KR100404737B1 - 종양괴사인자/신경성장인자(tnf/ngf)수퍼패밀리수용체와수용성올리고머종양괴사인자/신경성장인자수퍼패밀리수용체의조절인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 p55와 p75 TNF-Rs 그리고 Fas-R의 세포내 도메인에 결합하는 새로운 단백질에 관한 것으로, 이는 p55와 p75 TNF-Rs 그리고 Fas-R 및 그것들을 코딩하는 DNA 서열의 기능을 조절시킬 수 있다. 본 발명은 또한 새로운 수용성의 올리고머 TNF-Rs, 올리고머 Fas-Rs, 그리고 TNF-Rs와 Fas-R의 혼합물을 가지는 올리고머 수용체에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 이상의 모든 것의 제조와 사용방법에 관한 것이다.

Description

종양괴사인자/신경 성장인자(TNF/NGF) 수퍼패밀리 수용체와 수용성 올리고머 종양괴사인자/신경성장인자 수퍼패밀리 수용체의 조절인자

종양괴사인자(TNF-α)와 림포톡신(TNF-β)(이하에서 TNF라 함은 TNF-α와 TNF-β 양자를 말하는 것임)은 주로 단핵 식균세포에 의해 생성되는 다기능 선구염증성 시토카인(pro-inflammatory cytokines)이며, 세포에 많은 영향을 미친다(Wallach, D, (1986)in: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp.83-122, Academic Press, London; 및 Cerami(1987)). TNF-α 와 TNF-β 는 모두 특정 세포표면 수용체에 결합함으로써 그 효과를 일으키기 시작한다. 그 효과들 중 어떤 것은 생물에게 이로운 것으로 보인다: 그들은 예를 들어 종양세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴하고 그래뉼로사이트의 항균 작용을 증진시킨다. 이러한 방식으로 TNF는 종양과 감염자에 대한 생물의 방어에 기여하고 상처의 회복에 기여한다. 따라서, TNF는 항종양 인자로 사용될 수 있는데, 이것은 종양세포 표면의 수용체에 결합하며 종양세포의 사멸을 유도하는 반응을 개시한다. TNF는 항감염제로도 사용될 수 있다.

그러나 TNF-α 와 TNF-β 양자는 또한 해로운 효과도 가지고 있다. TNF-α 의 과량생산인 몇몇 질병에서 주요 병원성 역할을 한다는 증거가 있다. 그래서, TNF-α 의 효과는 원래 맥관구조 상에서 패혈 쇼크 증세의 주요 원인인 것으로 알려져 있다(Tracey etal., 1986). 어떤 질병에서, TNF는 지방세포의 활동을 억제하고 식욕부진을 일으킴으로써 체중의 과다 감소(영양불량; cachexia)를 일으키며 그리하고 TNF-α 는 캐커틴(cachetin)이라 불린다. 그것은 또한 류머티스성 질환에서 조직에 손상을 입히는 매개자로(Beutler and Cerarni, 1987), 이식조직대 숙주 간의 반응에서 관찰되는 손상의 매개자로(Piguet et al., 1987) 묘사되기도 하였다. 또한 TNF는 염증 진행과정과 다른 많은 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.

두개의 독립적으로 발현되는 별개의 수용체인 p55와 p75 TNF-Rs는 TNF-α 와 TNF-β 양자에 특이적으로 결합하는데, 앞서 기술한 TNF의 생물학적 효과를 개시하고/또는 매개한다. 이 두 수용체는 다른 신호를 나타낼 것을 암시하는 구조적으로 비유사한 세포내 도메인을 가지고 있다(Hohmann et al., 1989, Engelmann etal., 1990; Brockhaus et al., 1990: Leotscher et al., 1990. Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; 및 Heller et al., 1990 참조). 그렇지만, 세포 메카니즘, 예를 들어 p55와 p75 TNF-Rs의 세포내 신호전달에 관여하는 다양한 단백질과 가능성 있는 다른 인자들은 아직 밝혀지지 않았다(p75IC와 p55IC에 결합할 수 있는 새로운 단백질에 관하여 이하에서 처음으로 기술하고 있다). 궁극적으로 세포의 TNF에 대한 관찰된 것과 같은 반응을 일으키는 연쇄적 기작의 개시의 원인이 되는 것은 보통 리간드, 즉 TNF(α 또는 β )의 결합 후에 발생하는 세포내 신호전달이다.

TNF의 앞서 언급한 세포를 죽이는 효과에 관하여는 지금까지 연구되어 온 대부분의 세포에서 이 효과는 p55 TNF-R에 의해 주로 개시된다. p55 TNF-R의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인)에 대한 항체는 스스로 세포를 죽이는 효과를 개시할수 있는데(EP 412486 참조) 그것은 항체에 의한 수용체 교차결합 효과와 관련이 있으며, 이것은 세포내 신호전달 과정의 발생에 있어서 첫단계로 믿어진다. 나아가 돌연변이 연구(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993)는 p55 TNF-R의 생물학적 기능이 그 세포외 도메인의 완전성에 의존한다는 것을 보여주었고, 따라서 TNF의 세포를 죽이는 효과를 일으키는 세포내 신호전달의 개시는 2 또는 그 이상의 p55 TNF-R의 세포내 도메인과 결합한 결과로 인해 일어나는 것으로 추정된다. 또한, TNF(α 와β )는 호모 삼합체(homotrimer)로 존재하는데, 수용체 분자에 결합하여 수용체 분자를 교차 결합시키는 능력 즉, 다시 말하여 수용체 응집을 거쳐 p55 TNF-R을 통한 세포내 신호전달을 유도하는 것으로 추정된다. 이하에서 p55IC와 p55DD가 서로 어떻게 결합하고 리간드-비의존적인 방식으로 TNF-관련 효과를 세포 내에서 유도하는가를 기술한다.

TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리의 다른 멤버는 FAS수용체 (FAS-R)인데 그것은 Fas 항원이라고도 불리며, TNF-R과 NGF-R을 포함하는 다수의 세포표면 수용체와 유사성을 가지며, 다양한 조직에서 발현되는 세포 표면 단백질이다. FAS-R은 아포토시스(apoptosis) 형태의 세포 사멸을 매개하며(Itoh et al., 1991), 스스로 반응하는 T세포의 음성 선택자(negative selector)로서 기능하는 것으로 보이는데, 즉 T세포의 성숙기 동안 FAS-R은 자기 항원을 인식하는 T세포의 아포토시스로 인한 사멸을 매개한다. FAS-R 유전자(lpr)의 변이는 또한 마우스에서의 림프세포 증식증(lymphoproliferation disorder)을 일으키는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 인간의 자기면역 질병인 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus eruthematosus;SLE)(Watanabe-Fukunaga et al., 1992)와 유사하다. FAS-R의 리간드는 다른 것들중에서는 킬러 T세포(또는 세포독성 T임파구-CTLs라고도 함)에 의해 운반되는 세포-표면 결합 분자인 것으로 보이는데, 이와 같은 CTLs가 FAS-R을 가진 세포와 접촉하면 그들은 FAS-R-운반 세포의 아포토시스성 세포 사멸을 유도할 수 있다. 나아가, FAS-R에 특이적인 모노클론 항체를 제조할 수 있는데 이 모노클론 항체는 인간 FAS-R을 코딩하는 cDNA에 의해 형질 전환된 마우스 세포를 포함하여 FAS-R을 가진 세포에서 아포토시스성 세포사멸을 유도할 수 있다(Itoh et al., 1991).

T임파구 외에도 많은 다른 정상 세포들이 그 표면에 FAS-R을 발현하며 이 수용체의 개시반응으로 인하여 사멸할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 그와 같은 치사 과정의 통제되지 않은 유도는 어떤 질병에서 조직 손상을 일으키는 것으로 생각되는데, 급성 간염에서의 간 세포의 파괴같은 것이 그런 예이다. 따라서, FAS-R의 세포독성 활성을 억제하는 방법의 모색은 치료 가능성을 높일 수 있을 것이다.

반대로, 어떤 악성세포들과 HIV-감염 세포들이 그 표면에 FAS-R을 가지고 있다는 사실도 밝혀졌으므로 FAS-R 또는 FAS-R리간드에 대한 항체는 이들 세포에서 FAS-R이 매개하는 세포독성 효과를 개시하여 그와 같은 악성세포 또는 HIV-감염세포와 싸울 수 있는 수단을 제공해 줄 것이다(Itoh et al., 1991). 아직 발견되지는 않았지만 FAS-R의 세포독성 활성을 증대시키는 다른 방법들 또한 치료 가능성을 높여줄 것이다.

TNF(α 또는 β )와 FAS-R리간드에 대한 세포반응을 조절하는 방법이 오랫동안 절실하게 요구되어 왔다. 예를 들어, 앞서 언급한 것과 같은 질병 상황에서 TNF또는 FAS-R 리간드는 과량 발현되어서 TNF- 또는 FAS-R 리간드-유도 세포사멸 효과를 억제할 필요가 있었고, 한편 다른 상황, 예를 들어 상처를 치유하려는 시도에 있어서는 TNF 효과를 증진시키는 것이 바람직하고, 또는 FAS-R의 경우에는 종양세포나 HIV-감염 세포에서 FAS-R 매개 효과를 증진시키는 것이 필요하다.

본 발명자들에 의하여 TNF의 해로운 효과를 조절하려는 여러 가지 접근이 시도되었는데(예컨대 유럽특허출원번호 EP 186833, EP308378, EP 3983227 및 EP 412486 참조) 항TNF 항체를 이용하여 TNF가 그 수용체에 결합하는 것을 억제하거나 수용성 TNF 수용체(본래는 수용체의 수용성 세포외 도메인이다)를 사용하여 TNF의 세포 표면에 결합된 TNF-Rs와의 결합과 경쟁하는 것이다. 나아가, TNF의 그 수용체와의 결합이 TNF-유도 세포 효과에 필요하다는 사실을 기본으로하여 본 발명자들에 의하여 TNF-Rs의 활성을 조절함으로써 TNF의 효과를 조절하려는 접근이 시도되었다(예를 들면 EPO 568925 참조). 간단히 말하자면 EPO 568925는 TNF-Rs에서의 신호 도입(Signal transduction)을 조절하는 방법에 관한 것으로서, 여기에서 펩티드 또는 다른 분자들이 수용체 그 자체 또는 수용체와 상호작용하는 효과인자 단백질과 상호작용하여 TNF-Rs의 정상적인 기능을 조절하는 것이다. EPO 568925는 p55 TNF-R의 세포외, 막간(transmanbranal) 및 세포내 도메인에 변이가 있는 다양한 p55 TNF-Rs 변이체의 생산과 특성에 관하여 기술하고 있다. 이와 같은 방법으로 p55 TNF-R의 상기 도메인들 내에 있는 부분들이 수용체의 기능 즉, 리간드(TNF)의 결합 및 이어지는 신호도입과 궁극적으로는 세포에서 관찰되는 TNF 효과를 일으키는 세포내 신호전달에 필수적임을 밝혀 내었다. 나아가 또한 단백질, 펩티드 또는TNF-R의 상기 도메인들에 존재하는 다양한 부분에 결합할 수 있는 다른 인자들을 분리하고 규명하는 여러 접근에 관하여 기술되어 있는데, 이 단백질, 펩티드와 다른 인자들은 TNF-R의 활성을 조절하거나 조절하는데 관여할 것이다. 또한 그와 같은 단백질과 펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 분리와 클로닝; 이러한 단백질과 펩티드를 생산하는 발현 벡터의 구성; 그리고 TNF-R의 다양한 부분과 결합하는 상기 단백질 및 펩티드 또는 TNF-R과 상호 작용하는 항체 또는 항체 단편(fragment)의 제조에 관한 다양한 접근이 EPO 568925에 개시되어 있다. 그러나, EPO 568925에는 TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합하는 실제 단백질과 펩티드(예를 들어, p55 TNF-R)에 관하여, 또는 TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합하는 그와 같은 단백질 또는 펩티드를 분리하고 규명하기 위하여 이용되는 효모 이중혼성(yeast two-hybrid) 접근법에 관하여는 어떠한 언급도 없다. 유사하게 지금까지는 FAS-R 세포내 도메인과 결합 가능한 단백질 또는 펩티드에 관하여 개시된 바 없었다.

따라서, TNF 또는 FAS-R리간드의 효과를 억제하기 위하여는 세포표면에서 TNF-Rs 또는 FAS-R의 양 또는 활성을 감소시키는 것이 바람직하고, 반면 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 증대시키기 위하여는 TNF-Rs 또는 FAS-R의 양 또는 활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 목적을 위하여 p55 TNF-R과 p75 TNF-R 양자의 프로모터가 본 발명자들에 의해 최근에 서열이 결정되고 분석되었으며 다양한 전사조절인자에 특이적인 핵심서열 모티브(Key seguence motifs)가 발견되었으며, 이러한 TNF-Rs의 발현이 프로모터 수준에서 조절될 수 있다는 것 즉, 수용체의 수를 감소시키기 위하여는 프로모터에서의 전사를 억제하고 수용체의 수를 증가시키기 위하여는 프로모터로부터의 전사를 증대시키면 된다는 사실이 밝혀졌다(IL104355와 IL109633 그리고 아직 발행되지 않은 당해 EP 및 PCT 참조). FAS-R 유전자의 프로모터 수준에서의 FAS-R의 조절에 관한 연구는 아직 보고되지 않았다.

나아가, 종양괴사인자 및 구조적으로 관련 있는 수용체 FAS-R이 백혈구-생성 리간드에 의한 자극으로 세포 내에서 세포 자신의 사멸을 유도하는 파괴적 활성을 개시한다는 사실이 알려져 있음에도 불구하고, 이와 같은 개시기작은 여전히 거의 이해되고 있지 못하다. 변이 연구는 FAS-R 과 p55 TNF 수용체(p55-R)에 있어서 세포독성에 관한 신호전달이 그들 세포내 도메인의 독특한 부분과 관련이 있음을 나타낸다(Brakebusch et al., 1992, Tartaglia et al., 1993, Itoh and Nagata. 1993). 이 부분들(소위 '사멸 도메인')은 서열 유사성을 가진다. FAS-R과 p55-R 양자의 '사멸 도메인'은 자기 결합 (self-association)하는 경향이 있다. 자기 결합은 분명히 신호전달의 개시에 필요한 수용체 응집을 촉진시키고(이하에서 기술되어 있으며, Song et al., 1994, Boldin et al., 1995 등에 기술됨) 수용체가 높은 수준으로 발현되면 리간드-비의존적 신호전달을 일으킬 수 있다(Boldin et al., 1995 및 이하에서 기술됨).

따라서, 본 발명 이전에는 세포내 신호전달 과정을 매개함으로써 TNF 또는 FAS-R 리간드의 세포내 효과와 같은 TNF/NGF 수퍼 패밀리에 속하는 리간드의 효과를 조절하는 단백질에 관하여 제시되어 있지 않았다. 여기에서 신호전달은 FAS-IC 뿐만 아니라 TNF-Rs 즉, p55 및 p75 TNF-R의 세포내 도매인(각각, p55IC 및 p75IC라 함)과 같은 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리에 속하는 수용체의 세포내 도메인(ICs)에 의하여 대부분 조절되는 것으로 보인다.

따라서, 본 발명의 한가지 목적은 TNF-Rs와 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질 즉, TNF가 그 수용체에 또는 FAS리간드가 그 수용체에 결합함으로써 개시되는 세포내 신호전달과정에 관여하는 것으로 현재 믿어지는 단백질을 제공하려는 것이다.

본발명의 다른 목적은 이러한 세포내 도메인-결합 단백질(IC-binding protein)에 대한 대립자(예를 들면, 항체)를 제공하려는 것인데, IC-결합 단백질이 양성신호인자(즉, 신호전달을 유도하는 것)이거나 신호전달 과정을 증폭시키는 경우에는 신호전달 과정을 억제하는데 사용되고, IC-결합 단백질이 음성 신호전달인자(즉, 신호전달을 억제하는 것)인 경우에는 신호전달과정을 증폭시키는데 사용된다.

본 발명의 또다른 목적은 그와 같은 IC-결합 단백질을 이용하여 신호전달과정의 하류(downstream)에 관여할 것으로 생각되는 단백질 또는 인자를 분리하고 규명하려는 것이며, 그리고/또는 신호전달과정의 상류(upstream)에서 이러한 IC-결합 단백질에 결합하여 IC-결합 단백질의 기능에 관여하는 다른 수용체(예를 들면, TNF-Rs 또는 관련 수용체)를 분리하고 규명하려는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 언급한 IC - 결합 단백질을 항원으로 이용하여 그에 대한 폴리클론 그리고/또는 모노클론 항체를 제조하려는 것이다. 반대로 항체는 세포추출물 또는 형질전환된 세포계통과 같은 다른 근원으로부터 새로운IC - 결합 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다.

나아가, 이 항체는 진단목적 즉 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리에 속하는 수용체가 매개하는 세포효과의 비정상적인 기능에 관련된 질병을 확인하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 TNF- 유도 또는 FAS 리간드 유도 상태의 치료 또는 예방을 위하여 상기 IC-결합 단백질을 포함하는 악제 화합물을 제공하려는 것인데, 예를 들면 이러한 화합물들은 화합물 내의 IC-결합 단백질 또는 그 대립자의 상기와 같은 성질에 따라 TNF 또는 FAS 리간드 효과의 증진 또는 억제용으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적에 따라 여기에서는 수용성 올리고머 TNF-Rs, 올리고머 FAS-Rs, 또는 TNF-Rs와 FAS-Rs의 혼합물 올리고머를 이용하여 생체 내에서 생성되거나 생체 외에서 투여된 TNF 또는 FAS-R 리간드를 제거하거나 대립하는 다른 방법들에 대하여 개시한다. 이러한 관점에서 볼 때 이와 같은 방향에서의 시도가 TBP-1으로 명명된 TNF 결합 단백질의 분리 및 재조합 생산이었음이 언급되어야할 것이다. 이 단백질 TBP-I은 TNF의 효과에 대항할 수 있는 것으로 나타났다. 이 대항효과는 TNF와 그 수용체의 결합의 방해정도(EP 308378) 외에도 TNF의 세포독성 활성의 감소를 측정하여 결정하였다. TBP-I은 ml당 수 나노그램(ng)의 농도에서 TNF독성으로부터 세포를 보호하고 이들 시토카인을 동시에 적용하였을 때 TNF-α 와 TNF-β 양자가 세포에 결합하는 것을 방해하는 것으로 나타났다. 나아가, TBP-I 기능 메카니즘의 시험은 TBP-I이 목표세포와 반응하는 것이 아니라, TNF에특이적으로 결합하며 TNF에 대하여 TNF수용체와 경쟁함으로써 TNF의 기능을 차단한다는 것을 밝혔다.

결론적으로, 다른 정제기술로 두 활성요소의 존재가 밝혀졌다. 하나는 TBP-II라고 명명된 두 번째 TNF-결합 단백질이 그것이다(EP 398327에 처음 기술됨). 두 단백질은 모두 시험관 내에서 TNF의 세포독성적 효과를 방어하며, 양자 모두 TNF-α 보다는 TNF-β 에 덜 효율적으로 결합한다. 두 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석에서 TBP-I 과 TBP-II은 매우 유사한 분자량을 가지고 있는 것으로 나타나지만, N-말단 아미노산 서열이 비유사하고 면역적으로 교차반응성이 없어서 서로 명확히 구별가능하다.

그러나, 앞서 기술된 수용성 TNF 결합 단백질은 모노머이고 따라서 자연 리간드인 TNF 호모 삼합체의 한 모노머에만 결합할 수 있고 TNF 결합 단백질이 결합되지 않은 두 개의 활성이 있는 모노머를 가지고 있으므로 여전히 TNF 활성을 허용한다(즉, 불완전한 중화). 나아가, 이전에는 호모사합체이고 세포표면 결합분자로 알려진 FAS-R 리간드와 결합 가능한 수용성 FAS-Rs(수용성 FAS-R 리간드 결합 단백질)에 대하여 개시되지 않았다.

P55-IC 의 소위 '사멸 도메인'(Tartagliaetal., 1993)이 본 발명에 의하여 개시되었으나, p55- IC와 그의 '사멸 도메인'이 자기-결합하고, 이 자기 결합이 우선적으로 세포사(cell cytotoxis)를 유도하는 신호전달에 책임이 있는지는 밝혀지지 않았다. 또한, 이 출판물은 수용성 올리고며 TNF-Rs 또는 수용성 올리고머 Fas-Rs 또는 그들의 혼합물 올리고머의 생산가능성에 대하여 언급하지 않고 있으며 IL-8 유전자 발현유도와 같은 P55-IC 또는 그 일부분에 의하여 유도되는 다른 TNF-관련 효과에 대하여도 개시하고 있지 않은데, 본 발명은 이에 대하여 개시하고 있다. 유사하게, 본 발명일자 이후에 발간된 또다른 출판물은 p55-IC의 응집(즉, 자기결합) 능력에 대하여 개시하였으나 위에서 기술한 것과 같이 수용성 올리고며 TNF-Rs 또는 Fas-Rs의 제조를 위하여 그 응집능력을 이용하는 것과는 관련이 없고 본 발명에 의한 P55-IC 또는 그 일부에 의하여 리간드-비의존적 방식으로 유도되는 다른 TNF-관련 효과와도 관련이 없다.

[발명의 개요]

본 발명에 따라 우리는 p55-IC TNF-R, p75 TNF-R과 FAS-R의 어떤 세포내 도메인에 결합할 수 있는 신규 단백질(각각, p55 IC-결합 단백질, p75 IC-결합 단백질, 그리고 FAS-IC 결합 단백질)을 발명하였다. 이들 p55-IC, p75IC- 및 FAS-IC 결합 단백질들은 세포 표면에서 TNF의 p55 그리고/ 또는 p75 TNF-R에의 결합, 또는 FAS-R 리간드의 결합 이후 일반적으로 발생하는 세포내 신호전달과정을 매개하거나 조절하는 방식으로 세포의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과의 매개자 또는 조절인자로 작용할 수 있다. 나아가, 놀랍게도 p55 IC와 FAS-IC가 자기결합 능력을 가지며, p55IC 와 FAS-IC의 단편들이 p55IC에 대하여 유사한 결합 능력이 있고, 특히 이들 수용체의 ICs 내에 있는 소위 '사멸 도메인' 즉 p55DD 와 FAS-DD가 p55IC DP 대하여 유사한 결합능력이 있음이 우연히 밝혀졌다. 그리하여, p55IC 및 FAS-IC와 그 단편들 또한 p55IC 와 FAS-IC에 결합능력을 가지는 단백질을 나타내며, 따라서 세포에서의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과의 조절인자가 될 수 있다.

나아가, 여기에는 55.11 단백질이라고 명명된 본 발명의 신규 단백질 중의 하나가 p55-TNF-R의 세포내 도메인에 결합하는 성질에 대하여 좀 더 자세히 밝혀져 있다(실시예 1 참조).

또한, 다른 측면에서 본 발명은 소위 P55IC '사멸 도메인'을 포함하는 P55TNF 수용체의 세포내 도메인과 소위 Fas-IC '사멸 도메인'을 포함하는 Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인(Fas-IC)이 자기 결합능력이 있음을 밝힌 것에 바탕을 두고 있다. 따라서, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 융합 생성물 즉, 한쪽 말단에는 최소한 2이상의 TNF수용체 세포의 도메인을 다른 쪽 말단에는 최소한 2 이상의 상기 언급한 자기-결합 세포내 도메인 또는 그 일부분을 가지는 수용성 올리고머 TNF 수용체를 구성할 수 있다. 여기에서 자기 결합은 최소한 2이상의 융합 산물이 서로 연결된 올리고머를 제공한다. 그와 같은 수용성 올리고머 TNF-R은 따라서 자연산 TNF 호모 삼합체의 두 모노머와 결합할 수 있어서 효과적으로 TNF 활성을 무력화할 수 있다. TNF가 생체 내에서 과량 생산되거나 또는 세포 외에서 과량 투여되어 바람직하지 못한 부작용을 일으키는 앞서 언급한 모든 상황에서 TNF 활성의 무력화(중화)는 바람직하다. 또한, 본 발명의 수용성 올리고머 수용체에 의한 TNF의 효과적인 결합은 또한 TNF가 종양 치료와 같은 이로운 효과를 위하여 투여되는 조건 하에서 외부에서 투여된 TNF와 결합하여 이후에 서서히 방출되도록 해준다. 유사하게, 표준 재조합 DNA 기술로 한쪽 말단에는 최소 2 이상의 FAS-R 세포외 도메인과 다른쪽 말단에는 최소 2 이상의 앞서 기술한 자기 결합 세포내 도메인 또는 그 일부분을 포함하는 융합 산물 올리고머 FAS-R을 구성하는 것이 가능한데 자기 결합은최소한 2이상의 그러한 융합 산물을 서로 연결되게 하여 올리고머를 제공해 준다. 그리하여 그와 같은 올리고머 FAS-R은 자연 생성된 FAS -R 리간드 호모 삼합체의 두 모노머에 결합할 수 있고 효율적으로 FAS-R 리간드 효과를 무력화시킬 수 있다. 과량의 FAS-R 리간드가 바람직하지 못한 부작용을 일으키는 상기 언급한 조건 하에서 FAS-R 리간드 활성의 중화는 바람직하다. 유사한 유형으로 세포에서의 TNF와 FAS-R 리간드-유도 효과 간의 가능한 연계와 또한 그들이 그들의 수용체와 접합하는 세포 표면에서의 지리적으로 가능한 연계를 보여주는 최근의 보고를 살펴볼 때 TNF와 FAS-R 리간의 양자에 대하여 특이성을 가지는 혼합 올리고머 수용체를 표준 재조합 DNA기술로 구성하는 것 또한 가능하다. 그와 같은 혼합 올리고머는 그 한쪽 말단에 최소 1 이상의 TNF-R 세포외 도메인과 최소 1 이상의 FAS-R 세포외 도메인을 포함하고, 그 다른 말단에는 최소 2 이상의 상기 언급한 자기 결합하는 세포내 도메인 또는 그 일부분을 포함하는 상기 융합 산물의 혼합물이 될 것이며, 여기에서 자기 결합은 최소한 2 이상의 그와 같은 융합생산물이 서로 연결되게 하여 혼합된 올리고머를 제공해 준다. 그와 같은 혼합 올리고머는 최소한 하나의 TNF 모노머와 하나의 모노머 FAS-R 리간드가 동시에 결합할 수 있어 이러한 두 시토카인 과량이 바람직하지 못한 세포효과와 관련되어 있는 상황에서 세포 표면에서의 TNF와 FAS-R 리간드의 활성을 감소시키거나 효율적으로 중화시킬 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, FAS-R 리간드는 일반적으로 세포표면에 결합되어 있으며, 최근의 보고는 TNF의 세포표면-결합형태를 기술하고 있다. 따라서, 이러한 혼합형 TNF-R/FAS-R 올리고머는 세포표면에서 TNF 와 FAS-R 리간드의 활성을 중화시키는데 특별히 유용하다.

따라서, 본 발명은 종양괴사인자/신경성장인자(TNF/NGF)수용체 수퍼패밀리에 속하는 1 이상의 수용체의 1 이상의 세포내 도메인에 결합 가능한 단백질을 코딩하는 DNA서열을 제공한다.

특히 본 발명은 다음의 그룹 중에서 선택된 DNA 서열을 제공한다:

(a) 천연 TNF-R 세포내 도메인 결합 단백질의 코딩 부분에서 유래된 cDNA 서열

(b) 적절한 스트린전트 조건에서 (a)의 DNA와 혼성화할 수 있고 생물학적으로 활성이 있는 TNF-R 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열; 그리고

(c) (a)와 (b)에서 정의된 DNA 서열과 유전암호의 결과로써 같은 암호를 가지도록 중첩성(degeneracy)이고 생물학적으로 활성이 있는 TNF-R 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열.

본 발명은 또한 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된 DNA서열을 제공한다:

(a) 천연 FAS-R 세포내 도메인 결합 단백질의 코딩 부분에서 유래된 cDNA서열

(b) 적절한 스트린전트 조건에서 (a)의 DNA와 혼성화할 수 있고 생물학적으로 활성이 있는 FAS-R 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열; 그리고

(c) (a)와 (b)에서 정의된 DNA 서열과 유전암호의 결과로써 중첩성(degeneracy)이고 생물학적으로 활성이 있는 FAS-R 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열.

본 발명의 실시예에서 DNA 서열은 P55 TNF-R, P75 TNF-R 과 FAS-R 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는데 이하에서 단백질 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 및 DD11로 명명된 단백질을 코딩한다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 서열에 의하여 코딩된 단백질 또는 유사체를 제공하는데, 상기 단백질, 유사체 및 유도체는 1 이상의 TNF-Rs 또는 FAS-R의 1 이상의 세포내 도메인과 결합할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면의 실시예는 이하에서 단백질 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 및 DD11이라고 명명된 단백질과 유사체 및 그 유도체를 포함한다.

또한 본 발명에 의하여 제공되는 것은 본 발명의 상기 DNA 서열을 포함하고 본 발명의 상기 단백질을 코딩하는 벡터들인데, 이 벡터는 알맞은 진핵 또는 원핵 숙주세포내에서 발현될수 있으며; 그러한 벡터를 포함하는 진핵 또는 원핵 숙주세포를 형질전환하여; 상기 단백질, 유사체 또는 유도체의 발현에 알맞은 조건 하에서 그러한 형질전환된 숙주세포를 생장시키고 상기 단백질을 얻기 위하여 필요한 상기 단백질의 후 변형(post-translational modifications)을 수행하고 상기 발현된 단백질, 유사체 또는 유도체를 상기 형질전환된 세포의 배양 배지 또는 상기 형질전환된 세포의 추출물에서 추출해내어 본 발명의 단백질, 유사체 또는 유도체를 생산하는 방법이다.

다른 면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질, 유사체 또는 그 유도체에 특이적인 항체 또는 활성 유도체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면으로는 본 발명에 따른 상기 DNA 서열 또는 단백질의다음과 같은 다양한 이용방법을 제공한다:

(i) TNF-R 또는 FAS-R 을 가지는 세포에서 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과의 조절방법, 본 발명에 따른 단백질, 유사체 그리고 유도체 및 P55IC, P55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, 그 유사체 또는 그 유도체로 구성된 그룹 중에서 선택된 1 이상의 단백질, 유사체 또는 유도체로 세포를 처리한다. 상기 모든 단백질은 상기 TNF-R 또는 FAS-R 의 세포내 도메인에 결합하여 그 활성을 조절할 수 있다. 여기에서, 상기 세포에 상기 1 이상의 단백질 유사체 또는 유사체 또는 유도체를 세포내 투약 또는 세포내 도입에 적합한 형태로 또는 발현 벡터, 상기 1 이상의 단백질, 유사체 또는 유도체를 코딩하는 DNA 서열에 적합한 형태로 도입하는 세포의 상기 처리법;

(ii) 본 발명의 항체 또는 활성 유도체 또는 그 단편으로 상기 세포를 처리하여 TNF-R 또는 FAS-R을 가진 세포에서 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하는 방법:

(iii) 최소한 본 발명에 의한 서열의 일부에 대한 안티센스 서열 또는 P55IC, P55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고누클레오티드 서열로 상기 세포를 처리하여 TNF-R 또는 FAS-R을 가진 세포에서 TNF 또는 FAS-R 리간드의 효과를 조절하는 방법, 여기에서 상기 올리고누클레오티드 서열은 최소한 1 이상의 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인 결합 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

(iv) TNF-R 또는 FAS-R을 가진 세포에서 다음과 같은 단계로 구성되어 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절시키는 방법;

(a) 특정 세포표면 수용체에 결합 가능한 바이러스 표면 세포를 코딩하는 서열 및 본 발명에 의한 서열의 최소한 일부에 대한 안티센스 서열을 코딩하는 올리고누클레오티드 서열과 p55IC, p55DD, FAS-IC, 또는 FAS-DD 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고누클레오티드 서열 중에서 선택된 서열을 운반하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 구성한다. 여기에서 올리고누클레오티드 서열은 상기 바이러스에 의하여 상기 세포로 도입될 때 최소 1 이상의 TNF-R 또는 FAS-R 세포로 도메인 결합 단백질의 발현을 억제시킬 수 있다; 그리고

(b) (a)의 상기 벡터를 이용하여 상기 세포를 감염시킨다.

(v) 본 발명의 단백질, 유사체 또는 유도체를 코딩하는 mRNA 서열과 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 mRNA서열로부터 선택된 서열에 대하여 특이적인 서열을 가지는 리보자임을 코딩하는 적절한 벡터로 상기 세포를 처리하여 TNF-R 또는 FAS-R을 가지는 세포에서 TNF 또는 FAS-R리간드 효과를 조절하는 방법, 여기에서 상기 리보자임 서열은 상기 mRNA 서열과 상호작용을 할 수 있고 상기 mRNA 서열을 절단할 수 있어 본 발명의 단백질, 유사체 또는 유도체 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 발현을 억제할 수 있다.

(vi) 다음과 같은 단계로 구성되어 종양세포 또는 HIV-감염세포 또는 다른 질병에 걸린 세포를 처리하는 방법;

(a) 종양세포 표면 수용체 또는 HIV-감염 세포 표면 수용체 또는 다른 질병에 걸린 세포의 또다른 세포표면 수용체에 결합 가능한 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 서열 및 본 발명의 단백질, 유사체 또는 유도체를 코딩하는 서열과 p55IC,p55DD, FAS-IC, FAS-DD 또는 이들의 생물학적으로 활성이 있는 유사체 또는 유도체를 코딩하는 서열 중에서 선택된 서열을 운반하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 구성한다; 그리고

(b) 상기(a)의 벡터로 상기 종양세포 또는 HIV-감염 세포 또는 다른 감염세포들을 감염시킨다.

(vii) 본 발명에 따른 상기 단백질이 흡착 크로마토그래피의 기질에 부착되어 상기 부착된 단백질은 세포 추출물과 접촉하여 세포 추출물의 단백질, 인자 또는 수용체와 결합한 후 용출, 분리 및 분석되는 절차로 구성된, 본 발명에 따른 세포내 도메인 결합 단백질과 결합 가능한 단백질, 인자 또는 수용체를 분리하고 규명하는 방법.

(viii) 하나의 혼성벡터에 의해 운반되는 상기 세포내 도메인 결합 단백질을 코딩하는 하나의 서열과 두번째 혼성벡터에 의하여 운반되는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 온 하나의 서열로 이루어진 효모 이중-혼성법을 적용하고 벡터들은 효모 숙주세포를 형질전환시키는데 사용되며, 양성 형질전환세포들은 분리되며, 그후 상기 세포내 도메인 결합 단백질에 결합하는 단백질을 코딩하는 서열을 얻기 위하여 상기 두번째 혼성 벡터를 추출하는 절차로 구성된, 본 발명에 따라 세포내 도메인 결합 단백질에 결합 가능한 단백질을 분리하고 규명하는 방법; 그리고

(ix) 비-스트린전트 서던 혼성법을 적용한 후 PCR클로닝 절차로 구성된 TNF-Rs 또는 FAS-R의 세포내 도메인과 결합가능한 단백질을 분리 및 규명하는 방법, 여기에서 본 발명의 서열 또는 그 일부 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 그것과최소한의 부분적 유사성을 가지고 있는 서열을 결합시키기 위한 탐침으로 이용되며, 상기 결합된 서열은 그 후 본 발명의 상기 서열과 최소한의 부분적인 유사성을 가진 단백질을 코딩하는 클론을 얻기 위하여 PCR절차에 의하여 증폭되고 클론된다.

본 발명은 세포에서의 TNF 리간드 효과의 조절을 위하여 활성 성분으로서 다음의 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하려는 것이다. :

(i) 본 발명에 의한 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, 생물학적 활성이 있는 단편, 유사체, 유도체 또는 그들의 혼합물;

(ii) 본 발명에 의한 단백질, 유사체 또는 유도체 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 서열 및 TNF-R 또는 FAS-R-운반 세포-또는 종양세포-특이성 수용체와 결합가능한 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 재조합 동물 바이러스 벡터;

(iii) 상기(ii)의 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 재조합 동물바이러스 벡터와 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고 누클레오티드 서열; 그리고 (iv) 본 발명에 의한 단백질, 유사체 또는 유도체를 코딩하는 mRNA 서열 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 mRNA 서열과 상호작용 가능한 서열의 리보자임을 코딩하는 벡터.

본 발명의 상기 측면에 관한 특이한 실시예는 p55-IC 또는 그를 코딩하는 DNA의 이용이다. 이 실시예는 p55-IC가 리간드(TNF)-비의존적 방식으로 세포에서의 다른 TNF-관련 효과를 유도할 수 있다는 사실을 밝혀낸 것에 근거를 두고 있다. 따라서, 상기 세포를 1 이상의 단백질, 유사체 또는 유도체로 처리하는 절차, 단상기1 이상의 단백질은 필수적으로 p55 TNF-R의 자기-결합성 세포내 도메인(p55-IC) 전체 또는 자기결합가능한 그 일부분이다. 이들은 리간드(TNF)-비의존적 방식으로 세포 내에서 TNF효과를 유도할 수 있으며, 세포의 상기 처리는 상기 세포에 상기 1 이상의 단백질, 유사체 또는 유도체를 세포내 도입에 적절한 형태로 도입하거나 상기 세포에 상기 1이상의 단백질, 유사체 또는 유도체를 코딩하는 DNA서열을 상기 서열이 상기 세포내에서 발현될 수 있도록 상기 서열의 운반에 적합한 벡터의 형태로 도입하며, 상기 벡터는 상기 세포에 상기 서열의 삽입이 효과적이 되도록 한다.

본 발명의 상기 방법에 대한 실시예는 다음을 포함한다;

(i) 상기 세포의 처리는 다음의 단계들로 이루어지며 재조합 동물 바이러스 벡터를 이용하여 상기 세포를 트랜스팩션(transfection)하는 것이다.

(a) 두가지 서열을 운반하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 구성하는 단계, 한 서열은 처리될 상기 세포의 표면에 특이적 세포표면 수용체와 결합가능한 바이러스 표면 단백질(리간드)을 코딩하는 서열이고, 두번째 서열은 p55IC 또는 그 일부, 상기 모든 유사체 및 유도체를 코딩하는 서열인데, 상기 단백질은 상기 세포 내에서 발현되었을 때 자기-결합이 가능하고 상기 1 이상의 TNF-관련 효과를 유도할 수 있다.

(b) (a)의 벡터로 상기 세포를 감염시키는 단계,

(ii) 상기세포에 상기 TNF효과를 도입하는 방법은 IL-8유전자의 발현을 유도하는 것이데, 상기 벡터는 상기 p55-IC의 전체 또는 그 일부, 앞의 모든 것의 유사체와 유도체를 필수적으로 코딩하는 서열을 운반하는 벡터이며, 이것은 세포 내에서 발현되었을 때 자기-결합이 가능하며, 상기 IL-8 유전자 발현 유도의 신호전달이 가능하다.

(iii) 종양세포 또는 바이러스 감염된 세포의 치료방법 또는 그래뉼로사이트의 항균 효과를 증진시키는 방법, 여기에서 상기 바이러스 벡터는 상기 종양세포, 바이러스 감염세포 또는 그래뉼로사이트의 표면에서 특이적 세포표면 수용체를 결합할 수 있는 바이러스 리간드를 코딩하는 서열 및 상기 p55-IC와 그 일부, 유사체 및 유도체를 코딩하는 서열을 운반하며, 상기 종양세포, 바이러스 감염세포 또는 그래뉼로사이트에서 발현되어 TNF-관련 효과를 유도하여 이들 세포의 사멸을 유도한다.

(iv) 종양세포의 치료방법, 여기에서 상기 p55IC, 그 일부, 유사체 또는 유도체는 종양세포 내에서 발현되었을 때 IL-8의 발현을 유도하여 그래뉼로사이트와 다른 임파구를 종양세포로 유인하여 그 화학주성적 활성으로 상기 종양세포의 사멸을 유도하여 결국 종양세포를 죽인다.

본발명의 이러한 측면에서 또한 p55-R의 세포내 도메인(p55-IC), 유사체와 앞의 유도체들의 TNF-관련 효과의 유도에 의한 세포의 치료용으로의 사용방법이 제시되며, 이는 다음의 실시예와 같다:

(i) IL-8 유전자 발현의 유도에 의한 세포 치료에 사용하기 위한 p55-IC, 그 일부, 유사체와 유도체

(ii) 종양세포를 사멸시키는 IL-8 유전자 발현의 유도에 의하여 p55-IC, 그 일부, 유사체 및 유도체의 종양세포 치료에의 사용

또한, 본 발명은 이와 같은 측면에서 p55IC, 그 일부, 앞의 것들의 유사체 및 유도체와 같은 활성 성분과 약리학적으로 수용가능한 담체로 구성된 화합물로서 TNF-관련 효과의 유도에 의하여 세포를 치료하는 약제학적 조성물을 제공하며, 이는 다음의 실시예와 같다:

(i) TNF-관련 효과를 유도함으로써 세포를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서 p55-IC, 그 일부, 그의 유사체와 유도체 및 치료대상 세포의 세포표면 단백질과 결합가능한 단백질을 코딩하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 활성 성분으로 포함하는 것.

(ii) 상기 화합물의 투약으로 IL-8 발현을 유도하고 이어 종양세포의 사멸을 유도하는 종양세포 치료방법에의 사용을 위한 약제학적 조성물.

또다른 측면에서, 본 발명은 최소한 2 이상의 자기-결합 융합 단백질(fusion protein)로 구성된 수용성 올리고머 종양괴사인자 수용체(TNF-R)를 제공한다. 여기에서 각 융합 단백질은 (a) 한쪽 말단에는 TNF-R의 세포외 도메인, 그 유사체 또는 유도체로부터 선택된 TNF결합 도메인이 있는데, 상기 세포외 도메인, 그 유사체 또는 유도체는 해로운 자기-결합을 할 수 없고, TNF에 결합할 수 있으며; (b) 다른 말단에는, (i)온전한 p55TNF-R분자(p55-R)의 약 206 아미노산 잔기부터 약 426 아미노산 잔기를 연장한 본질적으로 모든 p55TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC); (ii) 온전한 p55-R의 약 328 아미노산 잔기부터 약 426 아미노산 잔기까지를 연장한 p55-IC의 사멸 도메인; (iii) 본질적으로 모든 Fas/APO1수용체의 세포내 도메인(Fas-IC); (iv) Fas-IC의 사멸 도메인; 그리고 (v) 자기-결합 가능한 (i)-(iv)중의 어느 하나의 유사체, 분액 또는 유도체, 중에서 선택된 것으로, 자기-결합 도메인이 존재한다. 여기에서 상기 최소 2이상의 자기-결합 단백질은 최소한 2이상의 TNF 모노머에 결합가능한 상기 말단 (a)를 가지고 상기 말단 (b)에만 자기-결합하며, 각 말단(a)는 하나의 TNF 모노머; 그리고 그 염 및 상기 수용성 올리고머 TNF-R의 기능성 유도체와 결합가능하다.

본 발명의 이러한 측면의 실시예는 상기 정의한 것과 같은 말단 (a)와 말단 (b)의 상기 조합 전부를 포함하는데, 예를 들면 세포외 도메인으로 p55-R 세포외 도메인을, 자기 결합성 세포내 도메인으로 p55-IC를 포함하는 수용성 올리고머 TNF-R과 같은 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 수용성 올리고머 TNF-R을 생산하는 다음과 같이 구성된 공정을 제공한다:

(a) 상기 융합 단백질 중의 어느 하나를 코딩하는 발현벡터의 구성, 융합 단백질의 상기 각 말단의 DNA서열은 본질적으로 모든 상기 TNF-R의 세포외 도메인, 그의 유사체 또는 유도체를 코딩하는 클론된 DNA서열; 및 본질적으로 모든 상기 p55-IC, p55IC 사멸 도메인, Fas-IC, Fas-IC 사멸 도메인, 전자 모두의 유사체 또는 유도체를 코딩하는 클론된 서열로부터 얻어지며, 상기 말단은 서로 연결되어 융합단백질 서열을 형성하고, 상기 융합단백질 서열은 전사 및 번역 조절서열의 조절 하에서 상기 벡터로 삽입된다;

(b) (a)의 벡터를 알맞은 숙주세포로 도입한다. 여기에서 상기 융합 단백질이 발현된다; 그리고

(c) 상기 숙주세포에서 발현된 융합단백질을 정제한다. 상기 융합 단백질은 정제과정 이전, 도중 또는 이후에 자기-결합하여 수용성 올리고머 TNF-R이 얻어진다.

나아가, 본 발명의 상기 방법에 유용한 상기 융합 단백질을 코딩하는 벡터, 또한 본 발명에 따라 수용성 올리고머 TNF-R, 그 염 또는 그의 기능성 유도체와 전자들의 혼합물을 활성 성분으로 하여 약리학적으로 수용가능한 담체와 함께 구성된 약제학적 조성물이 제공된다. 유사하게 본 발명에 따른 수용성 올리고머 TNF-R, 그 염, 그들의 기능성 유도체와 그들의 혼합물이 제공된다. 이는 포유동물에서 TNF의 해로운 효과를 대항하는데 유용하며, 특히 과량의 TNF가 생체 내에서 생성되거나 생체 외에서 투약되는 상황의 치료에 유용하다; 또는 반대로, TNF를 생체외에서 투약하여 포유동물에서의 지속적이고 이로운 TNF효과를 유지하는데 이용된다.

본 발명의 상기 측면에 관하여 앞서 언급한 내용과 더불어 Fas 리간드의 해로운 효과에 대항하는데 유용한 수용성 올리고머 Fas/APO1 수용체(Fas-R)를 구성할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 다른 측면에서 본 발명은 수용성 올리고머 Fas/APO1 수용체(Fas-R)를 제공하는데, 이것은 최소 2 이상의 자기결합성 융합단백질로 구성되어 있으며, 각 융합단백질은 (a) 한쪽 말단에, 자기-결합이 불가능하고 Fas 리간드와 결합가능한 Fas-R 세포외 도매인, 그 유사체 또는 유도체가 있고; 그리고 (b) 다른 말단에는, (i)본질적으로 모든 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC)으로서 온전한 p55 TNF-R의 약 206 아미노산 잔기로부터 약 426 아미노산 잔기까지를 연장한 것; (ii)p55-IC의 사멸 도메인으로서 온전한 p55-R의 약 328 아미노산잔기부터 약 426 아미노산 잔기를 연장한 것; (iii)본질적으로 모든 Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인(Fas-IC); (iv) Fas-IC의 사멸도메인; 및 (v) 자기-결합 도메인이 있다. 여기에서 상기 최소 2 이상의 자기-결합 단백질은 말단 (b)에서만 자기결합 가능하고, 최소 2 이상의 Fas 리간드 모노머와 결합 가능한 말단 (a)를 가지며, 각 말단 (a)는 하나의 Fas 리간드 모노머와 결합할 수 있다; 여기에는 상기 Fas-R의 염 및 상기 수용성 올리고머 Fas-R의 기능성 유도체도 포함된다.

본 발명의 이러한 측면에 따라 또한 다음과 같이 구성된 수용성 올리고머 Fas-R의 생산과정이 제공된다:

(a) 상기 융합 단백질 중의 하나를 코딩하는 발현 벡터의 구성, 융합단백질의 상기 각 말단의 DNA서열은 본질적으로 모든 상기 Fas-R의 세포외 도메인, 그 유사체 또는 유도체를 코딩하는 클론된 DNA 서열, 그리고 본질적으로 모든 상기 p55-IC, p55-IC 사멸 도메인, Fas-IC, Fas-IC 사멸 도메인, 상기 모든 것의 유사체 또는 유도체를 코딩하는 클론된 DNA 서열에서 얻어지며, 상기 말단들은 서로 연결되어 융합 단백질 서열을 형성하고, 상기 융합 단백질 서열은 전사 및 번역 조절 서열의 조절 하에서 상기 벡터에 삽입된다.

(b) 벡터 (a)를 적절한 숙주세포로 도입. 여기에서 상기 융합 단백질이 발현된다; 그리고 (c) 숙주 세포에서 발현된 융합 단백질의 정제. 상기 융합 단백질은 정제과정의 이전, 도중 또는 이후에 자기 결합하여 수용성 올리고머 Fas-R이 얻어진다.

또한 상기 과정에 유용한 수용성 올리고머 Fas-R을 코딩하는 융합단백질 서열이 포함된 발현 벡터; 벡터를 포함하는 숙주 세포; 그리고 수용성 올리고머 Fas-R, 염 또는 그의 기능성 유도체 또는 전자들의 혼합물을 활성 성분으로 하여 약리학적으로 수용가능한 담체와 함께 구성된 약제학적 조성물이 제공된다. 유사하게 수용성 올리고머 Fas-R, 그 염 또는 그의 기능성 유도체 또는 전자의 혼합물이 제공된다. 이는 포유류에서 Fas 리간드의 해로운 효과에 대항하는데 유용하며, 특히 과량의 Fas 리간드가 생체 내에서 생성되거나 또는 생체 외에서 투약되는 상황의 치료에 유용하다.

올리고머 TNF-Rs와 올리고머 FAS-Rs에 관하여 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 TNF 및 FAS-R 리간드 양자에 결합 특이성을 가지는 혼합 올리고머를 제조할 수 있다. 그리하여, 본 발명은 또한 최소 2 이상의 자기-결합성 융합 단백질로 구성된 혼합 올리고머 TNF-R/FAS-R을 제공한다. 융합 단백질 중의 하나는 상기 언급된 TNF-특이적 융합 단백질 중의 하나가 선택되고, 다른 융합 단백질은 상기 FAS-R 리간드-특이적 융합 단백질 중의 하나가 선택되어 최소 1 이상의 TNF-R 세포의 도메인과 최소 1 이상의 FAS-R 세포의 도메인을 가지는 혼합 올리고머를 제공하는데, 이는 자기-결합성에 의하여 세포내 도메인 또는 그 일부 사이에서 결합하여 이들 각 세포외 도메인에 융합한다. 이들 혼합 올리고머 수용체는 앞서 기록한 바와 같이 올리고머 TNF-Rs과 올리고머 FAS-Rs를 제조하고 그런 후에 이들을 서로 혼합하고, 그후 표준 방법으로 FAS-R 리간드와 TNF 양자에 대하여 결합 특이성을 가지는 올리고머를 선택함으로써 제조된다. 혼합 올리고머 수용체의 또다른 제조방법은 앞서 기록한 바와 같이 어떤 TNF 특이적 융합 단백질(수용성 TNF-Rs)을 코딩하고FAS-R 리간드-특이적 융합단백질(수용성 FAS-Rs)을 코딩하는 벡터들로 적절한 숙주 세포를 공동 트랜스펙션(co-transfection)하고, 정제의 이전, 도중, 또는 이후에 자기-결합되는 발현된 융합 단백질을 정제하여 올리고머 수용체를 얻고, 이후 표준 방법으로 TNF와 FAS-R 리간드 모두에 결합 능력을 가진 올리고머 수용체를 선택한다.

유사하게 또한 혼합 올리고머 수용체, 염 또는 그들의 기능성 유도체 또는 앞의 혼합물을 활성 성분으로 하고 약리학적으로 수용가능한 담체와 결합되어 구성된 약제학적 조성물이 제공된다. 또한, 혼합 올리고머 수용체, 염 또는 그의 기능성 유도체 또는 앞의 혼합물들을 활성 요소로 하고 약리학적으로 수용가능한 담체와 결합되어 구성된 약제학적 조성물이 제공되는데, 이는 포유류에서 TNF와 FAS-R 리간드 양자의 해로운 효과에 대항하는데 유용하며, 특히 과량의 TNF 및 FAS-R 리간드가 생체 내에서 생성되거나 또는 외부에서 투약될 때 포유류에서의 TNF 그리고/또는 FAS-R 리간드의 유익한 효과를 지속적으로 유지시키는데 유용하다.

본 발명의 다른 측면 및 실시예는 또한 다음에 오는 발명의 상세한 설명에서 제공된다.

전체를 통하여 사용되는 다음의 용어에 주의하여야 한다: "세포에서의 TNF-효과의 조절" 그리고 "세포에서의 FAS-리간드 효과의 조절"은 생체내(in vivo) 처리뿐만 아니라 시험관내(in vitro) 처리를 포함하는 의미이다.

본 발명은 일반적으로 종양괴사인자/신경성장인자(TNF/NGF) 수용체 수퍼패밀리에 속하는 수용체 및 그들의 생물학적 기능 조절 분야에 관한 것이다. TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리는 p55와 p75 종양괴사인자 수용체(TNF-Rs) 및 FAS 리간드 수용체(FAS/APO1 또는 FAS-R로 명명되기도 하며 이하에서는 FAS-R로 명명한다)등과 같은 수용체를 포함한다. 좀더 자세하게는, 본 발명은 p55와 p75 TNF-Rs와 FAS-R의 세포내 도메인(IC)(이 세포내 도메인 들은 각각 P55IC, p75IC 그리고 FAS-IC로 나타낸다)에 결합하는 신규 단백질에 관한 것이며, 이 신규 단백질은 p55와 p75 TNF-Rs 및 FAS-R의 기능을 조절시킬 수 있다. 완전한 p55 TNF-R의 p55IC에 결합할 수 있는 단백질 중의 하나는 p55IC 분자 형태로의 p55IC 자체이거나 또는 그것의 일부분, 예를 들어 p55IC의 소위 "사멸 도메인" (DD; death domain)과 같은 부분이다. 따라서, 본 발명은 또한 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55IC) 또는 그 일부분에 의하여 리간드(TNF)-비의존적 형태로 세포 내에서 유도되는 새로운 TNF-관련 효과에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이하에서 p55IC-, p75IC- 및 FAS-IC-결합 단백질로 호칭되는 새로운 p55와 p75 TNF-R-결합단백질 및 FAS-R 결합 단백질의 제조와 이용에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 새로운 수용성 올리고머 TNF-Rs, 올리고머 FAS-Rs 및 TNF-Rs와 FAS-Rs의 혼합 올리고머 수용체 및 그들의 이용 및 생산방법에 관한 것이다.

도 1a-c 는 p55IC와 p75IC 결합 단백질을 코딩하는 cDNA 클론의 부분적 및예비적 누클레오티드 서열을 도식적으로 묘사한 것이다. 여기에서 도1(a)는 p55IC-결합 단백질 55.11을 코딩하는 클론 55.11의 서열이다(SEQ ID NO: 9); 도1(b)는 p75IC-결합 단백질 75.3을 코딩하는 클론 75.3의 부분적이고 예비적인 서열이며(SEQ ID NOs: 10 및 11); 도1(c) p75IC-결합 단백질 p75.16을 코딩하는 클론 75.16의 부분적이고 예비적인 서열이다(SEQ ID NOs: 12 및 13); 이상은 실시예1에 기재된 바와 같다; 도1(d)는 도1(a)의 누클레오티드 서열로부터 추정된 것으로 단백질 55.11의 추정 아미노산 서열을 묘사한 것이며(SEQ ID NO: 14), 실시예 1에 기재된 바와 같다.

도2는 수 개의 시험된 세포 계통에서 나타난 55.11-특이적 mRNA들을 보여주는 노던 블랏 리프로덕션이며, 실시예1에 기재된 바와 같다.

도3A와 B는 55.11 cDNA에 의하여 코딩된 단백질과 p55-IC의 부분을 포함하는 GST 융합 단백질을 시험관 내에서 결합시킨 것을 나타내는 자동방사선상의 리프로덕션이다. 여기에서 도3A에는 전장(full-length) 55.11 단백질과 다양한 GST 융합 단백질의 결합이 묘사되어 있다; 그리고 도3B에는 FLAG 옥타펩티드에 융합된 55.11의 일부분과 다양한 GST 융합 단백질의 결합이 묘사되어 있으며 모든 것은 실시예1에 기재된 바와 같다.

도4는 인간 55.11의 추정 아미노산 서열을 진화단계가 낮은 생물들의 관련 단백질 서열과 비교한 것을 도식적으로 나타낸다(SEQ IN NOs: 15-18). 이는 실시예 1에 기재된 바와 같다.

도5는 항-MBP 폴리클론 항혈청으로 염색한 웨스턴 블랏 리프로덕션으로서p55-IC의 자기결합을 보여준다. 웨스턴 블랏은 SDS-PAGE 겔에 유래되었는데 겔에서는 박테리아-생산 p55IC-MBP 키메라 단백질과 p55IC-GST의 상호작용(레인1-4) 또는 p55IC-MBP 키메라 단백질과 GST 단독의 상호작용(레인5-8)이 전기영동되었으며, 키메라 단백질(그리고 대조구) 간의 상호작용은 SDS-PAGE에 앞서 글루타치온-아가로스 비드(bead)에서 수행되었다. 이상은 실시예2에 기재된 바와 같다.

도6은 전장 p55IC를 코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 HTtal 세포에서 전장 p55IC의 세포독성 효과(오른쪽 패널)와, 테트라사이클린으로 세포를 처리하여 벡터의 발현을 차단하였을 때 이 세포독성 효과의 억제를 보여주는 위상차 현미경의 리프로덕션이다. 이는 실시예 2에 기재된 바와 같다.

도7은 다음의 사멸 도메인을 포함하는 전장 p55-R, 그 세포내 도메인, 또는 세포내 도메인의 일부로 트랜스펙션된 HeLa 세포에서 리간드-비의존적인 세포독성 효과의 개시를 묘사한 것이다.

(i) 도7의 가장 왼쪽에는 트랜스펙션된 HeLa세포와 함께 벡터에 삽입된 전장 p55-R, 그 세포내 도메인 및 세포내 도메인의 일부분을 코딩하는 다양한 DNA 분자를 도식적으로 묘사하였다.

(ii) 왼쪽과 중앙의 막대 그래프는 도7의 가장 왼쪽에 나타난 각 유형의 수용체를 가진 HeLa 세포 내에서의 TNF 수용체의 발현을 보여준다. 왼쪽 막대 그래프는 시료 세포당 수용체의 양을 ng으로 나타내며, 가운데 막대그래프는 트랜스펙션된 세포에 결합한 방사선요오드화 TNF로 나타낸다; 그리고

(iii) 오른쪽 막대 그래프는 다양한 종류의 수용체를 발현하는 HeLa 세포의생존가능성을 나타낸다;

그리고 모든 막대 그래프에서 흰막대는 테트라사이클린 존재하에서 트랜스펙션된 세포를 나타내며, 검은 막대는 테트라사이클린 없이 트랜스펙션된 세포를 나타낸다; 이상은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

도8은 전장 p55-R 또는 그의 세포내 도메인(p55IC)으로 트랜스펙션된 HeLa 세포에서의 리간드-비의존적 IL-8 유전자 발현의 유도를 나타낸다. 여기에서 패널 A는 TNF로 처리되거나 처리되지 않은 HeLa 세포로부터 추출한 RNA의 노던 분석을 보여주는 노던 블랏 리프로덕션이며(좌측 두 레인은 '대조군'과 'TNF'로 표시됨), 각 경우에 테트라사이클린의 존재하에 또는 테트라사이클린 없이(-) 트랜스펙션하였다.(따라서 트랜스펙션당 2레인); 그리고 패널 B는 패널 A에 나타난 각 HeLa 세포 시험에서 18SrRNA의 메틸렌 블루 염색을 보여준다: 이상은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

도9(A와 B)는 p55R 또는 그 일부 또는 FAS-IC에 의하여 트랜스펙션된 HeLa 세포에서 리간드-비의존적 세포독성 효과의 개시를 도시한 것인데, 도9A는 p55R 또는 그 일부에 의한 결과를 나타내었고 도9B는 FAS-IC에 의한 결과를 나타내었다. 도9A와 B 양자의 왼쪽 패널은 트랜스펙션에 사용된 p55의 일부 또는 FAS-IC를 도식화하여 나타내었으며, 오른쪽 패널은 실험결과를 그래프로 나타내었다. 이상은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

도10은 'F2'라 불리는 cDNA클론의 부분적이고 예비적인 누클레오티드 서열을 도식적으로 나타내었다(SEQ ID NOs: 19 및 20). F2는 p55IC 및 FAS-IC에 결합 가능한 단백질을 코딩한다. 이상은 실시예3에 기재된 바와 같다.

도11은 'F9'로 명명된 cDNA 클론의 부분적이며 예비적인 누클레오티드 서열을 도식적으로 나타내었다(SEQ ID NOs: 21-23). F9은 p55IC 및 FAS-IC에 결합 가능한 단백질을 코딩한다. 이상은 실시예 3에 기재된 바와 같다.

도12는 DD11로 명명된 cDNA 클론의 부분적이며 예비적인 누클레오티드 서열을 도식적으로 나타낸다(SEQ ID NO: 24). DD11 은 p55IC, 특히 p55DD 및 FAS-IC에 결합가능한 단백질을 코딩한다. 이상은 실시예 3에 기재된 바와 같다.

본 발명은 일면에서 TNF-Rs 및 FAS-R과 같이 TNF/NGF 수퍼패밀리에 속하는 수용체의 세포내 도메인에 결합 가능하고 따라서 예컨대 TNF-Rs 및 FAS-R과 같은 이들 수용체 수퍼패밀리의 매개자 또는 조절인자로서 TNF 와 TNF-R 및 FAS 리간드와 FAS-R의 결합에 의하여 개시되는 신호전달과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 신규 단백질에 관련된 것이다. 이러한 단백질의 예로는 F2, F9 및 DD11 cDNA 클론에 의하여 코딩되는 것들(실시예3) 뿐만 아니라 여기에서 55.1, 55.3 및 55.11로 명명된 단백질(실시예1)과 같이 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55IC)에 결합하는 것; 여기에서 75.3 및 75.16으로 표시된 단백질(실시예1)과 같이 p75 TNF-R의 세포내 도메인(P75IC)에 결합하는 것; F2, F9 및 DD11 cDNA 클론에 의해 코딩되는 단백질(실시예3)과 같이 FAS-R의 세포내 도메인(FAS-IC)에 결합하는 것이 있다. 단백질 55.1과 55.3은 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55IC)의 일부 또는 단편을 나타내는 것으로 밝혀졌고; 다른 단백질 55.11, 75.3 및 75.16은 본 발명 이전에 전혀 기재되지 않은 단백질을 나타내거나(75.3, 75.16) 또는 기재되어 있기는 하나(55.11, Khan et al., 1992를 보시오), 그 기능과 특성, 특별히 TNF-R과의 결합에 관하여는 전혀 기재되어 있지 않다(아래의 실시예1을 보시오). cDNA 클론 F2, F9 및 DD11에 의하여 코딩되는 새로운 단백질은 또한 예전에 전혀 기재되지 아니한 단백질을 나타내는데, 즉 그들의 서열은 DNA 또는 아미노산 서열의 데이터베이스인 '진뱅크(GENEBANK)'나 '프로테인뱅크(PROTEIN BANK)'에 들어있지 않다.

따라서, 본 발명은 이러한 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 이 서열에 의하여 코딩된 단백질에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 또한 생물학적 활성이 있는 이들 단백질의 유사체 및 유도체를 코딩하는 DNA서열 및 그것에 의하여 코팅된 유사체 및 유도체에 관한 것이다. 이와 같은 유사체 및 유도체의 제조는 표준 방법(Sambrook at el., 1989)에 의하는데, 이들 단백질을 코딩하는 DNA 서열에서 1 또는 그 이상의 코돈이 다른 것에 의해 결실, 부가 또는 치환되어 원래의 단백질과 비교할 때 최소 1이상의 아미노산 잔기가 바뀐 유사체를 얻는다. 수용가능한 유사체는 예를 들어 p55IC, p75IC 또 FAS-IC와 같은 FAS-R 또는 TNF-R 등의 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리의 세포내 도메인에 결합 능력을 보유하는 것들 또는 p55, p75IC 또는 FAS-IC에 결합하는 유사체들과 같이 다른 결합 또는 효소활성을 매개할 수는 있으나 신호전달은 하지 않는 것, 즉 더이상 하류 수용체, 단백질 또는 다른 인자와 결합하지 않거나 신호-의존적 반응을 촉매하지 않는 것이다. 그와 같은 방식으로 소위 우성 음성효과(dominant-negative effct)를 가진 유사체, 다시 말하여 예를 들어 p55IC, p75IC 또는 FAS-IC에의 결합에 결함이 있거나 또는 결합 이후의 신호전달에 결함이 있는 유사체가 생산될 수 있다. 그러한 유사체는 예를 들어 자연산 IC-결합 단백질과 경쟁함으로써 TNF-또는 FAS-리간드 효과를 억제하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 예를 들어 TNF 또는 FAS 리간드 효과를 증진시키는 소위 우성-양성 유사체(dominant -positive analogs)가 생산될 수 있다. 이들은 자연산 IC-결합 단백질과 동일하거나 나은 IC-결합성질과, 동일하거나 더 나은 신호전달 특성을 가질 것이다. 유사하게, 단백질의 1 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 사이드 그룹을 표준변형방법으로 또는 이 분야에 공지된 것과 같은 방법으로 단백질을 예컨대 항체, 효소, 수용체 등의 다른 분자와 콘쥬게이션시켜서 유도체를 제조할 수 있다.

cDNA 클론 F2, F9 및 D11에 의해 코딩된 단백질(이하에서 F2, F9 그리고 D11)뿐만 아니라 예컨대 단백질 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16과 같은 새로운 TNF-R 및 FAS-R 세포내 도메인-결합 단백질은 다음의 예와 같이 몇 개의 가능한 사용예가 있다;

(i) TNF-또는 FAS-R 리간드-유도 세포독성이 필요한 곳에 항종양, 항염 또는 항-HIV 적용과 같이 증진된 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과가 요구되는 상황에서 위의 단백질들은 TNF 또는 FAS-R 리간드의 기능을 모방하거나 증진시키는데 이용될 수 있다. 이 경우에 F2, F9 및 DD11뿐만 아니라 55.1, 55.3과 같은 p55IC에 결합하는 단백질 및 p55IC의 '사멸 도메인'(p55DD) 뿐만 아니라 p55IC 그 자체(아래와 실시예2를 참조), 이들은 TNF 효과를 증진시킨다; 또는 FAS-R 리간드 효과 즉, 세포 독성 효과를 증진시키는 FAS-IC 및 FAS-DD를 비롯하여 단백질 F2, F9 및 D11은 그 자체로서 알려진 표준 절차에 의하여 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 단백질이 세포내 단백질이고 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과가 필요한 세포에만 도입되는 것이 요구될 때, 이들 단백질을 세포 내로 특이적으로 도입하는 시스템이 요구된다. 이를 수행하는 한 가지 방법은 예컨대 다음의 두 유전자가 도입될 DNA에 대하여 우두 바이러스에서 유래한 재조합 동물 바이러스를 만드는 것이다: 이 두 유전자 중 하나는 세포에 의하여 특이적으로 발현되는 세포 표면 단백질, 예컨대 어떤 세포(CD4 림포사이트 및 관련된 류케미아)에 특이적으로 결합하는 에이즈(HIV) 바이러스 gp120 단백질과 같은 것에 결합하는 리간드를 코딩하는 유전자 또는 TNF-R 또는 FAS-R을 운반하는 세포에 특이적으로 결합하는 어떤 다른 리간드를 코딩하는 유전자이며, 그리하여 재조합 바이러스 벡터는 그러한 TNF-R 또는 FAS-R-운반 세포와 결합할 수 있다; 그리고 다른 하나는 새로운 세포내 도메인-결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 단백질을 코딩하는 유전자이다. 그리하여, 바이러스 표면에서 세포-표면-결합 단백질의 발현은 종양세포 또는 다른 TNF-R- 또는 FAS-R-운반세포에 특이적인 바이러스를 목표로 할 것이며, 다음으로 세포내 도메인-결합 단백질을 코딩하는 서열 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 코딩 서열이 바이러스를 통하여 세포로 도입될 것이며, 일단 세포에서 발현되면 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과의 증대를 유발하여 사멸되어야 할 종양세포 또는 다른 TNF-R-또는 FAS-R-운반세포의 사멸을 유도한다. 그와 같은 재조합 동물 바이러스의 구성은 표준방법에 의한다(Sambrook et al., 1989 및 실시예 참조) 또다른 가능성은 새로운 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 서열을 올리고누클레오티드 형태로 도입하여 세포에 흡수되어 거기에서 발현되게 하는 것이다.

(ii) 위의 단백질들은 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과, 예컨대 패혈증 쇼크, 이식 조직 대 숙주 반응, 또는 급성 간염의 조직 손상의 경우를 억제하는데 사용될 수 있다. 이 경우에 TNF-유도 TNF-R 또는 FAS-R 리간드 유도 FAS-R 세포내 신호전달을 억제하는 것이 필요하다. 이러한 상황에서, 예를 들어 표준 방법으로 이러한 새로운 단백질의 안티-센스 코딩 서열 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD에 대한 안티-센스 코딩 서열을 가지는 올리고누클레오티드를 세포로 도입하는 것이 가능하다. 이것은 효과적으로 이 단백질을 코딩하는 mRNA들의 번역을 억제하여 그 발현을 억제하고 TNF-또는 FAS-R 리간드-효과를 차단한다.

이와 같은 올리고누클레오티드는 상기 재조합 바이러스 접근법을 이용하여 세포로 도입될 수 있고, 바이러스에 의해 운반되는 두번째 서열은 올리고누클레오티드 서열이다. 또 다른 가능성은 이들 단백질에 특이한 항체를 이용하여 그들의 세포내 신호전달 활성을 억제하는 것이다. 이들 새로운 단백질들은 세포내 도메인뿐만 아니라 세포외 도메인을 가지고 있으며, 전자는 TNF-R 또는 FAS-R 결합 도메인에 결합하며, 따라서 세포외 도메인으로부터 생성된 항체는 그들의 TNF- 또는 FAS-R 리간드-관련 기능의 억제에 이용될 수 있다.

TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 억제하는 또 다른 방법은 최근 개발된 리보자임 접근법에 의한 것이다. 리보자임은 특이적으로 RNA를 절단하는 촉매활성이 있는 RNA 분자이다. 리보자임은 예컨대 본 발명의 새로운 단백질을 코딩하는 mRNA나 p55IC, p55D, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 mRNA와 같이 선택된 목표 RNA를 절단하도록 조작될 수 있다. 이와 같은 리보자임은 선택된 mRNA에 특이적인 서열을 가지고 그것과 상호작용(상보적 결합)할 수 있을 것이고, 그 다음 mRNA를 절단하여 억제하고자 하는 단백질의 발현을 감소(또는 완전히 멸실)시키게 될 것이고, 감소되는 발현의 수준은 목표 세포에서의 리보자임 발현 수준에 의존한다. 리보자임을 선택된 세포(예컨대 TNF-Rs 또는 FAS-R을 가진 세포)에 도입하기 위하여는 예컨대 이와 같은 목적에 일반적으로 사용되는 플라스미드, 동물 바이러스(레트로 바이러스)벡터와 같이 알맞은 벡터를 이용하여야 한다( 상기 (i) 참조, 바이러스는 두 번째 서열로서 선택된 리보자임 서열을 코딩하는 cDNA를 가진다). 또한, 리보자임은 예컨대 1 또는 그 이상의 본 발명의 단백질 그리고/또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 발현을 억제하는데 이용될 수 있게 하기 위하여 다중 목표를 가지도록 구성될 수 있다(다중 목표 리보자임, multi-target ribozymes) (리보자임에 관한 방법 등의 검토는 Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993, Shore et al., 1993. Joseph and Burke, 1993, Shimayama et al., 1993, Cantor et al., 1993, Barinaga. 1993, Crisell et al., 1993 and Koizumi et al., 1993 참조).

(iii) 위 단백질들은 그들과 결합 가능한 다른 단백질들을 분리, 확인 및 클론하는데 이용될 수 있다. 예컨대, 다른 단백질이란 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인의 하류에 있는 세포내 신호전달 과정에 관여하는 다른 단백질과 같은 것들이다. 이 상황에서 이 선택권 즉, 그들을 코딩하는 DNA 서열은 효모 이중-혼성 시스템에 이용될 수 있는데(이하와 실시예1 참조), 여기에서 이들 단백질의 서열은 이들 새로운 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인-결합 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 코딩하는 게놈 DNA 라이브러리의 다른 서열("먹이(preys)")또는 cDNA로부터 분리, 클론 및 확인하기 위한 "미끼(baits)"로서 이용될 수 있다. 동일한 방법으로 본 발명의 특이적 단백질 즉, p55IC, p75IC 또는 FAS-IC에 결합하는 단백질이 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리의 다른 수용체에 결합 가능한지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 최근에 보고된 바로는(Schwalb et al., 1993; Crowe et al., 1994) p55 및 p75 TNF-Rs 외에도 다른 TNF-Rs이 존재한다. 따라서, 효모 이중-혼성시스템을 이용하여 본 발명의 단백질이 이러한 다른 TNF-Rs 또는 TNF/NGF 수퍼패밀리의 다른 수용체들과 특이적으로 결합 가능한지 여부가 특이적으로 시험될 수 있다. 나아가, 이러한 접근은 또한 본 발명의 단백질들이 그 활성에 의하여 기능적 역할을 수행하는 다른 알려진 수용체에 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 이용될 수 있다.

(iv) 이 새로운 단백질들은 동일 분류의 다른 단백질, 즉 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인에 또는 기능적으로 관련된 수용체에 결합하고, 세포내 신호전달과정에 관여하는 다른 단백질의 분리, 확인 및 클론에 이용될 수 있다. 이러한 적용에 있어서 위에서 나타낸 효모 이중-혼성 시스템이 이용될 수 있고, 또는 최근 개발된(Wilks et al., 1989) 비-스트린전트 서던 혼성화 이후 PCR 클로닝을 채택하는 시스템이 이용될 수 있다. Wilks 등의 간행물에서는 비-스트린전트 서던 혼성화 이후 키나아제 모티브의 알려진 서열, 고안된(conceived) 키나아제 서열에 기초하여 PCR 클로닝 방법을 적용하여 두 추정 단백질-티로신 키나아제를 확인 및 클로닝한 것에 대하여 기재되어 있다. 관련 있는 TNF-R, FAS-R 또는 관련 수용체(TNF/NGF 수퍼패밀리 수용체)의 세포내 도메인 결합 단백질의 그것을 확인하고 클론하기 위하여 새로운 단백질의 서열을 이용하는 본 발명에 따르면, 이러한 접근 방법이 이용될 수 있다.

(v) 본 발명의 새로운 단백질을 이용하는 또 다른 접근은 그들을 흡착 크로마토그래피방법에 이용함으로써 그들과 결합가능한 다른 단백질 또는 인자, 예컨대 TNF-Rs와 관련있는 다른 수용체(TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리) 또는 세포내 신호전달과정에 관여하는 단백질 또는 인자를 분리하고 확인할 수 있다. 이러한 응용에 있어서, 본 발명의 단백질들은 개별적으로 흡착크로마토그래피의 기질에 부착된 후 세포내 신호전달 과정에 관여할 것으로 추정되는 세포추출물 또는 단백질 또는 인자들과 접촉하게 된다. 흡착 크로마토그래피 과정 이후 새로운 단백질에 결합하는 다른 단백질 또는 인자들은 용출, 분리 및 규명될 수 있다.

vi) 위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 새로운 단백질은 또한 그에 대한 특이성 항체를 생산하는 면역원(항원)으로도 사용될 수 있다. 이들 항체는 또한 그들을 생산하는 형질전환된 세포계통이나 또는 세포 추출물로부터 새로운 단백질을 정제하는 목적으로 이용될 수 있다. 나아가, 이들 항체는 예컨대 과다활성 또는 지나치게 낮은 활성의 TNF- 또는 FAS-R 리간드 시스템의 비정상적인 기능과 관련된 질병의 확인이라는 진단목적으로 이용될 수 있다. 따라서, 어떤 질병이 새로운 단백질이 관여하는 세포내 신호전달 시스템의 기능부전(malfunction)과 관련되어 있다면, 그러한 항체는 중요한 진단 도구가 될 수 있을 것이다.

또한 지적되어야 할 것은 본 발명의 새로운 단백질의 분리, 확인 및 규명은 널리 알려진 표준 스크리닝 방법의 하나를 이용하여 수행된다는 점이다. 예를 들어, 이러한 스크리닝 방법 중의 하나는 다음에 오는 실시예(실시예 1 및 3)에 설명된 효모 이중 혼성 방법으로 본 발명의 새로운 단백질의 확인에 이용되었다. 이상 또는 이하에 기재된 것과 유사하게 본 발명의 새로운 단백질을 분리, 확인 및 규명하기 위하여 또는 본 발명의 단백질 또는 TNF/NGF 수용체 패밀리에 속하는 수용체에 결합할 수 있는 추가적인 단백질, 인자, 수용체 등을 분리, 확인 및 규명하기 위하여 본 기술분야에서 잘 알려진 흡착 크로마토그래피, DNA 혼성화 방법과 같은 다른 방법들이 이용될 수 있다.

이 문서 전체를 통하여 언급되는 항체에 관하여는 "항체"라는 용어는 폴리클론 항체, 모노클론 항체(mAbs), 키메라 항체, 용해성 또는 결합성 형태로서, 표지될 수 있는 항체에 대한 항-이디오타입(anti-Id; anti-idiotypic) 항체는 물론이고 다른 공지기술 즉 효소절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술 등에 의하여 제공되는 그들의 단편을 의미한다.

폴리클론 항체는 항원에 의하여 면역된 동물 혈청으로부터 유래된 이종집단(heterogeneous population)의 항체분자들이다. 모노클론 항체는 항원에 특이적인 항체의 사실상 동종집단으로서, 이 집단은 사실상 유사한 에피톱(epitope)결합 부위를 가진다.

모노클론 항체는 본 기술분야의 숙련된 당업자에게 알려진 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면 Kohler and Milstein, Nature, 256;495-497(1975): 미국특허 제4,376,110: Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); 그리고 Colligan et al., eds.,Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoc. and Wiley Interscience N. Y.,(1992, 1993)을 참조하라. 이들 참조문헌의 일람은 참조문헌 목록에 기재되어 있다. 그러한 항체들은 IgG, IgM, IfE, IgA, GILD 및 그들의 서브클래스를 포함하는 이뮤노글로불린 클래스에 속한다.

본 발명의 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마는 시험관내(in vitro), 인 시투(in situ) 또는 생체내(in vivo)에서 배양될 수 있다. 생체내 또는 인 시투에서의 모노클론 항체의 고적정량(high titers) 생산은 이 방법을 현재의 바람직한 생산방법으로 만들었다.

키메라 항체(chimeric antibodies)는 쥐 모노클론 항체에서 유래한 가변 영역과 인간 이뮤노글로불린 불변 영역으로 구성된 항체와 같이 다른 부분이 서로 다른 동물 종으로부터 유래한 분자를 말한다. 키메라 항체는 원래 응용에 있어서 면역원성(immunogenicity)을 감소시키고 생산수율을 높이기 위하여 이용된다. 예컨대 쥐 모노클론항체는 하이브리도마에서는 높은 수율을 나타내지만 인간에게는 높은 면역원성을 보여서 인간/쥐 키메라 모노클론 항체가 이용된다. 키메라 항체 및 그 생산방법은 본 기술분야에 알려져 있다(Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984): Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., 유럽특허출원 제125023(1984. 11. 14.자 발행됨); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985): Taniguchi et al., 유럽특허출원 17] 496(1985. 2. 19.자 발행): Morrison et al., 유럽특허출원 제173494(1986. 3. 5. 발행), Neuberger etal., PCT 출원 WO 8601533(1986. 3. 14.자 발행); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., 국제특허출원번호 WO8702671(1987. 5. 7.자 발행); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84;3493-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987), Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) ; and Harlow and Lane, ANTIBODIES :A LABORATORY MANUAL. supra.); 이 참고자료들은 참고 문헌 목록에 기재되어 있다.

항-이디오타입(anti-Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원결합 부위와 결합하는 특정 결정인자(determinant)를 인식하는 항체이다. 이디오타입(Id) 항체는 항 Id에 대한 모노클론 항체를 모노클론 항체의 소스로 하여 동일 종 및 동일 유전자 타입을 가지는 동물(예컨대, 마우스 변종)을 면역화하여 제조된다. 면역된 동물은 이들 이디오타입 결정인자에 대한 항체(항-Id 항체)를 생산함으로써 면역 항체의 이디오타입 결정인자를 인식하고 그에 대해 반응할 것이다. 예컨대 미국특허 4,699,880을 참조하라.

항-Id 항체는 또한 다른 동물에서 면역반응을 유도하는 "면역원(immunogen)"으로 이용되어 소위 항-항-Id 항체(anti-anti-Id antibody)를 생산할 수 있다. 따라서, 모노클론 항체의 이디오타입 결정인자에 대한 항체를 이용하여 동일한 특이성을 가지는 항체를 발현하는 다른 클론을 확인하는 것이 가능하다.

따라서, IC-결합 단백질에 대하여 제조된 본 발명의 모노클론 항체, 그들의 유사체 또는 유도체 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, 그들의 유사체 또는 유도체는 BALB/c 마우스와 같이 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도하는데 이용될 수있다. 그와 같이 면역된 마우스의 지라세포는 항-Id 하이브리도마를 생산하는데 이용될 수 있다. 나아가, 항-Id 모노클론 항체는 키이홀 림펫 헤모시아닌(KLH; Keyhole limpet hemocyanin)과 같은 담체와 결합될 수 있으며, 다른 BALB/c 마우스를 면역화하는데 이용될 수 있다. 이들 마우스의 혈청은 상기 IC-결합 단백질, 유사체 또는 유도체 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, 그 유사체 또는 유도체의 에피톱에 특이적인 원래의 모노클론 항체의 결합 성질을 가지는 항-항-Id 항체를 함유할 것이다.

항-Id 모노클론항체는 따라서 자신들의 이디오타입 에피톱을 가지거나 또는 GRB 단백질-α 와 같이 에피톱과 구조적으로 유사한 "이디오톱(idiotopes)"을 가진다.

"항체"라는 용어는 또한 온전한 분자 뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')₂와 같이 항원 결합능력을 가진 단편들을 포함하는 의미이다. Fab 및 F(ab')₂단편은 완전한 항체에서 Fc 단편이 없는 것인데, 순환과정에서 훨씬 빨리 제거되며 완전한 항체에 비하여 비특이적 조직과의 결합빈도가 낮다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24; 316-325(1983)).

본 발명에 유용한 항체의 Fab와 F(ab')₂및 다른 단편들은 온전한 항체 분자에 대하여 여기에 개시된 방법에 따라 IC-결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 탐지와 정량에 이용될 수 있을 것이다. 그와 같은 단편들은 전형적으로 파파인(Fab 단편 생산목적에 이용됨) 또는 펩신 F(ab')₂단편 생산목적에 이용됨)과 같은 효소를 이용하여 단백질 절단방법으로 생산된다.

항체는 분자와 특이하게 반응하여 결합할 수 있는 경우에 그 분자와 "결합능력을 가진다"라고 표현된다. "에피톱"이라는 용어는 어떤 항체에 의해 결합될 수 있는 분자의 일부로서 또한 그 항체에 의하여 인식될 수 있는 부분을 의미한다. 에피톱 또는 "항원 결정인자(antigenic determinants)"는 보통 아미노산 또는 당의 곁가지와 같이 화학적 활성이 있는 분자의 표면 그룹으로 구성되어 있으며, 특이적인 전하 특징 외에도 특이적인 3차원 구조 특징을 가진다.

"항원"은 항체에 의하여 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부로서 나아가 동물에 도입되어 그 항원의 에피톱에 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 항체는 1 또는 그 이상의 에피톱을 가진다. 상기 언급된 특이적 반응은 고도로 선택적인 방식으로 해당 항체와는 반응하나, 그렇지만 다른 항원에 의해 생산된 수많은 다른 항체와는 반응하지 않음을 의미한다.

항체 단편을 포함하여 본 발명의 유용한 항체는 시료 내의 IC 결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD를 정량적 또는 정성적으로 탐지하는데 이용될 수 있으며, 또는 본 발명의 IC결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD 단백질을 발현하는 세포의 존재를 탐지하는데 이용될 수 있다. 이것은 광학 현미경 탐지, 플로우 사이토메트리 탐지(flow cytometric detection)또는 형광분석 탐지 방법으로 결합되어 있는 형광물질-표지된 항체를 이용한 면역형광 기법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서 유용한 항체(또는 그 단편)는 본 발명의 IC결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD의 인 시투 탐지를 위하여 면역 형광 또는 면역 전자 현미경법과 같은 방법으로 조직학적으로 이용될 수 있다. 인 시투 탐지법은 환자의 조직절편을 제거하고 그러한 절편에 본 발명의 표지된 항체를 제공함으로써 수행된다. 항체(또는 단편)는 바람직하게는 생물학적 시료에 표지된 항체(또는 단편)를 오버레이하거나 적용하여 제공된다. 그와 같은 방법을 이용하여 IC 결합단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD의 존재 뿐만 아니라 시험대상 조직 상의 그 분포 또한 확정될 수 있다. 통상의 지식을 가진자는 본 발명의 이용에서 아주 다양한 조직학적 방법들(예컨대 염색법과 같은)이 인 시투 탐지를 수행하기 위하여 변형될 수 있다는 사실을 즉시 인식할 것이다.

본 발명의 IC 결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD에 관한 그와 같은 분석은 전형적으로 생물학적 유체(biological fluid), 조직 추출물과 같은 생물학적 시료, 임파구 또는 백혈구와 같은 즉시 얻어진 세포들 또는 조직 배양배지에서 배양된 세포들을 IC결합 단백질 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD를 확인할 수 있는 표지된 항체의 존재 하에 배양하고, 본 발명의 기술분야에서 잘 알려진 몇개의 기법에 의하여 항체를 탐지하는 단계로 구성되어 있다.

생물학적 시료는 니트로셀룰로스와 같은 고체상 지지체 또는 담체로 처리되거나 세포, 세포입자 또는 수용성 단백질을 고정화시킬 수 있는 다른 고체상 지지체 또는 담체로 처리된다. 이후 지지체나 담체는 적절한 완충용액으로 세척된 후 상기와 같은 본 발명에 따라 탐지 가능하도록 표지된 항체로 처리된다. 이후 고체상 지지체 또는 담체는 두번째로 완충용액으로 세척되어 결합되지 않은 항체가 제거된다. 그 후 상기 고체상 지지체 또는 담체에 결합된 표지의 양이 일반적인 방법으로 측정된다.

"고체상 지지체", "고체상 담체", "고체 지지체", "고체 담체" "지지체" 또는 "담체"는 항원 또는 항체를 결합할 수 있는 지지체 또는 담체를 말하는 것이다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 아밀라아제, 천연산 또는 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 게브로스(gabbros) 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적을 위하여 어느 정도 수용성이거나 또는 불용성이 될 수 있다. 지지물질은 사실상 결합된 물질이 항원 또는 항체와 결합가능한 어떠한 가능한 구조적 특성도 가질 수 있다. 따라서, 지지체 또는 담체의 모양은 구슬과 같이 원형이 될 수도 있고 시험관의 내부표면과 같이 원통형이 될 수도 있다. 또한, 표면은 시험지 등과 같이 종이처럼 평평할 수도 있다. 바람직한 지지체 또는 담체는 폴리스틸렌 비드를 포함한다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 항체 또는 항원을 결합하기에 적합한 다른 담체를 알 수 있을 것이며, 혹은 일반적인 시험방법을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.

상기와 같이 본 발명에서 주어진 많은 항체의 결합 활성은 공지의 방법에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 일상적인 실험 방법을 이용하여 각 결정에 있어서 운용분석 조건 및 최선의 분석조건을 결정할 수 있을 것이다.

세척, 휘저음, 진탕, 거름 등의 다른 단계들은 관습적으로 또는 특별한 상황을 위하여 필수적으로 분석에 부가될 수 있다.

본 발명에 따라 탐지 가능하도록 표지된 항체의 이용방법의 한 가지는 효소와 연결됨으로써 효소 면역분석법(EIA; enzyme immunoassay)에 이용되는 것이다. 역으로 이 효소는 이후 적절한 기질에 노출되었을 때 기질과 작용하여 예컨대 분광학적, 형광분석적 혹은 시각적 수단으로 탐지 가능한 화학적 부분을 생산한다. 탐지 가능한 항체의 표지로 이용되는 효소는 말레이트 탈수소효소, 스태필로코커스 핵산분해 효소, 델타-5-스테로이드 이성질화 효소, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성질화 효소, 홍당무 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다아제, 리보핵산 분해효소, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜리나아제를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 탐지는 효소에 대하여 색깔을 나타내는 기질을 채택하는 비색분석법으로 가능해진다. 또한 탐지는 유사하게 제조된 스탠다드와 기질의 효소반응 정도를 시각으로 비교함으로써 가능해진다.

탐지는 다양한 다른 면역분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 항체 또는 항체 단편을 방사성 표지함으로써 방사선면역분석법(RIA; radioimmunoassay)을 통하여 R-PTPase를 탐지할 수 있다. RIA에 관한 좋은 기술은 Work. T.S. et al.의 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company NY(1987)에서 간행된 것으로 Chard, T.에 의하여 "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"라고 제목붙여진 챕터의 특별한 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 방사성 동위원소는 감마(γ ) 계측기 또는 신틸레이션 계측기 또는 자동방사선 감광법(autoradiography)과 같은 수단으로 탐지될 수 있다.

본 발명에 따라 형광물질로 항체를 표지하는 것 또한 가능하다. 형광표지된 항체가 적절한 파장의 광선에 노출되었을 때 그 존재는 형광에 의해 탐지될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광표지물질은 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, O-프탈데히드와 플루오레스카민이다.

항체는 또한¹⁵²E 또는 다른 랜타나이드 계열과 같은 형광발광 금속을 이용하여 표지될 수도 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 이용하여 항체에 부착될 수 있다.

항체는 또한 화학발광물질과 결합하여 탐지가능하도록 표지될 수 있다. 화학발광물질-꼬리표가 달린 항체의 존재는 그 후 화학반응단계 동안 발생하는 발광의 존재를 탐지하여 결정된다. 특별히 유용한 화학발광 표지물질의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 서로매틱 아크리디늄에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살산에스테르가 있다.

유사하게 생물발광 물질도 본 발명의 항체를 표지하는데 이용된다. 생물발광은 생물계에서 발견되는 화학발광의 한 형태로서 촉매활성이 있는 단백질이 화학발광반응의 효과를 증대시키는 것이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 탐지하여 결정된다. 표지목적으로 중요한 생물발광 물질은 루시페린, 루시페라제 및 아쿠오린이다.

본 발명의 항체분자는 "이중-위치(two-site)" 또는 "샌드위치" 분석법이라고도 알려진 면역측정 분석법(immunometric assay)의 이용에 적용될 수 있다. 전형적인 면역측정 분석법에서는 표지되지 않은 일정량의 항체(또는 항체 단편)가 고체 지지체 또는 담체에 결합되고 탐지 가능하도록 표지된 일정량의 수용성 항체가 부가되어 고체상 항체, 항원 및 표지된 항체 간에 형성된 3중 복합체의 탐지 그리고/또는 정량을 가능하게 한다.

전형적이고 바람직한 면역측정 분석법은 고체상에 결합된 항체가 먼저 시험 대상 시료와 접촉하여 고체상 항체-항원 이중 복합체를 형성함으로써 시료로부터 항원을 추출해내는 "전향(forward)" 분석법을 포함한다. 적당한 배양기간 이후 고체 지지체 또는 담체는 액체 시료의 잔존물을 제거하기 위하여 세척되는데, 반응하지 않은 항원과, 만약 존재한다면 미지의 양의 표지된 항체(이것은 "리포터 분자(reporter modcule)"로 기능한다)를 함유하는 용액과 접촉한 물질이 세척된다. 표지된 항체가 고체 지지체 또는 담체에 결합된 항원과 표지되지 않은 항체를 통하여 복합체를 형성하도록 하는 두번째 배양기간 이후 고체 지지체 또는 담체는 두 번 세척되어 반응하지 않은 표지된 항체를 제거하였다.

본 발명의 항체로서 유용한 또다른 형태의 "샌드위치" 분석법에서, 소위 "동시(simultaneous)" 그리고 "역(reverse)" 분석법이 이용된다. 동시분석법은 고체 지지체 또는 담체에 결합된 항체 그리고 표지된 항체가 모두 동시에 시험대상 시료에 부가되는 단일 배양단계를 포함한다. 배양이 완료된 후 고체 지지체 또는 담체는 액상 시료의 잔존물 및 복합체를 형성하지 않은 표지된 항체를 제거하기 위하여 세척된다. 고체 지지체 또는 담체에 결합된 표지된 항체의 존재는 그 후 일반적인 "전향"샌드위치 분석법에서 결정된다.

"역" 분석법에서는 부가가 순차적으로 일어나는데 처음으로 표지된 항체 용액이 액체시료에 부가되고 다음에는 고체 지지체 또는 담체에 결합된 표지되지 않은 항체가 부가되며, 그 후 적당한 배양기간이 진행된다. 두번째 배양 이후 고체상은 일반적인 방식으로 세척되어 시험대상 시료의 잔존물과 반응하지 않은 표지된 항체의 용액이 제거된다. 고체지지체 또는 담체와 결합된 표지된 항체의 결정은 그후 "동시" 그리고 "전향" 분석법으로 결정된다.

예컨대 효모 이중혼성법, 흡착 크로마토그래피 그리고 당해 기술분야에 공지된 다른 방법과 같은 표준 스크리닝 방법 중의 하나로 일단 분리, 확인 및 규명된 본 발명의 새로운 단백질은 그후 표준 재조합 DNA 절차(예컨대 Sambrook et al., 1989 참조) 즉, 적절한 진핵 또는 원핵 숙주 세포가 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 적절한 진핵 또는 원핵 벡터에 의하여 형질전환되는 절차에 따라 생산된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 생산하기 위하여 그와 같은 발현 벡터와 형질전환 숙주와 관련되어 있다. 앞서 언급한 바와 같이 이들 단백질은 또한 그들의 생물학적 활성이 있는 유사체 및 유도체, 따라서 그와 같은 유사체를 생산하는 형질전환된 숙주 및 이들 단백질의 유사체를 코딩하는 벡터를 포함하여 그들을 코딩하는 벡터를 포함한다. 이들 단백질의 유도체는 단백질의 표준 변형에 의하여생산되거나 또는 형질전환된 숙주에 의하여 생산되는 유사체를 표준변형하여 생산된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 비결합상태의 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55IC) 또는 FAS-R 의 세포내 도메인(FAS-IC) 또는 그들의 소위 "사멸 도메인"(각각 p55DD 또는 FAS-DD)을 작용물로 하여 스스로 세포에서의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 증진시키는 목적으로의 이용과 관련이 있다(실시예 2 참조). 예컨대 종양세포 또는 HIV-감염 세포와 같은 세포 내에서 TNF- 또는 FAS-리간드 유도 세포독성 효과를 도입할 필요가 있는 곳에 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD는 앞서 언급(상기(i) 참조)한 재조합 동물 바이러스(예컨대, 우두 바이러스)를 이용하여 위와 같은 세포 내로 도입시킬 수 있다. 또한 여기에서 온전한 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, 생물학적 활성이 있는 유사체와 유도체 또는 단편이 이용될 수 있는데, 이들 모두는 앞서 기술한 바와 같이 제조된다.

유사하게 본 발명은 또한 p55IC, p55DD, FAS-IC, 또는 FAS-DD의 활성을 저해함으로써 TNF-효과 또는 FAS-R 리간드 효과를 특이적으로 저해하는 것과 관련되어 있다. 예컨대 안티센스 올리고누클레오티드는 세포내로 도입되어 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 발현을 저해할 수 있다.

또한 본 발명은 (p55IC, p55DD, FAS-IC, 및 FAS-DD를 포함하여) TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인 결합 단백질을 코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물과 관련이 있다. 여기에서 벡터는 또한 특정 목표세포(예컨대 종양세포)의 표면 단백질에 결합능력이 있는 바이러스 표면 단백질을 코딩하여 그 세포내로 세포내 도메인 결합 단백질 서열의 삽입을 지시한다.

또다른 측면에서 본 발명은 또한 p55 TNF 수용체의 세포내 도메인(p55-IC, 실시예 2 참조)의 자기 결합 효과와 특별히 관련되어 있다. 그러한 효과의 일례로서 TNF와 그 수용체의 결합에 의하여 일반적으로 매개되는 효과와 자기-결합성 P55-IC 또는 그 일부의 신호전달 활성에 의하여 모방되는 효과는 IL-8을 코딩하는 유전자의 발현을 유도한다.

IL-8은 원래 화학주성활성을 가지는 키모카인(chemokines)의 서브클래스에 해당하는 시토카인이며 몇몇 병리학적 단계와 관현하여 그래뉼로사이트 및 다른 세포 유형의 화학주성에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀져 있다.(예컨대 Endo et al., 1994; Sekodo et al., 1993; Harada et al., 1993; Ferrick et al., 1991 참조)

TNF는 종양세포 및 바이러스 감염세포를 파괴하거나 또는 그래뉼로사이트의 항균활성을 증대시키는 이로운 활성을 가지고 있으며, 치료에서 그러한 방면에 이용된다. 그러나, 상기와 같이 TNF는 또한 바람직하지 않은 활성을 가지고 있어서, 예컨대 다량의 TNF가 종양치료, 항바이러스 치료 또는 향균치료에 사용되는 경우에 그 활성을 저해할 필요가 있다. 따라서, TNF 또는 그 이로운 효과를 모방할 수 있는 물질을 치료가 특별히 요구되는 세포 또는 조직으로 향할 수 있도록 하는 것이 필요하다.

본 발명에 따라 자기결합성 p55-R의 세포내 도메인(p55-IC)은 리간드-비의존적 방식으로 TNF의 몇몇 효과를 모방한다는 것, 예컨대 p55-IC의 '사멸 도메인'이세포 내에 세포독성 효과를 유도할 수 있으며, p55-IC가 IL-8 유전자 발현을 유도할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서 p55-IC를 이용하여 부위-특이적 방식(site-direted fashion)으로 TNF 기능을 모방하는 것, 예컨대 치료하고자 하는 세포 또는 조직에만 p55-IC를 도입하는 것이 가능하다.

상기와 같은 접근법의 일례는 p55-IC 또는 그 일부를 코딩하는 DNA 분자를 가지는 종양세포 또는 악성 조직을 특이적으로 트랜스팩션(형질전환)시키는 것인데, 이는 그와 같은 세포 또는 조직에 세포독성 효과를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 IL-8의 동시 유도에 의하여 이들 효과를 증대시킬 수 있고, 이는 이들 세포부위 또는 그래뉼로사이트 조직 및 다른 임파구에서의 축적 결과를 초래할 수 있으며, 이것은 이어서 종양세포 또는 조직의 사멸을 일으킬 것이다. 이러한 접근은 해로운 관련 부작용이 있는 TNF의 다량 투여의 필요성을 막을 수 있다.

일반 DNA 재조합 기술을 이용하여 p55-IC의 가변 부위를 제조하고 각 TNF-유도 효과에 책임이 있는 부위를 결정할 수 있을 것이다. 예컨대, 우리는 '사멸 도메인'이 세포독성의 원인이 됨을 결정하였고(실시예2), 리간드-비의존적 방식으로 다른 TNF-효과의 원인이 되는 p55-IC 부분을 포함하는 다른 다양한 구조를 제조하였으며, 활성을 위하여 일단 자기-결합한 후 IL-8 유도와 같은 효과를 유도하였다.

다른 TNF-관련 효과의 유도(예컨대 IL-8 유도)에 관련된 P55-IC 서열은 세포독성과 관련된 서열, 즉 '사멸 도메인'의 전부 또는 일부를 전혀 포함하지 않는 서열과 비유사할 수 있으며, 세포내 도메인의 다른 부분에서 유래한 다른 서열 모티브를 가지고 있으며, 혹은 동일 서열을 가질 수도 있는데 서열의 다른 특성이 다른효과를 유도하는데 연관되어 있다는 것이 지적되어야 한다.

따라서, 앞서 또는 이후에 상세히 설명한 바와 같이 이들 p55-IC 부분, 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 발현 벡터들이 제조되고, 숙주세포에서 발현되고, 정제되고 활성이 시험될 수 있다. 이러한 방법으로 1 또는 그 이상의 TNF-관련 활성을 가지는 몇몇 p55-IC 단편들이 제조되어 다양한 병리학적 조건, 예컨대 바이러스 감염, 세균 감염, 종양 등의 치료에 비유사한 방식으로 이용될 수 있다. 이와 같은 모든 상황에서 특이적 활성은 IL-8 유전자 발현 유도에 관하여 책임이 있는 p55-IC 단편과의 통합으로 더해질 수 있고, 그리하여 바람직한 IL-8 화학 주성활성에 사멸 대상 세포 또는 조직의 사멸을 증가시킬 수 있다.

따라서, TNF의 체계적인 투약 없이도 p55IC 전체 또는 일부를 치료하여야 할 세포 또는 조직에 특이적으로 도입함으로써 바람직한 효과를 유도할 수 있다.

p55IC는 앞서 언급한 방법 중의 어느 한가지를 이용하여 파과하고자 하는 세포 또는 조직 내로 특이적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 이것을 수행하는 한가지 방법은 예컨대 우두 바이러스로부터 유래된 재조합 동물 바이러스를 제조함으로써 수행되는데, 그 DNA에는 다음의 두 유전자가 도입될 것이다: 그 하나는 세포에 의하여 특이적으로 발현되는 세포 표면 단백질 예컨대, 어떤 세포(CD4 임파구 및 관련 루케미아)에 특이적으로 결합하는 AIDS 바이러스 gp120 단백질에 결합하는 리간드, 또는 TNF-R을 가진 세포에 특이적으로 결합하는 다른 리간드를 코딩하는 유전자이며, 그리하여, 그 재조합 바이러스 벡터는 그러한 TNF-R 운반 세포와 결합할 수 있다, 그리고 다른 하나는 p55-IC 또는 그일부를 코딩하는 유전자이다. 따라서,바이러스 세포 상의 세포표면 결합 단백질의 발현은 종양세포 또는 다른 TNF-R 운반세포에 대하여 특이적으로 목표를 삼을 수 있으며, 이후 p55IC, 또는 그 일부를 코딩하는 서열이 바이러스를 통하여 세포 내로 도입될 수 있고, 세포 내에서 일단 발현되면 TNF 효과의 증대를 일으켜 사멸 또는 유도하고자 하는 종양세포 또는 다른 TNF-R 운반세포의 사멸을 일으킨다. 예컨대, IL-8의 세포 표면 결합 단백질의 발현은 세포사멸을 일으킨다. 그와 같은 재조합 동물 바이러스의 구성은 표준방법(예를 들어 Sambrook et al, 1989 참조)에 의한다. 또다른 가능성은 p55-IC 또는 그 일부 서열을 세포에 흡수되어 발현될 수 있는 올리고누클레오티드 형태로 도입하는 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 p55IC 또는 그 일부를 코딩하는 상기 재조합 동물 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물과 특이하게 연관되어 있는데 벡터는 또한 특정 목표세포(예컨대 종양세포)의 표면 단백질과 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 코딩하여 P55IC 또는 그 일부의 서열이 세포 내로 삽입되도록 지시된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 수용성이고 올리고머 형성 능력이 있어서 가능하게는 고차(high order)의 멀티머 TNF 수용체 분자를 형성할 수 있는 새로운 합성 TNF 수용체와 관련이 있는데, 이들 수용체의 각 모노머 부분은 TNF 모노머와 결합할 수 있다. TNF는 천연에서 세 개의 활성 TNF 모노머를 가지며 각각은 단일 TNF 수용체 분자와 결합능력이 있는 호모 삼합체로 생성되는데, 반면 TNF 수용체는 천연에서 TNF 호모 삼합체 분자 중 단 하나의 모노머와만 결합할 수 있는 모노머로생성된다. 따라서, TNF가 세포표면의 TNF수용체에 결합할 때 세 개의 수용체 분자와 결합하여 TNF 수용체의 뭉치(cluster)를 형성 할 수 있으며, 이것은 신호전달 과정의 개시가 되어 궁극적으로 관찰된 것과 같은 세포 상의 TNF-효과를 일으키는 것으로 믿어진다.

TNF는 예컨데 종양세포 또는 바이러스 감염세포를 파괴하고 그래뉼로사이트의 항균활성을 증강시키는 능력과 같은 많은 바람직한 효과를 가지고 있으나, TNF는 예컨대 자기면역 질병, 류머티스성 관절염, 이식 절편-대-숙주 반응(이식절편 거부반응), 패혈 쇼크와 같은 많은 바람직하지 않은 효과를 가진다. TNF는 병리학적 조직 파괴의 주요 원인인 것으로 암시되어 왔다. TNF는 또한 지방 세포의 활성을 억제하므로써 과다한 체중감소(영양불량)의 원인이 된다. 나아가, 다양한 악성 또는 바이러스 질병의 치료와 같은 바람직한 활성을 목적으로 투약한 경우에 있어서도 사용된 TNF의 양은 종종 환자에게서 건강한 조직의 파괴와 같은 바람직하지 못한 세포독성 부작용을 일으킬 정도로 높다.

따라서, TNF의 작용이 바람직하지 않은 상기 모든 경우에 있어서 TNF의 효과적인 억제자가 필요하다. 많은 TNF-억제 작용물이 제안되었는데, 여기에는 TNF에 결합하여 TNF의 그 수용체와의 결합을 억제함으로써 TNF의 세포독성 효과 또한 억제하는 수용성 단백질이 포함된다.(EP 308378, EP 398327 및 EP 568925 참조). 그러나, 이들 TNF결합 단백질 또는 수용성 TNF 수용체는 모노머로서, 각각은 TNF 호모 삼합체 중의 단하나의 TNF 모노머에만 결합한다. 따라서, TNF 기능의 억제는 완전하지 않으며, 각 모노머 수용체와 결합한 TNF 분자는 여전히 두 개의 TNF 모노머가 있어 세포표면 수용체 결합하여 세포 내에서 그 효과를 일으킬 수 있다.

TNF 기능의 억제에 있어서 상기 결점을 극복하기 위하여 융합 단백질로서 자연 산 TNF 호모 삼합체 분자의 최소 2 TNF 모노머에 결합가능한 수용성 올리고머 TNF수용체를 구성하는 수단이 본 발명에 따라 개발되었다. 결과로서, 이들 수용성 올리고머 TNF 수용체는 먼저 알려진 모노머 수용성 TNF 결합 단백질 또는 수용체보다 TNF 리간드에 더 잘 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 수용성 TNF 수용체가 이합체 형태일 때, TNF 삼합체 중 두 개의 TNF 모노머가 결합 가능하고 따라서 TNF의 좀 더 완전한 중성화가 일어나는데, 이 중성화는 TNF로부터 이합체 수용성 수용체의 분리율이 낮으므로 좀더 안정적이다. 나아가, 그와 같은 수용성 올리고머 수용체는 또한 모노머에 비하여 크고, 따라서 약리학적으로 생체로부터 제거되는 속도가 느린 경향이 있으므로 유리하다.

본 발명의 수용성 올리고머 TNF 수용체의 개발의 기초는 p55-R TNF 수용체의 세포내 도메인이 자기결합 능력이 있고, 나아가 이 세포내 도메인 (p55-IC)에 자기결합 능력이 있는 소위 '사멸 도메인'이 존재하여 리간드-비의존적 형태로 세포에서 세포독성 효과를 일으킬수 있음을 발견한 것이다(실시예 2참조). p55-IC 및 그 '사멸 도메인'의 이러한 자기결합 성질을 이용하여 표준 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 p75-R 또는 p55-R 수용체와 같은 TNF 수용체의 본질적으로 모든 세포외 도메인, 바람직하게는 p55-R 및 그것에 융합된 것, 본질적으로 모든 세포내 도메인(p55-IC) 또는 p55-IC의 사멸 도메인을 포함하는 융합 단백질을 구성하는 것이 가능해졌다. 이와 같은 방법으로 한쪽 말단에 TNF 결합 도메인 즉, 수용체의 세포외 도메인이 그리고 다른 말단에는 자기 결합 가능한 세포내 도메인 또는 사멸 도메인이 있는 새로운 융합 당백질이 생산된다. 따라서, 그러한 생산물은 두 개(그리고 가능하면 더 많은)의 p55-IC 또는 그 사멸 도메인 간의 자기 결합에 의하여 돌리고머화되어 최소한 두 개의 TNF 결합 도메인을 가지는 올리고머(또는 최소한 이합체)를 얻을 수 있다.

나아가, 본 발명에 따라 Fas/APO1 수용체가 p55IC 및 그 사멸 도메인과 어떤 유사성을 가지는 자기 결합성 '사멸 도메인'을 포함하는 자기결합성 세포내 도메인을 가지고 있다는 사실이 또한 밝혀졌다(실시예2). 따라서 TNF 수용체의 세포의 도메인(상기와 같음)과 Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인 또는 '사멸 도메인'에 융합시킴으로써 수용성 올리고머 TNF 수용체를 구성할 수 있다.

상기 두 경우 모두에 있어서, 본 발명의 올리고머 TNF 수용체는 단 하나의 수용성 TNF 수용체 세포외 도메인와 p55-R TNF 수용체 또는 Fas/ APO1 수용체의 수용성 세포내 도메인 또느 사멸 도메인을 가지므로 수용성이다. 즉, 그들은 어떤 형태의 수용체에서도 막간(비수용성) 도메인을 함유하고 있지 않다.

본 발명의 상기 올리고머 TNF 수용체의 구성은 이하의 실시예 4에 상세히 나타난다. 그러나 본 발명의 올리고머 TNF 수용체의 구성에 있어서 예전에 보고되지 않았던 것으로서, TNF 수용체의 세포외 도메인이 자기결합할 수 있는 상황이 있을 수 있다. 이 상황은 TNF 호모 삼합체 분자 중의 2 또는 그 이상의 TNF 모노머에 결합하는 올리고머 수용체의 능력을 방해할 수 있거나 또는 그러한 TNF 모노머의 결합을 최대치보다 낮아지게 할 수 있다. 따라서, 그러한 상황에서 표준 재조합 DNA방법으로 TNF 수용체 세포외 도메인을 변형할 수 있다. 예컨대, 그와 같은 자기결합을 방지하지 위하여 자기 결합 부위에 있는 1 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 결실시키거나 치환시키는 방법으로 변형 가능하다. TNF 수용체의 세포외 도메인의 그러한 변형은 따라서 본 발명의 일부이며 여기에서 TNF 수용체의 세포외 도메인의 유사체 또는 유도체로 나타내어진다. 유사한 형태로, 본 발명의 올리고머 TNF 수용체로 이용되는 p55-R 수용체 또는 Fas/APO1 수용체의 자기 결합에 세포내 도메인 (IC) 또는 사멸 도메인(DD)은 또한 그것의 유사체 또는 유도체가 될 수 있다. 즉, 사멸 도메인(p55DD)을 포함하는 P55-IC 서열 또는 그 일부의 변형, 또는 사멸 도메인(FAS DD)을 포함하는 Fas/APO1 세포내 도메인 (FAS-IC) 서열 또는 그 일부의 변형이 되며, 이때 이들 변형에 의하여 자기 결합성 산물이 얻어진다는 것을 조건으로 한다.

유사하게, 일단 수용성 올리고머 TNF 수용체, 그의 유사체 또는 유도체는 생산되고 정제되면 본 발명의이러한 TNF 수용체를 활성인자로 함유하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 목적으로 표준 화학적 방법으로 염 및 기능성 유도체를 제공하기 위하여 변형될 수 있다.

본 발명의 수용성 올리고머 TNF 수용체의 생산을 위하여 TNF 수용체 세포외 도메인을 코딩하는 DNA서열이 TNF 수용체의 기존 클론에서 얻어지는데, 그것의 세포내 도메인 또는 사멸 도메인도 마찬가지이며, Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인 또는 사멸 도메인도 마찬가지다(실시예 2 및 실시예 4 참조). 이러한 방법으로 요구되는 세포외 도메인의 DNA서열은 사멸 도메인을 포함하여 요구되는 세포내 도메인 또는 그 일부의 서열에 연결되며, 이 융합 산물은 프로모터의 조절 또는 다른 발현조절 서열의 조절 하에서 적절한 발현 벡터 내로 삽입(및 연결)된다. 일단 형성된 후 발현 벡터는 적절한 숙주 세포로 도입(형질 전환, 트랜스펙션 등)되는데, 그 후 벡터가 발현되어 수용성 자기 결합성 TNF 수용체 분자라는 본 발명의 융합 산물이 얻어진다. 이후 이들은 표준방법에 의하여 숙주세포로부터 정제되어 최종 산물인 수용성 올리고머 TNF 수용체가 얻어진다.

세포외 도메인 및 세포내 도메인 또는 그 일부를 코딩하는 융합단백질의 바람직한 조제는 TNF 수용체 전체를 코딩하는 클론으로부터 복제되는, 원하는 서열에 특이적인 올리고누클레오티드를 이용하는 PCR 기법으로 알려져 있다. 다른 방법 또한 가능한데 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 요구되는 부분의 제한 효소로의 분리와 같은 방법이며, 그 후 공지의 방식으로 이들을 연결한다. 이 때 수용체의 원하는 부분(세포외 그리고 세포내 도메인 또는 그 부분)의 바른 융합을 위하여 제한단편의 말단을 변형하거나 또는 변형하지 않는다. 이리하여 얻어진 융합 단백질은 이후 선택된 발현 벡터에 삽입된다.

유사한 방식으로 본 발명은 또한 Fas/APO1 수용체의 세포외 도메인과 p55-R의 자가 결합성 세포내 도메인(p55-IC), 그것의 사멸 도메인(p55DD) 또는 Fas/APO1 수용체의 자기 결합성 세포내 도메인(FAS-IC) 또는 그것의 사멸 도메인(FAS DD) 또는 그것의 유사체 또는 유도체(이전 내용 참조)를 포함하는 수용성 올리고머 Fas/APO1(FAS) 수용체와 관련되어 있다. 이들 수용성 올리고머 FAS 수용체의 구성은 이하의 실시예5에 상세히 설명되어 있으며, 개시 물질로서 구입가능한 클론된전장 FAS 수용체-코딩 서열 및 요구되는 세포외 및 세포내 도메인의 PCR 생산을 위한 적절한 올리고누클레오티드를 이용하고 그 후 융합 산물을 얻기 위하여 연결하며, 이후 적당한 발현벡터 내로 삽입된다. 이전 및 이후에 상세히 기술한 바와 같이, 윈핵 또는 진핵생물 벡터 및 숙주 세포는 요구되는 수용성 올리고머 FAS 수용체를 생산하기 위하여 이용되며, 그후 정제되어 활성 인자로 처방, 조제되어 약제학적 조성물을 얻는다.

본 발명의 상기 수용성 올리고머 FAS 수용체는 Fas 리간드를 효과적으로 억제하려는 의도로 만든 것인데 이것 또한 삼합체로 존재하며(상기의 TNF와 유사함) 본 발명의 각 올리고머 수용체는 2 또는 그 이상의 Fas 리간드와 결합할 수 있고 따라서 그 활성을 중화시킬 수 있다. Fas 리간드는 현저하게 세포 표면과 관련되어 있으나 또한 수용성 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 어느 경우에 있어서나 본 발명의 올리고머 FAS 수용체는 최소한 이 리간드의 두 모노머와 결합할 수 있으며, 그리하여 Fas 리간의 활성을 (모노머 FAS 수용체에 비하여) 좀더 효과적으로 중화시킬 수 있다. Fas 리간드, 그리고 그로부터 유래하는 FAS 수용체의 활성화는 수많은 병리학적 상태를 암시하는데, 특히 간염과 관련된 간의 손상을 포함하여 간의 손상(예컨대 간조직의 아포토시스), 그외에 HIV 감염된 인간의 임파구 손상(아포토시스)을 포함하여 자기면역 증상과 관련되어 있다(예컨대 Ogasawara et al., 1993, Cheng et al., 1994 참조). 따라서 본 발명의 수용성 올리고머 FAS 수용체는 Fas 리간드의 활성을 억제하기 위한 목적에 따른 것이고 Fas 리간드-관련 병리학적 상태 등의 치료를 위한 약제학적 조성물에서 활성인자로 이용될 수 있다.

유사하게, 본 발명은 또한 TNF 및 FAS-R 리간드 양자에 대하여 결합능력을 가지는 소위 "혼합" TNF-R/FAS-R 올리고머 수용체라고 명명된 수용성 올리고머 수용체와 관련되어 있다. 이러한 혼합 올리고머 수용체는 최소한 하나의 TNF-R 세포외 도메인 및 최소한 하나의 FAS-R 세포외 도메인을 함유하고 있는데, 이것은 이들 세포외 도메인 각각이 상기 자기결합성 p55IC, p55DD, FAS IC 또는 FAS DD 중의 하나와 융합됨으로 인하여 올리고머 수용체 내에서 관련되어 있다.

이들 혼합 올리고머 수용체는 다음과 같이 제조된다: (a) p55IC와 FAS IC의 자기결합 세포내 도메인 중의 하나 또는 자기결합 '사멸 도메인' p55IC 및 FAS DD 또는 자기결합 단백질의 그의 유사체 중의 하나와 융합된 TNF-R(p75 TNF-R 또는 바람직하게는 p55 TNF-R)의 세포외 도메인을 포함하는 상기 융합산물의 제공; (b)자기결합성 p55IC, FAS-IC P55DD, 그리고 FAS-DD 또는 자기결합성 부분, 그유사체 또는 유도체 중의 하나와 융합된 FAS-R의 세포외 도메인을 포함하는 상기 융합 산물의 제공; 그리고 (c) (a)의 TNF 특이적 융합산물 중의 어떤 것을 (b)의 FAS-R 리간드 특이적 융합산물 중 어떤 것과 혼합하여 적어도 TNF-R 및 FAS-R의 세포외 도메인 양자를 가진 올리고머(이합체 또는 그 이상의 올리고머)수용체를 제공(표준 선택법과 정제방법을 거쳐)하며 이것은 그들의 융합된 IC 또는 DD 부분의 자기 결합능력과 관련이 있다.

상기 혼합 올리고머 수용체의 제조에 관한 또다른 가능성은 적절한 숙주세포를 상기 발현 벡터로 공동 형질전환시키는 것인데, 그중 하나는 TNF-특이적 FAS-R 융합산물을 코딩하고 하나는 FAS-R 리간드-특이적 FAS-R 융합산물을 코딩한다. 숙주 세포에서의 이러한 비유사한 융합 산물의 발현 이후 혼합 올리고머(TNF-R/FAS-R) 수용체가 표준정제 방법과 선택방법을 통하여 얻어진다.

이러한 혼합 흡착 올리고머 수용체의 유용성은 우선 이들이 생체 내에서 과량 발현되거나 혹은 생체 외부에서 투약후 바람직하지 못하게 높은 수준이 되었을 때 TNF 및 FAS-R 리간드 양자를 중화하는 것이다. 최근의 증거는 FAS-R 리간드(일반적으로 세포-표면에 결합된)와 TNF-α (이것 또한 세포-표면에 결합된) 간의 기능에 있어서 상호상승작용이 존재할 가능성을 지적한다. 따라서, 어떤 경우에는 세포 표면의 동일한 지점에서 이들 양 리간드의 중화가 요구된다. 즉, 그러한 혼합-흡착 수용체는 TNF의 수용체와의 결합 및 FAS-R 리간드와 그 수용체의 결합 모두를 억제할 수 있다. 따라서, 이 혼합-흡착 수용체는 TNF와 FAS-R 리간드 효과 양자의 바람직하지 못한 상황을 치료하기 위하여 약제학적 조성물에서 활성인자로 이용될 수 있다.

유사하게, 본 발명의 수용성 올리고머 TNF-R 및 FAS-R, 그리고 TNF-R/FAS-R 올리고머에 관한 이상에서 언급된 부분에 따라 다른 수용체에 대한 수용성 올리고머 수용체, 또는 그들의 혼합물, 특히 TNF/NGF 수퍼패밀리의 다른 멤버중의 어떤 것들을 또한 생산할 수 있다. 이 경우에, 다양한 수용체의 세포외 도메인 중의 어떠한 것도 상기 자기결합 세포내 도메인 또는 그 부분 또는 자기결합 가능한 수퍼패밀리의 다른 세포내 도메인에 융합할 수 있다.

이 문서에 언급된 바와 같이 본발명의 재조합 단백질 중의 어떤 것에 대한 발현은 적절한 발현벡터를 이용함으로써 진핵세포(예컨대, 효모, 곤충 또는 포유류의 세포)에서 효과적이 될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 어떠한 방법도 적용될 수 있다.

예를 들어 상기 방법 중의 어떠한 것을 사용하여 얻어진 단백질을 코딩하는 DNA분자는 적적하게 구성된 발현 벡터에 본 기술분야에 알려진 방법으로 삽입된다(Sambrook et al., 1989 참조). 이중사슬 cDNA는 호모폴리머 테일링 또는 합성 DNA 링커 또는 블런트 엔드 리게이션 기술을 이용하는 제한적 링킹방법으로 플라스미드 벡터에 연결된다. DNA 리가아제는 DNA분자를 연결하기 위하여 사용되는데 바람직하지 않은 결합은 알칼린 포스파타아제의 처리로 피할 수 있다.

요구되는 단백질을 발현할 수 있게 하기 위하여 발현 벡터는 또한 요구되는 단백질을 코딩하는 DNA에 연결된 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 특이적 누클레오티드 서열을 포함하여야 한다. 이러한 방법으로 유전자 발현 및 단백질 생산이 가능해진다. 첫째, 유전자가 전사되기 위하여는 RNA 중합효소에 의하여 인식될 수 있는 프로모터가 선행되고 거기에 중합효소가 결합하고 그리하여 전사과정이 개시되어야 한다. 다양한 프로모터가 이용되는데 이들은 각각 다른 효율로 작용한다(강한 프로모터와 약한 프로모터). 그들은 원핵세포와 진핵세포에서 서로 비유사하다.

본 발명에 이용되는 프로모터는 보존적, 예컨대 박테리오파아지 △의 int 프로모터, pBR322의 β -락타메이즈 유전자의 bla 프로모터, 그리고 pPR325의 클로람페티콜 아세틸 트랜스퍼라아제 유전자의 CAT 프로모터 등이며, 또는 유도가능한 것으로 예컨대 박테리오파아지의 주요 우측 및 좌측 프로모터(PL 및 PR), 대장균의 trp, recA, lacZ, lacI, ompF 그리고 gal 프로모터, 또는 trp-lac 혼성 프로모터등과 같은 원핵 프로모터가 있다(Glick, B. R. (1987)). 다량의 mRNA를 생산하기 위하여 강한 프로모터를 사용하는 것 외에 원핵세포에서 고수준의 유전자 발현을 얻기 위하여는 또한 mRNA가 효과적으로 번역되게 하기 위하여 리보소옴-결합 부위를 사용하는 것이 필요하다. 일례로 개시코돈으로부터 적당한 곳에 위치하며, 16S RNA의 3'말단에 상보적인 샤인-달가르노 서열(SD서열)이 있다.

진핵 숙주에 있어서는 숙주의 성질에 따라 다른 전사 및 번역 조절서열이 채용된다. 그들은 아데노바이러스, 소의 유두종 바이러스, 시미안 바이러스, 또는 그와 유사한 바이러스 원천으로부터 유래되는데, 여기에서 조절신호는 고수준으로 발현되는 특정 유전자와 관련이 있다. 예로는 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이다. 전사개시 조절신호는 선택되어 억제 및 활성화를 가능케 하는데 이에 따라 유전자의 발현이 조절된다.

본 발명의 융합단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 요구되는 유전자서열을 숙주세포에 결합시킬 수 있도록 하는 조절가능하도록 연결된 전사 및 번역조절신호를 가진 벡터에 삽입된다. 도입된 DNA에 의하여 안정적으로 형질전환된 세포는 또한 하나 또는 그 이상의 마아커를 도입함으로써 발현 벡터를 함유하는 숙주세포의 선택을 가능하게 하여 선택될 수 있다. 마아커는 자가영양 및 예컨대 항생제, 구리와 같은 중금속 등의 생물독에 대한 저항성 숙주에 타가 영양 성질을 제공한다. 선택가능한 마아커 유전자는 직접 발현되어야 할 DNA 유전자 서열에 연결되거나 또는 공동-형질전환에 의하여 동일 세포에 도입될 수 있다. 부가적인 요소들 또한 본 발명의 단백질의 최적 합성을 위하여 필요하다. 이들 요소들은 전사 프로모터, 인핸서, 그리고 종결신호이다. 이러한 요소들이 결합된 cDNA 발현벡터는 Okayama,H.(1983)에 의하여 기술된 자료에 포함되어 있다.

바람직한 실시예에서, 도입된 DNA분자는 수용 숙주에서 자가 복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 결합될 것이다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어서 중요한 인자는 다음을 포함한다: 벡터를 함유하는 수용(recipient) 세포는 벡터를 함유하지 않는 수용세포로부터 인식되고 선택되기 쉬워야 한다; 특정 숙주에서 요구되는 벡터의 복제수; 다른 종에서 유래된 숙주세포 간에 벡터를 "셔틀(shuttle)"할 수 있는 것이 바람직한지 여부.

바람직한 원핵 벡터는 예컨대 pBR322, ColE1, pSC 101, pACYC184 등(Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989 참조); 바실러스 플라스미드 pC194, pC221, pT127 등(Gryczan, T., (1982)); pIJ101을 포함하여 스트렙토마이세스 플라스미드(Kendall, K.J. et al., (1987)): Φ C31과 같은 스트렙토마이세스 박테리오파아지(Chater, K. F. et al.,의 Sixth Internatioal Symposium on Actinomycetales Biology, (1986)), 그리고 슈도모나스 플라스미드(John, J.F. et al., (1986) 및 Izaki, K.(1978))과 같이 대장균 내에서 복제가 가능한 플라스미드를 포함한다. 바람직한 진핵 플라스미드는 BPV, 우두 바이러스, SV40, 2-미크론 원 등 또는 그들의 유도체를 포함한다. 그러한 플라스미드는 본 기술분야에 널리 알려져 있다(Botstein, et al.,(1982); Broach, J.R. in : The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance(1981); Broach, J.R, (1982); Bollon, D.P. et al., (1980); Maniatis, T., in Cell Biology: AComprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression(1980); 및 Sambrook et al., 1989).

일단 구성물을 포함하는 DNA 서열 또는 벡터가 발현을 위하여 제조되고, DNA 구성물은 다양한 알맞은 수단: 형질전환, 트랜스펙션, 콘쥬게이션, 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전법, 직접 마이크로주사법 등에 의하여 적절한 숙주세포로 도입된다.

본 발명에 사용되는 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포 어느 쪽이나 가능하다. 바람직한 원핵숙주는 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스, 슈도모나스, 살모넬라, 세라티아 등과 같은 세균을 포함한다. 가장 바람직한 원핵 숙주는 대장균이다. 특별히 흥미로운 세균 숙주에는 대장균 K12 변종 294(ATCC 31446), 대장균 X1776(ATCC 31537), 대장균 W3110(F- 람다-, 타가영양(ATCC 27325)), 그리고 살모넬라 티피뮤리움 또는 세라티아 마세슨스 및 다양한 수도모나스 종과 같은 다른 엔테로박테리아를 포함한다. 이와 같은 조건에서 단백질은 글리코실화되지 않는다. 원핵 숙주는 발현 플라스미드의 레플리콘 및 조절서열과 조화되어야 한다.

바람직한 진핵숙주는 인간, 원숭이, 마우스 및 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유류 세포인데, 왜냐하면 그들은 바른 위치에 바른 폴딩 또는 글리코실화를 포함하여 단백질 분자에 번역후 변형을 제공하기 때문이다. 효모세포 또한 글리코실화를 포함하여 번역후 펩티드의 변형을 일으킬 수 있다. 효모 내에서 요구되는 단백질의 생산에 이용될 수 있는 강한 프로모터 서열과 높은 복제수의 플라스미드를 이용할 수 있는 수개의 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 클론된 포유류유전자 산물 상의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 포함하는 펩티드를 분비한다(즉, 프리-펩티드).

벡터의 도입 이후, 숙주세포는 선택된 미디움에서 성장하는데, 여기에서 벡터를 포함하는 세포의 성장이 선택된다. 클론된 유전자 서열의 발현은 요구되는 단백질의 생산을 초래한다.

재조합 단백질의 정제는 이와 같은 목적으로 알려진 방법들 즉, 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기이동 또는 그와 유사한 것을 포함하여 일반적인 방법에 의하여 수행된다. 본 발명의 단백질을 정제하는데 바람직하게 이용될 수 있는 다른 정제방법은 항-TNF 수용체 모노클론 항체를 사용하는 흡착 크로마토그래피인데, 이것은 칼럼에 함유된 겔 매트릭스에 고정시킴으로써 만들어진다. 재조합 단백질을 포함하는 불순한 조제물은 이 칼럼을 거친다. 단백질은 특이적 항체에 의하여 칼럼에 결합할 것이고, 반면 불순물은 통과할 것이다. 세척 이후 단백질은 pH를 변화시키거나 또는 이온세기를 변화시킴으로써 겔에서 용출된다.

이 문헌(이상을 참조)에 이용된 것과 같이 "염"이라는 용어는 카르복실기의 염과 본 기술분야에 알려진 수단에 의하여 형성되는 단백질 분자의 아미노기의 산부가 염의 양자를 일컫는 것이다. 카르복실 기의 염은 예컨대 나트륨, 칼슘과 같은 무기염 및 트리아세틸아민, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아민 등의 유기적 기초로 형성된 염을 포함한다. 산 부가 염은 예컨대 미네랄산의 염과 유기산의 염을 포함한다.

이 문헌에 사용된 "기능성 유도체"는 본 기술분야에 알려진 방법으로 잔기또는 N-, C-말단기 상의 곁가지로 존재하는 작용기로부터 제조되는 유도체를 포함하며, 그들이 약리학적으로 수용가능한 한, 즉 그들이 단백질의 활성을 파괴하지 않고 그것에 포함된 구성물에 독성 성질을 주지 않는 한 본 발명에 포함된다. 이들 유도체는 지방족 에스테르 또는 카르복실기의 아미드, 그리고 아실 부분(예컨대 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일기)에 의하여 형성된 비결합 아미노기의 N-아실 유도체, 비결합 히드록시기의 O-아실 유도체를 포함한다.

이 문헌에 사용된 "분액"이라는 용어는 수용체의 일부 또는 부분을 의미하며, (그들의 세포내 도메인 또는 세포외 도메인), 또는 그것이 생물학적 활성을 보유한다면 수용체의 세포내 도메인과 결합하는 단백질의 일부를 의미한다.

앞서 언급한 바와 같이 본 발명은 또한 약리학적으로 수용가능한 담체 및 본 발명에 기술된 것과 같은 다양한 활성 인자 또는 그 염, 기능성 유도체, 또는 이상의 혼합물로 구성된 다양한 약제학적 조성물과 관련되어 있다. 이 화합물은 앞서 기재된 바와 같은 조건에서 이용된다. 예컨대 패혈 쇼크, 영양불량, 이식절편 대 숙주 반응, 류머티스성 관절염과 같은 자기면역 질병과 같이 생채내 TNF가 과량 생산되는 경우에 이용된다. 투약방법은 유사한 치료제의 투약에서 수용되었던 방법에 의하여 가능하며 치료해야 하는 조건에 따라 달라질 것이다. 예컨대 TNF 효과를 억제하기 위하여 사용하는 경우 패혈 쇼크예는 혈관으로 주사되며 또는 류마티스성 관절염에 있어서는 부분 주사(예를 들어, 무릎에)로 투약되거나 또는 점적으로 지속적으로 투약하는 방법 등이 있다. 이 화합물은 또한 예컨대 TNF 과량을 외부에서 투약하여 발생하는 TNF 중독의 경우에 즉, 종양치료 또는 바이러스 질병 치료의 경우에 이용된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단백질 또는 그 유도체를 생리학적으로 수용가능한 담체, 안정화제 및 부형제와 혼합함으로써 투약용으로 제조되며, 정량 유리병에서 응결건조하여 약 형태로 제조된다. 투약될 활성 화합물의 양은 투약경로, 치료목적 질병 그리고 환자의 상태에 따라 달라진다. 예를 들어 류마티스성 관절염의 염증상황에서는 부분 주사를 놓음으로써 몸무게 당 필요한 활성 인자가 패혈 쇼크의 경우에 있어서 혈관주사에 사용되는 양보다 덜 소요될 것이다.

본 발명의 다른 측면은 다음의 실시예에서 명확해질 것이다.

본 발명은 이하에서 좀더 상세히 기재될 것이나, 실시예와 도면이 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

p55와 p75 TNF 수용체의 세포내 도메인에 결합하는 단백질의 분리 및 클로닝

p55와 p75 TNF 수용체의 세포내 도메인(p55IC와 p75IC)과 반응하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 이중혼성 시스템이 사용되었다(Fields and Song, 1989). 간단히, 이 이중혼성 시스템은 분리된 두 도메인, DNA결합 도메인과 활성화 도메인을 가지는 GLA4 같은 진핵세포 전사 활성인자의 복구에 의해 생체 안에서의 특이 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 효모를 기초로 하는 유전적 분석법이다. 그 DNA결합 도메인과 활성화 도메인은 복구된 GAL4 단백질을 형성하기 위해 발현되어 함께 결합될 때, 배양된 세포에서 쉽게 발견되는 lacZ 혹은 HIS3 같은 리포터 유전자의발현을 억제하는 프로모터를 차례로 활성화시키는 상류(upstream) 활성화 서열에 결합할 수 있다. 이런 시스템에서 후보(candidate) 상호작용 단백질들을 위한 유전자들은 다른 발현 벡터로 클로닝된다. 한 발현 벡터에서 한 후보 단백질의 서열은 GAL4 DNA-결합 도메인을 가지는 혼성 단백질을 생성하기 위한 GAL4 DNA-결합 도메인의 서열로 클로닝되고, 다른 벡터에서 두 번째 후보 단백질의 서열은 GAL4-활성 도메인을 갖는 혼성 단백질을 생성하기 의한 GLA4-활성화 도메인의 서열로 클로닝된다. 그리고 두 혼성 벡터들은 상류의 GAL4 결합 부위의 조절 하에서 lacZ 혹은 HIS3 리포터 유전자를 같는 효모 숙주 균주로 공동-형질전환된다. 이중 혼성 단백질이 발현되어 서로 상호작용할 수 있도록 그렇게 형질전환된 숙주 세포들(cotransformants)만이 리포터 유전자로 발현될 수 있을 것이다. lacZ 리포터 유전자의 경우에서 이런 유전자를 발현시키는 숙주 세포들이 X-겔이 배양액에 첨가될 때 푸른색으로 변할 것이다. 그러므로 푸른 콜로니들이 두 클로닝된 후보 단백질들이 서로 작용할 수 있다는 사실을 제시한다.

이런 이중-혼성 시스템을 사용하여 세포내 도메인 p55pIC 및 p75IC이 GAL4 DNA-결합 도메인과 함께 융합 단백질을 생성하기 위하여 벡터 pGBT9 (GAL4 DNA-결합 도메인을 수반, 미국의 CLONTECH에 의해 제공됨, 아래를 참조하시오)로 각각 클로닝된다(유사하게는, 세포내 도메인, FAS-IC 및 5IC의 일부인 55DD가 또한 pGBT9로 클로닝되고 다른 IC-결합 단백질을 분리하기 위해 사용된다. 아래 실시예 3을 보시오). p55IC 및 p75IC의 pGBT9로의 글로닝을 위해 p55 pTNF-R(Schall et al., 1990)와 p75 TNF-R(Smith et al., 1990)의 전장 cDNA 서열을 코딩하는 클론들이 세포내 도메인(IC)이 다음과 같이 절단되는 데 사용되었다: p55IC는 효소 EcoRI와 SalI을 사용하여 절단되고, p55IC 서열을 포함하는 EcoRI-SalI 절편은 일반적인 방법에 의해 분리되어 다중 클로닝 부위 영역(MCS)에서 EcoRI-SalI과 함께 열려 있는 pGBT9으로 삽입된다. p75IC는 효소 BspH I과 Sal I를 사용하여 절단되고 그 p75IC 서열을 함유한 BspH I-Sal I 은 일반적인 방법에 의해 분리되어 클레노우 효소(Klnow enzyme)로 Sma I 및 Sal I과 같이 열려 있는 pGBT9 벡터에 주입될 수 있는 절편을 생성하기 위하여 삽입된다.

그 다음에 위의 혼성 (키메라) 벡터들은 GAL4 활성 도메인을 갖으면서 pGAD GH 벡터로 클론된 사람의 HeLa 세포에서 얻은 cDNA 라이브러리와 함께 HF7c 효모 숙주 균주(위에 언급한 모든 Hela 세포 cDNA 라이브러리를 수반하는 pGBT9와 pGAD GH 및 MATCHMAKER 이종 혼성 시스템의 일부인, #PT12651로서 미국의 Clontech Laboratories, Inc.로부터 구입한 효모 균주)로 공동-트랜스펙션된다. 공동-트랜스펙션된 효모들은 히스티딘이 결여된 배양액(His^-배양액)에서의 생장능력으로 선택되었는데, 이 때 생장한 콜로니들은 양성 형질전환체들임을 나타내는 것이다. 그리고나서 선택된 효모 클론들이 lacZ 유전자를 발현시킬 수 있는 능력이 있는지 즉, LAC Z 활성이 있는지 시험되고, 이것은 배양 배지에 X 겔을 첨가함으로써 lacZ 유전자에 의하여 코딩된 효소인 베타-갈락토시다아제(β -galactosidase)에 의해 청색의 생성물을 형성하도록 이화된다. 따라서 청색의 콜로니들이 lacZ 유전자의 활성을 나타내는 것이다. lacZ 유전자의 활성화를 위해서는 형질전환된 클론에서 활성화 형태로 존재하는 GAL4 전사 활성인자 즉, 위의 이종 벡터의 하나에 의하여 코딩된 GAL4 활성 도메인이 다른 혼성 벡터에 의해 코딩된 GAL4 활성 도메인과 적절히 결합되는 것이 필요하다. 그러한 결합은 GAL4 도메인의 각각에 융합된 두 단백질이 서로 안정적으로 상호작용(결합)할 수 있을 경우에만 가능하다. 따라서, 분리된 His⁺및 청색의(LAC Z⁺) 콜로니들이 p55IC를 코딩하는 벡터 및 p55IC에 안정적으로 결합할 수 있는 인간의 HeLa 세포 유래의 단백질 생성물을 코딩하는 벡터와 함께 공동트랜스펙션된 콜로니들이다: 혹은 p75IC를 코딩하는 벡터 및 p75IC에 안정적으로 결합할 수 있는 인간의 HeLa 세포 유래의 단백질 생성물을 코딩하는 벡터와 함께 트랜스펙션된다.

위의 His⁺와 LAC Z⁺효모 콜로니에서 플라스미드 DNA가 분리되고 Leu^-와 엠피실린 저항성 형질전환체의 선택에 의해 따르는 일반적인 방법에 의하여 E.coli 균주 HB101로 일렉트로포레이션(electroporated)되며, 이러한 형질전환체는 AMP^R및 Leu²의 코딩 서열을 모두 가지는 이종 pGAD GH 벡터를 수반하는 것이다. 그러므로 그러한 형질변형체는 p55IC 혹은 p75IC에 결합할 수 있는 새로이 확인된 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 클론들이다. 그 다음에 플라스미드 DNA가 이런 형질전환된 E.cole에서 분리되고 다음과 같이 재분석되었다:

(a) 위의 플라스미드 DNA를 원래의 세포내 도메인 이종 플라스미드(p55IC 서열이나 p75IC 서열을 수반하는 이종 pGTB9)와 함께 위에서 설명한 것과 같이 효모균주 HF7로 다시 형질전환시킨다. 대조군으로는 부적절한 단백질 코딩 서열을 갖는 벡터, 예를 들면, p55IC-결합 단백질 혹은 p75IC-결합 단백질 코딩 플라스미드와 함께 공동형질전환을 위해서 사용되는 pACT-라민(lamin)이나 pGBT9이다. 그리고나서 공동형질전환된 효모는 His^-배지에서만 흑은 3-아미노트리아졸(3-aminotriazole)의 다른 단계로 시험했다; 그리고,

(b) 플라스미드 DNA와 원래의 세포내 도메인 이종 플라스미드 및 (a)에서 설명한 대조군 플라스미드를 균주 SFY526의 효모 숙주 세포에 재형질전환시키고 LAC Z⁺활성을(β -겔 형성의 효율성 즉, 청색 형성.)을 결정하였다.

위 실험 결과 콜로니의 색에 의해 즉, His⁺콜로니 또한 LAC Z⁺처럼 됨으로써 평가되듯이 His^-배지에는 콜로니의 생장 패턴이 LAC Z 활성 패턴과 동일함이 드러났다. 게다가, 액체 배지(선택되어진 배지 조건)에서의 LAC Z 활성은 GAL4 DNA-결합 및 활성-도메인 이종을 HF-7 효모 숙주 세포의 것보다 GAL4 전사 활성인자로 더 나은 LAC Z 유도가능성을 갖는 SFY526 효모 숙주로 트랜스펙션시킨 후에 평가되었다.

위 공동-트랜스펙션의 결과는 아래의 표 1에서 설명된다. 표 1에서는 발견된 다수의 단백질이 p55IC 혹은 p75IC에 결합할 수 있다는 것 즉, 단백질들이 55.11을 나타내었고, 이로써 p55IC에 결합한다는 것이 분명하다. ; 그리고 p75IC에 결합하는 75.3 및 75.16. 이러한 p55IC- 및 p75IC-결합 단백질들 모두는 HeLa 세포 cDNA라이브러리에서 유래하는 cDNA 서열에 의해 모두 코딩되어지는 확실한 인간의 단백질이며, 이는 위 효모 이중 혼성 분석 시스템에서 플라스미드 pGAD GH에 있는 GAL4 활성-도메인 서열과 융합되었다.

흥미롭게도 p55IC의 절편 자체는 이른바, 55.1 및 55.3을 나타내는 단백질들은 p55IC에 결합할 수 있었다. 이러한 것들은 아래의 실시예 2에서도 역시 논의된다.

표 1

이중 혼성 접근법에 의하여 분리된 cDNA 클론(실시예 3참조) 중 일부의 특성개요

위 표1에서 플라스미드와 GAL4 DNA-결합 도메인 및 GAL4 활성화 도메인을 코딩하는 혼성체는 다음과 같다.

DNA-결합 도메인 혼성체:

pGBT9-IC55: p55-TNF-R(p55IC)의 전체 세포내 도메인

pACT-Lamin: 부적절한 단백질 -라민

pGBT9: 벡터 단독

pGBT9-IC75: p75-TNF-R(p75IC)의 전체 세포내 도메인

활성-도메인 혼성체

55.1과 55.3은 p55-TNF-R의 세포내 도메인의 절편과 일치한다.

55.11은 p55-TNF-R와 결합시키는 새로운 단백질이다.

75.3과 75.16은 p75-TNF-R과 결합시키는 새로운 단백질이다.

그 결과 새로운 p55IC-와 p75IC- 결합 단백질, 55.11, 75.3 및 75.16을 코딩하는 위에서 언급한 클론된 cDNA가 일반적인 DNA서열화 방법을 사용하여 서열화되었다. 이런 모든 단백질-코딩 서열들 중 부분적인 서열이 도면 1. a-c에서 설명된다. 그 도면 1.(a)는 단백질 55.11을 코딩하는 cDNA의 부분적인 서열을 묘사한다; 도면 1.(b)는 단백질 75.3을 코딩하는 cDNA의 부분적인 서열을 묘사한다. ; 그리고 도면 1.(c)는 단백질 75.16을 코딩하는 cDNA의 부분적인 서열을 묘사한다. 도면 1.(d)에서는 도면 1(a)의 누클레오티드 서열로부터 추정된 것으로 단백질 55.11의 유추된 서열을 보여주고 있다.

그런데, 55.11 단백질을 코딩하는 cDNA의 부분적인 서열이 사람 뇌의 cDNA 서열의 연구에서 Khan과 그의 동료들(1992)에 의해 보고되었다는 것을 주목해야 한다. 그 연구는 인간 뇌의 cDNAs들의 서열화와 물리적 및 유전적지도만들기(mapping)를 위한 새롭고 신속정확한 방법의 확립을 목적으로 수행되었다. 그러나, Khan과 그의 동료들은 55.11 cDNA 서열에 의하여 코딩되어지는 단백질의 기능 혹은 어떤 다른 특성에 관하여 어떤 정보를 제공하지 못하였고, 그러한 기능적 혹은 다른 분석들은 Khan과 그의 동료들이 그들의 연구에서 목적한 바가 아니었다.

55.11 단백질의 분석 및 특성화

(a) 일반적인 방법 및 재료

(i) 55.11의 cDNA 클로닝

단백질 55.11의 cDNA의 분석에서(예를 들면, 노던 분석(Northern Analysus) -아래를 보시오), 이중혼성 스크린 방법에 의하여 클론된 위에서 언급한 55.11 cDNA가 아미노산 309-900(도면1.(d)를 보시오)을 암호화하는 누클레오티드 925-2863을 갖는 55.11의 부분적인 cDNA에서만 나타난다는 것이 드러났다(도면 1.(a)를 보시오). 55.11 cDNA[아미노산 1-308(도면 1 (d))을 암호화하는 누클레오티드 1-924(도면 1 (a)]의 잔존 부분이 일반적인 방법 즉, 인간 태아의 간 cDNA 라이브러리에서 PCR에 의해 클로닝함으로써 얻어졌다(더 자세한 내용은 아래를 보시오). 55.11의 완전한 누클레오티드 서열은(도면 1 (a)) 다이데옥시 체인 터미네이션(dideoxy chain termination) 방법에 의하여 두 방향으로 결정되었다.

(ii) 이중-혼성 베타-갈락토시다아제(β -galactosidase) 발현 시험

베타-갈락토시다아제 발현 시험은 시험의 어떤 경우에서 pVP16 벡터가 VP16와 활성 도메인을 함유하여 pGAD-GH, Gal4 활성 도메인 벡터 대신에 사용된 것을제외하고는 위에서 묘사한 것처럼 수행되었다. cDNA 삽입부에 의해 코딩된 단백질에서 잔기를 번호매기는 것은 스위스-프랏 데이타 뱅크(Swiss-Prot data bank)에서와 같다. 결실변이가 PCR에 의해, 점돌연변이가 올리고누클레오티드-지배 돌연변이 유발에 의해 생성되었다(Kunkel, 1994).

(iii) 노던 분석(Northern analysis)

모든 RNA가 트라이 리에이전트(TRI REAGENT)(Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Oh., U.S.A.)를 사용해서 분리되었고, 포름알데하이드/포름아마이드 완충제로 변성되었다. 아가로스/포름알데하이드 겔에서 전기영동된 후 일반적인 테크닉을 사용하여 10xSSPE 완충액에 놓인 진스크린 플러스(GeneScreen Plus)막 (Dupont, Wilmington, De., U.S.A.)에 블랏팅되었다. 블랏은 55.11의 부분적인 cDNA로(위 누클레오티드 925-2963을 보시오) 혼성화되었고, 랜덤-프라임 킷(random -prime kit)(Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany)으로 방사성동위원소를 써서 표지되었다. 방사선자동사진법이 1주일 동안 이루어졌다.

(iv) HeLa세포에 있는 55.11 cDNA의 발현 및 p55-IC의 클루타티온 S-전달효소 융합 단백질에 55.11 단백질의 결합

글루타티온 S-전달효소(GST)를 p55-IC와 융합하고(GST-p55IC), 아미노산 345번 밑 부분이 잘린 p55-IC와도 융합한(GST-p55IC345) 후 글루타티온-아가로스 비드(beads)에 아래의 실시예 2에서 설명된 것과 같이(Smith and Corcoran, 1994; Frangioni and Neel, 1993을 또한 보시오) 흡착시켰다. 55.11의 cDNA(1-2863 누클레오티드, 전장 55.11cDNA), FLAG-55.11 및 루시페라아제(luciferase)의 cDNA가HeLa세포에서 발현되었다. FLAG-55.11은 55.11 단백질(원래 이중 혼성 스크린에 의해 클론되어진 부분적인 55.11의 cDNA(누클레오티드 925-2863)에서 FLAG 옥타펩티드에 N이 연결되면서 잔기 309와 900 사이에서 확장한 부분이다(Eastman Kodak, New haven, Ct., U.S.A.). 융합 단백질의 발현은 테트라사이클린-조절 전달활성인자를 발현시키는 HeLa 세포 클론에서 테트라사이클린-조절 발현 벡터(HtTA-1)를 사용하여 실행되었다(아래 실시예 2를 보시오, Gossen and Bujard, 1992). [³⁵S] Met 및 [³⁵S] Cys로 표지된 단백질의 대사적 식별 (Dupont, Wilmington, De., U.S.A. and Amersham, Buckinghamshire, England), HeLa 세포의 용균작용, 면역침강(immuno- precipertion), GST 융합단백질에 표지된 단백질의 결합이 세포 용균 완충제에 Nonidet P-40이 0.1%가 아니라 0.5%인 것을 제외하고는 아래에서 묘사되어진 것(실시예 2)처럼 실시되었다. 55.11 및 FLAG-55.11의 면역침강이 아미노산 309와 900 사이에 확장된 55.11의 부분을 함유하는 GST 융합 단백질에 대해 얻어진 토끼의 항혈청 및 FLAG 옥타펩티드에 대한 쥐의 모노클론 항체(M2; Eastman Kodak; 5 μ g/ml of cell lysate)를 이용하여 수행되었다.

(b) 형질전환된 효모 내에서 p55IV와 55.11 단백질의 결합

이 연구에서는 55.11과 p55IC 사이의 결합의 성질, 특히 이런 결합에 관계되어지는 이러한 단백질 각각의 부위를 확인하기 위해 노력하였다. 이 목적을 위해 "DNA-결합 도메인" 구성물에 있어서의 p55IC의 다양한 전장 및 결실 변이(아래의 실시예 2를 보시오)가 "먹이(preys)"를 결합시키기 위한 "미끼(baits)"로 사용되는데 위 이종-혼성 방법이 이용되며, 이는 벡터 GAL4AD 및 VP16AD에서 "활성 도메인"에 융합된 부분적인 55.11 서열(잔기 309-900, 원래 분리되어지면서)이 있는 구성물에서 코팅된 부분적인 55.11단백질이다. 나아가, 55.11의 다양한 결실변이가 또한 구성되었고, GAL4AD 벡터에 있는 "활성 도메인"에 융합되었다(예를 들면, 단지 잔기 309-680 및 457-900만을 갖는 55.11의 변이). 다양한 '결합 도메인' 구성물의 다양한 '활성 도메인에 구성물과의 결합이 트렌펙션된 SFY526 효모 세포에서 관찰되었다. 그 결합은 이중-혼성 베타-갈락토시다아제 발현 필터 분석법에 의해 분석되었다. 비적절 단백질 SNF1과 SNF4가 각각 '결합 도메인'과 '활성 도메인' 구성물을 위한 양성 대조군을 제공하였다; 비어 있는 Gal4(pGAD-GH)와 VP16(pVP16) 벡터가 '활성 도메인' 구성물에 대한 음성 대조군을 제공하였다. 그리고, 비어 있는 Gal4(pGBT9) 벡터가 '결합 도메인' 구성물을 위한 음성 대조군을 제공하였다. 분석 결과는 기호 "+++"와 "++"가 각각 분석시작 20-60 분 내에 색이 강하게 발생되었음을 의미하고(양성 결과); "-"는 분석 시작 24시간 내에 어떤 색의 발생도 없었음을 의미하는(음성 결과) 것으로 표 2에서 설명된다. 표에서의 여백은 결합 분석방법이 실시되지 않음을 의미한다.

[표 2]

위의 표2에서 나타나는 결과에서 55.11가 p55-IC의 '사멸 도메인' (잔기 328-426)으로 명백한 부위에서 p55-IC에 결합한다고 결론내릴 수 있다.

55.11 단백질이 절단되지 않은 p55-IC보다 더 효율적으로 사멸 도메인이 결실된(표 2에서 구성물 206-328) 절단된 p55-IC에 결합한다. 또한 55.11 단백질은 C 말단쪽으로 한층 더 잘린 구성물(구성물 206-328)과 사멸 도메인 및 막의 인접부 모두가 결실된(구성물 243-328) 구성물에 결합한다. 그러나, 55.11 단백질은 아래로 아미노산 266까지 N-말단이 잘린 구성물에 결합하지 않았다. 이러한 발견은 55.11를 위한 결합 부위가 p55-IC의 잔기 243과 308 사이에 확장된 부분에 위치함을 나타내는 것이다.

55.11의 cDNA를 Gal4 활성 도메인을 함유하는 원래 클론된 '먹이(prey)' 구성물에서 Vp16 활성 도메인을 함유하는 먹이 구성물로의 전달이, 55.11 단백질이 p55-IC에 결합하는 효율을 감소시키지 않았다. 그러므로, 이런 결합에 관계하는 구조가 활성 도메인과 55.11의 융합 부위를 포함시키는 것이 아니라 55.11 분자 내에 존재하는 것 같다.

그러나, 55.11의 p55-IC에의 결합은 55.11의 C말단(55.11 구성물 309-680)이나 N말단(55.11 구성물 457-900)에 55.11 단백질의 한층 더 제한된 절단에 의해서 제거되었다(잔기 309는 이중 혼성 스크린에서 처음에 분리되어진 부분적인 cDNA에 의해 코팅된 55.11 단백질 상의 최초의 잔기이다.).

55.11이 다른 단백질에 결합되지 않기 때문에 55.11과 p55-IC 사이에 관찰되는 결합은 TNF/NGF 수용체 패밀리(p75-R, Fas/APO1 및 CD4)와 라민 및 사이클린 D(보여지지는 않은 자료)와 같은 다른 단백질의 세 수용체를 포함하여 특이한 것처럼 보였다. 시험되어진 다른 TNF/NGF 수용체 단백질 중에 세포내 도메인을 포함하는 것들의 부분이 또한 시험되었음에 주목해야 한다: 인간의 FAS-R(잔기 175-319), CD40(잔기 216-277) 및 p75- TNF-R(잔기 287-461), 55.11과 어떤 것도 결합하지 않는 단백질들(보여지지 않은 자료).

(c) 전장 5.11 cDNAD의 탐침 및 클로닝으로서 55.11 cDNA를 이용하는 몇몇 세포계통에서의 RNA에 대한 노던 분석

관찰된 세포계통은 인간의 상피 악성종양, 급성 림포블라스틱 T 세포 백혈병, 급성 T 세포 백혈병 및 간세포 악성종양에서 각각 얻은 HeLA, CEM, Jurkat 및 HepG2 세포이다. 원래 분리된 55.11 cDNA(누클레오티드 925-2863)는 탐침으로 사용된다. 시료는 한 레인(lane) 당 10μ g의 RNA로 구성되었다. 노던 분석의 결과는 도면 2에서 보여지며 이는 노던 블랏의 생성물이다.

도면 2에서 탐침으로 55.11 cDNA를 사용한 노던 분석은 몇몇의 세포계통에서 약 3kB의 단일 혼성 전사체임이 드러났으며, 이는 처음에 분리된 55.11 cDNA의 cDNA(2kB)보다 더 큰 것이다. 55.11 서열에 일치하는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여, 본 발명자는 PCR에 의해 약 1kB 길이의 5' 확장 서열을 클로닝하였다. 원래의 클로닝된 cDNA의 것과 이 5' 확장 서열의 총 길이는 55.11 전사체의 길이와 비슷하다. 이러한 두 부분을 포함하는 3kB cDNA가 약 84 kDa의 단백질을 생성하는 트랜스펙션된 HeLa 세포에서 효율적으로 발현되며(아래를 보시오), 이는 3 kB cDNA가 번역 시작 부위(translational start site)를 함유하고 있음을 암시한다.

(d) 생체 내에서 55.11 단백질과 p55-IC의 일부를 포함하는 GST-융합 단백질의 결합

55.11 이 p55-IC 에 확실히 결합할 수 있는지를 확인하고 이런 결합에 효모 단백질의 관여를 배제하기 위하여 3kB 55.11 cDNA(55.11-full)에 의해 코딩되는 단백질과 같이 박테리아에 의해 생성되고, 트랜스펙션된 HeLa 세포에 의해 생성된 GST p55-IC 융합 단백질의 생체 내 상호작용이 관찰되었다. 이런 연구에서 전장 55.11, FLAG-55.11(처음에 클론되어진 부분적인 cDNA에 의해 코팅되고 FLAG 옥타펩티드로 N 말단에 융합된 55.11의 잔기 309-900) 및 루시페라아제(대조군)에 대한 cDNA가 트랜스펙션된 HeLa 세포에서 발현되었고 대사적으로 [³⁵S] Met과 [³⁵S] Cys로 표지되어졌다. 따르는 단백질들이 GST와 융합되었다: 전장 p55-IC (GST-p55-IC)와 '사멸 도메인'의 대부분을 제거하기 위해서 아미노산 345 위 쪽으로 C-말단 부분을 절단한 p55-IC(GST-p55-IC345)(표2를 보시오). GST만을 대조군으로 제공했다. 전장 55.11 단백질이 GST-융합 단백질에 결합하기 위하여 사용될 때 55.11 단백질에 대한 항체, 혹은 FLAS-55.11 융합 산물이 GST-융합 단백질에 결합하기 위해 사용되어질 때 FLAG 옥타펩티드에 대한 항체로 트랜스펙션된 세포의 용균액이 면역 침강되었다. 그 단백질들은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(Polyacryl-amide gel electrophoresis)(SDS-PAGE: 10% 아크릴아마이드)에 의해 분석되었고, 다음에 방사선자동사진법에 의해 분석되었다.

도면 3A와 B에서는 위 SDS-PAGE 겔의 자동방사선상의 리프로덕션을 나타내고있다. 도면 3A는 전장 55.11 단백질(55.11-full)과 다양한 GST-융합 단백질의 결합이 묘사된다; 그리고 도면 3B에서는 Flag-55.11 융합 생성물과 다양한 GST- 융합 단백질의 결합을 묘사한다. 도면 3A에서는 전장 55.11만으로 트랜스펙션되고 항-55.11 항체로 면역침강된 세포의 용균액의 대조 면역침강물(a 55.11 Abs)을 가장 오른쪽 레인에서 보여주고 있다. 도면 3B에는 FLAG-55.11만으로 트랜스펙션되어지고 항-FLAG 항체로 면역침강된 세포의 용균액의 대조 면역침강물(α FLAG Abs)을 가장 오른쪽 레인에서 나타낸다.

따라서, 전장 55.11 cDNA에 의해 코딩되어진 단백질이 HeLa 세포에서 발현될 수 있고, 그 단백질이 전장 p55-IC (GST-p55IC) 혹은 사멸 도메인의 대부분이 결여된 절단 p55-IC (GST-p55IC345)(도면 3A)를 포함하고 있는 융합 단백질에 결합한다는 것이 도면 3A와 B에서 명확해진다. 전장 55.11 단백질이 GST(대조군)에만은 결합하지 않았다. 유사하게 FLAG 옥타펩티드와 융합하여 처음에 클론된 55.11의 부분적인 cDNA에 의해 코딩되어진 HeLa 세포-발현 단백질(FLAG-55.11)은 생체 내에서 GST가 아니라 GST-p55IC 및 GST-p55IC345와 결합하였다. 그러므로 위 결과는 55.11이 사멸 도메인의 p55IC 상류 부위 즉, 막간 도메인에 더 인접한 p55-IC 부위에 결합한다는 부가적인 증거를 제공한다(위의 (b)를 보시오).

더욱이, 위 연구는 본 발명과 일치하여 55.11에 대한 항체가 성공적으로 생성되었음을 또한 증명한다(도면 3A).

(e) 인간 55.11의 추정된 아미노산 서열과 하등 생물체에 존재하는 관련 단백질 서열 비교 및 55.11 단백질의 서열 특성

위에 언급한 것처럼, 본 발명과 일치하여 전장 55.11 cDNA가 클론되어지고 서열화되었으며 (도면 1(a)의 뉴클레오타이드 서열을 보시오), 55.11의 전 아미노산 서열이 cDNA 서열에서 추정되었다(도면 1(d)의 아미노산 서열을 보시오). 데이타 뱅크 (Data bank)(GenBank TM/EMBL DataBank)의 조사는 cDNA 라이브러리를 임의로 서열화하는 동안 인간의 55.11 cDNA의 서열의 일부(수납 번호 T03659, Z19559, 및 F09128)와 쥐의 상동물(수납 번호 X80442 및 Z31147)이 이미 결정되었음을 드러내었다. 인간의 간종양 HC10 세포의 배양액에 존재하는 596개의 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하는 한 cDNA 서열(수납 번호 U18247)이 55.11의 것과 유사하다. 그러나, 이 간종양 단백질은 55.11의 것에 상응하는 N 말단 부분(아미노산 1-297)이 결여되어 있고, 또한, 55.11에 있는 잔기 297-377 및 잔기 648-668에 상응하는 부위에서 55.11과 다르다. 데이타 뱅크(data bank)의 조사는 또한 55.11과 고도로 서열의 상동성을 갖는 단백질이 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)(효모), 아랍트돕시스 탈리아나(Arabtdopsis thaliana)(식물) 및 캐노합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)(선충류)에 존재함을 나타내었다. 따라서, 55.11은 진화적으로 보존된 기능을 수행하는 것 같다. 효모에서는 55.11의 것과 유사한 DNA 서열을 갖는 알려진 두 종류의 단백질(오픈 판독 구조(open reading frame) YHR027c 및 SEN3)이 있다. 두 단백질의 크기는 55.11의 것과 유사하다. SEN3가 cDNA로 클론되는 반면, YHR027c는 단지 게노믹(genomic) 클론의 서열화에 의해서만 알려진다. 55.11과 SEN3 사이 보다 55.11과 YHR027c 사이가 훨씬 더 유사함이 명백하지만, SEN3의 부위와 유사한 55.11 내의 부위는 YHR027c에 대해 55.11이 갖는 유사성의 부위와 서로 관련되어 있다.Arabitdopsis thaliana와Caenorhabditis elegans의 단백질에 이용되는 DNA 서열 정보는 비록 부분적이기는 하지만, 이러한 단백질들이 효모의 YHR027c 단백질과 마찬가지로 55.11과 유사하다는 것을 명확하게 보여준다. 지금까지 성질이 밝혀진 이런 네 단백질 중 단 하나만이 55.11에 대한 상동성이 제한적인 것으로 효모 SEN3이다. SEN3는 20S 프로테아솜(proteasome)의 활성인자의 p112 소단위체에 대응하는 효모의 단백질인 것으로 확인되었다(26S 프로테아솜의 단백질 가수분해 코어[Rechsteiner et al., 1993, DeMartino et al., 1994]) (M.R Culbertson and M. Hockstrasser, personal communication).

도 4에서는 인간의 55.11의 추정된 아미노산 서열을 위에서 언급한 하등 생물체에 존재하는 관련된 단백질의 것과 도식적으로 비교하여 보여주고 있다. 도면 4에서 비교되어지는 서열은 다음에 관해 예측되는 아미노산의 서열이다: 55.11 cDNA(도면 1(d)를 보시오);Saccharomyces cerevisiae의 8번째 염색체에서 기인하는 코스미드(cosmid) 내의 오픈 판독 구조(YHR027c)(뉴클레타이드 21253-24234, 수납 번호 U103 99);Saccharomyce cerevisiae단백질의 cDNA 인 SEN3(수납 번호 L06321); 식물Arabtdopsis thaliana단백질의 부분적인 cDNA(수납 번호 T21500) 및 선충류Caenorhabditis elegans단백질의 부분적인 cDNA(수납 번호 D27396). 55.11에 있어 'KE KE' 서열은 실선으로, AYAGS(x)₈LL 서열은 점선으로 표시된다. 서열들은 GCG 패키지의 파일엎(PILEUP) 및 프리티박스(PRETTYBOX) 프로그램을 사용하여 정렬되었다. 정렬을 극대화하기 위하여 도입되어진 공백은 대시(dashes)에 의해 나타내진다.

인간 55.11의 서열에서 존재하는 다양한 서열의 특징 혹은 모티프에 관하여는 다음과 같이 관찰되었다: 보존된 아미노산 서열 모티프는 Lys 614 및 Glu 632 사이에 확장된 반복적 'KEKE' 서열(도면 4에서 언더라인 됨)을 제외하고는 55.11에 의해 코팅된 단백질 내에서는 식별되지 않았다. 그러한 'KEKE' 서열은 프로테아서널(proteasonal) 소단위체 및 쉐퍼로닌(chaperonins)을 포함하는 많은 단백질에 존재하며, 단백질 복합체들의 결합을 촉진시킨다(Realini et al., 1994). 어떤 AYAGS(x)₈LL 서열은 55.11 단백질에서 두 배를 나타낸다(부위 479 590에서, 도면 4를 보시오); 이런 서열에 관련한 어떤 기능적 중요성은 아직 설명되지 않았다.

(f) 55.11 단백질과 결합하는 데 관여하는 p55IC 부위의 서열 특징들

위에서 설명한 것처럼((b)와 (d)를 보시오), 55.11 단백질은 잔기 243 및 308 사이의 p55-IC 부위에 결합하고(이 결합 부위의 N 말단은 잔기 243 및 266 사이에 존재함), 이 부위는 '사멸 도메인'의 상류에 존재하며 p55-TNF-R의 막간 도메인에 더 인접해 있다. 55.11가 결합하는 p55-IC 내의 이런 부위는 프롤린(proline), 세린(serine) 및 트레오닌(threonine) 잔기의 상당량을 갖는다. 그러나, 이 부위는 몇몇 다른 사이토카인(cytokine) 수용체들에서 존재하는 RPM1 및 RPM2의 프롤린-풍부(proline-rich) 모티브를 포함하지는 않는다(O'Neal and Yu-Lee, 1993). 잔기 243 및 266 사이의 확장된 부위에서는 결실이 p55-R을 55.11에결합하지 못하도록 하며(위 (b)와 (d) 및 표 2를 보시오), 세린 두 잔기와 트레오닌 두 잔기 다음에 프롤린이 배열되어 있어, MAP 키나아제(kinase), CDC2와 다른 프롤린-의존 키나아제에 의해 인산화를 위한 퍼텐셜 부위(potential sites)를 만든다(Seger and Krebs, 1995). 수용체들에 있는 이러한 부위의 인산화는 55.11 단백질과 결합하는 것에 영향을 미칠지도 모른다.

단백질 55.11 및 55.11의 p55IC와의 결합에 관련해서 앞서 언급했던 것들 모두를 고려하여 보면, 본 발명과 일치하여 p55-IC의 '사멸 도메인'의 상류에 있는 분명한 부위에 결합하는 새로운 단백질이 발견되었다고 결론내릴 수 있다. 그러한 결합은 세포사멸의 유도 이외의 다른 TNF-중재 활성에 영향을 미칠 수도 있다. 55.11이 결합하는 부위는 나이트릭 옥사이드 합성효소(nitric oxide synthase)의 유도에 관여하는 것으로 보이며(Tartaglia et al., 1993), TNF에 의한 중성의 스핑고미엘리네이즈(neutral sphingomyelinase)의 활성에 관계되는 것 같다(Wiegmann et al., 1994). 그러므로 55.11과 p55-TNF-R의 세포내 도메인(p55IC)과의 결합이 다음에 영향을 미치거나 관계될 수 있다: (i) 위에 언급된 것들 및 다른 TNF 효과를 위한 신호전달, (ii) 단백질의 폴딩 혹은 프로세싱(folding or processing)(55.11과 26S 프로테아솜의 소단위체의 유사성에 의해 제시되었던 것처럼), 혹은 (iii) p55-TNF-R의 활성 혹은 발현의 조절.

실시예 2

p55 TNF 수용체의 세포내 도메인(p55IC)의 자기-결합 능력 및 세포 사멸과 다른 특징 그리고 활성화를 야기할 수 있는 능력 및 관련된 Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인

위의 실시예 1에서 설명된 것처럼 p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55IC)이 그 자신에 결합할 수 있고, 나아가 p55IC의 절편, 즉 단백질 55.1과 55.3이 p55IC에 또한 결합할 수 있다는 사실이 발견되었다. TNF와 p55 TNF-R의 결합이 이러한 수용체를 수반하는 세포에서 세포사멸 효과(cytocidal effet)를 유도함이 알려졌다. 나아가, 이러한 수용체의 세포외 도메인에 대한 항체가 이들 항체에 의해 교차-결합된(cross-linking) 수용체의 효율성과 관련하여 스스로 이러한 효과를 일으킬 수 있다.

게다가 변이연구들은(Tartaglia et al., (1993); Brakebrusch et al., (1992)) p55-R의 기능에 그것의 세포내 도메인의 보전도(integrity)에 의존함을 보여준다. 그러므로 TNF의 세포사멸 효과의 신호전달 개시는 p55-R(p55-IC)의 두 종류 혹은 그 이상의 세포내 도메인의 결합의 결과로 발생하며, 수용체 집단에 의해 부과되어진다는 것이 제안되어졌다. 본 발명과 일치하여 그 결과는 막간 혹은 세포내 도메인 없이 세포 안에서 p55-R의 세포내 도메인이 발현되어 세포 사멸을 일으킨다는 것을 보여주면서 이런 견해에 대한 그 이상의 증거를 제공한다. 그러한 p55-R의 자유로운 세포내 도메인들이 자기 결합하는 것이 보여지는데, 이는 아마도 TNF와 독립적으로 작용할 수 있는 능력을 설명하는 것 같다. 전장 p55-R에 의한 신호전달이 TNF 자극에 의존한다는 사실이 이러한 자기 결합을 감소시키거나 방해하는 수용체의 막간 혹은 세포외 도메인의 활성을 반영하기 위해 제안되어진다.

자기 결합하는 p55-R의 세포내 도메인(p55IC)의 능력은 이러한 수용체와 상호작용하는 작동체(effector) 단백질을 클론하기 위한 시도에서(실시예 1을 보시오) 뜻하지 않게 발견되어졌다. 본 발명자들은 그 목적을 위하여 위에서 언급했던 "이중-혼성" 테크닉을 사용하였다. 새로운 단백질 외에도 55.11이 p55IC에 결합하는 것이 발견되어졌고, 또한 다른 세 종류의 클론되어진 HeLa 세포 cDNA가 p55-IC가 자기-결합할 수 있음을 의미하는 p55-R의 세포내 도메인의 부분들을 코팅하는 cDNA 서열들을 함유하였음을 발견하였다. 이러한 클론들 중 2 종류는 아미노산 328-426을 코딩하는 삽입부를 포함하는 것으로 동일하였다(p55-IC의 단백질 절편을 코딩하는 클론 55.1로 불려진다). 세번째 클론은 아미노산 277-426을 코딩하는 더 긴 삽입부를 함유한다(p55IC의 단백질 절편 55.3을 코딩하는 클론 55.3으로 불린다).

게다가 본 발명자들은 박테리아에서 생성되어진 두 p55IC의 키메라 사이의 시험관내 상호작용을 분석하였는데, 여기서 하나는 말토오스 결합 단백질(MBP)과 다른 하나는 클루타티온-S-전달효소(glutathione-S-transferase, GST)와 융합되어 졌다. 이러한 키메라들은 일반적인 방법에 의해 구성 및 클론되어졌으며 발현되어 졌다. 키메라들의 발현에 이어, 위 박테리아에서 생성된 키메릭 단백질 GST-IC55(Mr - 51kD)과 MBP- IC55 (Mr - 67kD)간의 상호작용을 결정함으로써 p55-R 세포내 도메인(p55IC)의 자기-상호작용을 평가하였다. 동량의 GST-IC55 키메라(도면 5에서 레인1-4의 시료들) 혹은 GST만이(도면 5에서 표본 5-8의 시료들) 글루타티온-아가로스 비드(Sigma)에 결합되어졌고, 다음의 완충 용액 중 하나에서 동량의 MBP-IC55 융합 단백질과 같이 배양되어졌다.

(i) 완충액 I ( 20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 7.5, 100mM 염화칼륨(KCl), 2mM 염화칼슘(CaCl2), 5mM DTT, 0.2% 트리톤(Triton) X100, 0.5mM PMSF, 5% 글라이세롤(Glycerol)). 이 완충액은 도면 5의 레인 1과 5의 시료에 사용되어졌다.

(ii) 염화마그네슘 대신 6mM EDTA를 함유한 완충액 I. 이것은 도면 5의 레인 2와 6의 시료에 사용되어졌다.

(iii) 100mM 염화칼륨 대신 250mM을 함유한 완충액 I. 이것은 도면 5의 레인 3과 7의 시표에 사용되어졌다.

(iv) 100mM 염화칼륨 대신 400mM을 함유한 완충액 I. 이것은 도면 5의 레인 4과 8의 시료에 사용되어졌다.

4℃에서 2시간 동안 회전시키면서 배양한 후 비드를 동일한 완충액으로 씻고 SDS-PAGE 완충액에서 끓이고 나서 PAGE에서 전기영동시켰다. 그리고서 겔 위의 단백질들이 MBP에 대한 폴리클로날(polyclonal) 항혈청으로 염색되어진 나이트로셀룰로스 막에 웨스턴 블랏팅되어졌다. 이렇게 염색된 웨스턴 블랏의 리프로덕션이 위에서 언급된 레인 1-8의 시료로 도면 5에서 보여진다.

도면 5에서 p55IC-MBP 키메라가 p55IC-GST 키메라(레인 1-4)와 2가 양이온과 무관하고 오히려 더 높은 염 농도에서(0.4M 염화칼륨)조차 결합한다는 것이 명확해진다. 그러므로 p55IC가 강하게 자기-결합(self-associate)할 수 있다고 결론내려진다.

자기-결합하는 p55IC의 성질의 기능적 관계를 평가하기 위해, 본 발명자들은 세포를 죽이는 TNF의 효과에 민감한 세포들의 세포질 내에서, p55-IC를 발현시키려고 하였다. p55-IC가 세포독성으로 되는 가능성을 고려하면서 본 발명자들은 최근에 개발되어지고 단단히 조절된 테트라사이클린-조절 포유류 발현 시스템을(Gossen and Boujard, 1992)를 사용하여 유도방식으로 p55IC를 발현시키기로 결정하였다. p55-IC의 발현은 다량의 세포 사멸을 초래하였다(도면 6, 오른쪽 패널). 사멸되고 있는 세포들이 TNF에 의해 세포의 죽음에서 관찰되어지는 것처럼 세포 표면의 블래빙(blabbing)을 드러내었다. p55-IC의 트랜스펙션이 테트라사이클린이 존재하는 세포에 구성되어서, 비록 테트라사이클린의 부존재 하에서 관찰되어지는 것보다는 상당히 덜 하지만 어떤 세포의 사멸에서 여전히 일어나는 10⁵배만큼 많은 폴드(fold)에 의해 조절되어지는 pHD10-3 구조물의 발현을 감소시킨다고 전해진다(도면 6, 왼쪽 패널). 반대로 루시퍼레이즈 cDNA를 포함하며 대조 구성물로 트랜스펙션되어진 세포는 사멸의 징후를 보이지 않았다(결과는 보여지지 않음).

수용체가 막간 혹은 세포외 도메인 없이 발현되어질 때, 세포 사멸을 일으키는 p55-IC의 능력은 신호전달에서 이러한 도메인의 관여에 대한 더 한층의 증거를 제공한다. 더군다나 그것은 수용체에서 어떤 부분도 그런 신호전달에 직접적인 역할을 하지 않음을 나타낸다. p55-IC의 기능에 있어 본 발명에서 연구되어지는 그러한 변이를 포함하여 변이의 효과에 대한 연구는 아미노산 잔기 326-407 사이에 확장되는 부위가 p55-IC의 기능에 가장 중요하다는 것을 나타낸다. 이런 부위는 p55 TNF-R-에 진화적으로 관련되어진 두 개의 다른 수용체들 즉, 세포 사멸에 대해 신호 또한 전달해줄 수 있는 Fas 수용체(Itoh et al., 1989) 및 세포 생장을 증진시키는 CD40-a 수용체(Stamenkovic et al., 1989)의 세포내 도메인 내에서 서열에 특정적인 유사성을 보여준다: 따라서 이러한 서열을 신호전달에 있어 일반적인 어떤 종류의 역할을 수행하는 보존적 모티프를 구성하는 것 같다. 이는 효소 활성의 알려진 모티프들의 특징과 유사하지 않기 때문에, 간접적인 방식 즉, 아마도 자극신호를 전해주는 신호전달 효소 혹은 단백질들을 위한 도킹 부위(docking site)의 역할을 하는 식으로 신호전달한다고 하는 것이 그럴 듯 하다. p55-IC, Fas 수용체 및 CD40는 모두 세포외 도메인에 대한 항체들에 의해 자극되어질 수 있다. 이러한 자극은 수용체와 교차-결합하는 항체의 능력과 상관관계가 있다고 보여질 수 있다. 따라서, 신호전달은 세포외 도메인의 집합에 의해 부여되어지는 둘 혹은 그 이상의 세포내 도메인의 상호작용의 결과로서 시작되어지는 것 같다. 이런 수용체들의 신호전달의 개시에 있어 그러한 상호작용의 관여는 수용체의 세포내 도메인의 변이에 의해 비기능적으로 되어진 수용체들의 발현이 동시-발현된 정상 수용체들의 기능에 있어 "우성 음성" 효과를 갖고 있음을 보여주는 연구(Brakebusch et al., 1992)에 의해 나타난다. TNF에 대한 반응에 있어 p55-R의 결합은 단지 TNF 분자의 각각이 호모 삼합체(homotrimers)로 나타나며, 둘 혹은 세 종류의 수용체 분자들과 결합할 수 있다는 사실에 기인하여 수동적인 방법으로 일어난다고 제안되어졌다. 그러나, 본발명의 발견은 이런 과정이 다소 다르게 발생함을 제안한다.

p55-IC가 자기 결합하려는 성질은 이 도메인이 유도되어지는 결합에 있어 활발한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 게다가, 수용체 분자의 나머지와 무관하게 발현되어질 때 TNF의 부존재 하에서 흑은 어떤 다른 외부 자극으로 세포 사멸을 일으킬 수 있기 때문에, 이런 p55-IC의 활성화는 p55-IC의 신호전달을 시작하는 데 충분한 것 같다. 그럼에도 불구하고, 전장 수용체로 발현되어질 때, 만일 TNF에 의해 자극되어지지 않는다면 p55 -TNF-R은 신호전달을 하지 않는다. 따라서, p55-TNF-R를 활성화시킬 때, TNF가 어떤 방해 기구를 실제로 극복하며, 세포내 도메인의 자발적인 결합을 방해하고 이런 방해는 p55-IC와 수용체 분자의 나머지 부분과의 연결에 기인하는 것이라고 가정해야만 한다. 이런 방해는 막간 및 세포외 도메인에 의해 세포내 도메인에 부여되어지는 오리엔테이션(orientation) 및 수용체와 어떤 다른 단백질의 결합이나 어쩌면 원형질막에 놓여지도록 되어 있는 동량의 수용체들의 제한에만 기인하는 것인지도 모른다. 기록으로는 어떤 의견에 따르면 한 세포에 단지 한 TNF 분자가 결합하는 것으로도 세포의 사멸을 일으키는 데 충분하기 때문에 이러한 조절 기구는 훨씬 효율적이야 한다.

리간드와 무관한 자발적인 신호전달은 이러한 수용체에 의해 조절되어지는 과정의 광범위한 혼란을 초래할 수 있다. 가장 잘 알려진 예가 생장 인자 수용체들의 조절 을 하지 않는 것이다. 그들이 자발적으로 신호전달을 하도록 하는 변이들 예컨데, 그들을 자발적으로 결합하게 하는 변이들은 종양 세포들이 생장을 조절하지 못하도록 하는데 중요한 작용을 한다. 과도하게 유도되어질 때, THF의 효과가 많은 질병의 병리 상태에 기인하는 것으로 잘 알려져 있다. TNF와 무관하게 신호를 전달하기 위한 p55-TNF-R의 자유로운 세포내 도메인(p55IC)의 능력이 그런 과도한 기능에 아마도 기여할 수 있을 것이다. 예를 들면, 바이러스와 다른 병원체가 세포에 질병을 일으키는 효과는 직접적인 세포사멸적 기능에서가 아니라 p55-TNF-R의세포내 도메인의 단백질 가수분해적 분리 및 그 결과인 TNF-같은 세포독성 효과에서 기인할 가능성이 있는 것 같다.

자기-결합 가능성에 책임이 있는 p55IC 내의 부위 및 그로 인한 p55IC의 리간드-비독립적 세포의 세포독성을 더 설명하기 위해서 그리고, TNF/NGF 수용체 패밀리와 관련되는 다른 구성요소들이 세포내 자기-결합 가능성 및 리간드-비독립적 효과를 지닌 세포내 도메인을 또한 갖는지를 결정하기 위해 따르는 상세한 연구가 수행되어졌다.

(a) 일반적인 실험방법과 재료

(i) 이중 혼성 스크린 및 이중-혼성 베타-갈락토시다아제 발현 시험

p55IC 및 p55IC의 결실 변이들을 코딩하는 cDNA 삽입부들, Fas-IC 및 다양한 다른 단백질들(표 3을 보시오)이 PCR에 의해 본 실험실에서 이미 클론되어진 전장 cDNA나 구입한 cDNA 라이브러리에서 클론되어졌다. pGBT-9와 pGAD-GH 벡터에 있는 이러한 cDNA로(각각, DNA 결합 도메인(DBD)과 활성 도메인(AD) 구성물) 형질전환되어진 효모(SFY526 리포터 균주(Bartel et al., 1993))에서의 베타-갈락토시다아제 발현이 액체 시험(liquid test)(Guarente,1983)에 의해 분석되어졌다; 그것은 또한 필터 분석법에 의해 평가되어졌는데, 질적으로 동일한 결과를 초래하였다(보여지지 않음). 구입한 Gal4 AD-표지되어 있는, p55-R의 세포내 도메인(p55-IC)에 결합하는 단백질에 대한 HeLa 세포의 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, Ca., U.S.A.)의 이중-혼성 스크리닝(Fields and song, 1989)이 생산자의 추천에 따라HF7c효모 리포터 균주를 이용하여 수행되어졌다. 분리된 클론들이 확실한지는 (a) 5mM 3-아미노트리아졸(aminotriazole)의 존재하에 생장할 때 히스티딘에 대한 형질전환된 효모의 유기영양법(prototrophy), (b) 베타-갈락토시다아제 발현, (c) 특이성 시험(Gal4 DBD와 융합된 SNF4와 라민의 상호작용)에 의해 평가되어졌다.

(ii) 박테리아에서 생성되어진 p55-IC 융합 단백질들의 실험관 내 자기-결합

글루타티온 S-전달효소(GST)와 글루타티온 S-전달효소-p55-IC 융합 단백질(GST-p55-IC)이 다른 데서 설명되어진 것처럼(Frangioni and Neel, 1993; Ausubel et al., 1994) 생성되어졌다. 말토오스 결합 단백질(MBP) 융합 단백질이 pMalcR I 벡터(New England Biolabs)를 사용하여 생성되어졌고, 아밀로오스 레신 칼람(amylose resin column)에 의해 정제되어졌다. MBPP와 GST 융합 단백질의 상호작용이 GST와 MBPP의 융합 단백질을 차례로 글루타티온-아가로스 비드에서 배양함으로써 수행되어졌다(20μg 비드(bead) 당 5μ g의 단백질; 첫 배양은 15분 동안, 그리고 두 번째는 2시간 동안, 양자 모두 4℃). MBP 융합 단백질의 배양은 20 mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 7.5, 100mM 염화칼륨, 2mM 염화칼슘, 2mM 염화마그네슘, 5mM 디티오트레이톨(dithiotreitol), 0.2% 트리톤 X100, 0.5mM 페닐-메틸-설포닐-플루오라이드(phenyl- methyl-sulphonyl-fluoride)와 5%(v/v) 글라이세롤(glycerol), 혹은 지시되어질 때는 마그네슘 대신에 0.4 M 염화칼륨을 함유하거나 5mM EDTA를 함유한 완충액에서 수행되어진다. MBP 융합 단백질의 결합은 글루타티온-아가로스 비드와 결합되어진 단백질의 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(10% 아크릴아마이드)에 의해, 이어서 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되어진다. 블랏은 MBP에 대한 토끼의 항혈청(본 실험실에서 생성되어진) 및 양고추냉이-과산화효소-연결되어진(horseradish-peroxidase-linked) 염소-항-토끼 면역글로블린(goat-anti-rabbit-immunoglobulin)으로 검사되어진다.

(iii) p55-R 및 그 절편의 HeLa 세포에서의 유도된 발현

Grossen과 Bujard에 의해 생성되어진 테트라사이클린-조절 트랜스활성인자를 발현시키는 HeLa 세포(the HtTA-1 clone (Gossen and Bujard, 1992))가 10% 태아 송아지의 혈청(fetal calf serum), 100 u/ml 페니실린(penicillin), 100μ g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)과 0.5 mg/ml 네오마이신(neomycin)을 함유한 Dulbecco의 변형된 이글배지(Eagle's medium)에서 생장되어진다. p55-R 혹은 그 부분들을 코딩하는 cDNA 삽입부가 테트라사이클린-조절 발현 벡터(pUHD 10-3, H.Bujard에 의해 적절히 제공되어진)에 끼워 넣어진다. 세포들이 인산칼슘 침강법(Ausubel et al., 1994)에 의해 발현 구성물(6 cm의 플레이트(plate) 당 5μ g DNA)로 트랜스펙션되어진다. 트랜스펙션되어진 단백질의 일시적인 발현 효과는 테트라사이클린의 존재 혹은 부존재 시에(1μ g/ml) 트랜스펙션시킨 후 지시한 횟수대로 분석되어졌다. pUHD 10-3 벡터에서 인간 p55-IC cDNA로 안정적으로 트랜스펙션되어진 세포들의 클론이 cDNA를 하이그로마이신(hygromycin)에 저항성이 부여된 플라스미스와 함께 테트라사이클린이 존재하는 HtTA-1 세포로 트랜스펙션시킴으로써 만들어졌고, 이어서 하이그로마이신(200 μg/ml)에 저항성을 갖는 클론이 선택되어졌다. 세포 생장배지에 계속 존재하던 테트라사이클린을 제거함으로써 cDNA가 발현되었다.

(iv) p55-R 및 그 절편의 유도된 발현에 의하여 일어나는 TNF-같은 효과들의 분석

세포의 생존능력에 있어 수용체 및 TNF의 유도된 효과가 뉴트랄-레드 업테이크 법(neutral-red uptake method)(Wallach, 1984)에 의해 분석되어졌다. IL-8 유전자의 발현 유도는 노던 분석법에 의해 평가되어졌다. 일반적인 테크닉을 사용하여 RNA가 트라이 리에이전트(TRI REAGENT)(Molecular Research Center, Inc.)를 이용하여 분리되어졌고, 포름알데하이드/포름아마이드 완충액으로 변성되어졌으며, 아가로스/포름알데하이드 겔에서 전기영동되어지고, 10xSSPE 완충액에서 진스크린 플러스(GeneScreen Plus) 막(Du Pont)에 블랏팅되어졌다. 필터가 IL-8 cDNA 탐침(Matsushima et al., 1988), 누클레오티드 1-392)으로 혼성화되어쳤고, 랜덤-프라임 킷(random-prime kit)(Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany)에 의해 방사성 동위원소로 표지되어졌으며 제조자의 프로토콜에 따라 철저히 씻어졌다. 방사선자동사진법이 1-2일 동안 수행되어졌다.

(v) TNF 수용체 발현의 분석

1×10⁶개의 세포들의 시료에서 TNF 수용체 발현이 TNF의 결합을 측정함으로 분석되어졌고, 이미 설명했던 것처럼 클로라마인-T 방법(chloramine-T method)에 의해¹²⁵I로 표지되어졌다(Hotmann and Wallaxh, 1987). 그것은 또한 ELISA에 의해 분석되어졌고, 세포(60μ g/10⁶cells)를 용해시키고, 시험되어진 시료들을 희석시키기 위하여 RIPA 완충액(10mM 트리스-염산, pH 7.5, 150 mM 염화나트륨(Nacl), 1% NP-40, 1% 디옥시콜레이트(deoxycholate), 0.1% SDS와 1mM EDTA)의 사용을 제외하고는 수용성 TNF 수용체들의 측량(quantification)을 위해 설명되어졌던것처럼(Aderka et al., 1991) 수행되어졌다. 요소에서 정제되어진 이 p55-R의 수용성 형태를 기준으로 하였다.

(b) p55-IC의 자기-결합에 관여하는 p55-IC의 부위를 결정하기 위한 p55-R의 세포내 도메인(p55-IC)의 변이 분석

위에서 언급한 것처럼 p55-IC는 세포에서 자기-결합할 수 있고 세포독성 효과를 일으킬 수 있으며, p55-IC의 부분들이 있어 스스로 전장 p55-IC에 결합할 수 있다. 특별히 p55-IC 부분 중의 하나는(위의 실시예 1에서 단백질 절편 55.1로 불림) 전장 p55-IC에 강하게 결합할 수 있다는 것이 확인되어졌고, 이 부분은 서열화되어졌으며, p55-IC 내에 있는 p55-TNF-R의 아미노산 잔기 327-426을 함유하는 것으로 관찰되어졌다. 나아가 이 부분, 단백질 절편 55.1이 그 자체로 세포에서 자기-결합 및 세포독성 효과를 일으킬 수 있다는 사실이 발견되어겼다(아래를 보시오). 그러므로 p55-IC의 이 부분이 '사멸 도메인'이라 불려지고, 인간의 p55-R의 아미노산 잔기 328-426 사이의 부위에 위치하며, 그 중 대략 잔기 328과 414 사이의 아미노산 잔기로 주로 구성된다.

p55-IC에 있는 '사멸 도메인'이 자기-결합한다는 사실이 우연히 발견되어졌다. 이런 수용체의 세포내 도메인에 결합하는 단백질에 대한 이중-혼성 테크닉(위의 실시예 1을 보시오)에 의한 HeLa 세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝하면서 본 발명자들은 세포내 도메인-GAL4 DBD 융합-단백질에 특이하게 결합하는 산물의 cDNA 중에서 그 자체로 p55-R 세포내 도메인의 부분을(p55-IC; 표3에서 별표로 표시되어진) 코딩하는 몇몇 클론들을 발견하였다.

p55-IC의 자기-결합에서 특이성의 정도를 구하고 관여하는 부위를 더 정확히 밝히기 위하여 한 이중-혼성 시험은 다음과 같은 발견을 하게 했다(표 3): (a) p55-IC의 자기-결합이 '사멸 도메인' 내에 있는 부위에 제한되어진다. 그것의 N 말단은 잔기 328-344 사이에 위치하며, C 말단은 이 도메인의 보고된 C 말단의 다소 상류(잔기 414)인 잔기 404에 위치한다. (b) '사멸 도메인'의 55-IC 상류의 막에 인접한 부분의 결실은 자기-결합을 증진시켰는데, 이는 이 부위가 결합에 방해효과가 있음을 제시하는 것이다. (c) 쥐의 p55-IC는 자기-결합하고 또한 인간의 p55-R의 '사멸 도메인'과 결합한다. (d) TNF/NGF 수용체 패밀리의 다른 세 수용체의 세포내 도메인의 자기-결합의 관찰: Fas/APO1(FAS-R), CD40 (Fields and Song, 1989)와 p75 TNF 수용체(Smith et., 1990)는 p55-R '사멸 도메인'에 관련되어지는 서열 모티프에 의해 세포 사멸의 신호 전달을 해 주는 Fas-IC가 자기-결합하고, p55-IC와 어느 정도까지 결합한다는 것을 보여주었다. 그러나, 생장 자극 신호를 제공하는 CD40-IC('사멸 도메인'과 유사한 서열을 함유할지라도)와 p55-IC와 구조적 유사성을 갖지 않는 p75-IC는 자기 결합하지도 않으며 p55-IC 혹은 Fas-IC와도 결합하지 않는다.

[표 3]

위의 표 3은 다음과 같은 단백질들을 둘러싸는 Gal4 이중 구성물들의 상호작용의 앙적 평가를 보여준다: 인간의 p55-R과 그것의 다양한 결실 변이체들의 세포내 도메인((Loetscher et al., 1990)에서처럼 번호를 매긴 잔기); 쥐의 p55-R의 세포내 도메인(잔기 334-454, (Goodwin et al., 1991)에서처럼 번호를 매긴); 쥐의 Fas/APO1 (Fas-IC, 166-306, (Watanabe-Fukanaga et al., 1992)에서처럼 번호를 매긴); 인간의 CD40 (CD-IC, 216-277, (Stamenkovic et al., 1989)에서처럼 번호를 매긴), 그리고 인간의 p75 TNF수용체(p75-IC, 287-461, (Smith et al., 1990)에서 처럼 번호를 매긴). SNF1과 SNF4는 결합에 대한 양성 대조군으로 사용되어졌고(Fields and song, 1989), 라민은 음성 대조군으로 사용되어졌다(Bartel et al., 1993). Gal4 DBD 구성물에 의해 코딩되어진 단백질들은(pGPT)가 수직으로 나열되어진다; Gal4 AD 구성물에 의해 코딩되어진 것들은(pGAD-GH) 수평으로 나열되어진다. "미끼"로 pGBT9에서 클론되어진 p55-IC를 사용하여 별표로 표시되어진 두 결실 변이가 HeLa 세포 cDNA 라이브러리의 이중-혼성 스크린( Clontech Palo Alto, Ca., U.S.A.)에서 클론되어졌다. 그 스크린에서, 관찰되어진 약 4×10⁶cDNA 클론 중 네개가 양성이었다. 이러한 클른 중 세 개가 인간의 p55-R cDNA(두 개가 잔기 238-426을, 하나가 잔기 277-426을 코딩하였다)의 부분과 상관관계가 있는 것으로 발견되었다. 네 번째 것은 알려지지 않은 단백질을 코딩하는 것으로 발견되어졌다. 베타-갈락토시다아제 발현 자료는 두 독립적인 형질변이체에 대한 분석의 평균이며 베타-갈락토시다아제 생성물의 양을 나타낸다; (활성 단위는 분당, OD420× 10³을 효모 배양액과 반응 시간의 OD₆₀₀으로 나눈 것으로 정의되어짐). 분석의 탐지 한계는 0.05 단위이었다. 복제 시료 사이의 다양성이 모든 경우에 있어 평균의 25%보다 적었다(시험되지는 않음).

p55-IC-글루타티온-S-전달효소(GST)의 박테리아 융합 단백질과 p55-IC-말토오스 결합 단백질(MBP) 융합 단백질의 상호작용에 관한 생체외 시험은 p55-R이 자기-결합함을 확실하게 하였고 이런 결합에서 효모 단백질의 관련을 배제시켰다(위를 보시오). 그 결합은 EDTA는 물론 증가되어진 염 농도에 의해 영향받지 않았다(위를 보시오).

사멸 도메인의 자기-결합의 기능적 관계를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 p55-R 혹은 그 일부의 유도된 발현이 TNF의 세포독성에 민감한 세포에 영향을 주는 방식을 관찰하였다. 도면 7에서 보여지는 이런 분석 결과는 p55-R 및 그 세포내 도메인(p55-IC) 혹은 그 부분(사멸 도메인을 포함하는)으로 트랜스펙션되어진 HeLa 세포들에 세포사멸 효과를 일으키는 리간드-비의존을 설명한다.

도면 7에서 TNF수용체들의 다른 유형들을 코딩하는 다양한 DNA 분자들이 트란스펙션되어진 HeLa 세포들이 갖는 벡터에 포함되어지는 것이 도식적으로 보여진다.(도면 7에서 가장 왼쪽); 테트라사이클린-조절 발현 벡터를 사용하여 다양한 전장 p55-R (p55-R), p55-IC 혹은 p55-IC의 일부들을 일시적으로 발현시키는 HeLa 세포에서의 발현(왼쪽과 중앙의 막대 그래프) 및 생존가능성(오른쪽 막대 그래프), 혹은 대조군으로 루시페라아제(LUC)(각각은 도면 7의 가장 왼쪽에서설명되어진다). 흰 막대 그래프는(왼쪽, 중앙과 오른쪽)은 테트라사이클린의 존재하(1μ g/ml)에서 트랜스펙션되어진 세포들을 나타내며, 이들은 발현을 억제한다; 검은 막대 그래프들은(왼쪽, 중앙과 오른쪽) 테트라사이클린 없이 트랜스펙션되어진 세포들을 나타낸다. TNF 수용체 발현은 트랜스펙션되어진 후 수용체들의 세포외 도메인에 대한 항체를 사용하는 ELISA에 의해서(도면 7의 왼쪽에 있는 도식적 설명을 보시오)그리고 방사성 동위원소 표지된 TNF와 세포의 결합을 측정하는 방법에 의해서(중앙) 20시간 동안 분석되어졌다. 트랜스펙션되어진 단백질의 세포사멸 효과는 트랜스펙션되어진 후 48시간 동안 평가되어졌다. 보여진 자료는 질적으로 유사한 결과들을 갖는 세 실험 중 하나에서이며, 각 구성물은 복제되어 시험되어졌다. ND는 결정되어지지 않음을 의미한다.

그러므로 도면 7에서 테트라사이클린 조절 트랜스활성인자(Gossen and Bujard, 1992)에 의해 트랜스펙션되어진 cDNA의 엄격하게 조절된 발현을 가능하게하는 발현 벡터를 사용함으로써, 전장 수용체에 대해 일시적으로 감염되어진 cDNA의 발현에 의한 HeLa 세포에서의 p55-R 발현의 단순한 증가가 상당히 광범위한 세포 죽음을 초래하였음이 명백하다. 단지 p55-IC만을 발현시킬 때 훨썬 더 큰 세포독성이 관찰되어졌다. 중요한 세포독성이 또한 HeLa 세포들에 있는 '사멸 도메인'으로 주로 구성된 p55-IC의 부분만(잔기 328-426)을 발현시킬 때도 관찰되어졌다. 반면에 '사멸 도메인'이 결여된 혹은 단지 '사멸 도메인'만을 함유한(혹은 부적절한 대조군으로 사용되어지는 루시퍼레이즈 유전자의 발현) p55-IC 부분의 발현은 세포의 생존 가능성에 영향을 미치지 않았다. p55-IC의 세포독성이 그것의 cDNA로안정적으로 형질전환되어진 세포들을 사용하여 더 확실하게 되었다; 이러한 세포들은 p55-IC 발현이 유도되지 않았을 때 생장을 지속하였지만 p55-IC가 발현될 때 사멸하였다(위를 보시오).

(c) p55-TNF-R의 세포내 도메인의 다른 효과들

사멸 도메인을 포함하는 TNF의 다른 활성이 세포내 도메인의 자기-결합에 의해 일어나는지를 살펴보기 위해, 본 발명자들은 TNF에 의해 활성화되어진다고 알려진 인터루킨 8(IL-8)의 전사에 있어 전장 수용체(p55-R)의 증가되어진 발현 및 수용체의 세포내 도메인의 발현의 효과를 관찰하였다(Matsushima et al., 1988). 그 결과는 도면 8에서 보여지며, 이는 테트라사이클린-조절 구성물을 사용하여(또한 위의 일반적인 방법과 재료를 보시오), p55-R 혹은 p55-IC로 트랜스펙션되어진 HeLa 세포에서 IL-8 유전자 발현의 리간드-비의존 유도를 설명한다. 도면 8의 패널 A에는 HeLa 세포에서 추출되어진 RNA(7μ g/lane)(HTta-1), 처리되지 않은('대조군') 혹은 TNF(500μ g/ml, 4 시간동안)로 처리된('TNF') 또는 p55-IC('p55-IC'), p55-R('p55-R')이나 루시페라아제('Luc')로 트랜스펙션되어진 후 24시간 된 HTta-1 세포들의 노던 블랏 분석(위의 일반적인 방법과 재료를 보시오)을 나타내는 리프로덕션이 보여진다. 도면 8의 패널 B는 도면 8의 패널 A에 보여지는 시료들 각각에 18S rRNA와 메틸렌 블루 염색을 나타내는 노던 블랏의 리프로덕션을 보여준다.

따라서, 도면 9에서 명확해진 것처럼 p55-R cDNA를 코딩하는 테트라사이클린-조절 구성물을 이용한 HeLa 세포의 트랜스펙션이 IL-8의 전사를 유도하였다. p55-IC에 대한 cDNA로 트랜스펙션되어진 세포들에서 더 강하게 유도되는것이 관찰되어겼다. 두 경우에 있어, 트랜스펙션되어진 p55-R 혹은 p55-IC의 발현의 결과로 발생되어졌음을 나타내며 유도가 테트라사이클린이 세포 생장 배지에서 제외되었을 때만 발생하였다. 대조군으로 루시페라아제 cDNA을 이용한 트랜스펙션은 IL-8 전사에 영향을 미치지 않았다 그러므로 위 결과에서(도면 8) p55-R 발현에서의 단순한 증가 혹은 단지 그것의 세포내 도메인(p55-IC)만에서의 발현조차 세포 내에서 IL-8 유전자 발현의 증가를 포함하여 세포독성 및 다른 효과들도 리간드(TNF)-비의존 양식으로 일으키기에 충분하다. 이러한 효과들의 유발은 대부분 p55-R의 세포내 도메인(p55-IC)의 자기-결합에 기인하는 것 같다. 위에서 설명한 것처럼 p55-IC의 자기-결합 하에서 그 '사멸 도메인'이 세포 내에서 세포독성을 일으키도록 하는 세포내 과정의 유도에 신호를 전달하는 데 일차적으로 책임있는 것 같다. 반면에 다른 효과들, 이를테면 IL-8 유전자의 발현 유도를 일으키는 신호 전달은 p55-IC의 자기-결합에 이어지면서 p55-IC의 다른 부위에 기인하는 것 같다. 그러므로 p55-IC의 다른 부위가 세포 내에서의 다른 TNF-유도 효과들(예를 들어 세포독성, IL-8 유도)에 책임이 있고 이런 효과들은 p55-IC의 자기-결합 하에서의 세포내 신호전달의 결과라는 것이 가능하다.

p55-IC가 리간드(TNF)-비의존 양식으로 IL-8 유도 같은 다른 세포내 효과를 유발할 수 있다는 사실은 p55-IC 혹은 그것의 특이 부분이 그런 세포나 조직을 TNF로 처리할 필요 없이도 처리되어진 세포나 조직에서의 효과들을 일으키는 고도로 특이한 도구로 사용되어질 수도 있음을 의미한다. 많은 병리학상의 조건하에서(예를 들어 악성), TNF로 특히 많은 양의 투약으로 처리했을 때는, 수용체에 결합하면서 TNF에 의해 구조적으로 유도되어진 세포내 효과의 수에 기인하여 바람직하지 못한 부작용을 일으킬 수 있다. p55-IC가 예를 들어 IL-8 유도같은 특이한 다른 TNF-유도 효과들(세포독성 외에도)을 닮을 수 있고, 세포- 혹은 조직-특이적 방식으로 p55-IC 혹은 그 특이 부분들을 도입하는 방법을 개시하여 특이적으로 IL-8 유도처럼 기대되어지는 세포내 효과들을 유도할 수 있도록 신호전달할 수 있다는 본 발명과 일치하는 발견으로 인하여 TNF 처리동안 자주 관찰되어지는 구조적인 부작용을 극복할 수 있다.

(d) 세포내 도메인과 p55 TNF-R 및 FAS-R(Fas/APO1)의 사멸 도메인에 의해 HeLa 세포의 세포사멸 효과의 리간드-비의존적 유발

p55 TNF-R와 FAS-R의 세포내 도메인(p55IC와 FAS-IC)의 세포독성 활성에 관하여 p55IC의 '사멸 도메인'(p55DD)과 FAS-IC 모두가 HeLa 세포에서 세포사멸 효과를 리간드-비의존 유발할 수 있음이 더 밝혀지기도 하였다. 이런 연구에서 HeLa 세포들은 p55IC와 p55DD을 포함하는 전장 p55-TNF-R의 부분들이나 FAS-IC의 다양한 구성물들을 함유하는 발현 벡터로 트랜스펙션되어졌다. 일련의 실험에서 HeLa 세포들이 p55-TNF-R(p55-R)와 FAS-IC(구성물의 자세한 것에 대해서, 프레퍼레이션등, 위를 보시오)로 공동-트랜스펙션되어졌다. 이런 연구의 결과들은 도면 9(A와 B)에서 설명되어지며 도면 9A와 B 양자에서 HeLa 세포들을 트랜스펙션시키는 데 사용되어지는 구성물들이 왼쪽 패널에서 도식적으로 보여진다; TNF와 FAS수용체 발현의 결과들이 두 중앙의 패널에서 그래프로 보여지며(왼쪽에서 두 번째와 세 번째 패널), 트랜스펙션되어진 세포들의 생존가능성의 결과가 오른쪽 패널에서 그래프로보여진다. 도면 9A에는 전장 p55-R, p55-IC나 그 부분들 또는 대조군으로 사용되어지는 루시페라아제를 일시적으로 발현시키는 트랜스펙션되어진 HeLa 세포들의 결과가 보여지는데, 모두 경우들에서 테트라사이클린-조절 발현 벡터를 사용하였다. 도면 9B에서 보여지는 결과는 테트라사이클린-조절 발현 벡터를 사용하여 FAS-IC만을 혹은 p55-R를 함께 일시적으로 발현시키는 트랜스펙션되어진 HeLa 세포들의 결과이다. 도면 9A와 B에서 결과들을 내타내는 그래프들에서 흰색 막대는 테트라사이클린의 존재 하(1μ g/ml)에서 트랜스펙션되어진 발현을 억제하는 세포들을 나타내며 검은 막대들은 테트라사이클린 없이 트랜스펙션되어진 세포들을 나타낸다. TNF 수용체 발현이 트랜스펙션되어진 후 이런 수용체의 세포외 도메인(왼쪽 패널)에 대한 항체를 사용하는 ELISA에 의해서, 그리고 방사성 동위 원소로 표지된 TNF와 세포들의 결합을 측정함(오른쪽 패널)으로써 20시간 동안 분석되어졌다. 트랜스펙션되어진 단백질들의 세포사멸 효과는 트랜스펙션되어진 후 48시간 평가되어졌다. 보여진 자료들은 각 구성물이 복제로 시험되어 질적으로 유사한 결과들을 나타낸 세실험들 중의 하나에서 얻은 것이다. 도면 9A와 B에서의 표지 'ND'는 결정되어지지 않음을 의미한다. 도면 9A와 B에서 보여지는 결과들에서 단지 p55IC만의 발현이 더 강한 세포독성을 초래한다는 것이 분명해진다. 또한 중요한 세포독성이 사멸 도메인만(p55DD)을 발현시킬 때 나타난다. 반대로, 사멸 도메인이 결여되거나 단지 그 부분만을 포함하는 p55IC의 부분들의 발현은 세포의 생존 가능성에 영향을 미치지 아니하였다. FAS-IC의 발현이 상당한 세포독성을 초래하지는 않았지만, 그래도 동시-발현되어진 p55-R의 세포독성을 상당히 증가시켰다.

실시예 3:

p55 TNF-R 혹은 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 부가적인 단백질

위의 실시예 1에서 설명되어졌던 동일한 접근법과 기술을 사용하여 p55IC 혹은 FAS-IC와 결합할 수 있는 세 종류의 다른 단백질들이 분리 및 정제되어졌다.

도면 10-12에서 F2, F9 및 DD11이라 각각 불리는 cDNA 클론들의 부분적이고 예비적인 누클레오티드들의 서열이 도식적으로 보여진다. 클론 F2와 F9는 "미끼"로 뮤라인(쥐과의 동물) FAS-IC를 사용하여 뮤라인 배(embryonic)의 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리되어졌다. 도면 10에서는 서열화된 F2 cDNA의 부분적인 뉴클레오타이드 서열이 도식적으로 보여진다. F2와 F9에 의해 코딩되어진 단백질의 결합 가능성에 대한 분석이 보여진다:

(a) F2는 인간의 p55IC및 p55DD, 그리고 뮤라인 FAS-IC와 강하게 상호작용하는 반면 적절한 단백질인 인간의 FAS-IC는 물론 비적절한(대조군) 단백질인 SNF1과 라민과는 약하게 상호작용한다.

(b) F9는 인간의 p55-IC 및 뮤라인 FAS-IC와 강하게 상호작용하는 반면 인간의 FAS-IC(적절한 단백질)와 비적절 단백질인 SNF1과 라민과는 약하게 상호작용한다.

(c) F2와 F9 모두는 인간의 p75IC, pGBT9(비어 있는 미끼 벡터) 흑은 인간의 CD-40과는 전혀 상호작용하지 않는다.

게다가 '유전자 뱅크(Gene Bank)'와 '단백질 뱅크(Protein Bank)'의 조사에서 F2와 F9이 새로운 단백질들을 나타냄이 드러났다.

그러므로, F2와 F9는 FAS-IC와 p55IC 양자 모두에 대한 결합 특이성을 갖는 세로운 단백질임을 나타낸다.

"미끼"로 인간의 p55DD를 사용하여 인간의 HeLa 라이브러리를 스크리닝함으로써 클론 DD11가 분리되어졌다. 도면 12에서는 서열화되어진 DD11의 cDNA의 부분적인 누클레오티드 서열이 도식적으로 보여진다.

DD11 클론은 대략 800 누클레오티드의 길이를 갖는다. 전사체는 전장이 약 12kb이고, 클론을 사용하여 표지되어진다. 클론 DD11에 의해 코딩되어지는 단백질의 결합 가능성의 분석은 DD11이 p55DD(a.a. 326-414)와 강하게 상호작용하며 이런 도메인, 예를 들어, a.a. 326-404 부분이 결실된 변이체들과는 상호작용하지 않는다. DD11은 쥐와 인간의 FAS-IC와도 상호작용하며, 어느 정도까지는 라민과도 역시 상호작용한다. DD11은 SNF1이나 pGBT9(비어 있는 미끼 벡터)와는 전혀 상호작용하지 않는다. DD11은 또한 '유전자 뱅크(Gene Bank)'와 '단백질 뱅크(Protein Bank)'의 데이타 베이스에서발견되지 않았다. 따라서, DD11은 p55IC(p44DD)와 FAS-IC 특이 결합 단백질을 나타낸다.

실시예 4

수용성 이중합체 TNF 수용체의 구성

위의 실시예 2에서 설명되어지는 발견에 기초하면, p55-IC의 '사멸 도메인'과 유사한 p55-R(p55-IC)의 세포내 도메인과 그 일부('사멸 도메인'), 그리고 Fas/APO1과 그 일부(또한 '사멸 도메인'이라 불려진다)가 자기-결합할 수 있고, 자기-결합가능하며 수용성인 새로운 TNF 수용체를 구성할 수 있다. 그러한 TNF 수용체들은 p55-R 혹은 Fas/APO1의 세포내 도메인 혹은 그것의 '사멸 도메인' 모두에 필수적으로 융합되어지는 p55-R의 세포외 도메인 모두를 필수로 갖는 융합 단백질일 것이다. 그러므로 그런 융합 구성물들은 p55-R(혹은 Fas/APO1)의 막간 도메인이 결여될 것이며 그리하여 녹을 수 있을 것이다. 더욱이, 그것의 세포내 도메인 혹은 '사멸 도메인'의 자기-결합 가능성에 의해 이러한 융합 단백질들은 적어도 p55-R의 이중합체(그리고 아마 더 높은 다중결합체도)를 제공하기 위하여 올리고머라이제이션(oligomerization)할 수 있을 것이다. 결과적으로 그러한 이중합체 TNF 수용체들(p55-R)은 그것의 리간드에 더 강하게 결합하는 수용성인 TNF 수용체를 제공하기 위하여 자연적으로 발생하는 TNF 호모삼합체(homotrimer)의 적어도 두 TNF 모노머에 결합할 수 있다(homotrimeric TNF).

따라서, p55 TNF 수용체 융합 단백질의 적어도 네 가지 유형이 올리고머라이제이션할 수 있고 수용성인 각각을 구성할 것이다.

(i) p55-R의 세포외 도메인(EC55)과 p55-R의 세포내 도메인(p55-IC) 사이의 융합 생성물

(ii) EC55와 p55-IC의 '사멸 도메인'(DD55) 사이의 융합 생성물

(iii) EC55와 세포내 도메인 Fas/APO1(ICFAS) 사이의 융합 생성물; 그리고

(iv) EC55와 ICFAS의 '사멸 도메인'(DDFAS) 사이의 융합 생성물

위 융합 단백질들의 각각에서 TNF 모노머의 결합 가능성은 EC55 부분에 의해제공되어지나, 융합 단백질의 각 종류의 올리고머라이제이션(혹은 적어도 이중합체)은 p55IC, DD55, ICFAS 혹은 DDFAS 부분들인 그것의 "꼬리"부분에 의해 제공되어진다.

위 융합 단백질들의 조성을 위해, 현재 그 기술 분야에서 확립된 재조합 DNA 기술의 일반적인 테크닉이 이용되어질 것이다(예를 들어, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 간단히, 어떤 적합한 박테리아, 박테리오파지, 혹은 동물 바이러스 발현 벡터가 (선택한 삽입 DNA의 발현을 위해 지시되어진 클론닝 운반기구 흑은 플라스미드) EC55를 코딩하는 DNA와 p55-IC, DD55, ICFAS 혹은 DDFAS인 '꼬리'의 하나를 한 단계 또는 그 이상의 단계에서 주입되도록 이용되어질 것이다. 융합 단백질들의 각각을 코딩하는 그렇게-주입되어진 DNA는 프로모터, 라이보자임 결합부위, 전사 인자 결합부위 등등과 같이 클로닝 운반기구 혹은 플라스미드의 다양한 발현 조절 서열의 제어하에 놓여질 것이다. 이러한 발현 조절 서열들은 선택되어진 발현 벡터의 유형 및 본 발명의 융합 단백질을 발현시키도록 되어지는 숙주 세포(진핵세포 혹은 원핵세포)의 유형에 따라 선택될 것이다. 선택되어진 숙주 세포(그리고 발현 벡터)는 진핵 세포 특히, 포유류이다.

이상에서 기재된 융합 단백질 각각을 코딩하는 DNA 분자는 제조된 후 다음의 절차에 따라 발현벡터 내로 삽입될 것이다:

(a) 먼저, PCR에 이용하기 위한 올리고누클레오티드의 세트가 표준 방법에의하여 구성될 것이며, 그 올리고누클레오티드는 다음과 같다:

(b) 우리 실험실에 보유하고 있는 전체-길이 p55-R과 Fas/APO1 수용체를 클론하는 플라스미드는 각 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻기 위하여 다음의 조작 과정을 거치게 될 것이며, 이 DNA 단편은 그 후 상기 선택된 발현벡터에 연결될 것이다:

(i) 네 개의 모든 융합 단백질의 구성요소인 EC55를 코딩하는 DNA 단편의 생산을 위하여 PCR이 상기 올리고누클레오티드 1번 및 2번(단편의 크기 640bp)를 이용하여 인간 p55의 cDNA를 함유하는 플라스미드 상에서 수행된다.

(ii) 융합산물 EC55-IC55를 얻기 위하여 올리고누클레오티드 3번과 4번을 이용하여 인간 p55의 cDNA를 함유하는 플라스미드 상에서 PCR이 수행되어 IC55(크기 677bp)를 코딩하는 DNA 단편을 얻고, 그 후 Sal I에 의하여 절단된 EC55와 혼합시키고 블런트엔드 연결법으로 적절한 프로모터의 조절을 받는 포유류 세포의 발현벡터로 연결된다. 벡터 내로 삽입된 EC55-IC55의 방향은 제한효소절단 및 서열결정에 의하여 다양하게 달라진다.

(iii) EC55-IC FAS 융합산물을 얻기 위하여 IC FAS는 올리고누클레오티드 5번과 6번을 이용하여 FAS의 cDNA를 가지고 플라스미드 상에서 PCR에 의하여 생산되고, IC55(677bp)를 코딩하는 DNA 단편을 얻은 후, Sal I에 의하여 절단된 EC55와 혼합시키고 블런트엔드 연결법으로 적절한 프로모터의 조절을 받는 포유류 세포의 발현벡터로 연결된다. 벡터 내로 삽입된 EC55-IC FAS의 방향은 제한효소절단 및 서열결정에 의하여 다양하게 달라진다.

(iv) EC55-DD55 융합산물을 얻기 위하여 DNA 단편이 올리고누클레오티드 7번과 4번을 이용하여 인간 p55의 cDNA에서 PCR에 의하여 생산되고, 크기 314bp인 산물은 Sal I에 의하여 절단된 EC55와 혼합시키고 블런트엔드 연결법으로 포유류 세포의 발현벡터로 연결된다. 벡터 내로 삽입된 EC55-DD55의 방향은 제한효소절단 및 서열결정에 의하여 다양하게 달라진다.

(v) EC55-DD FAS 융합산물을 얻기 위하여 DD FAS를 가진 DNA 단편이 올리고누클레오티드 6번과 8번을 이용하여 FAS의 cDNA 상에서 PCR에 의하여 생산되고, 크기 332bp인 산물은 Sal I에 의하여 절단된 EC55와 혼합시키고 블런트엔드 연결법으로 포유류 세포의 발현벡터로 연결된다. 벡터 내로 삽입된 EC55-DD FAS의 방향은 제한효소절단 및 서열결정에 의하여 다양하게 달라진다.

일단 상기 발현벡터들이 구성된 후, 그들은 발현을 위하여 표준방법으로 적절한 포유류 세포(예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO)세포 또는 원숭이 신장(COS)세포)에 도입될 것이다. 그렇게 발현된 융합단백질은 그 후 표준방법으로 정제될 것이다(EP398378; EP398327; 및 EP568925 참조). 정제된 융합단백질은 그 후 올리고머화 능력(그리고 그 정도 즉, 그들이 이합체 또는 더 고차의 멀티머를 형성하는지 여부) 및 FAS 리간드 결합능력(그리고 그 결합의 친화정도)에 대하여 시험된다.

실시예 5

수용성 이합체 Fas/APO1수용체의 구성

상기 실시예 4에 언급한 것과 유사한 방식으로 다음 4종류의 Fas/APO1 융합 단백질을 생산할 수 있으며, 이들 각각은 올리고머화 가능하고 수용성이다:

(i) Fas/APO1 세포외 도메인(EC FAS)와 p55-IC 세포내 도메인 간의 융합산물

(ii) EC FAS와 p55-IC의 '사멸 도메인'(DD55) 간의 융합산물

(iii) EC FAS와 Fas/APO1의 세포내 도메인(IC FAS) 간의 융합산물; 그리고

(iv) EC FAS와 IC FAS의 사멸 도메인(DD FAS) 간의 융합산물.

상기 융합단백질 각각에서 FAS 리간드 결합능력은 EC FAS 부분에 의하여 제공되며, 각 종류의 융합단백질의 올리고머화(또는 최소한 이합체화)는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD부분의 '꼬리' 부분에 의하여 제공된다.

상기 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편과 그들을 포함하는 발현벡터의 구성은 다른 적절한 올리고누클레오티드(기재되지 않음)가 상기 '꼬리' 부분에 연결될 EC FAS 단편의 제조에 이용된다는 사실만을 제외하고는 실시예 4에 상세히 기재되었다. 다음으로, 발현벡터는 적절한 숙주세포 내로 도입되어 그 결과로 발현된 융합 단백질이 정제되고 올리고머화 능력(그리고 그 정도 즉, 그들이 이합체 또는 더 고차의 멀티머를 형성하는지 여부) 및 FAS 리간드 결합능력(그리고 그 결합의 친화 정도)에 대하여 시험된다.

실시예 6

수용성 올리고머 '혼합' TNF/FAS 수용체의 구성

혼합 친화성 즉, TNF 및 FAS-R 리간드 양자에 대한 친화성을 가지는 올리고머 수용체를 제조하기 위하여, 상기(실시예 4 및 5) 융합단백질이 다음의 절차에 이용될 수 있다:

i ) 실시예 4에 기재한 융합산물의 제공, 여기에는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 중의 어느 하나와 융합한 TNF-R(p75 TNF-R 또는 p55 TNF-R)의 세포외 도메인을 포함한다;

ii) 실시예 5에 기재한 융합산물의 제공, 여기에는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD 중의 어느 하나와 융합한 Fas-R의 세포외 도메인을 포함한다; 그리고

iii) i )의 융합산물 중의 어느 하나를 ii)의 융합산물 중의 어느 하나와 혼합하여 그들의 -IC 또는 -DD 부분에 의하여 결합된 TNF-R 및 FAS-R 세포외 도메인 양자를 가지는 새로운 이합체(또는 더 고차 올리고머) 수용체의 제공.

상기 방법에서, 융합산물 i )과 ii)는 분리되어 제공되며 즉, 그들이 생산되는 형질전환된 세포로부터 그들을 정제한 후 혼합 흡착 수용체를 얻기 위하여 시험관 내에서 혼합되었다. 이와 달리, 숙주세포는 두 형태의 융합산물을 코딩하는 서열을 운반하는 벡터로 공동-트랜스펙션할 수 있고, 이 경우에 혼합된 흡착 수용체는 공동-트랜스펙션된 세포에서 직접 얻을 수 있다. 융합산물의 올리고머 수용체로의 실제 올리고머화는 세포에서 발현되는 융합산물을 얻기 위한 세포 내에서의 정제과정 이전, 동안 또는 이후에 일어난다. 혼합 흡착 수용체를 특이적으로 선택하기 위하여 예컨대 TNF-R과 FAS-R 세포외 도메인에 대한 항체가 두 형태의 세포외 도메인을 가진 그들 수용체를 선택하기 위한 순차적 크로마토그래피 단계에서 사용되는 흡착 크로마토그래피와 같은 표준 방법이 이용된다.

참고문헌 목록

Claims (36)

1. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 9는 p55 TNF-R 세포내 도메인(p55IC)결합 단백질로서 이 문서에서 단백질 55.11로 명명된 단백질을 코딩하고; 상기 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11는 p75 TNF-R 세포내 도메인(p75IC)결합 단백질로서 이 문서에서 단백질 75.3으로 명명된 단백질을 코딩하고; 상기 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13은 p75 TNF-R 세포내 도메인(p75IC)결합 단백질로서 이 문서에서 단백질 75.16으로 명명된 단백질을 코딩하고; 상기 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20은 p55 TNF-R 세포내 도메인(p55IC)결합 단백질 or FAS-R 세포내 도메인(FAS-IC) 결합 단백질로서 이 문서에서 단백질 F2로 명명된 단백질을 코딩하고; 상기 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 및 SEQ ID NO: 23은 p55 TNF-R 세포내 도메인 (p55IC)-결합 단백질 또는 FAS-R 세포내 도메인 (FAS-IC) 결합 단백질로서 이 문서에서 단백질 F9로서 명명된 단백질을 코딩하며; 상기 SEQ ID NO: 24는 p55 TNF-R 세포내 도메인 (p55IC)-결합 단백질 또는 FAS-R 세포내 도메인 (FAS-IC) 결합 단백질을 코딩하는 단백질로서 이 문서에서 단백질 DD11로서 명명된 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
3. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열과 유전자 암호의 결과로써 중첩성(degenerate)이 있으며, 생물학적 활성이 있는 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인 결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
4. p55 TNF-R 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 328 내지 잔기 426의 아미노산 서열을 가지는 단백질로서 이 문서에서 단백질 55.1로 명명된 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
5. p55 TNF-R 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 277 내지 잔기 426의 아미노산 서열을 가지는 단백질로서 이 문서에서 단백질 55.3으로 명명된 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
6. 제 1항에 따른 DNA서열을 포함하는 벡터.
7. 제 6항에 따르는 벡터를 포함하는 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주세포.
8. 종양괴사인자/신경성장인자(TNF/NGF) 수용체 수퍼패밀리에 속하는 수용체의세포내 도메인과 결합 가능한 단백질의 생산방법으로서, 상기 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 제 92항에 따른 형질전환된 숙주세포를 키우고, 상기 단백질의 획득에 필요한 상기 단백질의 번역후 변형을 수행하고 상기 발현된 단백질을 상기 형질전환된 세포의 배양배지에서 또는 상기 형질전환된 세포의 세포 추출물에서 추출하는 과정을 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항, 제4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열에 의하여 코딩된 단백질로서, TNF 또는 FAS 수용체의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질.
10. 제 9항에 있어서, 단백질 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 및 DD11를 포함하는 그룹에서 선택된 단백질.
11. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 가지는 단백질.
12. 제 10항에 따른 단백질에 특이적인 항체.
13. 제 12항에 따른 항체로 상기 세포를 처리하는 것을 포함하는, TNF-R 또는 FAS-R을 운반하는 세포에의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하기 위한 방법으로서, 상기 처리는 상기 세포에 상기 항체를 포함하는 적절한 조성물을 적용하는 것이고, 상기 세포의 IC-결합 단백질이 세포외 표면에 노출되는 경우, 상기 조성물은 세포외 적용에 맞게 조제되며, 상기 IC-결합 단백질이 세포내에 있는 경우, 상기 조성물은 세포내 적용에 맞게 조제되는 방법.
14. 제 9항에 의한 단백질 그리고 단백질 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, (상기 모든 단백질은 상기 TNF-R 또는 FAS-R 의 세포내 도메인에 결합하여 그 활성을 조절시킬 수 있다)로 구성된 그룹에서 선택된 일 또는 그 이상의 단백질을 이용한 상기 세포의 처리를 포함하는 TNF-R 또는 FAS-R 운반세포에의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절시키는 방법으로서, 상기 세포의 상기 처리법은 그것의 세포내 도입에 적절한 형태로 일 또는 그 이상의 단백질을 상기 세포로 도입하거나 또는 상기 일 또는 그 이상의 단백질을 코딩하는 DAN 서열을 상기 서열 운반에 적절한 벡터의 형태로 상기 세포에 도입하는 것을 포함하며, 상기 벡터는 상기 서열이 상기 세포 내에서 발현되는 방식으로 하는 상기 세포로의 상기 서열의 삽입을 수행할 수 있는 방법.
15. 제 12항에 따른 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 서열, 그리고 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 안티센스 서열을 코딩하는 서열에서 선택된 올리고누클레오티드 서열(상기 올리고누클레오티드 서열은 TNF-R 또는 FAS-R 세포내 도메인 결합 단백질 중 최소한 하나의 발현을 억제할 수 있다)로 상기 세포를 처리하는 것을 포함하는, TNF-R 또는 FAS-R 운반 세포에의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과를 조절하는 방법.
16. 자기결합 가능한 p55 TNF-R 또는 자기결합 가능하고 리간드(TNF)-비의존적 방식으로 세포에 상기 TNF 효과를 유도할 수 있는 p55 TNF-R의 부분들로부터 선택된 일 또는 그 이상의 단백질로 상기 세포를 처리하는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서의 TNF-관련 효과의 유도 방법으로서, 상기 세포처리는 그것의 세포내 도입에 적합한 형태로 상기 일 또는 그 이상의 단백질을 상기 세포로 도입하거나 상기 일 또는 그 이상의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 상기 서열의 운반에 적합한 벡터형태로 상기 세포내로 도입하는 것을 포함하고, 상기 벡터는 상기 서열이 상기 세포 내에서 발현되는 방식으로 하는 상기 세포내로의 상기 서열의 삽입을 수행할 수 있는 방법.
17. 제9항에 따른 단백질을 코딩하는 세포 mRNA 서열 또는 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 mRNA 서열과 상호작용 가능한 리보자임 서열을 코딩하는 벡터가 상기 리보자임 서열이 상기 세포 내에서 발현될 수 있는 형태로 상기 세포에 도입되며, 상기 리보자임 서열은 상기 세포내에서 발현되어 상기 세포 mRNA 서열과 상호작용하여 상기 mRNA 서열을 절단함으로써, 상기 단백질 또는 상기 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD의 상기 세포내 발현을 억제하는 리보자임 방법의 적용을 포함하는 세포에의 TNF 또는 FAS-R 리간드 효과의 조절방법.
18. 세포내 도메인 결합 단백질을 코딩하는 서열이 하나의 혼성 벡터에 의하여 운반되고 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 온 서열이 두번째 혼성벡터에 의하여 운반되며, 벡터들은 이후 효모 숙주세포를 형질전환하는데 이용되며, 양성 형질전환세포는 분리되며, 그 후 상기 두번째 혼성벡터의 추출로 상기 세포내 도메인 결합 단백질과 결합하는 단백질을 코딩하는 서열을 얻는 효모 이중혼성법을 적용하는 것을 포함하는 제9항에 따른 세포내 도메인 결합 단백질과 결합할 수 있는 단백질을 분리 및 확인하는 방법.
19. 제9항에 따른 단백질, 또는 단백질 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD, 또는 그것들의 혼합물을 활성 성분으로서 포함하는 세포에의 TNF-또는 FAS-R 리간드 효과의 조절을 위한 약제학적 조성물.
20. 세포표면 수용체와 결합가능한 단백질을 코딩하고 제9항에 따른 단백질, 또는 단백질 p55IC, p55DD, FAS-IC 또는 FAS-DD를 코딩하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 활성 성분으로서 포함하는 세포에의 TNF- 또는 FAS-R 리간드 효과의 조절을 위한 약제학적 조성물.
21. 제1항에 따른 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고누클레오티드 서열을 활성 성분으로서 포함하는 세포에의 TNF-또는 FAS-R 리간드 효과의 조절을 위한 약제학적 조성물.
22. 최소한 두 개의 자기결합된 융합 단백질을 포함하고, 각 융합 단백질은 (a) 한쪽 말단에 TNF-R의 세포외 도메인들로부터 선택된 TNF 결합 도메인을 가지는데, 상기 세포외 도메인은 TNF 결합을 방해하거나 또는 TNF 최적결합보다 낮은 결합을 일으키는 해로운 자기결합이 불가능하며, TNF에 결합할 수 있고; (b) 다른 말단에는 (i) 온전한 p55TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 206에서 약 426까지를 확장한 p55TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC); (ii) 온전한 p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 328에서 426까지를 확장한 p55-IC의 사멸 도메인; (iii) Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인(Fas-IC); 및 (iv) Fas-IC의 사멸 도메인 중에서 선택된 자기결합 도메인을 가지고, 상기 최소 두 개의 자기결합 단백질은 상기 말단 (b)에서만 자기결합하며, 최소한 두개의 TNF 모노머와 결합능력이 있는 상기 말단 (a)를 가지며, 각 말단 (a)는 하나의 TNF 모노머와 결합할 수 있는 수용성 올리고머 종양괴사인자 수용체(TNF-R) 또는 그 염.
23. 제 22항에 있어서, p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 1에서 약 172까지를 확장한 p55-R의 세포외 도메인인 최소 두 개의 말단 (a)와 상기 p55-IC의 사멸 도메인인 최소 두 개의 말단 (b)를 포함하는 수용성 올리고머 TNF-R 또는 그 염.
24. 제22항에 있어서, 각각이 하나의 TNF 모노머와 결합가능하고 자기결합이 불가능한 p55-R의 세포외 도메인 기능의 두 개의 말단 (a)와 상기 p55-IC의 사멸 도메인인 두 개의 말단 (b)를 포함하는 수용성 올리고머 TNF-R 또는 그 염.
25. 제22항에 있어서, p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 1에서 약 172까지를 확장한 p55-R의 세포외 도메인인 최소 두 개의 말단 (a)와 상기 Fas-IC의 사멸 도메인인 최소 두 개의 말단 (b)를 포함하는 수용성 올리고머 TNF-R 또는 그 염.
26. 제22항에 있어서, 각각이 하나의 TNF 모노머와 결합가능하고 자기결합이 불가능한 p55-R의 세포외 도메인 기능의 최소 두 개의 말단 (a)와 상기 Fas-IC의 사멸 도메인인 최소 두 개의 말단 (b)를 포함하는 수용성 올리고머 TNF-R 또는 그 염.
27. 제22항의 상기 융합 단백질을 코딩하는 융합 단백질 서열을 포함하는 발현 벡터.
28. 상기 융합 단백질 서열을 발현시킬 수 있는, 제27항에 따른 벡터를 함유하는 숙주세포.
29. 활성 성분으로서 제22항에 따른 수용성 올리고머 TNF-R 또는 그의 염 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
30. 최소한 두 개의 자기결합된 융합 단백질을 포함하는 수용성 올리고머 Fas/APO1 수용체(Fas-R) 또는 그 염으로서, 각 융합 단백질은 (a) 한쪽 말단에 Fas-R의 세포외 도메인들로부터 선택된 Fas 리간드 결합 도메인을 가지는데, 이들은 자기결합이 불가능하고 Fas 리간드에 결합할 수 있으며; (b) 다른 말단에는 ( i ) p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC)으로서, p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 206에서 약 426까지를 확장한 것; (ii)p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 328에서 약 426까지를 확장한 p55-IC의 사멸 도메인; (iii) Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인(Fas-IC); 및 (iv) Fas-IC의 사멸 도메인 중에서 선택된 자기결합 도메인을 가지며 상기 최소 두 개의 자기결합 단백질은 상기 말단 (b)에서만 자기결합하며, 각각이 하나의 Fas 리간드 모노머와 결합할 수 있는 최소한 두 개의 Fas 리간드 모노머와의 결합능력이 있는 상기 말단 (a)를 가지는 수용성 올리고머 Fas/APO1 수용체(Fas-R) 또는 그의 염.
31. 제30항의 상기 융합 단백질을 코딩하는 융합 단백질 서열을 포함하는 발현 벡터.
32. 상기 융합 단백질 서열을 발현시킬 수 있는 제31항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
33. 활성 성분으로서 제30항에 따르는 수용성 올리고머 Fas-R 또는 그 염 또는그 혼합물을 약리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
34. TNF 및 FAS-R 리간드 양자에 친화성을 가지는 수용성 올리고머 수용체(혼합 친화성 수용체) 또는 그 염으로서, 최소한 2 이상의 자기결합된 융합 단백질을 포함하고, 그 중 하나는 제22항에 따른 TNF-특이적 TNF-R 유래 단백질이며; 다른 융합단백질은 적어도 두 개의 자기결합된 융합 단백질을 포함하는 수용성 올리고머 Fas/APO1수용체(Fas-R)로서 각 융합 단백질은 (a) 한 쪽 말단에 자기결합이 불가능하고 Fas 리간드에 결합할 수 있는 Fas-R의 세포외 도메인들로부터 선택된 Fas 리간드 결합 도메인을 가지고; (b) 다른 말단에는 (i) p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC)으로서, p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 206에서 약 426까지를 확장한 것; (ii) p55 TNF-R 분자의 아미노산 잔기 약 328에서 426까지를 확장한 p55-IC의 사멸 도메인; (iii) Fas/APO1 수용체의 세포내 도메인(Fas-IC); 및 (iv) Fas-IC의 사멸 도메인 중에서 선택된 자기결합 도메인을 갖고 상기 최소 두 개의 자기결합된 단백질은 상기 말단 (b)에서만 자기결합하며, 최소한 두 개의 Fas 리간드 모노머와 결합능력이 있는 상기 말단 (a)를 가지는데, 각 말단 (a)는 하나의 Fas 리간드 모노머와 결합할 수 있는 수용성 올리고머 수용체 또는 그 염.
35. 제34항에 따른 혼합 친화성 수용체를 약리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
36. 제 19항에 있어서, 활성 성분으로서 p55-IC를 약리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, TNF 관련 효과의 유도에 의해 세포를 치료하기 위한 약제학적 조성물.