 카스파제-8에 결합하여 시그널을 발생하는 능력이 결실되거나 또는 결합후에 이어지는 다른 활성에 결손이 있는 유사체와 같은 우성-음성 효과를 가지는 유사체를 만들 수도 있다. 이와 같은 유사체를 이용하여 카스파제-8의 세포 독성 효과를 저해시키거나 또는 증가시킬 수 있는데, 이는 세포 죽음을 증가시키기를 원하는지 또는 세포 생존을 증가시키기를 원하는지에 따라 달라지고, 이와 같은 활성이 카스파제-8 상호작용 단백질 및 카스파제-8의 상호작용에 의해 조절되는 주요 활성중에 하나인지에 따라 달라지고, 이와 같은 유사체에 의해 카스파제-8에 결합하거나 상호작용을 하는 고유 카스파제-8 상호작용 단백질과 경쟁을 하게 된다.
유전자 수준에서, 이와 같은 유사체는 카스파제-8 상호작용 단백질을 인코드하는 DNA 서열의 뉴클레오티드에 부위-직접적인 돌연변이를 이용하여 유사체를 인코드하는 DNA 서열을 만들고, DNA을 합성하고 재조합 세포 배양물에서 폴리펩티드를 발현시켜 만들 수 있다. 일반적으로 유사체는 천연 발생 단백질과 동일한 또는 생물학적 활성이 양적으로 증가된다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologu, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989).
카스파제-8 단백질 고유 또는 초기 준비된 유사체를 인코드하는 DNA의 부위-돌연변이를 이용하여, 동일한 폴리펩티드를 인코드하는 또는 천연 서열과는 다른(공지의 유전자 코드의 축중으로 인한 변화 때문에) 서열을 가지는 카스파제-8 단백질을 준비할 수 있다. 부위-특이적인 돌연변이는 원하는 돌연변이를 가지는 DNA 서열을 인코드하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열과 인접한 상당수의 뉴클레오티드를 이용하여 유사체를 만들 수 있는데 유사체는 반대로 된 결손 양측에 안정한 이중 나선을 만들기 위해 충분한 크기의 프라이머 서열을 제공한다. 일반적으로 길이가 20 내지 25개 뉴클레오티드로 된 프라이머가 적절한데 서열의 각 측면에는 약 5 내지 10개의 상보 뉴클레오티드가 바뀔 수 있다. 일반적으로, 부위-특이적인 돌연변이 기술은 당업자에게 공지된 기술이고, 이는 Adelman et al., DNA 2;183(1983)에 예시하고 있다.
인지하는 바와 같이, 부위 특이적인 돌연변이 기술은 일반적으로 단일 가닥 및 이중 가닥형으로 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위-특이적인 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 Messing et al., Third Cleveland Symposim on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor, A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981)에 상술하고 있는 M13 파아지이다. 이들 파아지는 시판되는 것을 이용할 수 있고 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다. 또는 복제원점을 포함하는 한 가닥 파아지를 포함하는 벡터를 이용하여 단일-가닥 DNA를 얻을 수 있다(Veira et al., Meth. Enzymol. 153;3, 1987).
일반적으로, 본 발명에 따르는 부위-직접적인 돌연변이는 관련 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 한 가닥 벡터를 얻어야 한다. 원하는 돌연변이된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 자동화된 DNA/올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 준비한다. 이와 같은 프라이머를 단일가닥 단백질 서열을 포함하는 벡터에 어닐링하고 대장균 폴리메라제 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소로 처리하여 돌연변이를 포함하는 가닥을 완전히 합성한다. 따라서, 돌연변이된 서열과 제2가닥은 원하는 돌연변이를 가진다. 이와 같은 이형이중 벡터를 이용하여 대장균(E. coli) JM101과 같은 적절한 세포에 형질 도입시키고 돌연변이된 서열을 가지는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.
이와 같은 클론을 선택한 후에, 돌연변이된 카스파제-8 상호작용 단백질 서열을 제거하여 적절한 벡터에 옮기고, 이때 벡터는 일반적으로 적절한 숙주에 트랜 스펙션을 위해 이용되는 형태의 발현 벡터가 된다.
따라서, 카스파제-8 상호작용 단백질을 인코드하는 유전자 또는 핵산은 PCR 및 화학적 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 공지의 DNA 또는 RNA 증폭 기술을 이용하여 in vitro, in vivo에서 감지, 수득 및 변형된 것이다. PCR을 이용하면 반복된 DNA 폴리메라제 반응에 의해 특정 DNA를 증폭(수를 증가)시킬 수 있다. 이와 같은 반응은 클로닝을 대신할 수 있는데; 이때 모든 핵산 서열을 알아야 한다. PCR을 실행하기 위해, 원하는 서열에 상보적인 프라이머를 만든다. 일반적으로 자동화된 DNA 합성에 의해 프라이머를 만들 수 있다. 프라이머는 유전자의 임의 부분에 하이브리드할 수 있도록 만들어진 것이기 때문에, 상보적인 염기쌍에 짝이 잘못된 것(mismatch)을 견딜 수 있도록 환경을 만든다. 이와 같은 잘못이룬 쌍을 증폭시키면 돌연변이된 생성물을 만들게 되고 새로운 성질을 가지는 펩티드가 형성된다(가령, 부위 특이적인 돌연변이)(Ausubel., Ch.16). 또한, PCR에서 역전사효소를 이용하여 커플링 상보적인 DNA(cDNA) 합성하여, 클로닝없이 프로락틴 수용체의 세포외 도메인 합성을 위한 출발물질로 RNA를 이용한다.
또한, PCR 프라이머는 증폭된 유전자 부분의 양단에 종료 코돈이 있는 것과 같은 특징 및 새로운 제한효소 절단 부위를 가지는 등과 같이 만든다. 증폭된 유전자 서열의 5'와 3'단부에 제한효소 절단부위가 위치하면, 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 이의 단편을 인코드하는 유전자 단편이 벡터에 다른 서열 및 클로닝 부위를 결찰하도록 만들 수 있다.
PCR 또는 RNA 및 DNA를 증폭시키는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 야기에서 제시하는 기술에 따라 과도한 실험없이도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. DNA 또는 RNA를 증폭시키는 공지된 방법은 폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR)과 관련된 증폭 과정(참고; 미국 특허, 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188(Mullis et al.,); 4,921,794(Tobor et al.,); 5,142,033(Innis et al.,); 5,122,464(Wilson et al.,); 5,091,310(Innis); 5,066,584(Gyllensten et al.,); 4,889,818(Gelfand et al,); 4,994,370(Silver et al.,); 4,766,067(Biswas); 4,656,134(Ringold); Innis et al., eds, PCR Protocols; A Guide to Method and Applications) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위해 주형으로 표적 서열에 앤티센스 RNS를 이용하여 RNA 중개된 증폭(미국 특허 5,130,238(Malek et al., NASBA) 및 항체 표지된 DNA 증폭을 이용하여 복합된 면역-PCR(Ruzick et al., Science 260;487(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotechniques 9;1378(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotchnique 9;1378(1991)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
유사한 방식으로 카스파제-8 상호작용 단백질의 생물학적으로 활성 단편(가령, 카스파제-8의 동소체)을 카스파제-8 상호작용 단백질의 유사체에 대해 전술한 것과 같이 만들 수 있다. 카스파제-8 상호작용 단백질의 적절한 단편은 카스파제-8 단백질 능력을 보유하고, 카스파제-8 상호작용 단백질의 생물학적 활성을 중재할 수 있거나 직간접적으로 카스파제-8과 연관된 다른 단백질의 생물학적 활성을 중재할 수 있는 것을 말한다. 따라서, 카스파제-8 상호작용 단백질 단편은 유사체에 대해 전술한 것과 같이 도미넌트-네거티브 또는 도미넌트-포지티브 효과를 가지도 록 만든다. 이와 같은 단편은 본 발명의 유사체의 특정 부류를 나타내는데 즉, 이들은 완전한 카스파제-8 상호작용 단백질에서 유도된 카스파제-8 상호작용 단백질의 일부이고(가령, 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 이의 동소체중 하나), 이와 같은 일부분 또는 단편은 원하는 활성의 일부를 가진다. 이와 같은 단편은 펩티드가 될 수 있다.
유사하게, 당업자에게 공지된 것과 같이, 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편의 하나이상의 아미노산 잔기의 측쇄에 표준 변화 또는 다른 분자 가령, 항체, 효소, 수용체 등에 카스파제-8 상호작용 단백질, 유사체 또는 단편을 결합시켜 유도체를 만들 수 있다. 따라서, 여기에서 언급하는 "유도체"는 당업자에게 공지된 방법으로 잔기의 측쇄 또는 N- 또는 C-단부 그룹에 있는 기능기로부터 만든 유도체를 포함하고 이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 유도체는 이와 같은 단편이 카스파제-8 상호작용 단백질로 동일한 또는 더 큰 생물학적 활성을 가진다면 탄수화물 도는 인산 잔기와 같은 화학적 부분을 가질 수 있다.
가령, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 2차 아민과 반응한 카르복실기의 아미드, 아실 부분을 형성한 아미노산의 자유 아미노시 또는 N-아실 유도체(가령, 알카노일 또는 카르복실 아로일 기) 또는 아실 부분을 형성하는 자유 히드록실 기의 O-아실 유도체(가령, 세릴 또는 트레오닐 잔기)를 포함한다.
"유도체"는 한 아미노산이 20개의 자연 발생 아미노산중 하나로 변화되지 않은 유도체만을 포함하는 것이다.
테스트할 단백질의 결손 돌연변이체를 만들고, 각 결손 돌연변이체가 상기 설명하는 것과 같이 카스파제-8에 의한 절단에 감수성이 있는 지를 테스트하여 절단 부위를 결정할 수 있다. 결손 돌연변이체는 주형으로 테스트할 단백질을 코딩하는 클론의 DNA 서열을 이용하여 테스트할 단백질의 원하는 단편을 PCR 클로닝하여 작제할 수 있다. PCR 증폭된 단편을 발현벡터에 클론시키는데, 이때 ATG 시작 코돈 적절하게는 Kozak 서열(Kozak, M, Nucleic Acids Res. 12p. 857-72, 1984)이 있어야 한다. his-tagged 단백질 뿐만 아니라 일반적인 단백질 발현에 대해서, 발현벡터에 대한 상세한 내용은 Qiagen 정보에서 찾을 수 있다. 상기 설명하는 Current Protocols의 단백질 발현에 대한 다른 참고문헌으로는 16장을 참고로 한다.
테스트할 단백질의 절단 부위는 이의 다양한 결손 돌연변이체를 준비하고, 카스파제-8에 의해 절단되는 결손 돌연변이체를 결정하여 확인할 수 있다.
절단 부위를 확인하는 또 다른 방법은 테스트할 클론의 예상 단백질 서열에 따라 만들어진 펩티드를 이용하는 것이다. 펩티드는 Bodanszky and Bodanszky에서 설명하는 것과 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 펩티드 합성, Spring, New York, ISBN 0-387-13471-9, Bodanszky "the principle of peptides sybthesis, Spring, New York, ISBN 0-387-12359-4를 참고로 한다. 통상적인 펩티드 합성의 몇 개 회사, SynPep Corp., Dublin, CA USA, California Peptide Research, Inc., Napa, CA, USA에서 이용할 수 있다. 펩티드는 다른 단백질과 융합되거나 또는 재조합 DNA 코딩에 의해 발현되는 다른 단백질과 융합되어 만들어질 수도 있다. 좀더 상 세한 내용은 Current Protocols의 16장을 참고로 한다.
테스트할 단백질의 절단부위를 매핑하는데 펩티드를 이용하기 위해, 단백질의 예상 아미노산 서열을 각 구역으로 나누고, 각 구역에 상응하는 펩티드를 합성한다. Ehgks, 한 구역의 아미노산의 절반정도에 상응하는 펩티드와 바로 인접하는 구역의 아미노산의 절반정도에 상응하는 펩티드를 합성하여, 두 구역사이에 경계가 겹쳐지도록 한다. 이와 같은 구역은 5 내지 100개 아미노산, 적절하게는 9 내지 40개 아미노산, 가장 적절하게는 20 내지 30개 아미노산으로 구성된다. 전체 펩티드 세트를 카스파제-8에 의한 절단에 대한 감수성을 설명하는 것과 같은 방법으로 테스트한다. 준비된 펩티드는 순수한 형태로 다량 제공될 수 있다. 절단 반응이 종료된 후에는, SDS 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 바로 분석하고, UV 감지 및 코마시 블루를 이용한 착색으로 눈으로 확인할 수 있다. 또는, 펩티드는 용이하게 감지하기 위해 동위원소 말단-표지(Shevchenko A, et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 11, p. 1015-24, 1997)를 이용하여 표지할 수 있다.
상기에서 설명하는 펩티드 선별이 종료된 후에, 카스파제-8에 대한 절단 부위로 구성된 것으로 알려진 펩티드를 동일한 기술을 반복 이용하여 추가 연구하는데, 확인된 펩티드 서열에서 더 작은 부분을 선택하여 연구한다.
펩티드의 실제 절단 부위는 카스파제 절단 서열 XXXXD과 일치해야 한다Boldin et al., Cell 1996 and Nicholson et al., Killer caspases, Trends in Biochem Sci. 22, 299-306, 1997). 펩티드에서 각 아미노산의 역할은 한 개 아미노산이 돌연변이된 펩티드를 준비하고, 이와 같이 돌연변이된 펩티드가 카스파제-8 에 의한 절단에 감수성이 있는지를 테스트하여 평가한다. 돌연변이된 아미노산은 비극성 아미노산 집단(Lehninger, Biochemistry, Worth, NY, 1979, chapter 4)에서 선택된 아미노산으로 치환된 것으로 대부분은 글리신 또는 알라닌에서 선택되는 것이 바람직하다.
주요 아미노산을 돌연변이시켜, 카스파제-8에는 결합을 하지만, 절단에 대해서는 감수성이 없는 펩티드를 만들 수 있다. 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 비-변성 조건하에서 펩티드-카스파제-8 복합체의 크기 분리에 의해 결합을 테스트할 수 있다.
카스파제-8의 활성 시스테인과 반응하여, 시스테인과 공유결합을 할 수 있는 변형된 펩티드를 작제하는 것이 가능하다. 화학분야 당업자에게 공지된 티올기와 반응을 할 수 있는 시약을 이용하여 이를 실행한다. 이와 같은 시약은 가역적인 방식으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 시약을 포함하는 티올기는 카스파제-8의 활성 시스테인의 SH기와 반응을 할 수 있다. 형성된 공유 S-S 결합은 사이토졸에서 생리적인 환경하에서 환원에 의해 또는 디티오트레톨(DTT)과 같은 S-S기를 환원시킬 수 있는 시약을 이용하여 환원에 의해 절단시킬 수 있다. 티올기와 반응을 하는 시약은 카스파제-8에 비가역적으로 결합한다. 이와 같은 시약은 당분야에 공지의 티올기와 반응할 수 있는 교차-결합기가운데에서 용이하게 찾을 수 있다. 이 분야의 참고문헌은 PIERCE Life Sciences catalog(PIERCE, Rockfor, IL, USA) 및 0-90페이지에서 볼 수 있다.
티올기와 반응을 할 수 있는 적절한 기에는 피리딜디티오, 요오드아세타미 도, 멜레이미도기등이 있다. 이와 같은 기는 선택적으로 불포화된 지방족 탄화수소 사슬, -O-, -S-, -NH-, 방향족기로 구성된 링커를 통하여 펩티드에 연결될 수 있다. 링커는 선택적으로 치환될 수 있다.
티올-반응성기는 당분야에 공지된 화학 합성에 의해 펩티드에 연결될 수 있고, 펩티드의 기능기는 티올-반응성 기-링커 분자의 적절한 기능기와 반응할 수 있다. 펩티드 서열에 존재하는 또는 적절한 기능기를 만들기 위한 목적으로 펩티드 서열에 삽입시킨 리신 잔기(리신의 경우에는 ε아미노기)와 N-감마-말레이미도부티릴옥시-숙시니미드 에스테르와 같은 이형기능성 교차-링커와 반응할 수 있는데, 교차 링커의 말레이미도 기는 반응을 하지 않고, 카스파제-8와 접촉하는 경우에, 카스파제-8과 펩티드가 특이적으로 결합할 경우에 한하여, 시스테인의 티올기와 반응하여, 카스파제-8을 비활성화시킨다.
티올-반응성 시약과 반응을 하는데 이용되는 펩티드내에 위치는 카스파제-8에 의해 절단되는 부분의 아미노산(통상적으로 아스파르트산)에 근접한 것을 선택한다. 티올-반응성 기가 펩티드에 결합할 수 있도록 하는 링커는 길이, 극성 기의 존재(가령, 하이드록시), 니트로 및 황기와 같은 전하를 띈 기, 페닐 잔기의 페닐렌기와 같은 방향족 기등에 있어서 다양하다. 링커 구조의 다양성으로 인하여, 펩티드 및 카스파제-8에 특이적으로 결합하게 되는 티올-반응성 시약에 공유결합된 시약을 만들 수 있다.
테스트할 단백질 또는 이의 단편은 포유류 세포로 단백질 또는 펩티드를 도입시키고, 세포에서 아팝토시스-유도 시약의 효과를 특정하여 특징을 조사할 수 있 다.
포유류 세포에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위해서는 벡터내로 테스트할 단백질을 코딩하는 DNA를 삽입시키면 되는데, 이때 벡터는 프로모터, 선택적으로 인트론 서열 및 접합 제공자/수용자 시그널 및 선택적으로 정료 서열로 구성된다. 이 기술에 대한 전반적인 설명은 Current Protocols, 16장에 있다.
전술한 프로모터, 인트론, 종료 서열은 포유류 세포에서 작용할 수 있다. 프로모터는 적절하게는 RSV, CMV, MPSV 프로모터와 같은 강력한 프로모터가 적절하다. 프로모터는 SV40 초기 프로모터(Everett, et al. Nucleic Acids Res. 11 p. 2447-64, 1983), 세포 프로모터, 베타-악틴 프로모터 또는 ELF-1 프로모터(Tokushige, et al., J Virol Methods. 64 p. 73-80, 1997)가 될 수도 있다. EH한, lac 오퍼레이터 및 사람의 ELF-1 알파 프로모터사이에 하이브리드된 하이브리드 프로모터(Edamatsu et al.(Gene 197, p. 289-94, 1997)) 또는 CMV-베타 악틴 하이브리드 프로모터(Akagi et al., Kidney Int. 51, p. 1265-9, 1997) 또는 tet 오퍼레이터 서열 및 CMV 프로모터사이에 하이브리드된 프로모터(Furth et al., PNAS 91, p. 9302-6, 1994, and references therein)등이 이용될 수 있다.
접합 제공/수용 부위를 포함하는 완전한 서열로 삽입될 인트론 서열을 발현되기를 원하는 단백질의 코딩 서열에 삽입시킬 수 있다. 이와 같은 인트론 서열을 삽입하여 RNA 안정성이 강화되면 원하는 단백질의 생산도 강화된다. 원칙적으로, 적절한 인트론 서열은 임의 인트론을 포함하는 임의 유전자에서 선택될 수 있지만, 적절한 인트론 서열은 베타-악틴 인트론, SV 40 인트론, p55 TNF 수용체 인트론이 된다.
인트론 서열에는 상기 프로모터에서 전사를 강화시킬 수 있는 증폭제 원소를 포함할 수도 있다.
종종, 인트론 서열에는 조직 특이적인 발현을 부여하는 전사 또는 해독 조절 서열이 포함될 수 있다. 따라서, 조직 특이적인 방식으로 본 발명의 단백질이 발현되기를 원하는 경우에는 이와 같은 인트론 서열을 이용하는 것이 유익하다. 조직-특이적인 증폭제 원소를 포함하는 인트론으로는 사람 5-아미노루블리네이트 합성효소-2 유전자의 인트론 8에 위치한 적혈구-특이적인 증폭제(Surinya et al., J Biol Chem. 273, p. 16798-809, 1998)가 되고, 예시하는 인트론 서열과 함께 인트론 서열을 이용한 단백질 생산을 강화시키는 방법에 대해서는 Huang et al. Nucleic Acids Res. 18, p. 937-47, 1990에서 설명하고 있다.
전사 종료 서열 및 폴리아데닐화 시그널 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA의 3'말단에 추가할 수 있다. 이와 같은 서열은 대부분의 유전자에서 볼 수 있다. 유익하게는 SV 40 폴리아데닐화 시그널 이용한다(Schek et al., Mol Cell Biol., p. 5386-93, 1992, and references therein).
포유류 세포에서 단백질을 발현시키는데 이용되는 적절한 벡터는 pcDNAHis(Invitrogen)로써 원하는 단백질을 인코드하는 유전자의 발현을 구동시키기 위한 CMV 프로모터를 포함한다. 이용될 수 있는 다른 벡터에는 pCDNA3 또는 pMPSVEH 벡터가 있다. 이와 같은 벡터에는 각각 CMV 및 MPSV 프로모터를 가지고 있다.
테스트할 단백질의 재조합 발현을 이용하여, 카스파제-8에 의해 중개되는 아팝토시스 시그널에 대해 단백질의 효과를 평가한다. 이를 위해, 아팝토시스를 유도하는 단백질 예를 들면, CD120a 세포내 도메인, CD95 세포내 도메인, Mort-1 단백질, 카스파제-8 또는 이의 등가체의 과발현 또는 CD120a, CD95, TRAMP/DR3 또는 이의 등가체 수용체의 자극에 의해 아팝토시스 시그널의 활성화에 의해 유도할 수 있다. 리간드와 수용체를 접촉시키거나 항체 적절하게는 다클론성 항체와 수용체의 교차 결합을 이용하여, 수용체 활성화시킬 수 있다(Engelmann et al. J. Biol. Chem. 265, p. 14497-504, 1990).
일반적으로 CD120a와 같은 수용체의 자극은 강력한 아팝토시스 시그널 얻기 위해 사이클로헥시미드와 같은 단백질 합성 저해인자를 추가해야하지만, 아팝토시스 시그널 전환에 관련된 단백질 또는 수용체 세포내 도메인의 과발현시에는 요구하지 않는다(Boldin et al., Cell 85, p. 803, 1996). Boldin et al에는 아팝토시스 감지, 배양 시간 및 이와 같은 검사와 관련된 변수 및 다른 상세한 설명이 기재되어 있다.
테스트할 단백질을 발현시키는 세포에서의 세포 죽음, 이를 발현시키지 않는 세포는 DNA 분절화에 기초한 방법 또는 Boehringer Mannheim 및 다른 회사에서 이용할 수 있는 키트형의 아팝토시스 감지를 위한 아팝토시스-특이적인 항원 및 에피토프, 시약, 프로토콜에 기초한다.
세포 죽음은 세포의 형태학적 외양으로 결정할 수 있다. 아팝토시스 세포 죽음은 세포 용혈없이 세포막이 흔들리거나 주름지는 것을 특징으로 한다.
성공적인 트랜스펙션의 표식을 제공하기 위해, 포유류 세포에서 리포터 유전자가 발현되는 것이 유익하다. 트랜스펙션 과정 자체로 인하여, 트랜스펙션안된 세포 죽음을 포함한 일부 세포가 죽기 때문에, 트랜스펙션안된 세포만을 평가하는 것이 유익하다. 이 목적에 적절한 리포터 유전자는 lacZ 유전자인데, 이는 Xgal 또는 활성이 있는 베타-갈락토시다제를 확인하는 유사 시약으로 트랜스펙션된 세포를 배양하면 용이하게 확인할 수 있기 때문이다. 그러나, 임의 공지의 다른 리포터 유전자를 이용할 수도 있는데, 적절하게는 유전자의 생성물은 현미경을 이용하여 평가할 수 있는 간단한 발색 반응을 이용하여 용이하게 감지할 수 있다. 예를 들면, 녹색 형광 단백질을 이용하여 발색 반응없이 바로 감지할 수 있다. 이와 같은 리포터 유전자는 형광 현미경을 이용해야 한다.
포유류 세포는 적절하게는 HeLa 또는 사람의 배아 신장(HEK) 293-T 세포가 된다. 트랜스펙션은 Current Protocol에서 설명하는 인산칼슘염 방법을 이용하여 실행한다. 트랜스펙션후 1 내지 150시간후, 적절하게는 4 내지 35시간후에, 가장 적절하게는 20시간후에 세포의 형태를 평가한다.
항체의 형성
다클론성 항체는 토끼, 닭, 생쥐, 들쥐, 양 또는 유사한 포유류에서 만들 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩티드에 대한 항체를 만들기 위해, 상기에서 설명하는 단백질 또는 펩티드를 포유류 세포에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 만든다. Current Protocol, 16장에서 설명하는 것과 같이 박테리아 또는 곤충 세포에서도 단백질을 만들 수 있다.
단백질 또는 펩티드는 세포에서 정제한다. 단백질 정제 공정은 당업자에게 공지된 것이고, Current Protocols(Biology, Chapter 16), Protein Science, Wiley and Sons Inc. 5장 및 6장의 Current Protocols를 참고로 한다. 유익하게는 단백질은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 이와 유사한 제2단백질과 융합시키거나 또는 히스티딘 tag 서열과 같은 서열 tag을 이용한다. 융합된 또는 tag-단백질을 이용하는 방법은 Current Protocols, Molecular Biology 6장에서 상세히 설명하고, 상기 Qiagen his-tag-단백질 발현 및 정제 키트에 대한 소개도 하고 있다.
단백질 또는 펩티드가 융합된 경우에, 항체를 만드는데 이용되는 단백질을 이용하기 전에 융합 짝을 제거하는 것이 바람직한데, 그 이유는 융합 짝에 대한 항체가 만들어지는 것을 방지할 수 있기 때문이다. 융합 짝의 절단 및 원하는 단백질의 분리에 대해서는 Current Protocols, Molecular Biology 16장에 설명하고 있다. 말토즈-결합 단백질 융합된 재조합 단백질을 발현시키고 정제하는데 이용되는 벡터, 프로토콜, 시약은 시판하는 것을 이용하면 된다.
본 발명의 펩티드를 만들 때, 융합짝을 제거하지 않아도 되는데, 그 이유는 융합 단백질은 펩티드에 대한 항체 생산을 자극하기 때문인데, 이와 같은 생각은 길이가 50개 아미노산미만인 펩티드로부터 항체를 만들 때 관계한다.
상기에서 설명하는 것과 같이, 펩티드는 당분야에 공지된 화학적인 방법으로 합성할 수 있다.
단백질에 대한 다클론성 항체를 만드는 것은 Current Protocol 2장, Immunology, Wiley and Sons Inc.에서 설명한다. 펩티드에 대한 항체를 만들 때에 는 프로토콜을 약간 변형해야하는데, 그 이유는 단백질과 비교하였을 때 펩티드의 항원성이 일반적으로 낮기 때문이다. 펩티드에 대한 다클론성 항체를 만드는 것은 Current Protocol, Immunology 9장에서 설명한다.
면역주사한 동물 가령, 들쥐 또는 생쥐의 비장 또는 임파구에서 취한 B 세포로부터 하이브리드 세포가 잘 생장할 수 있는 조건하에서 불사화된 B 세포와 융합시켜 단클론항체를 만드는데, 뮤린 B 세포의 융합을 위해서는 세포주 Ag-8이 적절하다.
단클론항체를 만드는 기술은 많은 문헌에서 설명하는데, 예를 들면, Current Protocols, Immunology 2장에서도 설명한다. 9장에서는 펩티드 또는 동물의 면역화 방법에 대해서 설명한다. 이들 동물의 비장, 또는 임파구 세포를 2장에서 설명하는 단클론항체를 만들기 위한 단백질-면역화된 동물의 비장 또는 임파구 세포와 마찬가지로 이용할 수 있다.
단클론항체를 만드는데 이용되는 기술에 대해서 Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 및 USP 4,376,110에서 설명한다.
가변 부분이 대부분 무작위 서열로 치환된 사람 항체 유전자 뱅크에서 항체를 만드는 방법은 USP 5,840,479에서 설명한다. 이와 같은 항체는 주어진 펩티드 또는 단백질로 동물을 면역주사하기 어려울 경우에 적절하다. 일부 구조는 면역원성이 약하고, 융합 구조체에 다른 단백질에 연결하거나 또는 어쥬번트를 추가하여도 유지될 수 있다. USP 5,840,479에서 설명하는 항체는 항체가 사람에서 면역원성이 낮아야하는 경우와 같은 사람 항체와 유사한 구조를 가지는 항체를 이용하고 자하는 경우에 적절하다.
일단 적절한 항체가 확인된 경우에, 이의 성질을 변경시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 키메라 항체는 더 많은 생산율을 얻을 수 있다. 항상 부분이 사람 항체의 항상 부분으로 치환된 키메라 항체는 사람에서 항원성이 낮은 항체를 원할 경우에 바람직하다. 키메라 항체와 이를 생산하는 방법에 대해서는 본 분야에 공지되어 있다(Cabilly et al., PNAS 81, p. 3273, 1984, Morrison et al., PNAS 81, 6851, 1984, Boulianne et al., Nature 312, p. 643, 1984, EP 125023, EP 171496, EP 173494, EP 184187, WO 86/01533, WO 87/02671, and Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
또 다른 항체 타입은 항-이디오타입(항-Id) 항체이다. 항-이디오타입(항-Id) 항체는 항체의 항원 결합 부위와 일반적으로 연합하는 독특한 결정 부위를 인지하는 항체이다. Id 항체는 항-Id를 만든 mAb원으로써 동일 종 그리고 동일한 유전자형의 동물(가령, 쥐 strain)에 면역처리하여 준비할 수 있다. 면역처리된 동물은 이와 같은 이들 이디오타입 항원결정기에 대한 항체를 준비함으로써 면역처리된 항체의 이디오타입 결정부위를 인지하고 반응한다(참고 미국 특허 4,699,880).
항-id 항체는 다른 동물에서 소위 항-항-id 항체를 만드는 면역 반응을 유도하는 "이뮤노겐"으로 이용될 수 있다. 항-항-id는 항-ID를 유도한 원래 mAb의 에피토프와 동일하다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정부위에 대한 항체를 이용함으로써 동일한 특이성을 가지는 항체를 발현시키는 다른 클론을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 대항하여 발생된 mAb을 이용하여 BALB/c 쥐과 같은 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도할 수 있다. 이와 같은 면역처리된 쥐의 췌장 세포를 이용하여 항-Id mAb를 분비하는 항-Id 하이브리도마를 생산한다. 또한, 항-Id mAb를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 결합시켜 추가 BALB/c 쥐를 면역처리한다. 이들 쥐의 혈청에는 상기 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체의 에피토프에 특이적인 고유 mAb의 결합 성질을 가지는 항-항-Id 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 항-Id mAbs에는 이들 고유의 이디오타입 에피토프 또는 평가할 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프(idiotopes)"를 가진다.
"항체"는 고유 항체뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2와 같은 단편을 포함한다. Fab와 F(ab')2 단편은 고유 항체의 Fc 단편이 부족하고 순환계로 부터 더 빨리 제거되고 고유 항체보다는 다소 특이성이 적은 조직 결합을 가진다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24;316-325(1983)).
Fab와 F(ab')2 및 본 발명의 항체의 다른 단편을 이용하면 고유 항체 분자에 대해 본 발명에서 상술하고 있는 카스파제-8 상호작용 단백질의 감지와 정량을 할 수 있다. 이와 같은 단편은 일반적으로 파파인(Fab 단편을 만듦) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 만듦)과 같은 효소를 이용하여 단백질 분해에 의해 만들 수 있다.
항체는 분자에 특이적으로 반응한다면 특이적으로 분자에 "결합할 수 있는 능력"이 있는 항체에 분자가 결합한다. "에티토프"는 항체에 의해 인지되어 항체가 분자의 임의 부분에 결합할 수 있는 부분을 말한다. 에피토프 또는 "항원 결정부위"는 일반적으로 아미노산 또는 당의 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성이 있는 표면 그룹으로 구성되고 3차 구조적인 특징 및 특이적인 전하 특징을 가진다.
"항원"은 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 만들기 위해 동물에 추가 유도할 수 있는 항체에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가진다. 상기에서 언급한 특이적인 반응은 매우 특이적인 방식으로 항원에 상응하는 항체에 반응을 하고 다른 항원에 의해 야기되는 다른 항체에는 반응하지 않는다는 것을 말한다.
본 발명에 유용한 항체의 일부분을 포함하는 항체를 이용하여 샘플에서 카스파제-8 상호작용 단백질을 정량 또는 정성적으로 감지하거나 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질을 발현시키는 세포의 존재를 확인할 수 있다. 이는 광 현미경, 흐름 세포 계산기 또는 형광측정 감지기가 결합된 형광 표지된 항체(하기 참조)를 이용한 면역형광 기술을 이용한다.
본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 조직학적으로 이용하여 면역형광 또는 면역전자 현미경에서 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질의 in situ 감지한다. In situ 감지는 환자에서 조직학적 견본을 떼내고, 본 발명의 표지된 항체를 견본에 제공하여 이루어진다. 항체(또는 이의 단편)는 생물학적 샘플에 표지된 항체(또는 이의 단편)를 제공하거나 겹치게 하여 적절하게 제공할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여 카스파제-8 상호작용 단백질의 존재를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 검사한 조직에서 이의 분포를 알 수 있다. 본 발명을 이용하면, 당업자는 이와 같은 in situ 감지를 위해 광범위한 다양한 조직학적 방법(가령 착색 과정)을 변형시킬 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질의 생물학적 검사는 일반적으로 카스파제-8 상호작용 단백질을 확인할 수 있는 감지 가능한 표지된 항체 존재하에 생물학적 유체, 조직 추출물, 임파세포 또는 백혈구세포와 같은 새로 수득한 조직 또는 조직 배양물에서 배양된 세포를 배양하고, 공지의 여러 가지 방법을 이용하여 항체를 감지하는 것으로 구성된다.
생물학적 샘플은 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 지지체 또는 담체와 같은 고형상 지지체 또는 담체로 처리한다. 지지체 또는 담체는 전술한 것과 같이 본 발명에 따른 감지 가능한 표지된 항체로 처리한 후에 적절한 완충액으로 세척한다. 고형상 지지체 또는 담체를 다시 세척하여 결합안된 항체를 제거한다. 고형상 지지체 또는 담체에 결합된 라벨의 양을 통상적인 방법을 이용하여 감지한다.
"고형성 지지체", "고형상 담체", "고형 지지체", "고형 담체", "지지체" 또는 "담체"는 항원 또는 항체가 결합할 수 있는 임의 지지체 또는 담체를 의미한다. 공지의 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 아밀라제, 천연 또는 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다. 천연 담체는 본 발명의 목적을 위해 어느 정도의 가용성 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 임의 가능한 구조적인 모양을 가질 수 있다. 따라서, 지지체 또는 담체 모양은 비드와 같은 원형, 시험관의 내부 또는 막대의 외부와 같은 실린더형이 될 수 있다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 스트립등과 같은 편평한 것일 수 있다. 적절한 지지체 또는 담체는 폴리스테렌 비드를 포함한다. 당업자는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 다른 적절한 담체를 이용할 수 있고 임의 실험을 통하여 결정할 수 있다.
상기에서 언급한 것과 같이 본 발명의 주어진 항체에 대한 결합 활성은 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험을 이용하여 각 측정에 적합한 실험 조건을 결정할 수 있다.
세척, 교반, 혼합, 여과등과 같은 다른 과정은 특정 상황에 따라 또는 통상적인 과정에 따라 추가할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 효소를 연결하여 감지가능한 표지를 하는 한 가지 방법으로 효소 면역검사(EIA)에 이용할 수 있다. 다시 이와 같은 효소는 적절한 기질에 노출되었을 때, 분광광도계, 형광 측정 또는 다른 시각적 수단등으로 감지할 수 있는 화학적 부분을 만드는 방식으로 기질과 반응한다. 항체에 감지가능한 표지를 하는데 이용되는 효소로는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 곰팡이 알코올 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레이즈, 카탈라제, 포도당-6-포스페이트 디하이드로 게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린-에스테라제 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 효소에 대한 발색 기질을 이용하는 발색 방법으로 감지할 수 있다. 유사하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 감지할 수 있다.
다양한 다른 면역검사를 이용하여 감지할 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편에 방사능활성 표지를 함으로써, 방사능 면역검사(RIA)를 통한 R-PTPase를 감지할 수 있다. RIA에 대해서는 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY(1978) with particular reference to the chapter entitled "An Imtroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard. T.에 상세하게 기술하고 있다. 방사능활성 에피토프는 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사 등에 의해 감지될 수 있다.
형광 화합물로 본 발명에 따른 항체를 라벨할 수 있다. 형광 표지된 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키면, 형광이 존재하기 때문에 존재를 확인할 수 있다. 흔히 이용되는 형광 표지 화합물중에는 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플로로카민 등이 포함된다.
항체는 152E 또는 다른 란탄이드과 같은 형광을 발생하는 금속을 이용하여 표지를 할 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 기를 이용하여 항체에 결합할 수 있다.
항체는 화학적 발광 화합물에 결합시켜 감지 가능한 표지를 할 수 있다. 화학적 발광 화합물이 결합된 항체는 화학 반응 과정동안에 발생하는 발광을 존재를 감지함으로써 결정할 수 있다. 특히 유용한 화학적 발광 표지 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 트레오마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리딘염 및 옥살레이트 에스테르이다.
유사하게, 생물학적 발광 화합물을 이용하여 본 발명의 항체를 표지시킬 수 있다. 생물학적 발광은 촉매 단백질이 화학적 발광 반응의 효과를 증가시키는 생물계에서 볼 수 있는 일종의 화학적 발광이다. 생물학적 발광의 존재는 발광의 존재를 감지하여 결정할 수 있다. 표지를 목적으로 하는 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린이 있다.
본 발명의 항체 분자는 "two-site" 또는"sandwich" 검사로 공지된 면역측정 검사에 이용할 수 있다. 일반적인 면역측정 검사에서 표지안된 항체(또는 항체의 단편)의 양은 고형 지지체 또는 담체에 결합된 것이고 감지 가능한 표지된 가용성 항체를 첨가하면 고형상 항체, 항원 및 표지된 항체간에 형성된 세 가지 복합체의 감지 및 정량할 수 있다.
일반적인 그리고 적절한 면역측정 검사에는 "forward" 검사를 포함하는데 이는 고형상에 결합된 항체를 우선 고형상과 항원 복합체를 형성할 수 있도록 샘플에서 항원을 추출하기 위해 샘플과 접촉시킨다. 적절한 배양 기간 후에, 고형상 지지체 또는 담체를 세척하여 반응 안한 항원을 포함하는 유체 샘플 잔류물을 제거하고 양을 모르는 표지된 항체를 포함하는 용액과 접촉시킨다(이는 "reporter" 분자 로 작용을 함). 고형 지지체 또는 담체에 결합된 항원 복합체에 표지된 항체를 결합시키기 위한 제2배양 기간 후에, 고형 지지체 또는 담체는 2번째로 세척하여 반응 안된 표지 항체를 제거한다.
또 다른 형태의 "sandwich" 검사는 본 발명의 항원을 유용하게 이용하는 것으로 소위 "simultaneous" 또는 "reverse" 검사를 이용한다. 동시검사는 고형상 지지체에 결합된 항체와 표지된 항체를 동시에 테스트할 샘플에 첨가하는 1단계 배양 단계로 구성된다. 배양이 완료된 후에, 고형상 지지체 또는 담체를 세척하여 유체 샘플 잔류물과 결합 안된 표지된 항체를 제거한다. 고형상 지지체 또는 담체와 연합된 표지된 항체는 "forward" 샌드위치 검사와 같이 결정된다.
"reverse" 검사에서, 유체 샘플에 표지된 항체 용액을 우선 첨가하고 적절한 배양 시간후에 고형 지지체 또는 담체에 라벨 안된 항체를 첨가한다. 제2배양 후에, 고형상은 통상의 방식으로 세척하여 테스트할 샘플에 잔류물과 반응 안된 표지된 항체 용액을 제거한다. 고형 서포트 또는 담체와 연합된 표지된 항체는 "simultaneous" 또는 "forward" 검사와 같이 결정할 수 있다.
면역검사
RIA 또는 ELISA와 같은 면역검사는 여러 문헌에 공지되어 있고, WO 97/03998, p. 48, line 4 to p.52, line 27의 것을 참고로 하였다. 본 발명의 면역검사는 일반적으로 두 가지 타입인데, 첫째로는 고정된 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 이의 등가 펩티드를 이용하는 면역검사는 카스파제-8를 정량화시키는데 이용하는 것이다. 둘째로, 카스파제-8 상호작용 단백질의 에피토프에 상응하는 고 정된 항체를 이용하는 면역검사는 카스파제-8 상호작용 단백질을 정량화시키는데 이용된다.
이와 같은 검사를 진단에 이용하여, 아팝토시스에 관련된 카스파제-8 및 다른 단백질의 수준을 이 과정에 관계할 가능성이 있는 여러 질병 및 증상에서 평가한다.
핵산
본 발명의 선별에서 얻는 클론은 부분 클론이 될 것으로 예상된다. 필요한 경우, 완전 클론의 획득은 상기에서 추가로 설명하였다. 본 발명의 선별과정동안 발견된 완전 클론과 부분 클론의 DNA 서열은 다양한 용도에 사용된다.
가령, 카스파제-8 상호작용 단백질의 발현을 조작하기 위하여, 세포에 앤티센스 RNA를 생산하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 카스파제-8 상호작용 단백질을 코딩한 완전 또는 부분 cDNA는 프로모터를 포함한 발현벡터로 삽입한다. cDNA의 3'말단은 프로모터의 3'말단에 접하도록 삽입하는데, cDNA의 5'말단은 상기 cDNA로 인해 프로모터의 3'말단과 떨어져 위치하게 된다. 세포에서 cDNA의 발현 직후, 단백질을 코딩할 수 없는 앤티센스 RNA가 만들어진다. 세포에서 앤티센스 RNA가 존재하면, 카스파제-8 상호작용 유전자의 세포(게놈)내 사본의 발현이 감소된다.
앤티센스 RNA 생산의 경우, 완전 cDNA를 사용할 수 있다. 대안으로, 이의 단편을 사용할 수 있는데, 이 단편의 길이는 바람직하게는 9 내지 2,000개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 15 내지 500개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 30 내지 150개 뉴클레오티드가 된다.
단편은 바람직하게는 cDNA의 5'절반내 영역, 좀더 바람직하게는 5' 비번역영역 및/또는 제 1 엑손 영역으로 이루어진 5'영역, 가장 바람직하게는 ATG 번역 개시위치를 포함한 5'영역에 상응한다. 대안으로, 단편은 5'비번역 영역의 DNA 서열에만 상응한다.
합성 올리고뉴클레오티드를 앤티센스 올리고뉴클레오티드로 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 가급적 DNA 올리고뉴클레오티드다. 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 바람직하게는 9 내지 150개, 좀더 바람직하게는 12 내지 60개, 가장 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드가 된다. 앤티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 덮이는 영역에는 바람직하게는 cDNA의 3' 비번역 영역이 포함되고, 좀더 바람직하게는 폴리아데닐화 신호, 번역 종결코돈, 또는 둘 모두가 포함된다.
앤티센스 RNA의 작용기작 및 앤티센스 이용기술의 현재 수준은 Kumar et al. Microbiol Mol Biol Rev. 62, p. 1415-1434, 1998에서 검토하였다. BMP 수용체 합성의 억제에서 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 용도는 Yeh et al. J Bone Miner Res. 13,. p. 1870-9, 1998에서 제시하였다. 압력-의존 칼륨 채널 유전자 Kv1.4의 합성억제에서, 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 용도는 Meiri et al. PNAS 95, p. 15037-15042, 1998에서 제시하였다. Bcl-x 합성의 억제에서 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 용도는 Kondo et al., Oncogene 17, p. 2585-91, 1998에서 제시하였다.
앤티센스 약물의 치료요법적 용도는 Stix in Sci Am. 279, p. 46, 50, 1998, flanagan, Cancer Metastasis Rev 17, p. 169-76, 1998, Guinot and Temsamani, Pathol Biol (Paris) 46, p. 347-54, 1998에서 제시한다.
앤티센스 올리고뉴클레오티드를 구상하는 경우, 원하는 성질을 강화하기 위하여 올리고뉴클레오티드를 변형시킨다. 가령, DNA에 자연적으로 발생하는 포스포에스테르 결합대신, 포스포로티오에이트 결합을 이용하는데, 그 이유는 이런 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 세포 효소에 의해 분해될 가능성이 적기 때문이다. Peng등은 혼성 포스포디에스테르-포스포로티오에티트 골격을 이용하는 경우, 포스포로티오에티트 올리고뉴클레오티드의 in vivo 부작용을 줄일 수 있다고 지적하였다. 가급적, 올리고뉴클레오티드의 60%가 변형된 2'메톡시리보뉴클레오티드를 이용한다. 이런 변형된 올리고뉴클레오티드는 포스로로티오에이트 올리고뉴클레오티드에서 관찰되는 효과와 유사한 앤티센스 효과를 유도할 수 있다. Peng 등은 또한, 리보뉴클레아제 H 활성을 뒷받침할 수 없는 올리고뉴클레오티드 유사체는 불활성이라고 지적하였다.
따라서, 본 발명의 적절한 앤티센스 올리고뉴클레오티드는 혼성 포스포디에스테르-포스포로티오에이트 골격을 갖는다. 좀더 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 30% 내지 80%, 가장 바람직하게는 60%가 변형된 2'메톡시리보뉴클레오티드를 사용한다.
앤티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 변형시킬 수 있다. 가령, 올리고뉴클레오티드 분자는 선택적으로 부분불포화된 지방성 탄화수소 사슬 및 하나 또는 복수의 극성 기, 예를 들면, 카르복실산기, 에스테르기, 알코올기로 이루어진 그룹에 연결할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 펩티드 구조체와 연결할 수 있는데, 상기 구조체는 가급적 막지향성 펩티드가 된다. 이런 변형 올리고뉴클레 오티드는 막을 좀더 쉽게 통과하는데, 이것은 이들의 기능에 매우 중요하고, 따라서, 이들의 활성을 상당히 향상시킨다. 뇌까지 이동해야 하는 앤티센스 약물에서 막 투과성은 특히 중요하다. 팔미틸-연결된 올리고뉴클레오티드는 Gerster et al. Anal Biochem. 262, p. 177-84, 1998에서 제시한다. 게라니올-연결된 올리고뉴클레오티드는 Shoji et al., J Drug Target 5, p. 261-73, 1998에서 제시한다. 펩티드, 예를 들면, 막지향성 펩티드에 연결된 올리고뉴클레오티드 및 이들의 제조는 Soukchareun et al., Bioconjug Chem 9, p. 466-75, 1998에서 제시한다. 분자가 특정 표적세포로 향하도록 하여, 상기 표적세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 흡착을 강화시키는 앤티센스 분자 또는 다른 약물의 변형체는 Wang, J Controlled Release 53, p. 39-48, 1998에서 제시한다.
리보자임
유전자의 mRNA 서열이 공지된 경우, 리보자임을 구상할 수 있는데, 이것은 상기 mRNA 서열과 특이적으로 결합하고, 이를 분해시키는 RNA분자다(Chen et al., Ann, NY Acad. Sci. 660, 271-3, 1992, Zhao and Pick, Nature 365, p. 448, 1993, Shore et al., Oncogene 8, 3183, 1993, Joseph and Burke, J. Biol. Chem. 268, 24515, 1993, Shimayama et al., Nucleic Acids Symp Ser 29, p. 177, 1993, Cantor et al., PNAS 90, p. 10932, 1993).
따라서, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질의 mRNA를 분해시키는 리보자임을 인코딩하는 RNA 서열을 구상할 수 있다. 분해지점은 바람직하게는 코딩영역 또는 5'비번역 영역, 좀더 바람직하게는 AUG 번역 개시코돈에 가까운 코딩 영역의 5'말단에 위치한다.
본 발명에 따른 리보자임을 인코드한 DNA는 DNA 흡착, 변형된 DNA(후술한 바와 같이 막 투과성을 강화시킨 올리고뉴클레오티드와 단백질의 변형체)의 흡착 또는 바이러스 벡터-매개의 유전자 전달로 세포로 도입할 수 있다.
카스파제-8 상호작용 단백질, 펩티드, DNA의 세포로의 도입
본 발명은 카스파제-8 상호작용 단백질, 이에서 유래된 펩티드, 앤티센스 DNA 분자, 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이들 수단을 치료요법 또는 연구에 관련하여 사용하는 경우, 이들은 살아있는 미생물의 세포로 도입해야 한다. 이를 위해, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드의 막투과성을 향상시키는 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드의 막투과성을 향상시키는 방법은 전술하였다. 동일한 원리, 다시 말하면, 지질친화성 구조체를 이용한 유도체화(반응)로 막 투과성이 강화된 펩티드와 단백질을 만들 수 있다. 가령, 전술한 것과 같은 공지된 막지향성 펩티드의 서열은 펩티드 또는 단백질의 서열에 첨가할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 단백질은 전술한 탄화수소 사슬과 같은 부분지질친화성 구조체로 유도체화할 수 있는데, 여기서 상기 탄화수소 사슬은 하나이상의 극성 기로 치환된다. 가령, 펩티드의 라우로일 유도체는 Muranishi et al., Pharm. Research 8, 649, 1991에서 제시한다. 또한, 펩티드와 단백질의 변형에는 메티오닌 잔기 산화를 통한 술폭사이드기의 생성이 포함된다(Azcharia et al., Eur. J. Pharmacol. 203, p. 353, 1991). Zacharia와 그의 동료들은 상대적으로 소수성 펩티드 결합이 이의 케토메틸렌 이소에스테르(COCH2)로 치환된 펩티드 또는 유사체를 제시한다. 막 투과성을 향상시키기 위하여, 단백질과 펩티드를 변형시키는 것은 당업자에게 공지된 것이다.
막투과성을 향상시키는 다른 방법은 수용체, 예를 들면, 바이러스 수용체를 세포 표면에 사용하여, 펩티드 또는 단백질의 세포내 흡착을 유도하는 것이다. 이런 기작은 주로 바이러스에 의해 이용되는데, 상기 바이러스는 특정 세포 표면 분자에 특이적으로 결합한다. 결합직후, 세포는 바이러스를 내부로 끌어드린다. 세포 표면 분자는 바이러스 수용체라 한다. 가령, 인테그린 분자 CAR과 AdV는 아데노바이러스에 대한 바이러스 수용체로 알려져 있다(Hemmi et al., Hum Gene Ther 9, p. 2363-73, 1998). CD4, GPR1, GPR15, STRL33 분자는 HIV에 대한 수용체/보조수용체로 확인되었다(Edinger et al. Virology. 249, p. 367-78, 1998).
따라서, 세포 표면 수용체와 결합하는 것으로 알려진 분자에 펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드를 접합시키면, 상기 펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 막투과성이 증가하게 된다. 접합체 형성을 위한 적합한 예는 자당, 비타민, 호르몬, 사이토킨, 트랜스페린, 아시알로당단백질등이다. Low et al., USP 5,108,921에서 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드의 막투과성을 향상시키기 위한 이들 분자의 용도 및 상기 접합체의 제조를 설명한다.
Low와 그의 동료들은 또한, 엽산염 또는 비오틴과 같은 분자를 이용하면, 이들 분자에 대한 수용체의 풍부하고 비특이적인 발현으로 인해, 접합체가 생물체의 다양한 세포를 표적으로 하도록 할 수 있다고 지적하였다.
본 발명의 펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 막투과성을 강화하기 위한 상기 세포 표면 단백질은 본 발명의 펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드가 특정 세포형 또는 조직을 표적으로 하도록 할 수 있다. 가령, 암세포를 표적으로 하는 경우, 이들 암세포의 표면에서 좀더 풍부하게 발현되는 세포 표면 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 예로는 엽산염 수용체, 무친 항원 MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, 당단백질 항원 KSA, 태아성 암항원, 전립선-특이적 막항원(PSMA), HER-2/neu, 사람 융모막 성선 자극 호르몬-베타를 들 수 있다. 전술한 Wang et al., 1998에서는 암세포를 표적하기 위한 엽산염의 용도를 지적하고, Zhang et al. Clin Cancer Res 4, p. 2669-76, 1998에서는 다양한 형태의 암과 정상세포에서, 전술한 다른 항원 각각이 상대적으로 풍부하게 존재한다고 지적하였다.
본 발명의 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드는 전술한 접합 기술을 이용하여, 원하는 특정 세포형을 표적으로 하도록 할 수 있다. 가령, 림프구 계통의 세포에서 아팝토시스를 강화하는 경우, 이들 세포에서 발현되는 MHC II형 분자를 이용하여, 본 발명의 카스파제-8 양성 조절단백질 또는 펩티드가 이런 세포를 표적으로 하게 한다. 이것은 상기 MHC II형 분자의 불변영역으로 이동하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 본 발명의 단백질 또는 펩티드와 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 다양한 사이토킨과 다른 시그널발생 분자에 대한 다수의 표면 수용체가 제시되고 있는데, 이들 분자의 대부분이 다소의 조직- 또는 세포-형 제한방식으로 발현된다. 따라서, T 세포의 아족을 표적으로 하는 경우, CD4 T 세포의 표면 분자를 사용하여 본 발명의 접합체를 만든다. CD4-결합 분자는 HIV 바이러스 로 제공하는데, 이의 표면 항원 gp42는 CD4 분자와 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 아팝토시스-강화 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 펩티드는 T 세포에 기초한 자가면역반응으로 고통받는 환자, 예를 들면, 홍반성 루프스 환자의 치료에서, T 세포를 표적으로 한다는 장점이 있다.
바이러스-매개의 세포내 표적
본 발명의 단백질, 펩티드, 앤티센스 서열은 바이러스 벡터를 이용하여 세포로 도입할 수 있다. 이를 위한 우두 벡터의 용도는 분자생물학의 현재 프로토콜 16장에서 자세히 제시한다. 아데노바이러스 벡터의 용도는 Teoh et al., Blood 92, p. 4591-4601, 1998, Narumi et al., Am J Respir Cell Mol Biol 19, p. 936-941, 1998, Pederson et al, J Gastrointest Surg 2, p. 283-91, 1998, Guang-Lin et al., Transplant Proc 30, p. 2923-4, 1998, Nishida et al., Spine 23, p. 2437-42, 1998, Schwarzenberger et al., J Immunol 161, p. 6383-9, 1998, and Cao et al., J Immunol 161, p. 6238-44, 1998에서 제시한다. 앤티센스 서열의 레트로바이러스 전달은 Daniel et al. J Biomed Sci. 5, p. 383-94, 1998에서 제시한다.
바이러스를 벡터로 이용하는 경우, 일반적으로 바이러스 표면 단백질을 사용하여 바이러스를 표적으로 한다. 다수의 바이러스는 상기 아데노바이러스와 같이 세포내 굴성이 비특이적이기 때문에, 세포-형 또는 조직-특이적 프로모터를 이용하여 특이성을 첨가하는 것이 바람직하다. Griscelli et al., Hum Gene Ther. 9, p. 1919-28, 1998에서는 유전자의 심장-특이적 표적화를 위한 심실-특이적 심장 근섬 유소 경사슬 2 프로모터의 용도를 지적하였는데, 상기 유전자의 전달은 아데노바이러스에 의해 매개된다.
대안으로, 바이러스 벡터를 가공하여 이의 표면에 다른 단백질을 발현시켜 또는 바이러스 벡터의 표면 단백질을 변형하여 원하는 펩티드 서열을 통합하도록 할 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터는 하나 또는 복수의 다른 에피토프를 발현하도록 가공할 수 있는데, 상기 에피토프는 상기 바이러스 벡터를 표적으로 하는데 사용한다. 가령, 사이토킨 에피토프, MHC Ⅱ형-결합 펩티드 또는 호밍 분자에서 유래된 에피토프를 이용하여, 본 발명의 지침에 따라 바이러스 벡터를 표적으로 한다.
전술한 수단의 응용
본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질은 카스파제-8의 단백분해 활성에 관여하는 카스파제-8 소단위와 특이적으로 상호작용한다. 비록 가설로 한정하지 않기를 바라지만, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질은 카스파제-8이 포함되는 신호경로에서 "하류"구성 요소다. 상류 작용제는 단백질-단백질 상호작용 도메인을 매개하는 카스파제-8 프로도메인을 통하여 결합하는 것으로 보인다. 아팝토시스 반응을 결집시키는 다수 작용제를 이용한 광범위한 교차-응수는 사멸 주효체 도메인(DED)과 관련 도메인, 예를 들면, 카스파제의 프로도메인에 위치한 도메인을 포함한 단백질-단백질 상호작용으로 매개되는 것으로 보인다. 이들 단백질과는 대조적으로, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질은 세포 사멸 과정의 직접적인 실행물질중의 하나다. 가령, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질중 하나인 Tip- 60은 히스톤 탈아세틸화효소다. 따라서, 이 단백질은 크로마틴 구조의 변화에 직접 관여하게 된다.
본 발명의 단백질과 카스파제-8과의 상호작용에 의해 다음과 같은 몇 가지 결과가 도출된다: 먼저, 카스파제-8 활성의 조절. 이것은 본 발명의 J2 클론이 카스파제-8 매개의 아팝토시스를 억제한다는 것을 보인 in vivo 분석으로 입증되었다.
둘째, 카스파제-8 상호작용 단백질은 카스파제-8의 분해를 예방하여 카스파제-8 활성을 증가시키거나 또는 억제물질로 작용하여 이의 활성을 감소시킨다.
셋째, 카스파제-8 상호작용 단백질의 활성을 조절할 수 있다. 이것은 카스파제-8 상호작용 단백질을 분해하는 카스파제-8의 능력으로 입증되었다. 이들 단백질 중의 일부는 분해로 인해 불활성화되는 것으로 보인다. 하지만, 단백질의 활성을 변화시키거나, 신규한 활성을 유도하거나, 또는 카스파제처럼 분리하여 카스파제-8 상호작용 단백질을 활성화시킬 수 있다.
결과적으로, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 항체는 카스파제-8 활성조절에 유용하다. 카스파제-8의 하향조절은 아팝토시스에 의한 과도한 세포 사멸이 발생하는 경우에 바람직하다. 가령, 일차 희돌기글리패티로 인한 다중경화증, 자가면역 포도막 망막염, 당뇨병, 루프스, 자가면역 심근염 I, 급성 간부전(병인에 상관없이), HCV-매개의 만성 간염, 만성 위염(예, A 형 위염), 혼성연결 조직 질환(MCTD), 크론병 또는 궤양성 대장염에서, 신체조직의 파괴는 아팝토시스 신호에 의해 야기되는 것으로 짐작된다. 따라서, 아팝 토시스 세포 사멸에 의해 파괴되는 세포에서, 카스파제-8 활성을 하향조절하는 것은 이런 질환에 걸린 사람에게 유익하다.
가령, 상기 희돌기패티에서, 희돌기교세포의 카스파제-8 활성을 억제하는 것이 바람직하다. 세포 표면 G-단백질-결합된 인지질 리소포스파티드산 수용체는 희돌기교세포와 다양한 다른 뇌세포에서는 발현되지만, 체내의 다른 조직에서는 발현되지 않는다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 단백질은 이들 세포를 표적으로 한다. 이것은 상기 펩티드 또는 단백질을 인지질 리소포스파티드산에 결합시키거나, 또는 상기 인지질 리소포스파티드산 수용체를 특이적으로 인식하는 항체의 서열을 바이러스 벡터로 도입하여, 상기 바이러스 벡터가 상기 인지질 리소포스파티드산 수용체와 결합하도록 하여 달성할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 단백질은 전술한 질환 및 다른 질환에 관여하는 다른 세포형을 표적으로 할 수 있는데, 여기서 과도한 아팝토시스 세포 사멸은 체내 조직 손상을 매개하는 것으로 보인다.
또한, 본 발명의 앤티센스 RNA, 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임은 다른 질환에서, 상기 희돌기교세포 또는 상응하는 세포를 표적으로 할 수 있다. 이런 경우에, 카스파제-8 자체의 발현이 아닌 카스파제-8 상호작용 단백질의 발현이 억제된다. 다수의 카스파제-8 상호작용 단백질의 발현을 억제하면, 카스파제-8의 아팝토시스 효과가 감소된다. 하지만, 특정 카스파제-8 상호작용 단백질의 발현을 감소시키면, 카스파제-8의 효과가 실제적으로 증가할 수도 있는데, 이것은 특정 카스파제-8 상호작용 단백질이 카스파제-8 활성의 음성 조절물질 역할을 할 수 있기 때문이다. 따라서, 이런 작용제를 치료용으로 고려하기에 앞서, 전술한 in vivo 분석에서, 앤티센스 올리고뉴클레오티드와 앤티센스 RNA를 이용할 경우의 효과 및 리보자임의 효과를 검사한다.
한편, 카스파제-8 활성을 증가시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 이것은 전술한 질환, 예를 들면, 홍반성 루프스와 같은 경우다. 하지만, 표적이 되는 세포형은 상이하다. 가령, 루프스에서, T 세포 개체군은 흉선에서 파괴되지 않는 자가반응성 세포를 보유한다. 따라서, 본 발명의 카스파제-8 상향조절 작용제는 T 세포를 표적으로 해야 한다. 카스파제-8 상향조절 작용제는 자가반응성 세포를 표적으로 하도록 하는 것이 바람직하다. 일부 질환, 예를 들면, 다발성 경화증에서, 특정 T 세포 클론이 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 카스파제-8 상향조절 작용제는 자가반응성 T 세포 클론의 T 세포 수용체의 불변영역에 특이적인 하나 또는 복수의 항체를 이용하여, 이런 세포를 표적으로 하는데, 상기 카스파제-8 상향조절 작용제는 본 발명에 따른 카스파제-8 상호작용 단백질 또는 펩티드가 된다.
상기 측면에서, 본 발명에는 활성물질을 포함하는 제약학적 조성물이 포함되는데, 상기 활성물질은 본 발명에 따른 하나 또는 복수의 카스파제-8 상호작용 단백질, 펩티드, 항체, 리보자임, 앤티센스 RNA 또는 앤티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명에는 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 벡터를 포함하는 제약학적 조형이 포함되는데, 여기서, 상기 벡터는 선택적으로 결합된 프로모터 및 본 발명에 따른 카스파제-8 상호작용 단백질, 펩티드, 리보자임, 앤티센스 RNA, 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 코딩한 본 발명의 DNA 서열로 이루어진다. 바이러스 벡터는 프로모터에 선택적으로 연결된 코딩서열을 선택적으로 포함할 수 있는데, 상기 프로모터는 바이러스 표면에 위치한 펩티드 또는 단백질을 인코드하고, 포유동물 세포의 표면 단백질과 결합할 수 있다. 표면 단백질은 가급적 바이러스 벡터를 흡착하고, 가급적 조직-또는 세포-형 특이적 방식으로 발현되어, 바이러스 벡터를 표적으로 할 수 있는 단백질이다.
카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편 또는 유도체를 이용하여, 동일 종류의 다른 단백질, 다시 말하면, 카스파제 또는 기능적으로 관련된 프로테아제 또는 단백질에 결합하는 단백질을 분리하고, 확인하고, 클론할 수 있는데, 상기 단백질은 세포내 시그날발생 과정에 관여한다. 본 출원에서, 전술한 곰팡이 이중-하이브리드 시스템 또는 비-엄격한 사우던 하이브리드화 및 추후 PCR 클로닝을 이용하여 최근에 개발된 시스템을 사용하였다(Wilks et al., 1989). Wilks등은 간행물에서, 2개의 추정 단백질-티로신 키나아제의 확인 및 클로닝을 설명하였는데, 여기서, 인정된 키나아제 서열인 키나아제 모티프의 공지된 서열에 기초한 비-엄격한 사우던 하이브리드화 및 추후 PCR을 실시하였다. 카스파제-8 상호작용 단백질의 서열을 이용한 본 발명에 따른 방법을 이용하여 관련된 카스파제-8 상호작용 단백질을 확인하고, 클론하였다.
본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편 또는 유도체를 이용한 다른 방법은 이들이 결합할 수 있는 다른 단백질 또는 인자, 예를 들면, 세포내 시그날발생 과정에 관여하는 다른 단백질 또는 인자를 친화성 크로마토그래피 방법으로 분리하고, 확인하는 것이다. 이런 경우, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편, 유도체는 친화성 크로마토그래피 메트리스에 개별적으로 접착되고, 이후 세포내 시그날발생 과정에 관여하는 것으로 여겨지는 세포 추출물, 분리된 단백질 또는 인자와 접촉하게 된다. 친화성 크로마토그래피 과정후, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편 또는 유도체와 결합하는 다른 단백질 또는 인자는 용출하고, 분리하고, 특성화시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체, 단편 또는 유도체는 이의 특이적인 항체를 생산하기 위한 면역원(항원)으로 사용할 수 있다. 상기 항체는 카스파제-8 상호작용 단백질, 이의 유사체 또는 이의 단편을 생산하는 세포추출물 또는 형질전환된 세포계로부터, 카스파제-8 상호작용 단백질(예, 사람 N-아세틸-글루코사민-6-인산염-탈아세틸화효소 또는 이의 동소체)을 정제하는데 사용할 수 있다. 또한, 이들 항체는 카스파제-8 매개의 FAS-R 리간드 또는 TNF 시스템의 비정상적 기능과 관련된 질병을 확인하기 위한 진단용으로 사용할 수 있다. 따라서, 이런 질환이 카스파제-8 단백질 또는 카스파제-8 상호작용 단백질을 포함하는 세포내 시그널발생 시스템의 기능이상과 관련된 경우, 상기 항체는 중요한 진단 도구가 된다.
본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질의 분리, 확인, 특성화는 임의의 잘 공지된 표준 선별 과정을 이용하여 실시할 수 있다. 가령, 이런 선별 과정중의 하나인 곰팡이 이중-하이브리드 과정을 이용하여, 카스파제-8 단백질(Stanger et al., 1995)을 확인하고, 계속해서 본 발명의 다양한 카스파제-8 상호작용 단백질(전술 및 후술한 특허 출원의 다른 다양한 신규 단백질 제외)을 확인하였다. 전술 및 후술한 바와 같이, 당분야에 잘 알려진 다른 과정, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, DNA 하이브리드화 과정을 이용하여, 본 발명의 카스파제-8 상호작용 단백질과 결합할 수 있는 다른 단백질, 인자, 수용체등을 분리하고, 확인하고, 특성화하였다.
실시예 1A
카스파제-8 상호작용 단백질의 확인을 위한 이중 하이브리드 선별
"Yeast-three Hybrid system"(Tirode F. et al. 1997)으로 설명된 변형된 곰팡이 이중 하이브리드 시스템을 이용하여, 카스파제-8 상호작용 단백질 및 이의 잠재적인 기질을 선별한다. 이용된 개별 벡터, 곰팡이 균주 및 라이브러리는 Matchmaker two-hybrid system(#PT1265-1)의 성분으로써, Clontech(Palo Alto, USA)에서 구하였다.
다른 프로모터의 제어하에서 두 개의 카스파제-8 소단위가 각각 발현된다. 짧은 p10 소단위(세린 375이 아스파르트산 479으로)은 곰팡이 Gal4 단백질(Laughon et al., Molecular and Celluar Biology, 4, 260-267, 1984에 따른 서열 번호, 아미노산 1-147)의 DNA 결합 도메인내 프레임에서 벡터 pGBT9(Clontech)로 클론시킨다. 긴, 활성이 있는 p20 소단위(세린 271이 아스파르트산 374로)는 360 위치에서 돌연변이되었는데, 예를 들면 이 위치에 있는 시스테인은 세린(C360S)으로 바뀌어, 비활성 효소에 프로테아제 활성을 제공한다. 돌연변이된 C360S p20 소단위는 메티 오닌이 보족한 배지에서 양성으로 조절되는 Met25 프로모터(Sangsoda, Mol Gen Genet. 200, p. 407-14, 1985) 제어하에서 융합안된 단백질로 발현된다. 곰팡이 세포 생장 배지에서 메티오닌 농도를 조절함으로써, p20 소단위의 발현을 구동시키는 프로모터의 활성을 조절할 수 있으면 (1)bait로 독성 단백질 소단위를 이용할 수 있고; (2) 제3의 짝 가령, p20 소단위에서 단백질-단백질 상호작용의 관계를 조절할 수 있다. p10 및 p20 발현 단위는 다른 벡터에 위치할 수도 있다. 또한, 동일한 벡터에 위치할 수도 있다. 현재 설명하는 실시예에서, 변형된 pGBT9 벡터 pGBT9-3H(Tirode et al., 참고)를 이용하였다. p20 소단위는 핵에 국소화된 시그널을 가지는 융합체로써 발현된다.
발현시에, 메티오닌이 없는 경우에, 두 소단위는 곰팡이 세포에서 서로 연합되어 있다. 두 소단위의 연합은 공동-면역침전 및 Western Blot 실험에 의해 설명할 수 있다.
pGAD GH 벡터에 클론된 B 세포 cDNA 라이브러리(Durfee et al., Genes Dev 7, 555-569)는 Dr. S. Elledge로부터 얻었다. 벡터에는 Gal4 활성 도메인(아미노산 768-881)을 포함한다. 이와 같은 GAL4 활성 도메인은 GAL4 DNA-결합 도메인과 융합되었을 때, GAL4 유전자의 실질적인 전사 활성을 유도할 수 있다(Ma and Ptashne, Cell, 48, 847-853(1987).
Keegan et al.(1986)에서 설명하는 것과 같이 GAL 상류 활성 부위(UAS.sub.G)는 Clontech에서 구한 곰팡이 균주 HF7c에서 리포터 유전자(lacZ)와 (His)선택을 할 수 있게 하는 상류 부분에 위치한다.
카스파제-8을 포함하는 플라스미드를 이용하여 HF7c 배양물을 형질전환시키고, 형질전환된 곰팡이 세포는 Clontech 곰팡이 프로토콜에서 설명하는 선택성 배지 즉, 트립토판, 루이신, 메티오닌, 티로신이 부족한 배지에서 생장시켜 선별할 수 있다. 호모세린을 80㎎/ℓ농도로 선택적으로 첨가할 수 있다.
그 다음 형질전환체 배양물은 B 세포 라이브러리를 포함하는 벡터로 추가 형질전환시키고, 그 다음 상기 히스티딘이 부족한 배지(선택성 배지)에서 도말한다.
선택적으로 선택성 배지에는 효소 히스티딘 합성효소 저해물질인 3-아미노트리아졸을 보충시킨다. 저해물질을 첨가시키면 카스파제-8 상호작용 단백질을 포함하고 있지 않는 곰팡이 세포에서 his 유전자를 구동하는 프로모터에서 누출되는 것을 조절할 수 있다. 일부 경우에, 약하지만, 비-특이적인 상호작용으로 인하여 GAL4-UAG-his 프로모터로부터 가짜 전사를 유도하여, 선택성 배지에서 생장할 수 있는 곰팡이 클론을 유도할 경우도 있다.
선택성 배지에서 생장하는 형질전환체를 선별하고, 여기에 있는 DNA 플라스미드를 추출한다. 그 다음 DNA를 HB101 박테리아에 형질도입시켜, 루이신이 부족한 배지에서 선별할 수 있도록 한다.
박테리아를 생장시키고, 그로부터 플라스미드 DNA를 추출 및 정제한 후에, 플라스미드 DNA를 SFY526 곰팡이 세포로 형질도입시킨다. 그 다음 SFY526 형질전환체의 lacZ 활성을 테스트하는데, 히스티딘 및 Xgal을 포함하는 선택성 배지에 도말시키면 된다. 곰팡이 콜로니를 Whatman 3MM No. 50 여과지(콜로리 리프팅을 위한 것, Sambrook et al., 참고)를 이용하여 들어올리고, 그 다음 알루미늄 호일에 약 20초간 두고, 약 25초간 액체 질소로 옮겨 곰팡이 세포를 냉동시키고, 약 1분간 실온에 노출시켜, 곰팡이 세포를 해동시키고, Xgal을 포함하는 Z 완충액(베타-갈락토시다제 반응 완충액(Clontech protocols, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology)으로 미리 적신 Whatmann 3MM No.1 여과지가 있는 배양접시에 둔다. 콜로니에 푸른색이 나타나는 것은 베타-갈락토시다제가 활성이 있다는 것을 나타낸다. 카스파제-8 상호작용 단백질은 통상적으로 이 검사에서 수분 내지 12시간 적절하게는 5분 내지 3시간동안 가장 적절하게는 5분 내지 1시간안에 푸른 색을 발생시킨다. 또는, Xgal을 포함하는 배지에서 액상 배양시키고, 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 분광광도계를 이용하여 배지의 흡수도를 측정함으로써 베타-갈락토시다제 활성을 정량화할 수 있다.
상기 선별 과정에서 확인된 cDNA 클론을 다른 단백질과의 상호작용에 대해서도 추가 연구하였다. 테스트할 클론을 pGAD GH 벡터에 있는 DNA 활성 도메인과 융합된 것으로 발현되는 무관한 단백질과 함께 형질전환시켜 테스트하였다.
히스티딘이 부족한 배지에서 생장할 수 있는 또는 lacZ 활성을 나타내는 이중 형질전환체는 라이브러리 클론이 비특이적으로 결합되었다는 것을 말하는 것이다.
다른 단백질과 비-특이적으로 상호작용하는 등의 "달라붙는(sticky)"것으로 알려진 단백질등의 무관한 단백질 및 다른 관련이 없는 단백질을 이용한다. 예를 들면, 라민(Lamin), RIP, RAIDD, TRAF2, MORT1에 결합하는 것에 대해 단백질을 검사한다. 일반적으로 라민-결합성 단백질을 버린다.
상기 3중 하이브리드 테스트는 lex DNA 결합 도메인에 융합된 카스파제-8 소단위 p10을 이용하여 실시한다. 적절한 벡터는 pLexA 벡터(Clontech)이다. DNA 결합 도메인으로 lexA를 이용할 경우에 곰팡이 L40 균주 또는 이의 등가체를 이용해야 한다.
상기에서 설명하는 선별 방법을 이용하여 카스파제-8 상호작용 단백질을 확인하고, in vivo 및 in vitro 절단 검사 및 시그널 변환 검사를 이용하여 추가 분석하였다.
실시예 1B
카스파제-8 상호작용 단백질 동정을 위한 이중 하이브리드 선별을 위한 변형된 Bait
변형된 카스파제-8 bait를 이용하여 곰팡이 이중 하이브리드 시스템(Figlds and Song, 1989)으로 카스파제-8 상호작용 단백질을 추가 선별한다. 카스파제-8는 bait 벡터 GBT9(Clantech)에서 단일 사슬 단백질로 발현된다. 활성 카스파제-8의 모양과 닮은 bait 단백질을 만들기 위해, 프로도메인을 제거하고, 작은 소단위 2(세린 375에서 출발하여 아스파르트산 479에서 종료되는)는 Gal4 DNA 결합 도메인에 융합한다. 작은 소단위의 C-말단은 큰 소단위 1의 N-말단과 16개 아미노산 글리신-세린-링커(GGGGSGGGGSGGGGSG)에 의해 분리된다. 활성 카스파제-8의 2개 소단위는 한 분자의 자발적인 폴딩에 의해 유도된다. 소단위 1의 활성 부위의 시스테인은 세린(sub 1 C360S)으로 돌연변이된다. 이와 같은 단일 쇄 카스파제-8가 과발현되면, 카스파제-8와 유사하게 pcDNAHis에서 과발현된 경우에 HEK 293-T 세포에 서 아팝토시스를 유도하는 능력으로 결정된 바와 같은 야생형 카스파제-8의 과발현과 유사한 기능을 나타낸다. 단일 쇄 카스파제-8의 활성은 카스파제 저해물질인 p35의 공동 발현으로 차단될 수 있다.
이중 하이브리드 선별은 상기에서 설명하는 데로 실시하나, 단 단일 쇄 카스파제-8는 pGBT9 벡터(Clontech)로부터 발현된다.
실시예 2
카스파제-8 상호작용 단백질의 동정
실시예 1A에서 설명하는 변형된 이중 하이브리드 선별을 이용하여, 특정 카스파제-8 결합 단백질을 인코드하는 몇 가지 클론을 확인하였다. 곰팡이에서 이중 하이브리드 테스트에서 클론의 특이적인 결합을 확인하였지만, 기준 단백질에 대한 결합은 감지되지 않았다. 선택된 DNA 클론을 분리하고, 서열화시켜, 하기에서 설명하는 Genbank에서 볼 수 있는 서열과 뉴클레오티드 서열을 비교하였다.
실시예 2.1
클론 L1은 Stat.1의 아미노산 690-750과 동일한 부분적인 cDNA 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다. Stat.1은 인터페론-자극을 받은 반응 요소(ISRE) 및 감마 활성화된 서열(GAS) 요소(Iffic SN, 1998)에 결합하는 전사인자로 확인되었다. Stat. 1은 최근에 구성상의 카스파제 수준을 조절하고(Kuiner et al. 1997) 카스파제-3의 in-vitro 기질(King P. et al 1998)로 작용하는데 관여하는 것으로 나타났다. Stat l이 절단되는 것은 자체가 아팝토시스 반응을 조절하는데 역할을 한다는 것을 말하는 것이다.
클론 L7은 기능이 없는 것으로 알려진 Genbank의 EST 클론(기탁번호 AA608733)의 C 말단과 거의 완벽하게 일치되는 부분적인 cDNA를 인코드하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2.3
클론 L20은 NEFA(기탁번호 462693)의 아미노산 104-420의 것과 동일한 것으로 밝혀졌다. NEFA는 잠재적인 핵 표적 시그널을 가지는 염기성 아미노산 가상 DNA 결합 도메인, 두 개의 나선-루프-나선(HLH) 모티프 부분, 나란하게 EF-핸드 모티프, EF-핸드 모티프사이에 있는 산성 아미노산이 풍부한 부분, 루이신 지퍼 모티프(Barnikol-Watanabe et al. 1994)를 포함하는 신규한 단백질이다. NEFA는 EH한, 칼슘 결합 단백질로 밝혀졌고, 세포질내에 그리고 세포 표면에 국소화되어 있으며, 배양배지에서도 감지된다. NEFA는 뉴클레오바인딘 서브페밀리에 속한다. 그러나, NEFA의 생물학적 역할에 대해서는 아직 규명되지 않았다. 클론 L2는 in-vitro 및 in-vivo 모두에서 카스파제-8에 의해 절단된다.
실시예 2.4
클론 L12는 데이터베이스에서 볼 수 있는 사람의 EST 클론(기탁번호 M62097)와 완전하게 일치하는 부분적인 cDNA를 인코드하는 것을 볼 수 있다. 클론 L12는 in vitro 프로테아제 검사에서 볼 수 있는 것과 같이, 카스파제-8에 의해 in-vitro 상에서 절단된다. 간단하게 설명하면, in-vitro 상에서 합성된 35S-표지된 단백질을 박테리아에서 생성된 카스파제-8 존재하에서 프로테아제 완충액상에서 30-60분 간 배양시킨다. 단백질 및 이의 단편은 SDS-PAGE상에서 분리하고, 그 결과는 방사능사진 또는 인산이미지로 확인할 수 있다. 프로테아제 활성은 특이적인 판카파아제 저해물질 z-VAD-플로오르메틸케톤에 의해 차단된다.
실시예 2.5
클론 L5는 Tip60 단백질(기탁번호 3024755)와 동일한 cDNA를 인코드한다는 것을 알았다. Tip60(Tat 상호작용 단백질 60kDa)은 세포 HIV-Tat 트랜서활성물질 상호작용 단백질로써 처음으로 (Kamine et al., Virology 216, 357-366, 1996)설명된 바 있고, 나중에는 히스톤 아세틸트란스퍼라제 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다(Yamamoto and Horikoshi, 1997). HIV 프로모터의 Tat 중개된 활성을 강화시키는 능력외에는 Tip60의 생물학적 역할에 대해서는 아직 밝혀지지 않고 있다.
곰팡이에서 2-하이브리드 테스트에서, 클론 L5는 카스파제-8 소단위와 p10-p20 복합체에 결합하였다. 클론 L5는 실시예 2.4에서 설명하는 in vitro 프로테아제 검사에서 카스파제-8에 의해 절단되었다. Tip60는 HeLa 및 HEK 293-T 세포에서 p55 TNF-수용체와 함께 공동 발현시에 카스파제-의존 방식으로 절단된다. 또한, 단백질 합성 저해물질없이도 TNF 처리시에 HeLa 세포에서 절단되었다. 간단하게 설명하면, 단백질을 pcDNAHis 벡터(Invitrogen)에 클론시키고, HEK 293-T 또는 HeLa 세포에서 아팝토시스 유도 단백질(p55TNF-R 또는 카스파제-8)과 함께 발현된다. 트랜스펙션후 24시간에 세포를 수득하고, 0.5-1x106의 전체 세포 용해물질을 SDS-PAGE에 얹고, 연속하여 Poly-His 항체(Sigma)를 이용하여 Western Blot를 실 시한다. 결과는 ECL로 확인할 수 있다. Tip60 단백질과 일치하는 삽입체를 인코드하는 몇 가지 cDNA 클론을 분리하였다. Tip60의 "야생형 전체 길이" 클론을 포함하는 모든 클론에는 아미노산 94(프롤린)에서 145(트레오닌)까지의 단편이 부족한 것으로 나타났다. 이 부분은 아세틸라제 활성 부위의 일부분이 아니고, 단백질 기능에 필수적인 부분이 아닌 것으로 간주된다. 200위치와 203위치에서 아스파르트산 잔기가 알라닌으로 바뀐 돌연변이체 Tip-60은 절단되지 않았다.
실시예 2.6
클론 M26은 Genbank에서 볼 수 있는 사람의 EST 클론(기탁번호 Cl8037)과 거의 완전하게 일치하는 부분적인 cDNA를 인코드하는 것으로 밝혀졌다. 곰팡이에서 2-하이브리드 테스트에서, 클론 M26는 카스파제-8 소단위 2에만 결합하였다.
실시예 3
카스파제-8 상호작용 단백질의 분리
실시예 1B에서 설명하는 이중 하이브리드 선별을 이용하여, 특이적인 카스파제-8 결합 단백질을 인코드하는 몇 가지 추가 클론을 확인하였다. 선택된 cDNA 클론을 분리시키고, 서열화시켜, Genebank에서 발견되는 서열과 하기에서 설명하는 방식으로 뉴클레오티드 서열을 비교하였다.
B-세포 라이브러리(Durfee T et al., 1993)와 Jurkat T-세포 라이브러리를 선별하였다. 표2는 클론의 제 1 군의 초기 특징을 나타낸 것이다.
Figure 112000017715218-pct00001
NEFA의 일부 및 클론 B.1의 일부분을 코딩하는 부분 클론을 실시예 1A에서 설명하는 곰팡이-이중 하이브리드 방법을 이용하여 분리하였다.
실시예 3.1
각 ESTs의 말단에 상동성인 cDNA 삽입체를 인코드하는 클론 B4(기탁번호 3327044), 클론 B17(기탁번호 H23509), 클론 B27(기탁번호 AA936350), 클론 J40(기탁번호 2887413)
실시예 3.2
CTP-포스포에놀아민 시티딜일트랜스퍼라제의 C-말단에 상동성인 cDNA를 인코드하는 클론 B11(ET, 기탁번호 D84307). ET는 인지질 대사에 관여하는 효소이고, 이는 포스포에탄올아민이 CDP-에탄올아민(Nakashima et al. 1997)으로 전환하는 것을 촉매한다. 클론 B11은 상기 실시예 2.4에서 언급하는 검사에서 설명된 것과 같이 카스파제-8에 의해 in vitro에서 절단된다.
실시예 3.3
클론 B13 및 B37은 EBV 게놈의 일부분을 인코드하는 클론의 C-말단 cDNA 삽입체를 인코드한다(기탁번호 V01555).
실시예 3.4
클론 B22는 T-세포 사이클로필린의 C-말단에 상동성인 cDNA 삽입체를 인코드한다(기탁번호 Y00052). T-세포 사이클로필린은 사이클로스포린 A 및 FK506의 세포내 수용체로 확인되었고, 고유 펩티딜프로일 cis-trans-이소메라제 활성을 가지는 것으로 확인되었다(Haendler B. et al., 1987).
실시예 3.5
클론 B33는 C-말단 뉴클레오바인딘에 상동성인 cDNA 삽입체를 인코드한다(기탁번호 2506255). 뉴클레오바인딘은 DNA 및 Ca2+ 결합 성질을 가지는 분비 단백질로써, 실시예 3.3에서 설명하는 NEFA 단백질과 매우 유사하다. 뉴클레오바인딘은 자가면역 lpr 생쥐 췌장 세포 배양물에서 항-ENA 항체 생산을 강화시키는 55kDa 단백질로 처음 설명된 바 있다(Miura K. et al., 1992). 클론 B33은 실시예 2.4 및 2.5에서 언급한 검사에서 설명한 바와 같이 in-vitro 및 in-vivo에서 모두 카스파제-8에 의해 절단되었다.
실시예 3.6
클론 J2는 무세포 시스템 및 세포에서 in vitro 발현시킬 때, ∼20kDa 폴리펩티드를 만드는 부분적인 단백질 서열을 인코드하는 600bp 삽입체를 포함한다. 클론 J2에 의해 인코드되는 폴리펩티드는 카스파제-8에 의해 in-vitro에서 절단되고, 실시예 2.4 및 2.5에서 설명하는 검사에서 p55TNF-R 또는 카스파제-8과 공동발현시에 HEK 293-T 및 HeLa 세포에서도 in-vivo 절단된다.
클론 J2의 뉴클레오티드 및 유추된 아미노산 서열은 도 2에서 제공한다.
데이터베이스에 공지된 서열과 PCR에 의한 클론 J2의 5'연장부의 비교 및 배열로 인하여 클론 J2는 사람의 EST(기탁번호 AA460869)에 상동성이 있는 것으로 나타났는데, 이는 가상적인 사람의 N-아세틸글루코자민-6-포스페이트 디아세틸라제 및 추가 클론(L48741)에 상응하는 것이고, 이로써 도 3에서 제공하는 전체 길이의 사람 N-아세틸글루코자민-6-포스페이트 디아세틸라제의 조성을 알 수 있다.
실시예 4
클론 J2의 기능조사
클론 J2의 초기 기능상의 특징에서는 이는 카스파제-8에서 저해 활성을 가지고, HEK 293-T 및 HeLa 세포에서 사람 p55TNF-R는 아팝토시스를 유도한다는 것이다. J2의 발현은 p55 TNF 수용체로 공동 트랜스펙션된 HEK 293-T 세포의 아팝토시스를 억제 또는 지연시키고 또는 도 3에서 설명하는 것과 같이 TNF 및 사이클로헥 시미드 25∼50%로 처리된 HeLa 세포의 아팝토시스를 지연 또는 억제시킨다. 아팝토시스 세포 죽음을 정량화하는 방법은 지시한 구조체로 트랜스펙션후 20시간에 베타-갈락토시다제 발현 세포의 일부분이 아팝토시스성 모양을 나타내는 지를 결정하는 것이다. 데이터는 헤아린 전체 푸른 세포에 대해 아팝토시스 징후를 나타내는 푸른 세포의 평균 비율로 나타낸다(샘플당 약 500개 세포). 또는, 그린색 형광 단백질을 표식으로 이용하여, 형광 공촛점 현미경으로 감지한다.
실시예 5
카스파제-8 상호작용 단백질의 클로닝
pACT2 벡터(Clontech, Palo Alto, USA)에서 발현되는 사람의 태반 cDNA 라이브러리는 상기 실시예 1B에서 설명하는 bait를 이용한 이중 하이브리드 선별 방법으로 선별한다. 이와 같은 선별 과정을 이용하여, 특이적인 카스파제-8 결합 단백질을 인코드하는 몇 가지 클론을 확인하였다. 클론 P16, P27, P43, P70, P74, P79는 추가 연구하였다.
cDNA 클론 P43, P16, P74의 cDNA 삽입체의 서열에서 이들은 일부 상동성 서열을 공유하는 것을 알 수 있다. 클론 P74는 가장 긴 cDNA(3000bp)를 가지고, 574개 아미노산의 유추된 오픈 리딩 프레임을 인코드하는 것으로 나타났고, 이의 분자량은 67-70kDa이다. 상기 언급한 3가지 cDNA의 서열을 공지의 데이터베이스에서 볼 수 있는 서열과 비교하였다. 클론 P43, P16, P74의 cDNA 삽입체는 Genbank (W04418 and N64095)에서 볼 수 있는 두 개 EST 클론의 서열과 일부 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 세 개 cDNA 삽입체 모두의 서열은 동일한 단백질의 상이한 접합 동소체의 3'말단으로 구성된다. 세 개 삽입체 서열을 배열하면P74의 서열내에 574개 아미노산의 오픈 리딩 프레임을 확인할 수 있다(도 5). 유사한 서열을 사람의 염색체 12q31에 위치한 또 다른 공지의 데이타베이스(RPC15-1057120; Roswell Park Cancer Institute Human PAC library)에서 확인된 게놈 클론에서 볼 수 있다. 이와 같은 PAC 클론의 서열에서 유추한 오픈 리딩 프레임은 1428개 아미노산으로(도 6), 574개 아미노산을 가지는 오픈 리딩 프레임으로 구성된다. 도 7에서는 클론 P74의 cDNA 삽입체("Cloned"로 표시함)의 유추 아미노산 서열의 오픈 리딩 프레임의 서열 배열과 PAC 클론의 유추된 아미노산 서열의 오픈 리딩 프레임의 서열("유추된 것"으로 표시함)을 배열한 것이다.
클론 P74의 유추한 아미노산 서열과 전체 PAC 클론의 유추한 아미노산 서열을 비교하면, P74에 상응하는 단백질의 전체가 5'말단에서 더 길고, 도 6에 나타낸 PAC의 서열 첫째 또는 처음 메티오닌중 하나에서 시작할 것이라는 것을 알 수 있다.
클론 P74의 서열은 또한, 생쥐와 사람의 히스톤 디아세틸라제의 매우 상동성이 큰 부분에 상당한 상동성을 나타내는 것을 알 수 있는데, 이 부분은 히스톤 디아세틸라제 효소 활성 부위를 포함하는 부분으로써, P74에 인코드된 단백질이 이들 단백질의 기능을 공유할 것이라는 것을 알 수 있다. 클론 P74의 부분 cDNA의 163-1716bp 사이 서열은 히스톤 디아세틸라제 A(기탁번호 NP_006028)에 80% 정도 상동성을 나타낸다. 클론 P74의 부분 cDNA의 385-1707bp사이에 서열은 히스톤 디아세틸라제 5(기탁번호 NP-005465)의 서열에 상동성을 나타낸다. 클론 P74의 부분 cDNA의 417-1629bp사이에 서열은 히스톤 디아세틸라제 mHDA1(기탁번호 AAD09834))의 서열에 상동성을 나타낸다. 클론 P74의 부분 cDNA의 424-1551bp사이에 서열은 히스톤 디아세틸라제 6(기탁번호 NP-006035)의 서열에 상동성을 나타낸다. PAC 서열에서 유추한 단백질 전체 길이의 아미노산 서열과 히스톤 디아세틸라제 A(Genebank 기탁번호 NP-006028.1)의 아미노산 서열 배열을 도 8에 나타내었다.
실시예 6
카스파제-8 상호작용 단백질의 기능상 특징
A) 이중 하이브리드 선별에서 확인된 cDNA 클론 J2, P16, P43, P70, P74, P79에 의해 인코드된 단백질은 TnT T7 결합된 망상적혈구 용해물질 시스템[Retyculocyte Lysate System](Promega,cat. #L4610)에서 35S 메티오닌 존재하에 망상적혈구 용해물질에서 발현시켜, SDS-PAGE 겔상에서 분리하였다(도 9A). 단백질을 발현시킨 동일한 양의 망상적혈구 용해물질을 이용하여 GST에 용합되어, 박테리아에서 발현된 상기 실시예 1B의 카스파제-8 GST-S2-S1(C360S)의 2개 소단위 융합단백질의 결합에 대해 분석하였다. 4℃에서 GST 비드만으로 1시간동안 선-처리한 후에, 단백질을 생산하는 TnT는 GST 비드와 함께 1시간 배양함으로써 GST 비드에 결합된 카스파제-8 GST-S2-S1 융합 단백질로 침전되고, GST 침전물은 세척하고, SDS를 포함하는 샘플 완충액에서 끓여 비드로부터 카스파제-8에 결합하는 단백질을 분리시키고, SDS-PAGE를 이용하여 해리시킨다. 카스파제-8에 결합할 수 있는 단백질은 방사능사진으로 볼 수 있다. Fas 아팝토시스 시그날발생 경로에서 카스 파제-8의 가장 가까운 기질로 공지된 Bid에 GST-S2-S1(C360S)가 결합하는 것과 비교하였을 때, 클론 P74에 의해 인코드된 단백질은 in vitro에서 카스파제-8에 특이적으로 결합하는 것으로 보인다(도 9B). 망상적혈구 용해물질에서 생산된 전체 크기의 단백질을 도면에서 별표로 표시하였다.
상기 실시예 1A에서 설명한 이중 하이브리드 테스트에서, P74에 의해 인코드된 단백질은 카스파제-8의 작은 소단위로 발현된 것이 아닌 카스파제-8의 2개 소단위에 의해 인코드된 융합 단백질에 결합하였다. 대조적으로, 상기 실시예에서 언급한 다른 단백질 가령, Tip60은 단독으로 발현되는 경우에 카스파제-8의 작은 S2 소단위에 결합하지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
B) P43 cDNA에 의해 인코드된 단백질은 TnT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System을 이용한 35S 메티오닌 존재하에 in vitro에서 망상적혈구 용해물질에서 발현되고, 히스티딘 tag된 소단위 2-소단위 1(S2-S1) 융합 단백질로써 대장균(E. coli)에서 발현된 재조합 야생형 또는 돌연변이 카스파제-3 또는 카스파제-9 또는 카스파제-10에 의해 절단된다. 카스파제-8은 소단위 1-소단위 2(S1-S2)-히스티딘 tag 융합 단백질로 발현된다. 총 박테리아 용해물 1용적 및 4용적(각 1 또는 4 상대 단위(RU)로 나타냄)을 단백질 검사에 이용한다(도 10). 간단하게 설명하면, in vitro에서 합성된 35S 표지된 단백질은 박테리아에서 생성된 카스파제-8 존재하에 37℃에서 프로테아제 완충액상에서 30분간 배양시킨다. 단백질 및 이들의 단편은 SDS-PAGE상에서 분리시키고, 그 결과는 방사능사진 및 인산-영상기등을 이용하여 확인할 수 있다. 결과에 따르면, 기질로 이용된 P43 cDNA에 의해 인코드된 단백질 은 카스파제-8에 의해 효과적으로 절단되지만, 카스파제-10에서는 절단이 잘 안되고, 카스파제-3 또는 카스파제-9에 의해서는 절단되지 않았다(도 10). 따라서, 단백질은 카스파제-8의 특이적인 기질이라는 것을 알 수 있다.
C) TNF 수용체 시그날발생 경로에 의해 유도된 아팝토시스 세포 죽음에서 새로 클론된 단백질의 효과를 분석하기 위해, 선택된 cDNA들을 pcDNA 3.1/His C 발현벡터(Invitrogne)에 클론시키고, HEK-293-T 세포로 pcDNA3 벡터(Invitrogen)에서 발현된 p55 TNFR 수용체와 pEGFPCl 발현벡터(Clontech)로부터 발현된 그린 향광 단백질(GFP)로 일시적으로 공동트랜스펙션시킨다. Tip60 cDNA와 처음 32 N-말단 아미노산이 부족한 △32-Tip60을 pCGN 벡터에 클론시키는데(M.Tanala and W.Herr, Cell 60, 375-386, 1990), 이때 헤마글루티닌(HA) tag가 cDNA의 N 말단에 융합되어 있고, 이를 이용하여 동일한 실험을 한다.
24시간후에, 트랜스펙트된 세포는 형광 현미경하에서 검사하고, 세포 죽음은 형광 세포 전체 집단에서 아팝토시스성 모양을 나타내는 세포의 수를 헤아려 계산한다. pcDNA-His 벡터에 클론된 부분적인 cDNA에서 과발현된 P74 단백질은 p55 TNF 수용체를 과발현시켜(도 11) 또는 카스파제-8의 융합된 2개 소단위의 과발현으로(자료는 없음) HEK-293-T 및 HeLa 세포를 보호하는 것을 알 수 있다. 야생형 Tip60과 절단되지 않은 Tip60 돌연변이(이때 위치 200 및 203의 아스파르트산은 알라닌 잔기로 치환됨)는 p55 TNF 수용체를 과발현되어 유도된 세포 죽음으로부터 HEK-293-T 세포를 보호하는 반면에 처음 32 N-말단 아미노산이 부족한 △32-Tip60는 이와 같은 보호 효과를 나타내지 않았다.
본 발명에서 충분히 설명하는 바와 같이, 당업자는 다양한 등가의 변수, 농도, 조건등의 범위내에서 본 발명의 범위에 벗어나지 않고 과도한 실험없이도 동일하게 실시할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명은 특정 구체예로 설명을 하고 있지만, 이 구체예를 추가 변형시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원은 본 발명의 원리, 본 발명이 포함하는 분야에서 출발하여 본 발명의 임의 변화, 용도, 범위를 포함하며, 청구범위내에서 제시한 바의 기본적인 특징에 이용할 수 있을 것이다.
저널, 요약서, 공고 또는 미국 및 다른 외국 출원, 미국 특허 및 외국 특허 또는 임의 다른 참고문헌을 포함하여 여기에서 언급한 모든 문헌은 모든 자료, 표, 도면, 내용등을 포함하여 함께 제시한다. 추가로, 여기에서 언급한 모든 문헌의 모든 내용을 포함한다.
공지의 방법, 통상적인 방법 및 그 단계등을 언급함은 본 발명의 임의 설명 또는 구체예를 당분야에 제시하는 또는 설명하는 것을 허용하는 것은 아니다.
특정 구체예의 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 충분히 나타내는 것으로 당분야에 속하는 지식을 응용하여, 과도한 실험없이 그리고 본 발명의 일반적인 범위를 벗어나지 않고 이와 같은 특정 구체예를 변형 또는 다양하게 응용할 수 있다. 따라서, 이와 같은 변형 및 응용은 본 발명에서 제시하는 것을 기초로 하여 상기 설명하는 구체예의 범위내에 속한다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 설명하는 용어등은 본 발명을 설명하기 위함으로, 이에 한정하는 것이 아니고, 본 발명에서 기술적인 용어등은 여기에서 설명하는 것으로 당업자의 일반적인 지식을 이용하면 당업자가 이해할 수 있을 정도의 것이다.
참고문헌
Ahmad M et al. Cancer Res 1997; 57(4):615-9
Bamikol-Watanabe S. et al. Biol Chom Hoppe Seyler 1994;375(8):497-512
Cohen OM Biochem J 1997;326 (Pt1). 1-16
Duan H et al. Nature 1997;385(6611):86-9
Durfee T et al. Genes Dev 1993;7(4)..SSS-69
Femandes-Alnemri T et al. ProcNariAcadSciUSA1996;93(15):7464-9
Fields S, Song 0 Nature 1989;340(6230):245-6
Haendler B. er al. EMBO J 1987;6(4):947-50
lhle JN Cell 1996;84(3)..331-4
Kamine J. et al. Virol@ 1996;216(2):357-66
King P et al. J Biol Chem 1998;273(15)..8699-704
Kischkel FC et al. EMBO J 1995; 1 4(22);5579-88
Kumar A et al. Science 1997:278(5343):1630-2
Quelle FW et al. J Biol Chem 1995;270(35):20775-85
MacFarlane M et al. JBiol Chem 1997;272(41):25417-20
Mittl PR et al JBiol Chem 1997;272(10):6539-47
Miura K et al. Biochem Blophys Res Commun 1992; 1 87(1), 3 75-80
Muzio M et al JBiol Chem 1998.,273(5):2926-30
Nagata S et al. Cell 1997;88(3):355-65
Nakashima A et al. JBiol Chem 1997;272(14):9567-72
Nicholson DW et al. Tren&Biochem Sci 1997;22(8):299-306
Rotonda J et al Nat Struct Siol 1996;3(7):619-25
Salvesen GS et al. Cell 1997;91(4):443-6
Srinivasula SM et al. ProcNatlAcadSciUSA1996;93(25):14486-91
Srinivasila SM et al. JBiot Chem 1998;273(17)..10107-11
Thornberry NA et al. JBiol Chem 1997;272(29):17907-11
Tirode F et al. J Biol Chem 1997;272(3 7):22995-9
Yamamoto T et al. JBiol Chem 1997;272(49):30595-8
Yang X et al. Mol Cell 1998;1(2).319-25
SEQUENCE LISTING <110> WALLACH, David SCHUCHMANN, Marcus GONCHAROV, Tanya Yeda Research and Development Co. Ltd. <120> Caspase-8 Interacting Proteins <130> Caspase-8 <140> <141> <150> 132105 <151> 1999-09-28 <150> 127721 <151> 1998-12-24 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cggcacgagg gcctgggcaa cggccggcac acgctgggac agcaggaagt ggaagtggac 60 ggtctgacgg cctacgtggc aggtgagcgc cctgacccac tgggtcccag gtcccagccc 120 gcatgccagg tggcccacga cccccccaga gcctgccctc tctgctctca aggcaccaag 180 acgctgagtg gcagcatagc cccaatgaac gtctgtgtcc gggcacttcc tgcaggccac 240 aggttcagca tgaagtcggc cttgaaggct gcatccttgc accccgccca gttgctgggg 300 ctggagaaga gtaaggggac cttgactttg gtgctgacgc agacttcgtg gtgctcgacg 360 actcccttca cgtccaggcc acctacatct cgggtgagct ggtgtggcag gcggacgcag 420 ctaggcagtg acaaggacct cggctga 447 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg His Glu Gly Leu Gly Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Gln Gln Glu 1 5 10 15 Val Glu Val Asp Gly Leu Thr Ala Tyr Val Ala Gly Glu Arg Pro Asp 20 25 30 Pro Leu Gly Pro Arg Ser Gln Pro Ala Cys Gln Val Ala His 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Asn Ile Thr Leu Gly Leu Pro Ala Thr Gly Pro 305 310 315 320 Ser Ala Gly Thr Ala Gly Gln Gln Asp Thr Glu Arg Leu Thr Leu Pro 325 330 335 Ala Leu Gln Gln Arg Leu Ser Leu Phe Pro Gly Thr His Leu Thr Pro 340 345 350 Tyr Leu Ser Thr Ser Pro Leu Glu Arg Asp Gly Gly Ala Ala His Ser 355 360 365 Pro Leu Leu Gln His Met Val Leu Leu Glu Gln Pro Pro Ala Gln Ala 370 375 380 Pro Leu Val Thr Gly Leu Gly Ala Leu Pro Leu His Ala Gln Ser Leu 385 390 395 400 Val Gly Ala Asp Arg Val Ser Pro Ser Ile His Lys Leu Arg Gln His 405 410 415 Arg Pro Leu Gly Arg Thr Gln Ser Ala Pro Leu Pro Gln Asn Ala Gln 420 425 430 Ala Leu Gln His Leu Val Ile Gln Gln Gln His Gln Gln Phe Leu Glu 435 440 445 Lys His Lys Gln Gln Phe Gln Gln Gln Gln Leu Gln Met Asn Lys Ile 450 455 460 Ile Pro Lys Pro Ser Glu Pro Ala Arg Gln Pro Glu Ser His Pro Glu 465 470 475 480 Glu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Glu His Gln Ala Leu Leu Asp Glu Pro 485 490 495 Tyr Leu Asp Arg Leu Pro Gly Gln Lys Glu Ala His Ala Gln Ala Gly 500 505 510 Val Gln Val Lys Gln Glu Pro Ile Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Glu 515 520 525 Pro Pro Arg Glu Val Glu Pro Gly Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gln Glu 530 535 540 Leu Leu Phe Arg Gln Gln Ala Leu Leu Leu Glu Gln Gln Arg Ile His 545 550 555 560 Gln Leu Arg Asn Tyr Gln Ala Ser Met Glu Ala Ala Gly Ile Pro Val 565 570 575 Ser Phe Gly Gly His Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala 580 585 590 Ser Ala Thr Phe Pro Val Ser Val Gln Glu Pro Pro Thr Lys Pro Arg 595 600 605 Phe Thr Thr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Leu Met Leu Lys His Gln Cys 610 615 620 Thr Cys Gly Ser Ser Ser Ser His Pro Glu His Ala Gly Arg Ile Gln 625 630 635 640 Ser Ile Trp Ser Arg Leu Gln Glu Thr Gly Leu Arg Gly Lys Cys Glu 645 650 655 Cys Ile Arg Gly Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Thr Val His 660 665 670 Ser Glu Ala His Thr Leu Leu Tyr Gly Thr Asn Pro Leu Asn Arg Gln 675 680 685 Lys Leu Asp Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ser Leu Ala Ser Val Phe Val 690 695 700 Arg Leu Pro Cys Gly Gly Val Gly Val Asp Ser Asp Thr Ile Trp Asn 705 710 715 720 Glu Val His Ser Ala Gly Ala Ala Arg Leu Ala Val Gly Cys Val Val 725 730 735 Glu Leu Val Phe Lys Val Ala Thr Gly Glu Leu Lys Asn Gly Phe Ala 740 745 750 Val Val Arg Pro Pro Gly His His Ala Glu Glu Ser Thr Pro Met Gly 755 760 765 Phe Cys Tyr Phe Asn Ser Val Ala Val Ala Ala Lys Leu Leu Gln Gln 770 775 780 Arg Leu Ser Val Ser Lys Ile Leu Ile Val Asp Trp Asp Val His His 785 790 795 800 Gly Asn Gly Thr Gln Gln Ala Phe Tyr Ser Asp Pro Ser Val Leu Tyr 805 810 815 Met Ser Leu His Arg Tyr Asp Asp Gly Asn Phe Phe Pro Gly Ser Gly 820 825 830 Ala Pro Asp Glu Val Gly Thr Gly Pro Gly Val Gly Phe Asn Val Asn 835 840 845 Met Ala Phe Thr Gly Gly Leu Asp Pro Pro Met Gly Asp Ala Glu Tyr 850 855 860 Leu Ala Ala Phe Arg Thr Val Val Met Pro Ile Ala Ser Glu Phe Ala 865 870 875 880 Pro Asp Val Val Leu Val Ser Ser Gly Phe Asp Ala Val Glu Gly His 885 890 895 Pro Thr Pro Leu Gly Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Arg Cys Phe Gly Tyr 900 905 910 Leu Thr Lys Gln Leu Met Gly Leu Ala Gly Gly Arg Ile Val Leu Ala 915 920 925 Leu Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Ala Ile Cys Asp Ala Ser Glu Ala 930 935 940 Cys Val Ser Ala Leu Leu Gly Asn Glu Leu Asp Pro Leu Pro Glu Lys 945 950 955 960 Val Leu Gln Gln Arg Pro Asn Ala Asn Ala Val Arg Ser Met Glu Lys 965 970 975 Val Met Glu Ile His Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Leu Gln Arg Thr Thr 980 985 990 Ser Thr Ala Gly Arg Ser Leu Ile Glu Ala Gln Thr Cys Glu Asn Glu 995 1000 1005 Glu Ala Glu Thr Val Thr Ala Met Ala Ser Leu Ser Val Gly Val Lys 1010 1015 1020 Pro Ala Glu Lys Arg Pro Asp Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Pro Pro 1025 1030 1035 1040 Leu

Claims (40)

  1. 카스파제-8의 p10 또는 p20과 상호작용할 수 있으며, SEQ ID No.:4의 아미노산 서열을 가지는 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소(N-acetylglycosamine-6-phosphate deacetylase).
  2. 제 1 항에 있어서, in vitro에서 카스파제-8에 의해 절단되는 사람의 N-아세틸글루코사민-6-인산염 디아세틸화효소.
  3. 제 1 항에 있어서, in vivo에서 카스파제-8에 의해 절단되는 사람의 N-아세틸글루코사민-6-인산염 디아세틸화효소.
  4. 제 1 항 내지 3항중 어느 한에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 코딩하는 분리된 DNA.
  5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID No.:3의 서열로 구성된 분리된 DNA.
  6. 제 5 항에 따른 분리된 DNA와 사람 CMV 프로모터와 같은 조절 서열로 구성된 벡터.
  7. 제 6 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포.
  8. 제 6 항에 따른 벡터를 포함하는 진핵 숙주 세포.
  9. 제 8 항의 진핵 숙주 세포를 단백질이 생산 및 포스트-트랜스레이션(post-translation) 될 수 있는 조건하에 생장시키고, 단백질을 분리하는 단계로 구성된 제 1 항에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 생산하는 방법.
  10. 제 7 항의 원핵 숙주 세포를 단백질이 생산될 수 있는 조건하에 생장시키고, 단백질을 분리하는 단계로 구성된 제 1 항에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 생산하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 진핵세포는 포유류, 곤충 또는 이스트 세포인 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 생산하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 세포는 HeLa 또는 293 T HEK 세포인 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 생산하는 방법.
  13. 제 5 항에 따른 DNA 서열에 상응하는 핵산 서열에 특이적인 리보자임(Ribozyme).
  14. 제 1 항에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소의 에피토프에 대응하는 항체.
  15. 제 14 항의 항체를 시약으로 하여 제 1 항에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 감지하는 면역검사법.
  16. 제 1 항에 있어서, 카스파제-8 활성을 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소.
  17. 제 13 항에 있어서, 카스파제-8 활성을 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  18. 제 14 항에 있어서, 카스파제-8 활성을 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 제 1 항에 있어서, TNF 수용체 또는 Fas-중재 효과를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소.
  20. 제 13 항에 있어서, TNF 수용체 또는 Fas-중재 효과를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  21. 제 14 항에 있어서, TNF 수용체 또는 Fas-중재 효과를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항체.
  22. 제 1 항에 있어서, 아포프톱시스를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소.
  23. 제 13 항에 있어서, 아포프톱시스를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  24. 제 14 항에 있어서, 아포프톱시스를 조절하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항체.
  25. 제 1 항에 따른 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소를 활성 성분으로 하고, 희돌기글리오패티, 자가면역 포도막 망막염, 당뇨병, 루프스, 자가면역 심근염 I, HCV 만성 간염, A 형 위염과 같은 만성 위염, 혼성연결 조직 질환(MCTD), 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료용 약학 조성물.
  26. 제 13 항에 따른 리보자임을 활성 성분으로 하고, 희돌기글리오패티, 자가면역 포도막 망막염, 당뇨병, 루프스, 자가면역 심근염 I, HCV 만성 간염, A 형 위염과 같은 만성 위염, 혼성연결 조직 질환(MCTD), 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료용 약학 조성물.
  27. 제 14 항에 따른 항체를 활성 성분으로 하고, 희돌기글리오패티, 자가면역 포도막 망막염, 당뇨병, 루프스, 자가면역 심근염 I, HCV 만성 간염, A 형 위염과 같은 만성 위염, 혼성연결 조직 질환(MCTD), 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료용 약학 조성물.
  28. 제 1 항에 있어서, 동일한 클래스에 속하는 또 다른 단백질을 분리, 동정, 클로닝하는데 이용하는 것을 특징으로 하는 사람 N-아세틸글루코사민-6-인산염 탈아세틸화효소.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA04002103A (es) * 2001-09-04 2004-06-07 Yeda Res & Dev Una proteina de union a caspasa-8, su preparacion y uso.
US20040072770A1 (en) * 2002-07-03 2004-04-15 Besterman Jeffrey M. Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-7 and 8
IL158599A0 (en) * 2003-10-26 2004-05-12 Yeda Res & Dev Methods of modulating hematopoiesis
JP5513130B2 (ja) * 2007-02-23 2014-06-04 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 金属タンパク質の活性を阻害するために有用な抗体および該抗体を含有する医薬組成物
US8809002B2 (en) * 2008-07-10 2014-08-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. MUC1, caspase-8, and DED-containing proteins
JP6710680B2 (ja) 2014-09-04 2020-06-17 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ヘモグロビン異常症を処置するためのグロビン遺伝子療法
CN104694485A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 广西壮族自治区兽医研究所 Z-ietd-fmk在提高prrsv体外培养滴度方面的应用及其方法
CN106146665B (zh) * 2016-08-31 2019-08-09 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法
JP2020510097A (ja) * 2017-03-16 2020-04-02 イミュンワーク インク．Ｉｍｍｕｎｗｏｒｋ Ｉｎｃ． リンカーユニット及びリンカーユニットを含む分子構築物

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL73883A (en) * 1984-12-20 1990-12-23 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL94039A (en) * 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
JPH0625292A (ja) * 1990-10-31 1994-02-01 Mitsui Toatsu Chem Inc タンパク質及びその遺伝子
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
WO1993016178A2 (en) * 1992-02-12 1993-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sequences characteristic of human gene transcription product
US5364503A (en) 1992-02-20 1994-11-15 Macmillan Bloedel Limited Nitric oxide treatment for ozone bleaching
IL101769A (en) * 1992-05-03 2007-02-11 Yeda Res & Dev Modulation of TNF receptor action
IL104355A (en) * 1993-01-10 2006-08-20 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
IL109633A (en) * 1994-05-11 2005-05-17 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
JP2002514903A (ja) * 1996-06-17 2002-05-21 ジンザイム コーポレイション 新規のヒト第１６染色体遺伝子、組成物、それを作製および使用する方法
US6242569B1 (en) * 1997-02-05 2001-06-05 Tularik, Inc. Regulators of apoptosis
JP2003500002A (ja) * 1998-05-29 2003-01-07 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ
US6326354B1 (en) * 1998-08-19 2001-12-04 Washington University Modulation of apoptosis with bid
CA2350415A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Inflammation-associated genes
EP1002900A1 (de) 1998-11-18 2000-05-24 SP Beton GmbH &amp; Co. KG Verkehrsflächen-Bodenbelag mit Bodenbelagelementen aus Kunststeinmaterial

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