JP2003500002A - ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ - Google Patents

ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ

Info

Publication number
JP2003500002A
JP2003500002A JP2000551010A JP2000551010A JP2003500002A JP 2003500002 A JP2003500002 A JP 2003500002A JP 2000551010 A JP2000551010 A JP 2000551010A JP 2000551010 A JP2000551010 A JP 2000551010A JP 2003500002 A JP2003500002 A JP 2003500002A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hhh
polynucleotide
sequence
seq
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000551010A
Other languages
English (en)
Inventor
バンドマン、オルガ
ヒルマン、ジェニファー・エル
ユエ、ヘンリー
ラル、プリーティ
コーレイ、ニール・シー
ゲグラー、カール・ジェイ
パターソン、チャンドラ
ボーグン、マライア・アール
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Incyte Corp
Original Assignee
Incyte Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Incyte Pharmaceuticals Inc filed Critical Incyte Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2003500002A publication Critical patent/JP2003500002A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトヒドロラーゼ相同体（ＨＨＨ）及びＨＨＨを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また本発明はＨＨＨの発現に関連する障害を診断、治療或いは予防するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、ヒトヒドロラーゼ相同体の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、生殖
障害、炭水化物代謝障害及び細胞増殖障害の診断、治療及び予防におけるこれら
の配列の使用法に関する。
【０００２】 背景技術 加水分解は、一般的な酵素機構である。種々の酵素が存在しており、その触媒
機構は、結合間に水の分子を加えることによる、基質内の共有結合の破壊を含む
。その反応は、基質内の標的結合への水分子中の酸素原子による求核攻撃を含み
、その結果、標的結合間の水分子の分裂が生じ、それにより結合を破壊し、２つ
の生成物分子を生成する。この一般的な機構は、ホスファターゼ、グリコシルヒ
ドロラーゼ、リゾホスフォリパーゼ、ペプチダーゼ及びアミドヒドロラーゼを含
む、種々の酵素に当てはまる。
【０００３】 タンパク質リン酸化／脱リン酸サイクルは、細胞活性を制御するために真核細
胞により用いられる主な調節機構の１つである。タンパク質リン酸化中に、リン
酸基は、プロテインキナーゼによってアデノシン三リン酸分子からタンパク質に
移送される。タンパク質脱リン酸中には、リン酸基は、タンパク質ホスファター
ゼによって、加水分解機構を用いて除去される。このようにして、ホスファター
ゼは、細胞成長及び分化、細胞間接触、細胞サイクル、腫瘍成形を調節する多く
の細胞シグナル伝達イベントの制御に関係する（Cohen P. (1989) Annu. Rev. B
lochem. 58:453-508）。
【０００４】 グリコシルヒドロラーゼは、２つの炭水化物間、或いは炭水化物と非炭水化物
成分との間のグリコシドボンドを分割するヒドロラーゼ酵素の大きなグループで
ある。配列類似性に基づいて、これらの酵素は、その基質特異性に従って命名さ
れる少なくとも５４のファミリに分類されている。グリコシルヒドロラーゼの例
は、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、ガラクトシダー
ゼ、シアリダーゼ、マンノシダーゼを含む。炭水化物代謝の障害は、多くの場合
にグリコシルヒドロラーゼに関連する。例えば、α−１．４−グルコシダーゼの
突然変異によって、ポンペ病を生じるグリコーゲンを蓄積するようになり、一方
、非機能的なガラクトシルセラミドに起因するガラクトセレブロシドの蓄積によ
り、クラッベ病が発生する。マンノース含有オリゴ糖の蓄積、すなわちマンノシ
ドーシスは、α−マンノシドーシスの欠乏から生じる。従って、グリコシルヒド
ロラーゼは、炭水化物代謝の障害に関係する（Davies G. and Henrissat B. (19
95) Structure 3:853-859: PROSITE documents PDOC 00621 and PDOC 00511）。
【０００５】 リゾホスフォリパーゼ（ＬＰＬ）は、細胞内脂質を代謝し、種々のアイソフォ
ームにおいて生じる広範に分布した酵素である。これらのアイソフォームは、分
子量、代謝される基質、活性のために必要とされる最適なｐＨにおいて変化する
。約１５〜３０ｋＤの小さなアイソフォームはヒドロラーゼとして機能し、６０
ｋＤ以上の大きなアイソフォームはヒドロラーゼ及びトランスアシラーゼとして
機能する。ＬＰＬのための特定の基質、すなわちリゾホスファチジルコリンによ
り、それが細胞内に形成或いは移入される際に、細胞膜の溶解が生じる。ＬＰＬ
は、アシルカルニチン、アラキドン酸及びホスファチジン酸を含む脂質因子によ
り調節される。これらの脂質因子は、炎症反応を含む、種々の経路において重要
なシグナル伝達分子である（Anderson, R.15 et al. (1994) Toxicol. Appl. Ph
armacoi. 125:176-183; Se!le, H. et al. ( 1993); Eur. J. Blochem.212:411-
416）。
【０００６】 ヒドロラーゼは、多くのタンパク質分解経路に関係する。ピログルタミルペプ
チダーゼ及びＮ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼのようなペプチダーゼは
、ペプチド結合を加水分解し、それゆえタンパク質分解に関係する。例えば、Ｎ
−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼは、標的タンパク質からＮ−末端アスパ
ラギンを分割し、それによりさらに分解するために標的をタギングすることによ
る代謝不安定性を与える。他のヒドロラーゼは、タンパク質分解中に非タンパク
質コファクタを除去することに関係する。ビオチンは、正常な代謝に関係する種
々のカルボキシラーゼのためのコファクタとして作用する不可欠な水溶性ビタミ
ンである。ビオチニダーゼ、すなわちビオチン−アミド アミドヒドロラーゼは
、ビオチン−リシン結合を分割し、タンパク質分解中にビオチンを再生できるよ
うにする。ビオチニダーゼ欠乏、或いは多数のカルボキシラーゼの欠乏により、
ビオチン再生が不十分になる（Rawlings N.D. and Barrett A.J. (1993) Bloche
m. J. 290:205-218;Barren A.J. and Rawlings N.D. (1995) Arch. Blochem. Bi
ophys. 318:247-250: Pomponio R.J. et.al. (1997) Hum. Molec. Genet. 6:739
-745）。
【０００７】 新規のヒトヒドロラーゼ相同体及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
は、生殖障害、炭水化物代謝障害及び細胞増殖障害の診断、治療お及び予防にお
いて有用な組成物を提供することができ、当分野における必要性を満足する。
【０００８】 発明の概要 本発明は、集合的に「ＨＨＨ」と呼ばれ、個別に「ＨＨＨ−１」、「ＨＨＨ−
２」、「ＨＨＨ−３」、「ＨＨＨ−４」、「ＨＨＨ−５」、「ＨＨＨ−６」及び
「ＨＨＨ−７」と呼ばれる、実質的に精製されたポリペプチド、ヒトヒドロラー
ゼ相同体を特徴とする。一態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、及びそのフラグメントからなるグループから選
択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【０００９】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配
列或いはこれらの配列いずれかのフラグメントに少なくとも９０％アミノ酸配列
同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。また本発明は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラグメントからなるグルー
プから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され、精製
されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるア
ミノ酸配列含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも９０％
ポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変
異配列を含む。
【００１０】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離され、精
製されたポリヌクレオチド、並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離され、
精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１４）、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるポリヌク
レオチド配列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチドを提供する。さらに
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、及びそのフラグメ
ントからなるグループから選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チドに少なくとも９０％ポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され、精製さ
れたポリヌクレオチド変異配列、並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１４、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離され、精製された
ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベクタを提供
する。別の態様では、発現ベクタは宿主細胞に含まれる。
【００１３】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを生
成するための方法を提供し、その方法は、（ａ）ポリペプチドの発現に適した条
件下で、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメ
ントを有する発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞
培養株からポリペプチドを回収する過程とを有する。
【００１４】 また本発明は、適当な医薬品担体とともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ
酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を提供する
。
【００１５】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに
結合する精製された抗体、並びにそのポリペプチドの精製されたアゴニスト及び
精製されたアンタゴニストを提供する。
【００１６】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの
アンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む、生殖障害
を治療或いは予防するための方法を提供する。
【００１７】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの
アンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む、炭水化物
代謝障害を治療或いは予防するための方法を提供する。
【００１８】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの
アンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む、細胞増殖
障害を治療或いは予防するための方法を提供する。
【００１９】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、及びそのフラグメントからなるグループから選択される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するた
めの方法を提供し、その方法は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列を生物学的サンプル
の核酸の少なくとも１つにハイブリダイズさせ、それよりハイブリダイゼーショ
ン複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出す
る過程とを有し、ハイブリダイゼーション複合体の存在が生物学的サンプルにお
けるそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなしている
。一態様では、生物学的サンプルの核酸は、ハイブリダイズする前にポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅される。
【００２０】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。
【００２１】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。
【００２２】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。
【００２３】 定義 「ＨＨＨ」は自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソースから
の任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒトを含む哺
乳類から得られる実質的に精製されたＨＨＨのアミノ酸配列である。
【００２４】 「アゴニスト」は、ＨＨＨに結合される際に、ＨＨＨの量を増加するか、或い
は活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタンパク質、核酸、炭
水化物或いはＨＨＨに結合し、その作用を調節する任意の他の分子を含む場合が
ある。
【００２５】 「アレル変異配列」はＨＨＨをコードする遺伝子の代替形である。アレルは、
核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ、変化したｍＲＮＡ或いは
ポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化する場合もしない場合もある。
任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を有する場合もあれば、全く
有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般に、ヌクレオチ
ドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変化はそれぞれ単
独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において１回或いは２回以
上生じる場合がある。
【００２６】 ＨＨＨをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能的に等価なＨＨ
Ｈをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入或
いは置換を含む。本定義には、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドのある特定
のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができる場合もでき
ない場合もある多形性及びＨＨＨをコードするポリヌクレオチド配列に対する通
常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適当な或いは予想外のハ
イブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク質は「変化して」
、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＨＨＨをもたらすアミノ酸残基の欠
失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置換は、ＨＨＨの生物活
性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両
親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミ
ノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン
及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性頭基（polar
head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン、グリシン及
びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、フェニルア
ラニン及びチロシンを含む。
【００２７】 「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成
分子のことである。ＨＨＨのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であり
、１４アミノ酸が最も好ましく、ＨＨＨの生物学的活性或いは免疫学的活性を保
持していることが好ましい。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミ
ノ酸配列を示すものとして表されるが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタン
パク質分子に関連する完全な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定するこ
とを意味しない。
【００２８】 「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般に当分野にお
いて周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行される（例えば、 Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Lab. oratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, pp. 1-5.を参照されたい）。
【００２９】 「アンタゴニスト」は、ＨＨＨに結合される際にＨＨＨの生物学的或いは免疫
学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパク質、核酸、
炭水化物或いはＨＨＨに結合し、ＨＨＨの作用を減少させる任意の他の分子を含
む場合がある。
【００３０】 「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆａ、Ｆ（ａｂ′） 2 及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ＨＨＨポリ
ペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さなペプチドを含む無傷
のポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことができる。動物（例えばマ
ウス、ラット或いはウサギ）を免疫するために用いられるポリペプチド或いはオ
リゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望に
より担体タンパク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される通
常用いられる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む。その後結合されたペプチドを用いて動
物を免疫する。
【００３１】 「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すなわちエピトープ）
のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿主動物を免疫する
際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次元構造体
に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或いは構造体
は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原（
すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と競合する場合があ
る。
【００３２】 「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド
配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相
補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸を含み
、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができる。一度細胞内に
導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然配列と結合し、二
重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「負（マイナス）」
はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プラス）」はセンス
鎖を示す場合に用いられることがある。
【００３３】 「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは生化学的機能を有
するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然、組換え或いは合
成ＨＨＨ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において特
異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のことである。
【００３４】 「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度条件下でのポ
リヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、
相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のあ
るものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が一本鎖分子間
に存在する場合には「完全」である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合いは、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これは核
酸鎖間の結合に及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用に依存する増幅
反応において特に重要である。
【００３５】 「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」或いは「所与のアミノ酸配列を
含む組成物」は、所与のポリヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の
組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態或いは水溶液状態を含む。Ｈ
ＨＨをコードするポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む組成物は
ハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。そのプローブは凍
結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と関連することもできる。ハ
イブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類（例えばＮａＣｌ）、界面活性
剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮ
Ａ等）を含む水溶液に分散される場合もある。
【００３６】 「コンセンサス配列」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するために再配
列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer, Norwal
k, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント構築用コ
ンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GCG, Madis
on WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されてい
るもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コンセンサ
ス配列を生成している。
【００３７】 「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析によるＨＨＨをコ
ードするポリヌクレオチドに類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにおいて
ＨＨＨをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりＨＨＨをコードす
るポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す。
【００３８】 「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにおいて変化し、
１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如することである。
【００３９】 「誘導体」は、ＨＨＨをコードする核酸配列或いはＨＨＨ又はコードされたＨ
ＨＨの相補配列の化学修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水素をア
ルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核酸誘導体は、自然
分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体
ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレングリコール形成（pegylati
on）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学的機能を保持する任意
の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。
【００４０】 「類似性」は相補性の度合いのことである。部分的な類似性或いは完全類な似
性がある。用語「同一性」を「類似性」の代わりに用いる場合もある。部分的に
相補的な配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分
的に抑制する配列であり、「実質的に類似性の」が用いられる。完全に類似（同
一）配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下
でハイブリダイゼーション検定法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶
液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査することができる。実質的に類似的
な配列或いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に類似的な配列及びプロー
ブの標的配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は
非特異な結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密な
条件は、２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であ
ることを必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在
しない（例えば約３０％同一性より小さい）第２の標的配列の使用により検査さ
れる場合もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補
的標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【００４１】 「パーセント同一性」或いは「％同一性」という表現は、２以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較する際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用いるこ
とによって電子工学的に求めることができる。このMegAlignTMプログラムは、異
なる方法、例えばクラスタ法（clustal method）（例えばHiggins, D.G.及びP.M
. Sharp (1988) Gene 73:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメントを
作成することができる。このクラスタ法のアルゴリズムでは、配列群を、全ての
配列の対について両配列間の距離を調べることによってクラスタ（集団）にグル
ープ分けする。このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグ
ループにおいてアライメントをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列
Ｂの間のパーセント類似性は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基の
数−配列Ｂにおけるギャップ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基の一致
の総数）×１００で計算する。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無
いケースは、パーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント
同一性も、他の周知の方法、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990) Metho
ds Enzymol. 183: 626-645参照）によってカウント即ち計算することができる。
配列間の同一性は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても決定することができる。
【００４２】 「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は、大きさが６ｋｂから１０ＭｂのＤＮＡ配列
を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含
む直鎖状の小染色体である(例えばHarrington, J.J. et al. (1997) Nat Genet.
15:345-355を参照されたい)。
【００４３】 「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合領域内においてア
ミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持している抗体分子の
ことである。
【００４４】 「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する
任意のプロセスのことである。
【００４５】 ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基との間、並びに相補
的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つの核酸配列間に形成
される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用に
よりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は、逆平行形状におい
て水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（例えばＣ0ｔ或いは
Ｒ0ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固形支持体（例えば
紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又は細胞或いはその
核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化される別の核酸配列
との間に形成することもできる。
【００４６】 「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いはそれ以上のア
ミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或いはヌクレオチ
ド配列における変化のことである。
【００４７】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものである。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する様々
な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産生に
よって特徴付けることができる。
【００４８】 「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ
、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持体上に配列さ
れる個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるアレイのことで
ある。
【００４９】 マイクロアレイに関して用いられる「エレメント」或いは「アレイエレメント
」は、基質の表面上に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのこと
である。
【００５０】 「調節」は、ＨＨＨの生物学的活性の変更ことである。例えば調節により、Ｈ
ＨＨのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的或いは免疫学的特性が
増減するようになる。
【００５１】 「核酸」或いは「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリ
ヌクレオチド並びにそのフラグメント、一本鎖或いは二本鎖の場合があり、セン
ス鎖或いはアンチセンス鎖を表すゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）或いは任意のＤＮＡ様或いはＲＮＡ様物質のことである
。「フラグメント」は、翻訳される際に、いくつかの機能的な特徴、例えば抗原
性、或いは構造的な領域の特性、例えば完全長ポリペプチドのＡＴＰ−結合部位
を保持しているポリペプチドを生成する核酸配列のことである。
【００５２】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結び付いた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモータは、そのプロモータがコードさ
れるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列の機能的に関連又は機
能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸配列は
近接して読み枠内に存在することができるが、ある種のゲノムの配列、例えばリ
プレッサー遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそ
のポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。
【００５３】 「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６０ヌクレオチ
ドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましく
は２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハイブリダイゼ
ーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、オリゴヌクレ
オチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アンプリマ」、「
プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である。
【００５４】 「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、リジンにおいて終端するアミノ酸残基のペプ
チドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（anti-gene agent）こ
とである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の寿命を延長し、その
中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延長を停止する（例え
ばNielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63を参照されたい）。
【００５５】 「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＨＨＨをコードする核酸或いはその
フラグメント又はＨＨＨ自体を含むと予想される生物学的サンプルは、溶液中に
存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（tissue print）等に結合さ
れている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から単離された
膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含む。
【００５６】 「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或いはペプチドとア
ゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことである。その相互作用
は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すなわち抗原決定基或
いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけるエピトープＡ或
いは遊離し、標識されないＡ及びその抗体を含むタンパク質の存在が、その抗体
に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。
【００５７】 「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポ
リヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを許容する条件のことであ
る。適切なレベルの厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション領域における塩又は有機溶剤（例えばホルムアミド）の濃
度、又はハイブリダイゼーション温度によって決定することができ、当分野でよ
く知られている。詳述すると、厳密性は、塩の濃度を低下させること、ホルムア
ミドの濃度を上昇させること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることに
よって高めることができる。
【００５８】 「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単離されるか或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それらは自然に関連する
他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には９０％含まないも
のである。
【００５９】 「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ
異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。
【００６０】 「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させるプロセスを意
味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或いは人工的条件
下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或いは真核宿主
細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その方法は形質転
換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス感染、電気穿
孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合がある。そのよ
うに「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含んでおり、その
細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或いはその宿主染色
体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、限られた期
間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含む。
【００６１】 ここで用いるＨＨＨの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸により変
更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があり
、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換える
場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあるが
、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的に
」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、又
はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくアミ
ノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に周知
のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフトウエアを用いて見出すこと
ができる。
【００６２】 用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、ＮＨＡ
Ｐに近縁なポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「アレ
ル変異体」（前に定義した）、「スプライスバリアント」、「種変異体」、また
は「多型変異体」も含まれる。スプライスバリアントは、基準の分子と有意な同
一性を有し得るが、ｍＲＮＡのプロセシングの際にエキソンのスプライシング部
位が変わるためにポリヌクレオチドの数が多いか或いは少ないものである。対応
するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有していたり、或いはドメインが
欠けていることがある。種変異体は、種の間で異なるポリヌクレオチド配列であ
る。これから生ずるポリペプチドは、通常、互いに有意なアミノ酸同一性を有し
ている。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列の１箇所の塩基が異なっている「
一塩基多型」（ＳＮＰｓ）も包含している。ＳＮＰｓが存在することが、例えば
、一定の集団、疾病状態、または疾病状態の性向を示すことがある。
【００６３】 発明 本発明は、新規のヒトヒドロラーゼ相同体（ＨＨＨ）、ＨＨＨをコードするポ
リヌクレオチド、及び生殖障害、炭水化物代謝障害及び細胞増殖障害の診断、治
療及び予防のためのこれらの組成物の使用法の発見に基づく。表１では、第１欄
及び第２欄がそれぞれアミノ酸及び核酸の配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）
を示し、第３欄が、各ＨＨＨをコードする核酸が最初に同定されたインサイト社
クローンのクローンＩＤを示し、第４欄がこのクローンのｃＤＮＡライブラリを
示す。第５欄はフラグメントを記載しており、例えばハイブリダイゼーション技
術においてフラグメントとして有用で、各ＨＨＨのコンセンサスヌクレオチド配
列の一部である、インサイト社クローン（及びライブラリ）及びショットガン配
列を示す。
【００６４】 表２の欄は、本発明のポリペプチドの種々の特性を示す。第１欄は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：を参照しており、第２欄はアミノ酸残基の番号を、第３欄は潜在的
なリン酸化部位を、第４欄は潜在的なグリコシレーション部位を、第５欄はタン
パク質の同一配列を、第６欄は配列相同性及びタンパク質モチーフを通してタン
パク質を同定するために用いられる解析方法を示す。
【００６５】 表３の欄は、ノーザン分析による各核酸配列の組織発現と、この組織発現に関
連する疾患或いは障害と、各ｃＤＮＡがクローニングされたベクタとを示す。
【００６６】
【表１】
【表２】
【表３】
【００６７】 また本発明は、ＨＨＨ変異体を含む。好適なＨＨＨ変異体はＨＨＨアミノ酸配
列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましいＨ
ＨＨ変異体はＨＨＨに少なくとも約９５％アミノ酸が同一で、ＨＨＨの少なくと
も１つの機能的或いは構造的特徴を含む変異体である。
【００６８】 また本発明はＨＨＨをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態で
は本発明は、ＨＨＨ−１、ＨＨＨ−２、ＨＨＨ−３、ＨＨＨ−４、ＨＨＨ−５、
ＨＨＨ−６及びＨＨＨ−７をそれぞれコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の配列
を含むポリヌクレオチド配列を含む。
【００６９】 また本発明は、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。
詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＨＨＨをコードするポリヌ
クレオチド配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最
も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するであろ
う。本発明の特定の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に少なくとも約８０％、より
好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌク
レオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のポリヌクレオチド配列の変
異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に少なくとも約８０％、
より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリ
ヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のポリヌクレオチド配列
の変異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に少なくとも約８
０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％
のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のポリヌクレオ
チド配列の変異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に少なく
とも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも
約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のポリ
ヌクレオチド配列の変異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少
なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
２のポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１３に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ま
しくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１３のポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。さらに本発明は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１４に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、
最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１４のポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記のポリヌク
レオチド変異配列の任意の１つが、ＨＨＨの機能的或いは構造的特徴の少なくと
も１つを含むアミノ酸配列をコードすることができる。
【００７０】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＨＨＨをコードする多数のヌクレオチド配
列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最
低限の相同性を示すものもあることは当業者には理解されよう。このように本発
明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成されるよ
うになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの組み
合わせは、自然発生ＨＨＨのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリ
プレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形形態が明確に開
示されているものと考慮されたい。
【００７１】 ＨＨＨをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択された
厳密な条件下で、自然発生ＨＨＨのヌクレオチド配列にハイブリダイズできるこ
とが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＨＨＨをコードするヌク
レオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コドンを選
択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチドの発現
が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。コード
されたアミノ酸配列を変更することなくＨＨＨをコードするヌクレオチド配列及
びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期のような、自然発
生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を生成する
ことを含む。
【００７２】 また本発明は、合成化学的に完全に、ＨＨＨ及びその誘導体をコードするＤＮ
Ａ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願の出
願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手可
能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、ＨＨ
Ｈをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入することも
できる。
【００７３】 また本発明にはに教示されるような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレ
オチド配列、詳細にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、及びそ
のフラグメントに示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Wahl,G.M及びS.L.Berger (1987; Me
thods Enzymol. Vol. 152:399-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. V
ol 152: 507-511)を参照されたい）。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好
ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナト
リウムであり、最も好ましくは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ
未満のクエン酸三ナトリウムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使
用しないと、厳密性の低いハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホル
ムアミド、更に好ましくは５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高
いハイブリダイゼーションになる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であ
り、より好ましくは約３７℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。
その他の変更できるパラメーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があ
り、当分野の技術者には公知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、
厳密性の程度を変えることができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーショ
ンは、温度が３０℃で、７５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナ
トリウム、１％のＳＤＳで行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５０
０ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３
５％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で
行う。最も好適な実施例では、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと
２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２０
０μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術
者には明らかである。
【００７４】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の
厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下
げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば
、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリ
ウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５ｍＭ
未満の塩化ナトリウムと約１０５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄
過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２℃以
上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は
、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリウム
、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４２
℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１
％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１
５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳ
で行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであろう
。
【００７５】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても
利用され得る。その方法は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、SEQUE
NASE（US Biochemical, Cleveland,OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、
耐熱性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）、或い
はELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）に於いて発
見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組
合せのような酵素を使用する。配列の準備は、Hamilton MICROLAB 2200（Hamilt
on,Reno,NV）、Peltier Thermal Cycler 200（PTC200; MJ Research,Watertown,
MA）及びABI CATALYST 800（Perkin Elmer）のような装置によって自動化するこ
とが好ましい。次に、ABI 373若しくは377 DNAシークエンシングシステム（Perk
in-Elmer）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamic
s, Sunnyvale CA）、又は他の周知のシステムを用いてシークエンシングを行う
。結果として得られた配列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分析す
る（例えば、Ausubei, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, J
ohn Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular B iology and Biotechnology , Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853を参照）。
【００７６】 ＨＨＨをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプロ
モータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において既
知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合があ
る１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣接
する未知の配列を回収する（例えばSarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:31
8-322を参照されたい）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプラ
イマ及び既知の領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増幅
された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異な
プライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適
当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される
。また別の方法、すなわち逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマ
を用いて配列を増幅或いは伸長することもできる。そのテンプレートは、既知の
ゲノム位置及び周囲をなす配列を含む制限フラグメントに由来する（Triglia T
等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186）。第３の方法は、ヒト及び酵母人工染色
体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴
う捕獲ＰＣＲ（Lagerstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19）である
。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に
遺伝子操作された二本鎖配列を未知の配列の領域に挿入することができる。未知
の配列を回収するために用いられることがある別の方法は当分野で公知である（
例えばParker JD 等 (1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060を参照されたい)
。さらにある方法はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを
用いて、ゲノムＤＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）。こ
のプロセスによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン
／エクソン接合部を見つける際に有用である。全てのＰＣＲに基づく方法の場合
、プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences Inc
, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用い
て、長さが２２〜３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さら
に約６８〜７２℃の温度でテンプレートにアニールするように設計することがで
きる。
【００７７】 完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする際に、より長いｃＤＮＡを含むよ
うに大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初
回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むよ
り大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライ
ブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況
では特に好ましい。ゲノムライブラリは５´非転写制御領域に配列を伸長するた
めに有用な場合がある。
【００７８】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper及びSequence Navigator 、Perkin Elmer）を用いて電気信
号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの
全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの
限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。
【００７９】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチド配列或いはそ
のフラグメントが、適当な宿主細胞においてＨＨＨ、そのフラグメント或いはそ
の機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる場合があ
る。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ
酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＨＨＨを発現
することもできる。
【００８０】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＨＨＨ
をコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝子
操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのラン
ダムなフラグメント化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチ
ド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて
、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の
変更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともでき
る。
【００８１】 別の実施形態では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＨＨＨをコードする
配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（例えばCaruthers MH
等 (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Sy
mp Ser 225-232を参照されたい）。別法では、タンパク質自体が、ＨＨＨのアミ
ノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある
。例えばペプチド合成は種々の固相技術（例えばRoberge JY 等(1995) Science
269:202-204を参照されたい）を用いて実行することができ、自動合成は、例え
ばABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いることにより実現する
ことができる。さらにＨＨＨのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直接合成
中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いはその任意の一部からの配列
を用いる化学的方法により結合され、変異体ポリペプチドを生成することもでき
る。
【００８２】 そのペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製される
ことができる（例えばChiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol.
182:392-421を参照されたい）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析或いは
配列決定により確認することができる（例えばCreighton, T. (1984) Proteins,
Structures. and. Molecular Prop..erties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照されたい）。
【００８３】 生物学的に活性なＨＨＨを発現させるためには、ＨＨＨをコードするヌクレオ
チド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内で挿入さ
れたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な配列を含むベクターに挿入
する。これらの配列としては、例えば、ベクターにおける、及びＨＨＨをコード
するポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成的及び誘導的プロモータ
ー、及び５’及び３’末端非翻訳領域のような制御配列が挙げられる。このよう
なエレメントの作用の強さや特異性は様々に異なったものであり得る。また、Ｈ
ＨＨをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必
要である。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列、
例えばKozak配列が挙げられる。ＨＨＨ及びその開始コドン及び上流の制御配列
が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写または翻訳の制御シグ
ナルは不要である。しかし、コーディング配列又はそのフラグメントのみが挿入
される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければ
ならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにするために、開
始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレメント及び開
始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。使用さ
れる特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の効率を高め
ることができる（例えば、Scharf,D.他（1994）Results Probl. Cell Differ. 2
0:125-162参照）。
【００８４】 当業者に周知の方法を用いて、ＨＨＨをコードする配列及び適当な転写或いは
翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲノム組
換えを含む（例えば、Sambrook,等(1989) Molecular Cloning. A Laboratory Ma nual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17;並び
にAusubel, F.M.等(1995, and periodic supplements) Current Protocols in M olecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16を参
照されたい）。
【００８５】 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨＨＨをコードする配列を含有し、発
現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、プ
ラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母発
現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系（例
えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例
えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ
）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ或い
はｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明は用
いられる宿主細胞により制限されない。
【００８６】 細菌系では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々なクロ
ーニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、ＨＨＨをコードす
るポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及び成長（
propagation）を、例えばBLUSCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）やpSPORT1プラ
スミド（Life Technologies）のような多機能大腸菌ベクターを用いて達成する
ことができる。ベクターの様々なクローニング部位にＨＨＨをコードする配列を
組み入れてlacZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質転換された細
菌を特定するための比色によるスクリーニングを行うことができるようになる。
更に、これらのベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシークエンシング、
ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、及びクロ
ーン化した配列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る（例えばVan
Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば
抗体産生のために大量のＨＨＨが必要な場合には、ＨＨＨの高レベルで発現を誘
導するベクターを用いることができる。例えば、強い誘導性Ｔ５またはＴ７バク
テリオファージプロモーターを含むベクターを用いることができる。
【００８７】 ＨＨＨの産生のために、酵母菌発現系を用いることもできる。例えばα因子、
アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーター
を含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）やメタノール資化酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）にお
いて用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパク質
の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現のため
の外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする（例えばAusubel, 前掲;
及びScorer, C.A.ら (1994) Bio/Technology 12:181-184参照）。
【００８８】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨＨＨをコードする配列の発現は、い
くつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及び
１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶからの
ω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6:307
-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ或
いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Broglie
等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Result
s Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、直
接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されること
ができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例えば、
Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1
992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。
【００８９】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨＨＨをコードする配
列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳
複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域内
の挿入により、感染した宿主細胞においてＨＨＨを発現することができる生ウイ
ルスを得ることができる（例えば、Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sc
i 81:3655-3659を参照されたい）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハ
ンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させる
ことができる。ＳＶ４０或いはＥＢＶ系ベクタを用いて、高レベルのタンパク質
を発現することもできる。
【００９０】 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリ
カチオンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。
【００９１】 哺乳動物系において長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、
安定した発現が望ましい。例えば、ＨＨＨを安定して発現する細胞株は、複製或
いは内性発現エレメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択
可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタ
の導入に続いて、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切
り替えるようにする。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであ
り、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収され
るようになる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適
した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００９２】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ-細胞或いはａｐｒｔ-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎ
ｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれ
クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移
酵素への耐性を与える（Murry、前掲）。さらに選択可能遺伝子が記載されてお
り、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光
タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＰ; Clonetech, Palo Alto, CA
）、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−Ｄ−グルクロノシド、または
ルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマー
カは、転換体を同定するのみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安
定したタンパク質発現の量を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(19
95) Methods Mol Biol 55:121-131）。
【００９３】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＨＨＨをコードする配列がマー
カ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＨＨＨをコードする配列を含む組換え細
胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、マー
カ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨＨＨをコードする配列と直列に配置
される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列型遺伝子
の発現を示す。
【００９４】 全般的に、ＨＨＨをコードする核酸配列を含み、ＨＨＨを発現する宿主細胞は
、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は、限
定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、溶液
或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ
ーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。
【００９５】 特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、Ｈ
ＨＨの発現を検出し、測定するための免疫学的方法は、当業者には周知である。
例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである。ＨＨＨにおける２つの非干渉性エ
ピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナル系イム
ノアッセイ（monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合タンパク競合
測定法が用いられてもよい。これら及び他の検定法は当分野において公知である
。（例えば、Hampton,R.等(1990)Serological Methods,a Laboratory Manual, A
PS Press,St Paul. MN, Section IV;Coligan, J. E.等(1997 and periodic supp
lements) Current Protocols in Immunology,Greene Pub. Associates and Wile
y-Interscience, New York, NY; and Maddox, D.E.等.(1983) J. Exp. Med. 158
:1211-1216を参照されたい)。
【００９６】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロー
ブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標
識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨＨＨを
コードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベク
タ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において知ら
れ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラー
ゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販のキッ
ト（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Biochemi
cal Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは標識
が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生
産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。
【００９７】 ＨＨＨをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、このタン
パク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養する
ことができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる
配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持される
。当業者には理解されるように、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドを含む発
現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＨＨＨ分泌を誘導するシ
グナル配列を含むように設計することができる。
【００９８】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパク
質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよう
なポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含
まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、
タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び／又は作用を特定するために用い
ることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有し
ている種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38）はAmerican T
ype Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手でき、導入される外来
タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかから
選択することができる。
【００９９】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨをコードする、天然の、修飾した、或いは組
換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける融合
タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって認識
され得る異種分子を含むキメラＨＨＨタンパク質は、ペプチドライブラリーから
のＨＨＨの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分子としては、
限定するものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルト
ース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプ
チド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）が挙げられる。GST
、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチオン、マルトー
ス、酸化フェニルアルシン（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、及び金属
キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG
、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）によって、それらのエピトープのタグを特異
的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タ
ンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク質を、ＨＨＨを
コードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク分解酵素による切断
部位を含むように組換えることによって、ＨＨＨを、精製の後にヘテロの分子か
ら切り離すことができるようになる。融合タンパク質の発現及び精製のための方
法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に記載されている。融合タ
ンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市販のキットを用いてもよ
い。
【０１００】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したＨＨＨを、TNTTMウサギ網状赤血
球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系（Promega, Madison, WI）を用いてin
vitroで合成することができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロ
モーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結びつ
ける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは35S-メチオニンの存在
の下で生じる。
【０１０１】 ＨＨＨのフラグメントの作製は、組換え体の産生によって行うのみならず、固
相技術を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる（例えばCreigh
ton, 前出pp.55-60参照）。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動的に
行うことができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチ
ド合成機 (The Perkin-Elmer) を用いて達成することができる。ＨＨＨの様々な
フラグメントを個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出すことができ
る。
【０１０２】 治療 ＨＨＨ−１とマウスからのＮ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ（ＧＩ
１３７３３６５）との間には化学的及び構造的な類似性がある。さらに、ＨＨＨ
−１は、生殖組織及び胃腸組織からのライブラリにおいて発現される。ＨＨＨ−
２とマウスからのｖａｎｉｎ−１（ＧＩ ４１３８２２９）との間には化学的及
び構造的な類似性がある。さらにＨＨＨ−２は、造血／免疫組織及び胃腸組織か
らのライブラリにおいて発現される。タンパク質配列解析は、ＨＨＨ−３をグリ
コシルヒドロラーゼ（ＢＬ００５９２）と同定する。さらにＨＨＨ−３は、造血
／免疫組織及び心臓血管組織からのライブラリにおいて発現される。タンパク質
配列解析は、ＨＨＨ−４をグリコシルヒドロラーゼ（ＢＬ００７７７５）と同定
する。さらにＨＨＨ−４は、生殖組織及び造血／免疫組織からのライブラリにお
いて発現される。ＨＨＨ−５と酵母からのグルコヒドロラーゼとの間には化学的
及び構造的類似性がある。さらにＨＨＨ−５は、生殖組織及び心臓血管組織から
のライブラリにおいて発現される。ＨＨＨ−６と枯草菌からのＮ−アセチルグル
コサミン６−Ｐデアセチラーゼ（ＧＩ ２６１８８５６）との間には化学的及び
構造的な類似性がある。さらにＨＨＨ−６は、生殖組織及び胃腸組織からのライ
ブラリにおいて発現される。タンパク質配列解析は、ＨＨＨ−７をグリコシルヒ
ドロラーゼ（ＰＲ００７４６）と同定する。さらに、ＨＨＨ−７は生殖組織及び
造血／免疫組織からのライブラリにおいて発現される。最後にＨＨＨは癌性組織
及び増殖組織から構築されるライブラリと関連する。それゆえ、ＨＨＨは、生殖
障害、炭水化物代謝障害及び細胞増殖障害においてある役割を有するものと考え
られる。
【０１０３】 それゆえ、一実施形態では、ＨＨＨのアンタゴニストを被検者に投与して、生
殖障害を治療或いは予防することができる。そのような生殖障害は、限定はしな
いが、プロラクチン生成の障害、卵管障害、排卵異常および子宮内膜症を含む不
妊症、発情周期の破壊、月経周期の破壊、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症
候群、子宮内膜および卵巣の癌、自己免疫障害、子宮外妊娠、奇形発生、乳房の
癌、線維嚢胞性乳腺症、乳汁漏出症、精子形成の破壊、異常精子生理、精巣の癌
、前立腺の癌、前立腺肥大症、前立腺炎、ペイローニ病、男性乳房の癌および女
性化乳房症を含む場合がある。一態様では、ＧＡＰＩＰを特異に結合する抗体を
、アンタゴニストとして直接、或いはＨＰＬＭを発現する細胞或いは組織に医薬
品因子を運ぶためのターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いること
もできる。
【０１０４】 さらに別の実施形態では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドの相補配列を
発現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む生殖障害を
治療或いは予防することができる。
【０１０５】 別の実施形態では、ＨＨＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を被検者に投与
して、炭水化物代謝障害を治療或いは予防することができる。そのような炭水化
物代謝障害は、限定はしないが、糖尿病、インスリン依存性糖尿病、非インスリ
ン依存性糖尿病、低血糖症、グルカゴノーマ、ガラクトース血症、遺伝性果糖不
耐症、果糖−１．６‐ジホスファターゼ欠乏、肥満症、先天性タイプＩＩ異常造
血性貧血、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠乏、ガラクトースエピメラー
ゼ欠乏、糖原病、リソソーム蓄積症、フルクトース尿症、ペントース尿症及びピ
ルビン酸代謝の遺伝的異常を含む。
【０１０６】 さらに別の実施形態では、ＨＨＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現で
きるベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む炭水化物代謝
障害を治療或いは予防することができる。
【０１０７】 別の実施形態では、適当な医薬品担体とともに実質的に精製されたＨＨＨを含
む医薬品組成物を被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む炭水化物
代謝障害を治療あるいは予防することができる。
【０１０８】 さらに別の実施形態では、ＨＨＨの活性を調節するアゴニストを被検者に投与
して、限定はしないが、上記障害を含む炭水化物代謝障害を治療あるいは予防す
ることができる。
【０１０９】 さらに別の実施形態では、ＨＨＨのアンタゴニストを被検者に投与して、細胞
増殖障害を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限定はしない
が、日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症、滑液泡炎、肝硬変、肝炎
、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性多
血症、乾癬、原発性血小板血症、及び腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫
、肉腫、及び奇形癌を含む癌、詳細には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子
宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌
が含む場合がある。一態様では、ＧＡＰＩＰを特異に結合する抗体を、アンタゴ
ニストとして直接、或いはＨＰＬＭを発現する細胞或いは組織に医薬品因子を運
ぶためのターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いることもできる。
【０１１０】 さらに別の実施形態では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドの相補配列を
発現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む細胞増殖障
害を治療或いは予防することができる。
【０１１１】 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。
【０１１２】 ＨＨＨのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されること
ができる。詳細には、精製されたＨＨＨを用いて抗体を生成するか、或いは医薬
品因子のライブラリをスクリーニングし、ＨＨＨと特異に結合するものを同定す
ることができる。
【０１１３】 ＨＨＨに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて産生することができる。そ
のような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、
一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグ
メントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治療
上の使用に適している。
【０１１４】 抗体を産生する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＨＨＨ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペプ
チドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジ
ュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバント
は、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミ
ネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチ
ド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよう
な表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カル
メット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１１５】 ＨＨＨに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、
或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、よ
り好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それらは
自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子からな
る完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＨＨＨアミノ酸の短い伸展部はＫ
ＬＭのような別のタンパク質の伸展部及びキメラ分子に対して生成される抗体と
融合されることもできる。
【０１１６】 ＨＨＨに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子の
生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は、限
定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ
−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozbor
等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci 80
:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。
【０１１７】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ＨＨＨ特異性一本鎖抗体を生成してもよ
い。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が、
ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成される
こともできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:10134-10137）。
【０１１８】 また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或
いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。
【０１１９】 またＨＨＨに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させること
もできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子のペ
プシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ（ａ
ｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することが
できるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを、所望の
特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定で
きるように作製してもよい（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）。
【０１２０】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＨＨＨとその特異的抗体との間の複合形成体を測定
することを含む。２つの非干渉性ＨＨＨエピトープに反応するモノクローナル抗
体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タンパ
ク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。
【０１２１】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチド或いはその任
意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様では、
ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡの転写を遮
断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、ＨＨＨをコ
ードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることができる。この
ように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＨＨＨ活性を調節するか、或いは
遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当分野では周知で
あり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大きなフラグメン
トを、ＨＨＨをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿った種々の位置か
ら設計することができる。
【０１２２】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＨＨＨをコードする遺伝子のポリヌクレオチ
ドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる（例えばSambro
ok 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)を参照されたい）。
【０１２３】 ＨＨＨをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＨＨＨをコードする高レベ
ルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質転換
することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳できないセン
ス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内に統
合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼにより無
能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非
複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメントが
ベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。
【０１２４】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ＨＨＨをコードする遺伝子の制御、５´或
いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に対す
る相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計する
ことにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−１
０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重らせ
ん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制
がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよう
になるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩
は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immunol ogic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY, pp.163-177)に記載さ
れている。また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合
するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる
。
【０１２５】 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＨＨＨをコードする配列のヌクレオチド鎖切
断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハンマ
ヘッドモチーフリボザイムを含む。
【０１２６】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。
【０１２７】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨＨＨをコードするＤＮＡ配列のin vitro及び in vivo転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或い
はＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ内
に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ作成物は、相補ＲＮＡを
合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入することがで
きる。
【０１２８】 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。
【０１２９】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の
場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達は、当分野で周知の方
法を用いて実現することができる（例えばGoldman, C.K. 等(1997）Nature Biot
echnology 15:462-466を参照されたい)。
【０１３０】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検体に適用
されることができる。
【０１３１】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＨＨＨ、ＨＨＨに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト或い
はＨＨＨのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限定はし
ないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の滅菌の生体適
合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少なくと
も１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組成物は
単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与しても
よい。
【０１３２】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。
【０１３３】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。
【０１３４】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。
【０１３５】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。
【０１３６】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。
【０１３７】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。
【０１３８】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。
【０１３９】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１４０】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。
【０１４１】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５〜５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、２％〜７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。
【０１４２】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＨＨＨの投与の場合、そのようなラベル
貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。
【０１４３】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。
【０１４４】 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。
【０１４５】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＨＨＨ或いはそのフ
ラグメント、ＨＨＨの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＨＨＨのイン
ヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び毒性は
、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ50（集団の
５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ50（集団の５０％が致死する量）に
より確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数であり、
比ＬＤ50／ＥＤ50として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物
が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに投与
するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投与量は、
毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ50を含む血中濃度の範囲内にあること
が好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び投与経路によりこ
の範囲内で変化する。
【０１４６】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。
【０１４７】 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。
【０１４８】 診断 別の実施例では、ＨＨＨを特異に結合する抗体を、ＨＨＨの発現により特徴付
けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＨＨＨ、アゴニスト、アンタゴニ
スト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法において
用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した方法と
同様の方法で調製することができる。ＨＨＨに対する診断検定法は、抗体及び標
識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＨＨＨを検出する方
法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いることができ、リポータ分子
と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することにより標識されることがで
きる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることができ、そのい
くつかが上記される。
【０１４９】 ＨＨＨを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロト
コルが当分野において知られており、ＨＨＨ発現の変更されたレベル或いは異常
なレベルを診断するための方法を提供する。ＨＨＨ発現のための正常或いは標準
的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液或いは
細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＨＨＨに対する抗体と結合することに
より確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量することができ
るが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＨＨＨの量、制御
及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被検者値と
の間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。
【０１５０】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドを診断のため
に用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列
、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを用
いて、ＨＨＨの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現を検
出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＨＨＨの存否及び過剰発現
を識別することができ、さらに治療処置中のＨＨＨレベルの調節をモニタするこ
とができる。
【０１５１】 一態様では、ＨＨＨ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションにより、ＨＨＨをコードする核酸配列を同定することができる。
非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、或い
は特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプローブの
特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中間或
いは低）が、そのプローブがＨＨＨをコードする自然発生配列、アレル変異配列
のみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。
【０１５２】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＨＨＨをコードする
配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ましい
。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の配列に、或いはプロモータ、エン
ハンサエレメント及び自然発生ＨＨＨのイントロンを含むゲノム配列に由来する
。
【０１５３】 ＨＨＨをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプローブを
生成するための手段は、ＨＨＨ或いはＨＨＨ誘導体をコードする核酸配列を、ｍ
ＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そのよう
なベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリメラーゼ及び
適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプローブを合成
するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のリ
ポータ群、例えば32Ｐ或いは35Ｓのような放射性核種、又はアビジン／ビオチン
結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファターゼのような酵
素標識により標識されることができる。
【０１５４】 ＨＨＨをコードするポリヌクレオチド配列はＨＨＨの発現に関連する障害の診
断のために用いることができる。そのような障害は、限定はしないが、プロラク
チン生成の障害、卵管障害、排卵異常および子宮内膜症を含む不妊症、発情周期
の破壊、月経周期の破壊、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜
および卵巣の癌、自己免疫障害、子宮外妊娠、奇形発生、乳房の癌、線維嚢胞性
乳腺症、乳汁漏出症、精子形成の破壊、異常精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、
前立腺肥大症、前立腺炎、ペイローニ病、男性乳房の癌および女性化乳房症を含
む生殖障害と、糖尿病、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、
低血糖症、グルカゴノーマ、ガラクトース血症、遺伝性果糖不耐症、果糖−１．
６‐ジホスファターゼ欠乏、肥満症、先天性タイプＩＩ異常造血性貧血、マンノ
シドーシス、ノイラミニダーゼ欠乏、ガラクトースエピメラーゼ欠乏、糖原病、
リソソーム蓄積症、フルクトース尿症、ペントース尿症及びピルビン酸代謝の遺
伝的異常のような炭水化物代謝障害と、日光性角化症、動脈硬化症、アテローム
性硬化症、滑液泡炎、肝硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維
症、発作性夜間血色素尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、及び腺癌、
白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌を含む癌、詳細には、副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含む細胞増殖障害とを含む場合がある。Ｈ
ＨＨをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ド
ットブロット、又は他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更
されたＨＨＨ発現を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するデ
ィップスティック、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用
いることができる。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知で
ある。
【０１５５】 特定の態様では、ＨＨＨをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に上
記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。ＨＨ
Ｈをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブリダ
イゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サンプル
に加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは洗浄
され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽出さ
れたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく変更
されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列と
ハイブリダイズされており、サンプル内のＨＨＨをコードするヌクレオチド配列
の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法を用い
て、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の治療措
置の有効度を評価することができる。
【０１５６】 ＨＨＨの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する正
常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検者
から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適した
条件下でＨＨＨをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することにより
与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られた値
を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から得ら
れた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得られた
標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される。標
準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。
【０１５７】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。
【０１５８】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。
【０１５９】 ＨＨＨをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらなる
診断上の使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学的
に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよい。
オリゴマは、ＨＨＨをコードするポリヌクレオチドのフラグメント、或いはＨＨ
Ｈをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのフラグメントを
含み、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下で用いられる
ことが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ、或いはオリ
ゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配列を検出並
びにまた定量するために低い厳密な条件下で用いることができる。
【０１６０】 またＨＨＨの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチド
の放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果が書
き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods, 159
:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプルを
定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速す
ることができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペクト
ル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。
【０１６１】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチド或いはその長寸のフラグメントをマイクロアレイ
の標的として用いることもできる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタし（転写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突
然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、
疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断し、また治療薬剤の活性を発生及び
モニタするために用いることができる。
【０１６２】 当分野で周知の方法を用いてマイクロアレイが準備、使用及び解析される（例
えばBrennan, T.M. et al. (1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M. et
al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler et al.
(1995) PCT applicationWO95/251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT applicat
ion WO95/35505; Heller, R.A. et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150
-2155; and Heller, M.J. et al. (1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照され
たい）。
【０１６３】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨをコードする核酸配列を用いて、自然発生ゲ
ノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生成
することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又は
例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染
色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリのよう
な人工染色体構造にマッピンクされてもよい（例えばPrice, C.M. (1993) Blood
Rev. 7:127-134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154を参照され
たい）。
【０１６４】 蛍光in situハイブリダイゼーションは、他の物理的な染色体マッピング技術
及び遺伝マップデータと相関をなす（例えばHeinz-Ulrich, et al.(1995) in Me
yers, R.A. (ed.) Molecular.Biology and Biotechnology, VCH Publishers New
York, NY, pp. 965-968を参照されたい）。遺伝子マップデータの例は種々の科
学雑誌或いはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すこと
ができる。物理的染色体マップ上のＨＨＨをコードする遺伝子の位置と特定の疾
患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤ
ＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用い
て、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出する
ことができる。
【０１６５】 染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを
用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２３まで
への遺伝子連鎖により自然のまま局在されていれば、その領域に対する任意の配
列マッピングが、さらなる研究のための関連或いは調節遺伝子を表すことができ
る(例えばGatti等(1998) Nature 336:577-580を参照されたい)。また本発明のヌ
クレオチド配列を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における
転座、逆位等により染色体位置内の差を検出することができる。
【０１６６】 本発明の別の実施例では、ＨＨＨ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメント
又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものにお
いて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスクリ
ーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体に
付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。Ｈ
ＨＨと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。
【０１６７】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、対象のタンパク質への適
当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する（例
えばGeysen, 等(1984) PCT application WO84/03564を参照されたい）。この方
法では、ＨＨＨに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチ
ックピン或いはある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物は
ＨＨＨ或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＨＨＨ
が当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＨＨＨは、上記の薬物
スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーティングされる
こともできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固
体支持体上に固定化することもできる。
【０１６８】 別の実施例では、ＨＨＨを特異に結合することができる中和性抗体がＨＨＨを
結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用
する。このようにして、抗体を用いて、ＨＨＨと１つ或いはそれ以上の抗原決定
基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
【０１６９】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＨＨＨをコードするヌクレオチド配列を
、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。
【０１７０】 当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用でき
るであろう。従って、以下に記す特定の実施例は、単なる例示であって本発明を
限定するものではない。
【０１７１】 先に記載したもの及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに
米国仮出願第６０／０８７，２３６号（１９９８年５月２９日出願）は、ここで
参照して本明細書の一部としている。
【０１７２】
【実施例】
１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＲＮＡは、Clontech (Palo AltO. CA)から購入されたか、或いは表４に記載さ
れる組織からインサイト社において単離された。その組織はホモジナイズされ、
グアニジニウムイソシアネートに溶解され、その溶解産物が、ＣｓＣｌクッショ
ン上で遠心分離された。別法では、その組織はホモジナイズされ、フェノール、
或いはTRIZOL試薬(Life Technologies)のような変性剤と、フェノールの単相溶
液と、グアニジンイソシアネートとの適当な混合物に溶解され、その溶解産物は
、クロロホルム（１：５ｖ／ｖ）で抽出された。イソプロパノール或いは酢酸ナ
トリウム及びエタノールのいずれかを用いて、その溶解産物からＲＮＡを沈殿さ
せた。別法では、調製用アガロースゲル電気泳動によって、その溶解産物からＲ
ＮＡが精製され、Whatman P81 paper (Whatman, Lexington. MA)から回収された
。ＲＮＡのフェノール抽出及び沈殿は必要に応じて繰り返され、ＲＮＡ純度を高
めるとともに、ＲＮＡはＲＮアーゼのない溶液内に保持された。ある場合には、
ＲＮＡはＤＮアーゼで処置された。大部分のライブラリの場合、ポリ（Ａ＋）Ｒ
ＮＡは、オリゴ d(T)結合常磁性体粒子 (Promega.Madison. WI)、Oiigotex樹脂.
或いは Oligotex kit (QIAGEN Inc. Chatsworth. CA)を用いて単離された。別
法では、ＲＮＡは、RNA Isolation kit (Stratagene)或いはAmbion PolyA Quick
kit (Ambion. Austin. TX)を用いて、組織産物から直性単離された。
【０１７３】 ＲＮＡは、UNIZAP vector (Stratagene. La Jolla. CA)或いはSuperScript plasmid system (Life TechnologieS. Inc)において推奨された手順に従って、
ｃＤＮＡ合成及びｃＤＮＡライブラリの構築のために用いられた。そのいずれの
手順とも、当分野においてよく知られた方法に基づいている（(Ausubel, 1997,
units 5.1-6.6)）。別法では、ｃＤＮＡライブラリは、インサイト社により提供
されるＲＮＡを用いて、Stratagene社によって構築された。オリゴｄ（Ｔ）或い
はランダムプライマを用いて、逆転写が開始された。合成オリゴヌクレオチドア
ダプタが二本鎖ＤＮＡに結合され、ｃＤＮＡは適当な制限酵素で消化された。大
部分のライブラリの場合、ｃＤＮＡは、Sephacryl S 1000或いはSepharose CL2B
又はCL4Bカラムクロマトグラフィ (Amersham Pharmacia Biotech)或いは調製用
アガロースゲル電気泳動を用いて、サイズを選択された（３００〜１０００ｂｐ
）。ｃＤＮＡは、例えばpBluescript (Stratagene)、pSPORT 1 (Life Technolog
ies)、pINCY (Incyte Pharmaceuticals Inc, Paio Alto. CA)のような適当なプ
ラスミドのポリリンカーの適合した制限酵素に結合された。PINCYは、ＪＭ１０
９セル内で増幅され、QiaQuick column (QIAGEN Inc)を用いて精製された。組換
えプラスミドは、例えばXLl-Biue、XLl-Blue MRF或いはSOLR (Stratagene)又はD
H50t. DHIOB或いはElectroMAX DH 10B (Life Technologies)のようなコンピテン
トＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換された。
【０１７４】
【表４】
【０１７５】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）又は細胞溶解を利用して、in vivoで
の切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。Magic若しくはWIZARD Mini
preps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosyste
ms, Gaithersburg MD）、及びQIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキッ
トのうちの少なくとも1つを用いてプラスミドを精製した。沈殿の後、0.1mlの蒸
留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【０１７６】 別法では、高スループットフォーマットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶
解産物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1
-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。
サンプルを処理して384-ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドDNAの濃
度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroskan II蛍光ス
キャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１７７】 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 ABI Catalyst 800（）またはHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV
）をPeltier Thermal Cyclers （MJ Research, Watertown, MA製のPTC200）と組
み合わせて用いて配列決定するためにｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡの配列
決定は、標準的なABIプトロコル、塩基呼出し（base-calling）ソフトウェア及
びキットを用いて、Sanger及びA.R. Coulsonの方法（1975, J. Mol. Biol.94:44
1-448）によりABI 373または377 DNA Sequencing System（Perkin Elmer）にお
いて行った。或いは、Amersham Pharmacia Biotech製の溶液及び色素を用いてｃ
ＤＮＡを配列決定した。リーディングフレームは、標準的な方法（Ausubel. 前
出）を用いて決定した。
【０１７８】 このｃＤＮＡ配列及び配列表の完全長ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配
列を問い合わせ配列として用いて、GenBankの霊長類（pri）、齧歯類（rod）、
哺乳動物（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）のデータベース、
SwissProt、BLOCKS、及び既に同定されたモチーフ及び配列が注釈付きで含めら
れている他のデータベース等のデータベースを検索した。一次配列パターン及び
二次構造ギャップペナルティを処理するSmith Waterman（Smith, T.ら (1992) P
rotein Engineering 5:35-51）のようなアルゴリズム及びBLAST （Basic Local
Alignment Search Tool; Altschul, S.F. (1993)J. Mol. Evol 36:290-300；及
びAltschui他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、及びHMM （隠れマルコフ
モデル（Hidden Markov Models）; Eddy, S.R.(1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6
:361-365及びSonnhammer, E.L.L.他 (1997) Proteins 28:405-420）のようなプ
ログラム及びアルゴリズムを用いて、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の組立
て及び解析を行った。これらのデータベース、プログラム、アルゴリズム、方法
及びツールは既存の利用可能のものであり、Ausubel（前出, unit 7.7）、Meyer
s, R.A.（1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, Inc, New
York NY, p 856-853）、ソフトウェア（Genetics Computer Group (GCG), Madis
on Wl）によって提供される文書や、インターネットのウェブサイト上の文書に
記載されている。多くのデータベース及びツールをリストし、記述し、リンクし
ている２つの総合的なウェブサイトは、１）the www resource in practical se
quence analysis（http://genome.wustl.edu/eddy/bio5495/online_resources.h
tml ）、及び（２）the bibliography of computational gene recognition（ht
tp://linkage. rockefeiler. edu/wli/gene/programs.html）である。例えば、
第１のウェブサイトは、データベースとしてPFAM（http://genome.wustl.edu/Pf
am/）にリンクしており、HMMサーチツール（http://genome.wustl.edu/eddy/cgi
-bin/hmm_page.cgi）にもリンクしている。
【０１７９】 表５には、ここで用いるデータベース及びツールの概要が記載されている。表
１の第１列には、ツール、プログラム、又はアルゴリズムが、表の第２列にはデ
ータベース名が、第３列には簡単な説明が記載されており、第４列には、（そこ
に記載がある場合は）２つの配列の間の一致度を決定するスコア（この値が高く
なる程相同性が高くなる）が記載されている。
【０１８０】
【表５】
【０１８１】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術
であり、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞タイプまたは組織に由来する
ＲＮＡが結合した膜とのハイブリダイゼーションを行う（例えば、Sambrook, 前
掲, ch. 7及びAusubel, F.M.等 前掲, ch. 4 and 16を参照されたい）。
【０１８２】 BLAST（Altschul, S.F. 1993及び1990, 前出）を用いる類似のコンピュータ技
術を用いて、GenBank又はLIFESEQTMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）の
ようなデータベースにおける同一或いは関連する分子を検索した。この分析は、
多くの膜系ハイブリダイゼーションと比較して非常に高速である。さらにコンピ
ュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類
を決定することができる。
【０１８３】 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義
されるものである。 （配列の一致率（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の両方を
考慮している。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコ
アの低いものも関連する分子として同定することもできる。
【０１８４】 ノーザン分析の結果は、ＨＨＨをコードする転写物が発生するライブラリのリ
ストとして報告される。配列の存在量（abundance）及び存在率（percent abund
ance）のリストも報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し
、存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラリ内で検出された配列の総数で割った値
である。
【０１８５】 ５ ＨＨＨをコードする配列の延長 インサイト社クローン３２１５１０、６３４３４３、２０１７９１８、２１７
５０７２、２４０３１０７、３０６９５４０及び４１８２３５０の核酸配列を用
いて、部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレオチドプ
ライマを設計した。１つのプライマを合成してアンチセンス方向の伸長を開始し
、他のプライマを合成してセンス方向の配列を伸長した。プライマを用いて、対
象の領域に対する新規で未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に
」発生させる既知の配列の伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (Na
tional Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計さ
れ、長さが約２２〜３０のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し
、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構
造及びプライマ−プライマ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は
避けられた。
【０１８６】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。
２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。
【０１８７】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完
全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ １５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） のパラメータで実行された。
【０１８８】 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A QuickTM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクロー
ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。
【０１８９】 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（例えばSambrook、前掲、付録Ａ p.2を参照されたい）。３７℃で１時間イ
ンキュベートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertan
i (LB)-agar (Sambrook、前掲、付録Ａ p.1を参照されたい)上に蒔かれた。翌日
、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の滅菌
９６穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれた１５０μｌの液体ＬＢ／２
ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μｌの一晩おいた培養株が有菌
の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプル
がＰＣＲアレイに移された。
【０１９０】 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） の条件で実行された。
【０１９１】 ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。
【０１９２】 同様にして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のヌクレオチド
配列を用いて、上記手順、５´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当
なゲノムライブラリを用いて５´調節配列を得る。
【０１９３】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に基づくハイブリダイゼーシ
ョンプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニン
グする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載され
るが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリ
ゴヌクレオチドをOLIGO 4.06（National Bioscience）のような最新のソフトウ
ェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと、２５０μＣｉの[γ‐3 2 Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPo
nt NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識された
オリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn
）を用いて精製する。毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコッ
トを、エンドヌクレアーゼ（AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII；D
uPont NEN, Boston, MA）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な
膜系ハイブリダイゼーション分析において用いる。
【０１９４】 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン膜
（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリダイ
ゼーションは４０℃で１６時間行われる。非特異的シグナルを取り除くため、ブ
ロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウムまでの徐々に厳密性が増す条件で順次室温にて洗浄する。XOMAT ARTMフィル
ム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager cassette（Molecular Dynamics
, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを視覚的に比較する。
【０１９５】 ７ マイクロアレイ 化学的な結合手順及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上にアレイエ
レメントを合成することができる（例えば前掲のBaldeschweilerを参照されたい
）。ドット或いはスロットブロットに類似のアレイを用いてエレメントを配列し
、熱的、ＵＶ、機械的或いは化学的結合手順、又は真空システムによりエレメン
トを基質表面に結合することもできる。典型的なアレイは手作業で、或いは利用
可能な方法及び機械を用いて作製し、任意の適当な数のエレメントを含むことが
できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。走査画像を調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列
の相補性の程度及び相対的な量を求める。
【０１９６】 完全長ｃＤＮＡ或いは発現した配列タグ（Expressed Sequence Tag：ＥＳＴ）
はマイクロアレイのエレメントを含む。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応
するか、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから無作為に選択された完
全長ｃＤＮＡ或いはＥＳＴが、適当な基質、例えばスライドガラス上に配列され
る。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ架橋結合を用いて、熱及び化学的に、それを乾燥す
ることによりスライドガラスに固定される（Schena, M. et al. (1995) Science
270:467-470, and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照さ
れたい）。基質上のエレメントにハイブリダイズさせるために、蛍光プローブが
準備され、使用される。その基質が上記の手順により解析される。
【０１９７】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＨＨをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然
発生のＨＨＨの発現を低減又は阻害するために用られる。約１５〜約３０個の塩
基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について特に記載されるが、より小さな配
列或いはより大きな配列フラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いることがで
きる。Oligo4.06ソフトウェア及びＨＨＨのコーディング配列を用いて、適切な
オリゴヌクレオチドを設計することができる。転写を阻害するためには、最も固
有の５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドをデザインし、これを用いてプロ
モータがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、
相補的なオリゴヌクレオチドをデザインして、リボソームがＨＨＨをコードする
転写物に結合するのを防ぐ。
【０１９８】 ９ ＨＨＨの発現 ＨＨＨの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でＨＨＨが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転
写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブ
クローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメ
ントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(ta
c)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質
耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発さ
れるとＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのＨＨＨの発現は、昆虫細胞株または哺
乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica cal ifornica 核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必
須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の
媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＨＨをコードするｃＤＮＡと置換
する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高い
レベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は Spodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感
染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる
遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-
1945.を参照)。
【０１９９】 ほとんどの発現系では、ＨＨＨが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ
(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タン
パク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベ
ースの精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２
６キロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維
持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。(P
harmacia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯ
Ｒからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで
、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いた免疫親和性の精
製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、金
属キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatsworth, CA)で精製が可能となる。タンパク質
の発現及び精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による(1995年、及び定期的に補足
された) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New Y
ork, NY, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したＨＬＯＲを直
接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０２００】 １０ ＨＨＨの活性の実証 例として、ＨＨＨ分子のβグルコシダーゼ活性を測定するアッセイが記載され
る。ＨＨＨの量を変更しながら、50 mM 酢酸ナトリウムバッファ. pH 5.0内で1m
M 4-nitropheny β-D-glycopyranoside （基質）を用いて、３７℃で時間を変え
ながら（典型的には１〜５分）インキュベートした。４１０ｎｍで分光光度分析
により吸収度を測定し、その吸収度がサンプル内のＨＨＨの活性に比例する（Hr
mova, M.等(1998) J. Biol. Chem. 273:11134-11143）。
【０２０１】 １１ 機能的アッセイ ＨＨＨの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルで
のＨＨＨをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高
いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクロー
ニングする。このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies. Gai
thersburg. MD)及びpCRTM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらも
サイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクタ
ーを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気
穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列
を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現に
より、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、
標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に
予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (Clont
ech, Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。レ
ーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPま
たはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態など
の特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断
する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウム
ヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモ
デオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節
と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパン
ク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によ
って計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod,
M. G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載されて
いる。
【０２０２】 遺伝子発現におけるＨＨＨの影響は、ＨＨＨをコードする配列とCD64またはCD
64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価する
ことができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転
換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気
ビードを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照)。ｍ
ＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＨＨＨ及び目
的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ
技術で分析することができる。
【０２０３】 １２ ＨＨＨ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参
照されたい）または他の精製技術を用いて実質的に精製されたＨＨＨを用いる。
【０２０４】 別法では、ＨＨＨアミノ酸配列をLASERGENETM software（DNASTAR社）を用い
て解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者が周
知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために用いる。
Ｃ末端付近或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトー
プの選択方法は当分野において周知である（例えばAusubel等. 前掲, ch. 11を
参照されたい.）。
【０２０５】 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前掲）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ
ュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血
清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ
抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと
反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。
【０２０６】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＨＨの精製 自然発生或いは組換えＨＨＨは、ＨＨＨに対して特異な抗体を用いる免疫親和
性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＨＨＨ抗
体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活性化されたク
ロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後、製造者の取
扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。
【０２０７】 ＨＨＨを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＨＨＨを選択
吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で洗浄
される。カラムは、抗体／ＨＨＨ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２〜３の緩衝剤
或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）で溶出
され、ＨＨＨが回収される。
【０２０８】 １３ ＨＨＨと相互作用する分子の同定 ＨＨＨ或いはその生物学的活性フラグメントが、125I Bolton-Hunter試薬(Bol
ton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多穴プレートのウエ
ル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＨＨＨでインキュベートされ、
洗浄され、標識されたＨＨＨ複合体を有する任意のウエルが検定される。種々の
ＨＨＨ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＨＨＨと候補分子との
関係を示す値を計算する。
【０２０９】 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものと考慮
されたい。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ 15/00 Ｃ１２Ｎ 9/24 43/00 １１１ 9/80 Ｚ Ｃ０７Ｋ 16/40 9/82 Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/80 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/82 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA11 AA19 BA11 CA03 CA04 CA07 CA09 CA12 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 GA27 HA03 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 CC05 DD11 EE01 FF14E GG01 LL01 LL02 LL03 LL05 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QQ44 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR40 QR56 QR62 QR84 QS16 QS25 QS34 QX02 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA25 DC22 MA01 NA14 ZA811 ZA812 ZB221 ZB222 ZC211 ZC212 ZC351 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB22 CC26 EE01 FF24 4H045 AA11 BA10 BA41 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA71 GA26

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるグル
    ープから選択されたアミノ酸配列或いはそのフラグメントを含む実質的に精製さ
    れたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１の配列に少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有
    する実質的に精製された変異体。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され、精製された
    ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
  5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドに厳密な条件でハイブリダイズ
    する単離され、精製されたポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する単
    離され、精製されたポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４からなるグ
    ループから選択されたポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む単離
    され、精製されたポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
  9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離さ
    れ、精製されたポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを
    含む発現ベクタ。
  11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクタを含む宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるグ
    ループから選択されたアミノ酸配列或いはそのフラグメントを含むポリペプチド
    を生成するための方法であって、 （ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１１の宿主細胞を培養する
    過程と、 （ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有するこ
    とを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 適当な医薬品担体とともに請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
  14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗体
    。
  15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
  16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
  17. 【請求項１７】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含む、生殖障害を治療或いは予防するための方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１３の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検者
    に投与する過程を含む、炭水化物代謝障害を治療或いは予防するための方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含む、細胞増殖障害を治療或いは予防するための方法。
  20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    １〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなるグループから選択されるアミノ酸配列或いは
    そのフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する
    ための方法であって、 （ａ）前記生物学的サンプルの核酸の少なくとも１つに請求項６のポリヌクレ
    オチドをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
    、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおける前記ポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 前記生物学的サンプルの前記核酸が、前記ハイブリダイゼ
    ーション過程の前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請
    求項２０に記載の方法。
JP2000551010A 1998-05-29 1999-05-28 ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ Pending JP2003500002A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8723698P 1998-05-29 1998-05-29
US60/087,236 1998-05-29
PCT/US1999/012021 WO1999061626A2 (en) 1998-05-29 1999-05-28 Human hydrolase homologs: n-terminal asparagine amidohydrolase, glycosyl hydrolase, glucohydrolase, biotinidase, and n-acetylglucosamine 6-p deacetylase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003500002A true JP2003500002A (ja) 2003-01-07

Family

ID=22203944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000551010A Pending JP2003500002A (ja) 1998-05-29 1999-05-28 ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1080203A2 (ja)
JP (1) JP2003500002A (ja)
AU (1) AU4322299A (ja)
CA (1) CA2329076A1 (ja)
WO (1) WO1999061626A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL132105A0 (en) 1998-12-24 2001-03-19 Yeda Res & Dev Caspase-8 interacting proteins
CN1301854A (zh) * 1999-12-29 2001-07-04 复旦大学 一种新的多肽——糖基水解酶12和编码这种多肽的多核苷酸
WO2003054153A2 (en) * 2001-12-12 2003-07-03 University Of Cincinnati Apyrase polypeptides and nucleic acids encoding same
AU2003231245A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Incyte Corporation Molecules for disease detection and treatment

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6537547B1 (en) * 1996-06-07 2003-03-25 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Polypeptides having L-asparaginase activity
US5958750A (en) * 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999061626A3 (en) 2000-04-06
WO1999061626A2 (en) 1999-12-02
EP1080203A2 (en) 2001-03-07
AU4322299A (en) 1999-12-13
CA2329076A1 (en) 1999-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5840871A (en) Prostate-associated kallikrein
JP2002527069A (ja) プロテインキナーゼホモログ
US6472195B2 (en) Human kallikrein
JP2001508663A (ja) 新規のヒトカテプシン
US6171843B1 (en) Human peptidyl-prolyl isomerases
US20030175924A1 (en) Human lysophosphatidic acid acyltransferase
US6365358B1 (en) Ubiquitin-like conjugating protein
JP2002519022A (ja) ヒトトランスフェラーゼ
US20020173022A1 (en) Human protein phosphatase
EP1054981A2 (en) Prostate-associated serine protease
US6416755B1 (en) Human beta-alanine-pyruvate aminotransferase
JP2002508176A (ja) ヒトホスファターゼ
US5849498A (en) Human 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme a hydrolase
JP2002507419A (ja) ヒトプロテインホスファターゼ関連分子
JP2003500002A (ja) ヒトヒドロラーゼ相同体：ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、ビオチニダーゼ及びｎ−アセチルグルコサミン６−ｐデアセチラーゼ
US6610526B2 (en) Human E1-like protein
JP2002517190A (ja) カルバモイルリン酸シンターゼホモログ
JP2002523051A (ja) シクロフィリン型ペプチジルプロリンｃｉｓ−ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ
US6558914B1 (en) Human lysophosphatidic acid acyltransferase
US20020091084A1 (en) Human calcium binding protein
JP2002517243A (ja) 細胞サイクル調節タンパク質
WO1999050396A1 (en) Nek1-related protein kinase
JP2002514081A (ja) ヒト・リゾホスホリパーゼ
JP2002512034A (ja) Ｂ細胞成長因子関連タンパク質