KR20020069140A

KR20020069140A - 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6 억제 단백질

Info

Publication number: KR20020069140A
Application number: KR1020020009371A
Authority: KR
Inventors: 이장희; 김홍희
Original assignee: 주식회사 코메드
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2002-08-29
Also published as: WO2002066508A1; US20040109854A1

Abstract

본 발명은 신규한 분리된 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6(TRAF6) 억제 단백질 또는 이의 기능적 유도체에 관한 것이다. 이들 단백질은 N-말단에 KRAB 도메인과 C-말단에 14개의 C₂H₂형 아연 핑거 모티브를 포함하고, TRAF6와 결합하지만 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF6과 상호작용하여 종양 괴사 인자(TNF) 신호전달 경로에서 NF-κB 또는 AP-1의 활성을 억제함을 특징으로 하는 신규한 아연 핑거 단백질이다. 또한, 본 발명은 상기 TRAF6 억제 단백질 또는 이의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산 서열, 이 핵산 서열을 포함한 재조합 플라스미드 및 이 재조합 플라스미드로 형질감염 또는 형질전환된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 형질감염체 또는 형질전환체를 이용한 TRAF6 억제 단백질 또는 이의 기능적 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA, 분리된 TRAF6 억제 단백질, TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체를 활성 성분으로 포함함을 특징으로 하는, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 및/또는 분리된 TRAF6 억제 단백질을 활성 성분으로 포함함을 특징으로 하는, 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

종양 괴사 인자 수용체 관련 인자 6 억제 단백질{A Novel TRAF6 Inhibiting Protein}

본 발명은 종양 괴사 인자 수용체 관련 인자(tumor necrosis factor receptor associated factor: TRAF) 6(이하, TRAF6으로 약칭한다)을 억제하거나 이에 의해 매개된 신호 전달을 차단하는 신규한 폴리펩타이드의 분리, 재조합 생성 및 성상확인에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 N-말단에 KRAB 도메인과 C-말단에 14개의 C₂H₂형 아연 핑거 모티브를 포함하고, TRAF6과 결합하지만 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF-6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 활성을 억제할 수 있는 신규한 단백질 또는 이의 기능적 유도체에 관한 것이다.

종양 괴사 인자(tumore necrosis factor: TNF)는 활성화된 마크로파지에서 주로 생산되는 시토카인(cytokine)이다. 종양 괴사 인자에 의한 세포 생리작용은 종양 괴사 인자가 그 수용체[약 55 kDa의 종양 괴사 인자 수용체-1 (tumor necrosis factor receptor-1: TNFR-1)과 약 75 kDa의 종양 괴사 인자 수용체-2(TNFR-2)]에 결합함으로써 개시된다. TNFR-1 및 TNFR-2의 cDNA 서열이 사람 및 쥐(mouse)에서 밝혀져 있다. 이들 TNFR은 다른 세포막의 수용체들과 같이 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인으로 구성되어 있으며, CD40 등과 함께 TNFR 상과(superfamily)에 속하고, 전사인자 NF-κB의 활성화를 매개한다. TNFR 상과는 대부분의 세포류에서 발현되며 세포의 증식, 분화, 염증, 뼈 발육 및 예정된 세포 사멸 등에 관여한다(Smith et al., Cell, 76, 959-962, 1994). NF-κB는 전사인자 Rel족의 일원으로 여러 가지 세포 및 바이러스 유전자의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

TNFR 상과의 일원들은 대부분 세포 내 영역에서 TRAF로 알려진 일군의 어댑터(adaptor) 단백질들과 상호 작용한다. TRAF 단백질들은 각각 N-말단에 고리(ring)와 아연 핑거 모티프를 가지고 있고 C-말단에 이들 단백질간에 고도로 보존된 서열인 TRAF 도메인을 가지고 있다(Arch et al., Genes Dev., 12, 2821-2830, 1998). 지금까지 밝혀진 TRAF 단백질에는 6종의 성분이 있는데, TRAF2, TRAF5 및 TRAF6은 과잉 발현시 NF-κB 경로와 JNK 경로를 모두 활성화시키는 것으로 알려진 반면, TRAF1, TRAF3 및 TRAF4는 신호 도입 체계에서의 역할이 분명하게 밝혀져 있지 않다(Kim et al., FEBS Lett., 443, 297-302, 1999; Rothe et al., Science, 269, 1424-1427, 1995).

TRAF6은 TNFR과 인터루킨(IL)-1 수용체 군의 성분들을 통한 유전자 활성화에 관여한다. 최근, 로마가 등의 문헌(Lomaga et al., Genes Dev., 15, 1010-1024, 1999; Naito et al., Genes Cells, 4, 353-362, 1999)에서는 TRAF6 결손 마우스를 이용한 실험을 통해 TRAF6이 CD40L, IL-1 및 리포폴리사카라이드에 의존적인 NF-κB의 활성화에 중요한 역할을 함을 입증하였다. TRAF6은 NF-κB의 수용체 활성체(RANK)에 존재하는 세포질 도메인과 상호작용하고, TRAF/NIK/IKK 신호전달 경로를 통해 RANK에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 매개한다(Darnay et al., J. Biol.Chem., 274, 7724-7731, 1999). IL-1 및 TNF-α는 MAP 키나제인 JNK와 p38 및 IκB 키나제(IKK)의 활성화를 통해 각각 전사인자 AP-1과 NF-κB를 자극한다. TNF-α와 IL-1은 TRAF2와 TRAF6의 올리고머화를 통해 세포에 신호를 전달하고(Veronique et al., Genes Dev., 13, 1297-1308, 1999), 또한 TRAF6은 IL-1 수용체 관련 키나제 1 및 2(IRAK1 및 IRAK2)와 상호 작용한다. 293 세포에 IL-1을 처리하면 IL-1 자극 후 IL-1 수용체에 빠르게 유인되는 세린/트레오닌 키나제인 IRAK와 TRAF6이 결합하는데, 이는 TRAF 단백질이 특정 수용체 군의 신호 도입인자로서 작용할 수 있고 TRAF6이 IL-1 신호전달에 관여한다는 것을 시사한다(Cao et al., Nature, 383, 443-446, 1996; Muzio et al., Science, 278, 1612-1615, 1997).

인간 게놈에는 아연 핑거 도메인을 포함하는 유전자가 300개 이상 있다(Bellefroid et al., DNA, 8, 377-387, 1989). 단백질의 아연 핑거 영역은 일반적으로 직렬로 반복된 아연 핑거 모티프로 구성되나, 경우에 따라서는 일군의 아연 핑거가 다른 군의 아연 핑거와 비핑거 영역에 의해 분리되어 있기도 한다(Ruizi et al., EMBO, 6, 3065-3070, 1987; Fan and Maniatis, Genes Dev., 4, 29-42, 1990). 아연 핑거 군의 유전자는 아연과 킬레이트하는 아미노산에 따라 2가지 부류로 분류된다. 그 중, 한 가지인 Kruppel 유사 단백질 또는 TFIIIA 유사 단백질은 아연 이온과 킬레이트를 형성하는 2개의 시스테인 잔기와 2개의 히스티딘 잔기(C₂H₂)를 특징으로 하는 반면, 다른 한 가지인 호르몬 수용체는 보통 2쌍의 시스테인(C₂C₂)을 갖고 있다(Gibson et al., Protein Eng., 2, 209-218, 1988; BergJ.M., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 99-102, 1988; Evans R.M., Science, 240, 889-895, 1988). 특성이 밝혀진 아연 핑거 단백질은 대부분 DNA에 특이적으로 결합하는 것으로서, 전사 조절인자이다(Green and Chambon, Nature, 325, 75-78, 1987; Blumberg et al., Nature, 328, 443-445, 1987).

본 발명은 TRAF6과 상호 작용하는 특정의 신규한 단백질의 동정, 재조합 생성 및 성상확인을 기초로 이루어진 것이다. 이들 단백질은 본원에서 TRAF6 억제 단백질로 명명한다. 보다 특정적으로는, 본 발명은 효모 2중 하이브리드 시스템을 이용하여 공지된 단백질과 유의적인 서열 유사성이 없는 사람 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 cDNA를 분리하고 코딩된 TRAF6 억제 단백질의 발현 및 성상확인을 기초로 하고 있다.

본 발명은 TRAF의 서브타입인 TRAF6과는 결합할 수 있되 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제할 수 있고, N-말단에 KRAB 도메인을 그리고 C-말단에 14개의 아연 핑거 모티브를 가지고 있는 신규한 TRAF6 억제 단백질을 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 도 6a에 제시된 아미노산 서열을 가진 신규한 TRAF6 억제 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 도 6a에 제시된 아미노산 서열을 가진 신규한 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF의 서브타입인 TRAF6과는 결합할 수 있되 TRAF2 및TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제할 수 있고, N-말단에 KRAB 도메인을 그리고 C-말단에 14개의 아연 핑거 모티브를 가지고 있는 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 신규한 핵산 서열 분자를 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 도 5에 제시된 핵산 서열을 갖는 신규한 핵산 서열 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 서열 분자는 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함하며, TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 서열 분자를 함유하는 플라스미드, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 상기 TRAF6 억제 단백질을 발현시키는 재조합 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 함유하는 세포 및 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 TRAF6 억제 단백질을 제조하는 방법, 특히 바람직하게는 유전공학적 방법으로 상기 TRAF6 억제 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질, 특히 다량 발현된 TRAF6 억제 단백질을 이용하여 TRAF6 억제 단백질과 선택적으로 결합하는 물질들, 예를 들어, TRAF6 또는 이의 단편을 분리 및/또는 정제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 또는 TRAF6의 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법, 특히 TRAF6/TRAF6 억제 단백질의 결합을 증진 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 벡터, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 분리된 TRAF6 억제 단백질 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 벡터, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 분리된 TRAF6 억제 단백질 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여함을 특징으로 하여, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여함을 특징으로 하여, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는 방법.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질을 선택적으로 인식하는 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 및/또는 분리된 TRAF6 억제 단백질을 활성 성분으로 포함함을 특징으로 하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 및/또는 분리된 TRAF6 억제 단백질을 활성 성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 동물에 투여함을 특징으로 하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

도 1a는 본 발명에 따라 작제된 베이트 벡터 pGBT9-TRAF6 전체길이의 지도이다.

도 1b는 본 발명에 따라 작제된 베이트 벡터 pGBT9-TRAF6 dm의 지도이다.

도 2a는 본 발명에 따라 벡터 pRK-Flag에 TRAF6 억제 단백질 전체길이 cDNA를 클로닝하여 작제한 재조합 플라스미드 pRK-Flag-TBZF의 지도이다.

도 2b는 본 발명에 따라 벡터 pSRαNtHA에 TRAF6 전체길이 cDNA를 클로닝하여 작제한 재조합 플라스미드 pSRαNtHA-TRAF6의 지도이다.

도 3a는 본 발명에 따라 GAL4 DNA 결합 도메인(DB)을 함유하는 벡터 pM에 TRAF6 전체길이 cDNA를 서브클로닝하여 작제한 재조합 플라스미드 pM-TRAF6 전체길이의 지도이다.

도 3b는 본 발명에 따라 VP16 전사 활성화 도메인(AD)을 함유하는 벡터 pVP16에 TRAF6 억제 단백질 전체길이 cDNA를 서브클로닝하여 작제한 재조합 플라스미드 pVP16-TBZF의 지도이다.

도 4는 효모에서 TRAF6 결실 변이체(아미노산 1 내지 274)와 TBZF의 상호작용 정도를 도시한 막대그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질 전체길이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

도 6a는 도 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질 전체길이의 아미노산 서열 및 이 서열의 중요 특징 부분을 나타낸 것이다. 이탤릭체는 KRAB 도메인을 나타내고, 밑줄친 부분은 효모 2중 하이브리드 스크린 방법으로부터 얻은 클로닝된 부분을 나타내며, 암색 부분은 아연 핑거 도메인을 나타낸다.

도 6b 및 6c는 도 6a에 제시된 본 발명의 TRAF6 억제 단백질의 아미노산 서열과 인간 아연 핑거 단백질 85(znf 85)의 아미노산 서열을 비교 정렬한 것이다.

도 7은 아세포 분획을 항-TRAF6 항체, 항-Flag 항체 및 항-튜블린 항체와 반응시킨 후 웨스턴 블롯한 결과를 나타낸 사진이다. 여기서, TBZF는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 약칭한 것이다.

도 8a는 포유동물 세포에서의 TRAF6과 TRAF6 억제 단백질과의 상호작용을 실험한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 8b는 포유동물 2중 하이브리드 시스템에서 확인된 TRAF6과 TRAF6 억제 단백질의 상호작용을 도시한 도표이다. 여기서, TBZF는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 약칭한 것이다.

도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질이 TRAF6(A 및 B)과 RANK(C) 및 IL-1R(D)에 의한 NF-κB(A, C, D) 및 AP-1(B)의 활성화에 미치는 효과를 도시한 도표이다. 여기서, TBZF는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 약칭한 것이다.

도 10a 및 도 10b는 TNF 및 IL-1β에 의한 NF-κB 활성화에 미치는 본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질의 효과를 도시한 도표이다. 여기서, TBZF는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 약칭한 것이다.

도 11은 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드 pCR2.1TOPO-TBZF의 지도이다.

도 12는 항체의 제조를 위해 면역원으로 사용하기 위한 본 발명의 TRAF6 억제 단백질-GST 융합 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드 pGEX5X-3-TBZF의 지도이다.

도 13은 COS 세포주에 발현된 TRAF6 및 TRAF6 억제제 단백질의 세포내 분포를 보여주는 공촛점 현미경사진(배율 400배)이다. 여기서, 사진 a는 세포의 전체적인 형태를 보여주는 일반 광학현미경 사진이고, 사진 b는 핵내에 발현된 TRAF6 억제 단백질의 약한 신호를 보여주는 공촛점 현미경사진이며, 사진 c는 핵주변 세포질 영역에서의 GFP로 태그된 TRAF6의 분포를 보여주는 공초점 현미경사진이고, 사진 d는 TRAF6 억제 단백질 및 TRAF6이 분리된 세포내 영역에 공동으로 위치해 있음을 보여주는 공초점 현미경사진이다.

도 14a 및 도 14b는 각각 파골세포발생 개시전에 TRAF6의 과다발현이 Raw264.7 세포가 파골세포로 분화하는 것을 억제함을 증명하는 TRAP-염색된 Raw264.7 세포의 광학현미경 사진(배율 100배) 및 파골세포의 수를 정량한 결과를보여주는 도표이다.

본원에 사용된 용어 "TRAF6 억제 단백질"은 TRAF6와 상호작용하여 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제하는 분리된(isolated) 천연(native) 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 (i) TRAF의 서브타입인 TRAF6과는 결합하나 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, (ii) TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제하고, (iii) N-말단에 KRAB 도메인을 그리고 C-말단에 14개의 아연 핑거 모티브를 갖고 있음을 특징으로 한다. 본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 특정적으로 도 6a에 제시된 569개의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드 및 이들의 스플라이싱 및 대립형질 변이체를 포함한다.

용어 "천연 폴리펩타이드"는 사람 또는 비-사람 포유동물 종의 모든 세포 유형에 존재하는 폴리펩타이드로서 개시 메티오닌이 존재하거나 부재된 모든 것을 포함할 뿐만 아니라 천연 공급원으로부터 정제되거나, 화학적으로 합성되거나, DNA 재조합 기술에 의해 생성되거나, 이들 및/또는 기타 방법의 조합에 의해 제조된 모든 것을 포함한다. 이런 관점에서, 사람은 물론 돼지, 개, 말 등과 같은 다른 포유동물 종으로부터 수득된 천연 폴리펩타이드 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질에는 그의 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다. 용어 "기능적 유도체"는 통상적으로 천연 폴리펩타이드와 동일하면서 실질적으로 대등한 생물학적 활성을 나타내는 화합물을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 천연 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체가 천연의 TRAF6 억제단백질과 대등한 생물학적 활성을 갖는다는 것은상기 유도체가 TRAF의 서브타입인 TRAF6과는 결합하나 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제하는 것의 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 천연 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체는 도 6a에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드의 기능적 유도체이다. 기능적 유도체는 천연 TRAF6 억제 단백질, 바람직하게는 사람 TRAF6 억제 단백질과 바람직하게는 약 60% 이상, 더욱 바람직하게는 약 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는 기능적 유도체는 천연TRAF6 억제 단백질의 TRAF6-결합 도메인, 예를 들면 사람 TRAF6 억제 단백질의 경우 폴리펩타이드(26 내지 1729의 개방 판독 프레임)에 해당하는 부위와 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 것이다.

본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체의 예로는 그 단백질 내의 아연 핑거 모티프가 세포 내에 다양하게 존재하는 공지의 다른 아연 핑거 모티프로 대체된 화합물을 들 수 있다.

본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체는 고유 생물학적 활성이 멸실되지 않는 한 천연 단백질 아미노산 중 일부가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체를 포함한다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro); 소수성 또는 방향족 아미노산(Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Trp); 산성 아미노산(Asp, Glu); 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn); 및 황-함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 TRAF6 억제 단백질이 TRAF6와 상호 작용하지 않는 부위 또는 아연 핑거 모티프의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

여러 포유동물 종으로부터 얻은 천연 TRAF6 억제 단백질의 단편(fragment)으로서 천연의 TRAF6 억제단백질과 실질적으로 대등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드는 천연 TRAF6 억제 단백질의 기능성 유도체의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 용어 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의범위내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며, 천연에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다. 또한, 천연 TRAF6 억제 단백질의 안정성, 저장성, 용해도 등을 변경시키기 위한 변형 또는 예를 들어 TRAF6과 같이 TRAF6 억제 단백질과 상호 작용하는 물질과의 관계를 변경시키기 위해 변형을 가한 기능성 유도체도 본 발명에 따른 천연 TRAF6 억제 단백질의 기능성 유도체의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다.

또 다른 바람직한 그룹의 천연 TRAF6 억제 단백질의 기능성 유도체는 천연 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산의 상보 서열과 긴축(stringent) 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다.

천연 단백질 또는 이의 기능적 유도체와 관련하여 사용되는 용어 "동일성" 또는 "상동성"은 천연 단백질 또는 이의 기능적 유도체의 아미노산 잔기와 동일한 상응하는 후보 서열을 배양하고 필요한 경우 최대 상동성 비율을 얻기 위해 갭을 도입한 후(서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존 치환도 고려하지 않음) 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 비율을 가리킨다. 서열의 배열을 위해 사용되는 방법 및 컴퓨터 프로그램은 본 분야에 잘 알려져 있다.

용어 "긴축 조건"은 여러 가지 방법에 의해 제공될 수 있는데 이러한 방법의 한 가지 예로는 20% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 μg/ml 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중, 42℃에서 밤새 배양하는 것이다. 긴축 조건을 위한 다른 방법은 42℃의 온도하에 5 x SSPE(0.18 M NaCl, 0.01 M NaPO₄(pH 7.7), 0.0001 M EDTA) 완충액중의 30% 포름아미드를 포함하는 완충액에서 하이브리드화하고 이어서 42℃에서 0.2 x SSPE로 세척하는 것이다. 바람직하게는 긴축 조건은 42℃의 온도하에 5 x SSPE중의 50% 포름아미드를 포함한 하이브리드화 완충액을 사용하고 동일한 온도에서 0.2 x SSPE로 세척하는 것이다.

단백질 또는 폴리펩타이드 또는 핵산과 관련하여 사용된 용어 "분리된"은 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 핵산과 천연 환경에서 결합되어 있는 물질중 적어도 일부로부터 그 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 핵산이 유리된 상태를 의미한다. 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드는 주어진 시료에서 전체 단백질의 약 2 중량% 이상, 바람직하게는 약 5 중량% 이상을 구성한다. 분리된 핵산은 주어진 시료에 존재하는 총 핵산의 약 0.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 5 중량% 이상을 차지한다.

본 발명자들은 사람 TRAF6의 일부인 TRAF dm(1-274aa)을 베이트로 하여, 효모 2중 스크리닝 방법으로 사람 cDNA 라이브러리를 스크리닝한 결과 TRAF6과 특히 강하게 결합하는 클론을 얻었으며, 상기 양성 클론의 cDNA를 수거하여 그 서열을 분석함으로써 도 5(서열 6)의 서열을 얻게 되었다. 진뱅크(Genebank) BLAST 상동성 조사를 이용한 서열 분석 결과, 상기 서열은 아직까지 보고되지 않은 새로운 단백질인 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 수득된 본 발명의 신규한 TRAF6 억제 단백질은 KRAB 도메인과 14개의 아연 핑거 반복체를 갖고 있으며, 인간 아연 핑거 단백질 85와 가장 높은 상동성을 나타낸다(도 6b 및 6c). 인간 아연 핑거 단백질 상과에 속하는 많은 구성원들은 전사 억제인자 도메인, KRAB 도메인 및 반복된 아연 핑거 모티프를 포함하고, DNA에 특이적으로 결합하여 전사 활성을 억제하는 것으로 확인되었고 최근에 표적 단백질에 결합하여 기능을 억제하는 새로운 아연 핑거 단백질들이 다른 연구진에 의해 동정되기도 하였다(Karen and Rudi, FEBS Letters, 442, 147-150, 1999; Lei et al., Molecular Cell, 6, 757-768, 2000; Song et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93, 6721-6725, 1996). 그러나, 본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 이들 공지된 단백질과 아미노산 서열에서 있어서 실질적으로 차이가 있다. 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 서열내 기능적 모티프(KRAB 및 아연 핑거 도메인)의 존재는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질가 전사 조절인자임을 강력하게 시사한다. 본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질의 아연 핑거는 C₂H₂형이다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 시험관내 효모 2중 하이브리드 실험으로 분석한 결과 TRAF6과 선택적으로 결합하고 TRAF2, TRAF3, 기타 LRRY 및 pGBT9 발현과는 결합하지 않는 것으로 나타났다(표 3). 나아가, 293T 세포를 분획하여 세포내 분포를 조사한 결과, TRAF6 억제 단백질과 TRAF6이 동일한 아세포적 위치에 존재하는 것으로 판명되었고(도 7), TRAF6 억제 단백질 유전자로 형질전환된 293T 세포로부터 공동면역침전 실험에서도 동일한 결과가 확인되었다(도 8a). 이와 같은 아연 핑거의 존재 및 TRAF6 억제 단백질의 과잉 발현 시 TRAF6, RANK 및 IL-1β에 의한 NF-κB의 활성화와 TRAF6에 의한 AP-1의 활성화를 차단한다는 실험 결과(도 9a 내지 도 10b)는 본 발명의 TRAF6 억제 단백질이 TNF 신호전달 경로에 있어서 TRAF6의 기능을 조절하는 중요한 조절인자, 특히 NF-κB 및 AP-1의 활성을 억제하는 인자임을 증명하는 것이다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 TRAF6와 결합하는 능역을 기초로 하여 그들의 mRNA를 발현하는 조직으로부터 동정 및 정제할 수 있다. 조직의 예로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 폐, 간, 골격근육, 비장, 뇌, 신장 등이 포함된다. 천연 TRAF6 억제 단백질은 면역침전된 TRAF6와 공동침전된다. 바람직한 양태로서, 방사능표지된 TRAF6을 단백질 A-아가로즈(Oncogene Science) 또는 단백질 A-세파로즈(Pharmacia)와 면역침전시킨다. 그런 다음 면역침전물을 사용된 방사능표지에 따라 자기방사기록법(autoradiography) 또는 형광분석법(flurography)으로 분석한다. 본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 TRAF6 또는 이의 유도체와 공동침전시키고 친화성 컬럼에서 정제하는 것과 같이 본 분야에 알려진 방법에 의해 정제할 수 있다. 대규모의 정제를 위해서는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67, 31-40, 1998]에 공개된 것과 유사한 방법을 사용할 수 있다. 정제될 TRAF6 억제 단백질을 함유하는 세포 용해물을 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-TRAF6 융합 단백질 친화성 컬럼에 적용한다. 컬럼에 결합된 단백질을 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 용출, 침전 및 분리하고 예를 들면 은 염색으로 시각화한다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질, 이의 기능적 유도체, 단편 및 상기된 모든 변형체는 펩티드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법 중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. 펩티드 합성의 유기 화학적 방법은 균질상에서 또는 소위 고체상의 보조하에 축합 반응에 의해 필요한 아미노산을 커플링시키는 것을 포함한다. 축합 반응에 관한 가장 통상적인 방법으로는 카르보디이미드 방법, 아지드 방법, 혼합 무수물 방법 및 활성 에스테르를 사용한 방법이 있는데, 이들 방법에 대해서는 문헌[ThePeptides Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3(Gross, E. 및 Meienhofer,J. 편집), 1979-1981(Academic Press Inc.)]에 개시되어 있다.

특히 적합한 고체상으로는 문헌(Wang, J. Am. Chem. Soc., 95, 132, 1974)에 기재된 p-알콕시벤질 알코올 수지(4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)가 있다. 합성 후 펩티드는 부드러운 조건하에 상기 고체상으로부터 분리될 수 있다. 목적하는 아미노산 서열의 합성 후, 수지로부터 펩티드의 탈리는 트리이소프로필 실란, 아니솔 또는 에탄디티올, 티오아니솔과 같은 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 사용하여 실시한다. 축합 반응에 관여할 수 없는 반응성기는 산, 염기를 사용하여 가수분해시키거나 또는 환원시킴으로써 매우 용이하게 다시 제거될 수 있는 기에 의해 효과적으로 보호된다. 가능하게 사용될 수 있는 보호기에 대해서는 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9(Gross, Udenfriend and Meienhofer 편집) 1979-1987(Academic Press Inc.)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.

특히 바람직한 TRAF6 억제 단백질, 이의 기능적 유도체, 단편 및 상기된 모든 변이체의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 천연 TRAF6 억제 단백질 유전자를 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 용해물을 만들거나 TRAF6 억제 단백질 mRNA를 시험관내 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 TRAF6 억제 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 용해물 또는 시험관내 번역물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등이 그 예이다. 친화성 컬럼은 예를 들어 항-TRAF6 억제 단백질 항체 또는 TRAF6를 이용하여 만들 수 있다. TRAF6 억제 단백질은 또한 분비 단백질 형태로 발현되어 세포 배양물로부터 수거될 수 있다. 일반적인 재조합 DNA 기술은 예를 들면 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1989]에 기술되어 있다.

천연 TRAF6 억제 단백질의 기능적 유도체를 포함한 아미노산 서열 변이체는 본 분야에 공지된 방법에 따라 천연 TRAF6 억제 단백질 DNA내로 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나 목적하는 폴리펩타이드의 시험관내 합성에 의해 제조한다. 아미노산 서열 변이체는 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이 성질의 두 가지 주요 변수가 있다. TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 조작이 필요 없는 천연 대립유전자를 제외하고, TRAF6 억제 단백질의 아미노산 서열 변이체는 바람직하게는 천연적으로 존재하지 않는 대립형질 또는 아미노산 서열 변이체가 형성되도록 DNA를 변이시켜 작제한다. 천연 단백질내의 표적 잔기를 동정하고 아미노산 서열 변이체를 제조하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들면 미국특허 제5,108,901호에 기술되어 있다. 바람직한 기술로는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법 등이 포함되며 이들은 모두 상기 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1989] 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, in Molecular Biology, Ausubel etal eds., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991]에 기술되어 있다.

본 발명은 TRAF의 서브타입인 TRAF6와는 결합할 수 있되 TRAF2 및 TRAF3와는 결합하지 않으며, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1이 매개하는 생리 활성을 억제할 수 있고, N-말단에 KRAB 도메인을 그리고 C-말단에 14개의 아연 핑거 모티브를 가지고 있는 도 6a의 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산서열을 제공한다. 핵산 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 천연형 단백질과 그의 기능적 동등물 및 기능적 유도체를 코딩하는 핵산서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다.

TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산서열은 포유 동물, 바람직하게는 사람으로부터 기원하는 것이다. TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산서열은 더욱 바람직하게는 코돈 축퇴(codon degeneracy)에 의해 도 6a(서열 7)에 제시된 아미노산 서열의 단백질을 코딩하는 핵산서열, 특히 바람직하게는 도 5(서열 6)에 제시된 핵산 서열이다. TRAF는 각각 N-말단에 고리(ring)와 아연 핑거 모티프를 가지고 있고 C-말단에 각종 TRAF 단백질간에 고도로 보존된 서열인 TRAF 도메인을 가지고 있는 것으로서 당업계에서 통상 지칭되는 TNF와 작용하는 일군의 어댑터(adaptor)이므로, 본 발명의 목적상, 단백질 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산서열은 예를 들면 TRAF mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 믿어지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, TRAF6 단백질을 발현하는 것으로 알려진 세포주로부터 폴리아데닐화된 mRNA를 수득하고 이 mRNA를 이본쇄 cDNA를 합성하는 주형으로 사용함으로써 cDNA 라이브러리를 작제할 수 있다. 또한, TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 DNA는 사람 게놈 코스미드 라이브러리와 같은 게놈 라이브러리로부터 수득할 수 있다.

cDNA 또는 게놈 라이브러리는 해당 유전자 또는 이에 의해 코딩된 단백질을 동정하기 위해 고안된 탐침으로 스크리닝한다. cDNA 발현 라이브러리의 경우, 적합한 탐침으로는 TRAF6 억제 폴리펩타이드를 인식하고 이와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체가 포함된다. cDNA 라이브러리에 적합한 탐침은 예를 들면 동일하거나 상이한 종으로부터의 TRAF6 억제 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 탐침, 보통 약 20 내지 80개 염기의 길이를 갖는 염기 서열을 포함한다. 게놈 DNA 라이브러리을 스크리닝하는데 적합한 탐침으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 동일하거나 유산한 폴리펩타이드를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드, cDNA 또는 이의 단편 및/또는 이의 동종(homologous) 게놈 DNA 또는 단편이 포함된다. cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선택된 탐침으로 스크리닝하는 것은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 기술된 표준 방법에 따라 실시할 수 있다.

또한, TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 cDNA는 다른 공지된 재조합 DNA 기술, 예를 들면 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al eds.,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991]에 기술된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하거나 직접적인 발현 클로닝에 의해 동정 및 분리할 수 있다. 이 방법은 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 DNA와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침의 사용을 필요로 한다.

본 발명이 예시하고 있는 바와 같이, TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 효모 2중 하이브리드(yeast two-hybrid system) 방법을 사용하여 수득할 수 있다[Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991); Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1992)]. 효모 2중 하이브리드 방법은 두 종류의 융합 단백질을 사용하는 것이다. 효모의 GAL4와 같은 많은 전사 활성인자들은 두 개의 물리적으로 분리되는 모듈 도메인, 즉 DNA-결합 도메인과 전사 활성 도메인으로 구성되어 있다. GAL4의 DNA-결합 도메인에 TRAF6, 바람직하게는 그의 결실 변이체인 TRAF6 dm(1-274aa)을 융합시키고(베이트 플라스미드), GAL4 전사 활성 도메인에 스크리닝하고자 하는 단백질을 융합시킨다 (프레이 플라스미드). GAL4 활성이 단백질간의 결합에 의해 재구성(reconstitution)되면 GAL4-프로모터 하의 GAL1-lacZ 리포터 유전자가 발현된다. 따라서, 결합하는 폴리펩타이드를 가진 콜로니는 β-갈락토시다제 활성을 측정하여 검출할 수 있다. 효모 2중 하이브리드 시스템은 상용화되어 있다[Matchmaker(Clontech)]. 본 발명자들은 사람 TRAF6의 일부인 TRAF6 dm(1-274aa)을 베이트로 하여, 효모 2중 스크리닝 방법으로 사람 cDNA 라이브러리를 스크리닝 한 결과 TRAF6와 특히 강하게 결합하는 클론을 얻었으며, 상기양성 클론의 cDNA를 수거하여 그 서열을 분석함으로써 도 5(서열 6)의 뉴클레오타이드 서열을 얻게 되었다.

본 발명에 의해 TRAF6 억제 단백질 유전자의 서열이 밝혀짐에 따라, 이 유전자는 또한 문헌[Engels and Uhlmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989)]에 기술된 방법중 어느 하나에 따라 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 이들 방법에는 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법 및 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성이 포함된다.

본 발명은 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 TRAF6 억제 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 정의상 벡터는 적당한 숙주 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열(regulatory sequences)에 작동 가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하기 위해 도입되는 서열들을 함유하는 DNA 작제물을 말한다. 그러한 조절 서열에는 전사를 조절하기 위한 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위해 선택적으로 부가된 오퍼레이터(operator), 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위 및 전사/번역의 종료를 조절하는 서열들이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 게놈에 삽입된 것일 수 있다. 본 발명에서 특히 예시된 것에는 pCR2.1 TOPO-TBZF 등의 클로닝 벡터와 pRK-Flag-TBZF, pVP16-TBZF 등의 발현 벡터가 있다. 여기서 TBZF는 본 발명에 따른 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 유전자를 가리킨다.

그러나, 본 발명의 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하도록 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하도록 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동 가능하도록 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하도록 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하도록 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하도록 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명은 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포 내지 세포주(이하, 숙주 세포)를 제공한다. 상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 본 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 효모 또는 동물 세포, 특히 바람직하게는 293T 세포 또는 293/EBNA 세포이다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 TRAF6와의 결합 능력을 기초로 하여 천연 TRAF6 단백질 또는 이들의 기능상 유도체 또는 각종 변이체 및 단편을 분리 및 정제하는데 사용할 수 있으며, 차례로 정제된 천연 TRAF6 단백질 또는 이들의 기능상 유도체 또는 각종 변이체 및 단편은 이들이 특이적으로 결합하는 TNF 수용체 상과의 각종 일원(예, TNF, CD40)을 정제하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질, 특히 다량 발현된 TRAF6 억제 단백질을 이용하여 TRAF6 억제 단백질과 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 TRAF6 단백질 또는 이의 유도체, 변이체 또는 단편을 분리 및/또는 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 TRAF6 억제 단백질과 후보 분자의 혼합물을 배양하고 복합체를 분리하며, 분리된 복합체로부터 TRAF6 억제 단백질을 유리 제거함을 포함한다. 복합체의 분리는 통상적인 다양한 분리 방법으로 수행할 수 있다. TRAF6 억제 단백질을 고정시킨 친화성 컬럼, 안티-이디오트 타입 항체를 이용한 친화성 컬럼, 효모 2중 하이브리드 시스템 등이 그 예이다.

본 발명은 TRAF6 억제 단백질은 TRAF6/TRAF6 억제 단백질의 결합을 조절하는 치료학적 활성 물질의 선도 화합물을 동정하는 검정에 유용하게 사용될 수 있다. 특정적으로, TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 형성을 억제하거나 이미 형성된 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 해리를 방지 또는 억제하는 선도 화합물은 통상적인 방법에 의해 동정될 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 또는 TRAF6의 활성을 조절하는 분자를 스크리닝하는 방법, 특히 TRAF6/TRAF6 억제 단백질의 결합을 조절하는 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 스크리닝된 분자들은 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 해리(dissociation)를 방지 또는 억제하거나 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 상호작용을 억제하는 것이다. 이 방법은 TRAF6 및 TRAF6 억제 단백질을 포함한 혼합물을 후보 분자와 배양하고 후보 분자가 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 결합을 조절하는 능력, 예를 들면 TRAF6와 TRAF6 억제 단백질의 상호작용을 억제하거나 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 해리를 방지 또는 억제하는 능력을 검출함을 포함한다.

TRAF6 억제 단백질과 TRAF6의 상호작용을 방지하는 분자는 면역체계의 강화할 필요가 있는 상황에 유용할 수 있다. TRAF6 억제 단백질/TRAF6 복합체의 해리 억제제는 면역억제제 또는 항염증제로서 유용할 수 있다. 또한, 스크리닝 검정은 TRAF6 단백질이 결합하는 TNF 수용체 상과 일원의 천연 리간드, 예를 들면 TNF, CD40 리간드 등의 생물학적 활성을 모사하는 선도 화합물을 탐지하도록 설계될 수 있다. 이들 스크리닝 방법은 후보 분자가 TRAF6 억제 단백질의 억제로부터 TRAF6를 방출시키는 능력에 대해 후보 분자를 검정하는 것을 포함한다.

검정은 다양한 포맷으로 실시할 수 있으며 예를 들면 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정, 세포-기본 검정 등이 포함된다. 이러한 검정 포맷들은 본 분야에 잘 알려져 있다.

검정 혼합물은 전형적으로 TRAF6 억제 단백질과 이 억제제가 보통 부분적으로 순수한 또는 순수한 분리된 형태로 정상적으로 결합하는 TRAF6 단백질을 함유한다. 이들 화합물중 하나 또는 둘 다는 예를 들면 단백질-단백질 결합을 제공하거나 증강시키고/거나 검정 조건하에서 안정성을 향상시킬 수 있는 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 또한, TRAF6 억제 단백질 및/또는 TRAF6는 보통 검출 표지를 포함하거나 이에 결합된다. 표지는 방사성, 형광, 발광, 흡광도 등을측정하기 위한 직접적인 검출을 제공하거나 에피토프 태그, 효소 등과 같은 간접적인 검출을 제공할 수 있다. 검정 혼합물은 추가로 후보 분자(예, 약물)를 함유하고 임의로 다른 여러 가지 화합물, 예를 들면 완충제, 캐리어 단백질(예, 알부민), 세정제, 프로테아제 억제제, 염, 뉴클레아제 억제제, 항균제 및 기타 결합 촉진, 안정성 증가, 비특이적 또는 배경 상호작용의 감소 또는 검정 효율 또는 감도의 개선을 위한 화합물을 함유할 수 있다.

TRAF6/TRAF6 억제 단백질 결합의 억제제를 스크리닝하는 경우, 검정 혼합물은 후보 분자가 존재하는 경우를 제외하고 TRAF6 억제 단백질이 TRAF6과 기준 결합 친화성으로 특이적으로 결합하도록 하는 조건하에서 배양한다. 혼합물의 성분들은 필요한 결합을 제공하는 한 어떠한 순서로도 첨가될 수 있다. 배양은 최적의 결합을 촉진하는 어떠한 온도에서도 수행할 수 있으며, 전형적으로는 약 4℃ 내지 40℃, 보다 일반적으로는 약 15℃ 내지 40℃이다. 배양 시간은 최적의 결합을 위해 선택해야 하나 고속의 스크리닝을 촉진하기 위해 최소로 해야한다. 전형적인 배양 시간은 약 0.1 내지 10시간이고, 바람직하게는 5시간 미만이며, 더욱 바람직하게는 2시간 미만이다. 배양 후 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 결합에 후보 분자가 미치는 효과는 통상적인 방법으로 결정한다. 세포-유리 결합-형 검정의 경우, 결합 성분과 비결합 성분을 분리하기 위해 흔히 분리 단계를 사용한다. 분리는 예를 들면 침전(예, TCA 침전, 면역침전), 고정(예, 고체 기질상 고정)한 다음 세척하여 실시할 수 있다. 결합된 단백질은 편리하게는 이에 부착된 검출 표지를 이용함으로써, 예를 들면 방사능 방출, 흡광도 등을 측정하여 검출하거나 항체 결합체와 같은 것을 사용하여 간접적으로 검출한다.

TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 해리를 억제하거나 방지하는 화합물은 편리하게는 후보 화합물의 부재하에서 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체를 형성하고, 형성된 혼합물에 후보 화합물을 첨가하며, 후보 화합물이 존재하는 경우를 제외하고 TRAF6이 복합체로부터 유리되도록 조건을 변화시킴으로써 동정할 수 있다. 이것은 예를 들면 배양 온도를 변화시키거나 혼합물에 후보 화합물의 부재하에서 복합체로부터 TRAF6을 유리시키는 후보 화합물을 첨가함으로써 달성할 수 있다.

TRAF6 단백질이 결합하는 TNF 수용체 상과 일원의 천연 리간드(예, TNF, CD40 리간드 등)의 생물학적 활성을 모사하는 치료학적 활성 물질의 선도 화합물을 동정하는 경우는 후보 화합물을 TRAF6와 TRAF6 억제 단백질의 혼합물에 첨가한다. TRAF6와 TRAF6 억제 단백질의 상대적인 비율 및 배양 조건은 후보 화합물이 첨가되기 이전에 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체가 형성되도록 하는 정도로 선택한다. 후보 화합물을 첨가한 후 후보 화합물이 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체로부터 TRAF6을 유리시키는 능력을 검사한다. 전형적인 검정 조건, 예를 들면 배양 온도, 시간, 결합 및 비결합 물질의 분리 및 검출 등은 상기된 바와 같이 설정한다. 후보 화합물을 첨가했을 때 후보 화합물이 TRAF6-매개된 신호 전달 경로를 개시하는 능력이 검출된다. 결과적으로 통상적인 방식으로 후보 화합물이 TRAF6-매개된 NF-κB 활성화를 유도하는 능력을 측정할 수 있다. 바람직한 방법에 따라, E-셀렉틴-루시퍼라제 리포터 작제물(Schindler and Baichwal, Mol. Cell. Biol. 14, 5820 (1994))과 같은 NF-κB-의존 리포터 유전자를 세포 유형 검정에서 사용한다. 루시퍼라제 활성은 β-갈락토시다제 발현을 기준으로 결정되고 규정화된다. 다른 방법으로서, NF-κB 활성화는 전기영동 이동 검정법(Schutze et al., Cell 71, 765-776 (1992))으로 분석할 수 있다. 그러나, 다른 통상적인 생화학적 검정법이 복합체 형태로부터 TRAF6의 유리를 검출하는데 마찬가지로 적합하다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 이 단백질이 TRAF6-매개된 신호 전달을 억제하는 능력을 차단하거나 모사하는 길항 또는 효능 항-TRAF6 억제 단백질 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. TRAF6 억제 단백질에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 공지의 기술을 용이하게 이용하여 제조할 수 있다(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Second Ed., James W. Goding, Academic Press (1986)). TRAF6 억제 단백질에 대한 항체, 항체의 단편(예, Fab 단편), 인간화 항체, 세포 독성 물질에 콘쥬게이트된 항체 등이 본 발명의 항체 범위에 포함된다.

본 발명의 TRAF6 억제 단백질에 대한 모노클로날 항체는 특정 양태로서 아래의 방법에 의해 얻을 수 있다. 즉, 모노클로날 항체의 제작에 필요한 면역용 항원으로서는 천연 TRAF6 억제 단백질 또는 유전자 재조합 TRAF6 억제 단백질을 이용할 수 있다. 각각의 항원에 의해 포유동물을 면역하던가, 혹은 인비트로법에 의해 면역화한 임파구세포를 골수종 세포주(미에로머) 등과 융합시켜 통상적인 방법에 의해 하이브리도마를 생성한다. 이 하이브리도마 배양액에 대하여 고도로 정제된 각각의 항원을 사용하여 고체상(solid phase) ELISA에 의해 각각의 항원을 인식하는 항체 생산 하이브리도마를 선별한다. 얻은 하이브리도마를 클로닝하고, 얻은 안정한 항체 생산 하이브리도마를 각각 배양하여 목적하는 항체를 수득한다. 하이브리도마의 제작에 마우스와 랫트를 사용할 수 있다.

면역은 항원을 적당한 용매, 예컨대 생리식염수 등에서 적당한 농도로 희석하고, 이 용액을 정맥내 또는 복강내에 투여하고, 이의 필요에 따라 프로인드 완전 아쥬번트를 병용 투여하고, 동물에 1 내지 2주간 간격으로 3 내지 4회 정도 투여하는 방법이 일반적이다. 이렇게 하여 면역화된 동물을 최종 면역 후 3-4일째에 해부하고, 적출한 비장에서 얻은 비장세포를 면역세포로서 사용한다. 면역세포와 세포융합하는 마우스 유래의 미에로머로서는, 예컨데 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, 653 및 S194 등이 사용될 수 있다. 또한, 랫트 유래의 세포로서는 R-210 등의 세포주가 사용될 수 있다. 사람형의 항체는 사람 B임파구를 인비트로로 면역화하고, 사람 미에로머 세포와 EB 바이러스에 의해 형질 전환된 세포주와 세포융합시킴으로써 제조할 수 있다.

면역화된 세포와 미에로머 세포주와의 융합은 공지의 방법, 예컨대 쾨흘러(Koehler)와 밀스테인(Milstein)의 방법(Koehler et al., Nature 256, 495∼497, 1975)이 일반적으로 사용되지만, 전기 펄스를 이용한 전기펄스법 등이라도 좋다. 면역 임파구와 미에로머 세포주는 통상 행해지고 있는 세포수의 비율로 혼합하고, 일반적으로 사용되는 소 태아혈청(FCS) 불합류 세포배양용 배지에 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 융합처리를 하고, FCS 첨가 HAT 선택배지로 배양을 하여 융합세포(하이브리도마)를 선별한다. 이어서, 항체를 생산하는 하이브리도마를 ELISA, 프라그(plague)법, 옥타로니(ouchterlony)법, 응집법 등 통상 이용되는 항체의 검출방법에 의해 선택하고, 안정한 하이브리도마를 수립한다. 이렇게 하여 수립된 하이브리도마를 통상의 배양 방법에 의해 계대배양 가능하고, 필요에 따라 동결 보존할 수 있다. 하이브리도마를 통상법에 의해 배양하여 그 배양액을 회수하거나 또는 그 배양액을 포유동물의 복강내로 이식하여 복수(腹水)에서 항체를 회수할 수 있다. 배양액 혹은 복수중의 항체는 염석법, 이온교환 및 겔여과 크로마토그라피, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그라피 등 통상 사용되는 방법에 의해 정제할 수 있다. 이러한 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체의 거의 모두는 천연 TRAF6 억제 단백질뿐만 아니라 이의 기능성 유사체, 변이체 및 단편을 특이적으로 인식할 수 있다. 이들 항체는 방사성동위원소 또는 효소 표지에 의해 방사선면역검정(RIA) 및 효소면역검정(EIA)으로 알려져 있는 측정 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 특정 양태로서, TRAF6 억제 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체는 다음과 같이 생성할 수 있다. TRAF6 억제 단백질을 발현하는 숙주 세포를 분쇄하고 이로부터 OCIF 고정화 컬럼 및 겔여과 크로마토그라피에 의해 정제함으로써 면역용 항원으로 사용될 천연 TRAF6 억제 단백질을 얻을 수 있다. 또한, TRAF6 억제 단백질 cDNA를 통상적인 방법에 의해 발현벡터에 삽입하고 형성된 재조합 플라스미드를 CHO세포, BHK세포, 나말와, COS-7세포 등의 동물세포, 곤충세포 혹은 대장균 등으로 발현시킨 후 상기와 동일한 방법으로 정제함으로써 유전자 재조합형 TRAF6 억제 단백질을 얻을 수 있고, 이를 면역용 항원으로서 사용해도 좋다. 다른 방도로서, TRAF6 억제 단백질 cDNA의 5' 말단의 상류측에 다른 분비 단백질 유래 기지의 시그널배열을 코딩하는 염기배열을 부가하고, 상기와 동일하게 유전공학 방법에 의해 발현벡터에 삽입시켜 각종 동물세포, 곤충세포 혹은 대장균 등을 숙주로 하여 발현하고, 이들 단백질을 정제함에 의해 면역용 항원을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 면역용 항원을 인산염완충 생리식염수(PBS)에 용해하고, 필요에 따라 같은 용량의 프로인드(Freund) 완전 보조제(adjuvant)로 혼합하여 유화한 후, 동물에 약 1주간 간격으로 피하 투여하고, 수회 면역한다. 항체 역가를 측정하고 최고의 항체 역가에 달한 시점에서 추가 접종하고, 투여 10일 후에 모두 채혈을 한다. 얻은 항혈청을 황산암모늄 분획 침전하고, 글로불린 분획을 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 정제하던가, 혹은 항혈청을 결합 완충액(binding buffer, Biorad)으로 2배 희석하고, 그 희석 항혈청을 프로테인 A 또는 프로테인 G 세파로스 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제하여 항-TRAF6 억제 단백질 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다. 안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들면 문헌[Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression." CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]에 기술되어 있다. 삼중 나선 형성은 예를 들면 문헌[Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); 및 Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)]에 기술되어 있다. 이 방법은 상보 DNA 또는 RNA에 폴리뉴클레오타이드의 결합을 기초로 하고 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 도메인을 코딩하는폴리뉴클레오타이드의 5' 코드 부분을 사용하여 길이가 약 10 내지 40개 염기 쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 연루된 유전자의 영역에 상보되도록 설계하며 그럼으로써 TRAF6 억제 단백질의 전사 및 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 하이브리드화하고 TRAF6 억제 폴리펩타이드로의 mRNA 분자의 번역을 차단한다. 상기된 올리고뉴클레오타이드는 또한 세포에 전달시켜 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 TRAF6 억제 단백질의 생성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산은 TRAF6 억제 단백질 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대적인 상보성이 바람직하기는 하나 반드시 요구되는 것은 아니다. 본원에 언급된 "RNA의 적어도 일부분에 상보적인" 서열은 그 RNA와 하이브리드화할 수 있도록 충분한 상보성을 가져 안정한 이중 가닥을 형성할 수 있는 서열을 의미한다. 따라서, 한 가지 양태로서, 이본쇄 TRAF6 억제 단백질 안티센스 핵산의 경우에, 이본쇄 DNA의 일본쇄를 시험하거나 삼중 가닥 형성을 검정할 수 있다. 하이브리드화하는 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이 둘 다에 의존한다. 일반적으로, 하이브리드화 핵산이 크면 클수록 핵산이 함유하고 안정한 이본쇄(또는 삼본쇄)를 형성할 수 있는 TRAF6 억제 단백질 RNA와의 염기 부정합은 더욱 많다. 당업자는 하이브리드화된 복합체의 융점을 결정하는 표준 절차를 사용함으로써 부정합의 허용가능한 정도를 파악할 수 있다.

메시지의 5' 말단(예, AUG 개시코돈을 포함하여 이전까지의 5' 미번역 서열)에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 번역을 억제할 때 가장 효율적으로 작용해야한다. 그러나, mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열은 또한 mRNA의 번역을 억제하는데 효과적인 것으로 제시되어 왔다(Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335). 따라서, NSP의 5'- 또는 3'- 비번역 비암호화 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 내인성 TRAF6 억제 단백질 mRNA의 번역을 억제하는 안티센스 방법에 사용할 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 AUG 출발 코돈의 상보체를 포함해야 한다. mRNA 암호 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 덜 효율적인 번역 억제제이나 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 안티센스 핵산은 TRAF6 억제 단백질 mRNA의 5'-, 3'- 또는 코드 영역에 하이브리드화하도록 설계되었든 아니든 간에 길이가 6개 이상의 뉴클레오타이드이어야 하며 바람직하게는 길이가 6 내지 약 50개 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드이다. 특정한 관점에서 올리고뉴클레오타이드는 10개 이상의 뉴클레오타이드, 17개 이상의 뉴클레오타이드, 25개 이상의 뉴클레오타이드 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드로 구성된다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이들로 한정되는 것은 아니지만 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀴노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린으로 이루어진 그룹중에서 선택된 한 개 이상의 변형된 염기 잔기를 포함할 수 있다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 아라비노즈, 2-플루오로아라비노즈, 크실룰로즈 및 헥소즈로 이루어진 그룹중에서 선택된 한 개 이상의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있고, 그러나 이들로 한정되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이들로 한정되는 것은 아니지만 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포름아세탈 또는 이들의 유사체로 이루어진 그룹중에서 선택된 한 개 이상의 변형된 포스페이트 백본을 포함한다.

또 다른 양태로서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 알파-아노머 올리고뉴클레오타이드이다. 알파-아노머 올리고뉴클레오타이드는 상보성 RNA와 특정 이본쇄 하이브리드를 형성하며 보통의 베타-단위와는 대조적으로 본쇄는 서로 나란히 평행을 달린다(Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)). 올리고뉴클레오타이드는 2-0-메틸리보뉴클레오타이드(Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330(1997))이다.

본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 벡터, TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

추가의 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 발현 벡터, TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여함을 특징으로 하여, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 천식, 관절염, 악액질, 암, 당뇨병, 장염 질환, 발작 및 패혈성 쇼크가 포함된다(Baldwin AS Jr., J Clin Invest. 2001 107:3-6; Baldwin AS., J Clin Invest. 2001 107:241-6; Yamamoto Y, Gaynor RB., J Clin Invest. 2001 107:135-42; 및 Handel ML., Inflamm Res. 1997 46:282-6).

다른 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6억제 단백질에 대한 항체 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여함을 특징으로 하여, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 AIDS, 신경퇴행성 질환, 면역자가 질환, 면역결핍증 및 발작이 포함된다[문헌: Ballard D. W., Immunol Res 23:157-66, 2001; Hayashi T. et al., Apoptosis 6:31-45, 2001; 및 Balla A. et al., Biochem Pharmacol 61:769-77, 2001].

본 발명의 TRAF6 억제 단백질은 파골세포 발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 또 다른 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질, TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 TRAF6 억제 단백질, TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동물에게 투여함을 특징으로 하여, 골대사성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 골대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포의 평형이 깨어짐으로써 발생한다.

대표적인 골 대사성 질환은 골다공증(osteoporosis)이다. 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골의 대사성 질환으로는 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인소인에 의해 발생하는 파게트 질병(Paget's disease) 등이 있다. 골수종은 심한 통증을 동반하면서 뼈가 쉽게 골절이 되는 질환으로 종양세포가 파골세포의 활성을 증진시켜 발생한다. 유방암이나 전립선암은 쉽게 뼈로 전이되어 역시 파골세포의 활성을 증진시켜 뼈를 파괴시킨다. 류마티스성 관절염이나 퇴행성 관절염이 있는 경우에도 면역반응에 의해 생성된 종양괴사인자, 인터루킨-1, 인터루킨-6 등이 관절강에 존재하는 파골세포의 활성을 증진시켜 관절 부위에 국소적인 뼈의 파괴가 일어난다. 치주질환을 일으키는 세균이 감염되어 염증을 일으키면 면역반응의 결과, 종양괴사인자, 인터루킨-1, 인터루킨-6 등 염증성 싸이토카인이 만들어지고 이들이 파골세포의 분화를 촉진시켜 치아를 지지하고 있는 치조골을 파괴하게 된다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 "약제학적으로 허용되는 담체"라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여 될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 약학 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

본 발명의 조성물과 관련하여 사용되는 용어 활성 성분의 "치료학적 유효량"은 동물(특히 사람)에 대한 상기 증세의 치료에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 1mg 내지 약 10mg의 용량 수준(전형적으로 약 50mg 내지 약 500mg/환자 kg/일)이다. 용어 "예방학적 유효량"은 동물(특히 사람)에 대한 상기 증세의 예방에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 0.1mg 내지 약 1mg의 용량 수준(전형적으로 약 5mg 내지 약 50mg/환자/일)을 가리킨다.

환자에 대한 투여량은 사용된 단백질 또는 핵산분자의 활성, 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로, 약물의 배합 및 특정 질환의 종류 등에 따라 당업자가 공지기술을 이용하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 경우, 1회 용량에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 약 25 μg 내지 5 mg이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양하지만 전형적으로 약 0.1mL 내지 약 5 mL이다.

TRAF6 억제 단백질에 대한 항체의 경우 단일 용량형을 만들기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 양은 치료받는 숙주 및 특정 투여방식에 따라 다양할 수 있으나, 예를 들면, 사람에게 경구 투여하고자 하는 제제는 전체 조성물의 약 20 내지 약 40%를 차지할 수 있는 적절하고 편리한 양의 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 50mg 내지 500mg의 항체를 함유할 수 있다. 단위용량형은 일반적으로 항체를 약 10mg 내지 약 50mg을 함유한다. 약제학적 조성물중의 모노클로날 항체는 바이알 등의 유리용기와 주사통 등에 흡착하고 또한 불안정하며, 여러 가지 물리화학적 인자, 예컨대 열, pH 및 습도 등에 의해 쉽게 실활한다. 따라서, 안정한 형으로 제제화하기 위해 안정화제, pH조정제, 완충제, 가용화제, 계면활성제 등을 첨가한다. 안정화제로서는 글리신, 알라닌 등의 아미노산류, 덱스트란 40 및 만노우스 등의 당류, 솔비톨, 만니톨, 크실톨 등의 당알콜 등이 열거되고, 또한 이들의 2종이상을 병용해도 좋다. 이들 안정화제의 첨가량은 항체의 중량에 대하여 0.01 내지 100배, 특히 0.1 내지 10배 첨가하는 것이 좋다. 이들 안정화제를 가함에 의해 액상제제 또는 동결건조제제의 보존안정성을 향상할 수 있다. 완충제로서는 예컨대 인산버퍼, 구연산버퍼등이 열거된다. 완충제는 액상제제 또는 동결건조제제의 재용해 후 수용액의 pH를 조정하고, 항체의 안정성, 용해성에 기여한다. 완충제의 첨가량으로서는 예컨대 액상 제제 혹은 동결건조 제제를 재용해 한 후의 수량에 대해 1 내지 10mM로 하는 것이 좋다. 계면활성제로서는 폴리솔베이트 20, 프르로닉(pulluronic) F-68, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으며 특히 바람직하게는 폴리솔베이트 80이 열거되고, 또 이들의 2종 이상을 병용해도 좋다.

상기한 바와 같이 항체와 같은 고분자 단백질은 용기의 재질인 유리와 수지 등에 흡착하기 쉽기 때문에, 계면활성제를 첨가하는 것에 의해 액상제제 혹은 동결건조제제의 재용해 후 항체의 용기로의 흡착을 방지할 수 있다. 계면활성제의 첨가량으로서는 액상제제 혹은 동결건조제제의 재용해 후 물 중량에 대해 0.001 내지 1.0% 첨가함이 좋다. 이상과 같은 안정화제, 완충제 혹은 흡착방지제를 가하여 본 발명 항체의 제제를 조제할 수 있지만, 특히 의료용 또는 동물약용 주사제로서 이용하는 경우는 삼투압비로서 허용되는 삼투압비는 1 내지 2가 좋다. 삼투압비는 약제화시에 염화나트륨의 증감에 의해 조제할 수 있다. 조제중의 항체 함량은 적용질환 적용투여경로 등에 따라 적절히 조정할 수 있고, 사람에 대한 사람형화 항체의 투여량은 항체의 사람 단백질 NSP에 대한 친화성, 즉 사람 단백질 NSP에 대한 해리정수(Kd값)에 의존하고, 친화성이 높은(Kd값이 낮은) 만큼 사람에 대한 투여량을 적게해도 약효를 발현할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1) 베이트 플라스미드 작제

베이트로 사용된 TRAF6은 인간의 유전자로 GeneBank No. U78798 L81153을 기초로 하였다. 전체길이의 TRAF6(아미노산 1-523)의 전체 개방 판독 프레임(ORF)을 증폭시키기 위하여 프라이머 1(서열 1)과 프라이머 2(서열 2)를 사용하고(이 부분에 해당하는 베이트 벡터를 pGBT9-TRAF6 전체길이로 지칭), TRAF6의 N-말단(아미노산 1-274)을 증폭시키기 위하여 프라이머 1(서열 1)과 프라이머 3(서열 3)을 사용하여(이 부분에 해당하는 베이트 벡터를 pGBT9-TRAF6 dm으로 지칭) 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하였다(표 1).

PCR은 Taq 폴리머라제(Gibco BRL)를 사용하여, 94℃ (1분), 55℃(1분), 72℃(1분)의 주기를 30회 반복하였다. PCR 생성물을EcoRI 및BamHI으로 분해하고, GAL4 DNA 결합 도메인(DB)을 함유하는 벡터 pGBT9(Clontech, Palo Alto, CA)에 각각 서브클로닝하여 베이트 벡터인 pGBT9-TRAF6 전체길이 및 pGBT9-TRAF6 dm을 작제하였다(도 1a 및 1b).

프라이머 서열

pGBT9-TRAF6 전체길이 제작용 프로모터	TRAF6-YF 5'-CGGGATTCAGTCTGCTAAACTGTGAA-3' (프라이머1, 센스: 서열 1)TRAF6-YR1 5'-CGGGATCCCTATACCCCTGCATCAGT-3'(프라이머2, 안티센스: 서열 2)
pGBT9-TRAF6 dm제작용 프로모터	TRAF6-YF 5'-CGGGATTCAGTCTGCTAAACTGTGAA-3'(프라이머 1, 센스: 서열 1)TRAF6-YR2 5'-CGGGATCCGGCCAACATTCTCATGTGT-3'(프라이머 3, 안티센스: 서열 3)
pRK-Flag-TBZF제작용 프로모터	TBZF-F 5'-CGGAATTCGGACTGTTGACATTTAGGGAT-3' (프라이머4, 센스: 서열 4)TBZF-R 5'-ACGCGTCGACTCACACATTCCAGTTCTGTAG-3'(프라이머5, 안티센스: 서열5)

<실시예 2>

베이트 벡터의 베타 갈락토시다아제 기본 전사 활성능 평가

실시예 1에서 작제된 베이트 벡터 pGBT9-TRAF6 전체길이 및 pGBT9-TRAF6 dm이 그 자체로 베타 갈락토시다아제 전사활성 능력을 간직하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 필터 베타 갈락토시다제 분석을 실시하였다. pGBT9-TRAF6 전체길이 및 pGBT9-TRAF6 dm 벡터를 각각 효모 Y190(Clontech)에 열처리 방법(42℃, 15분)으로 형질전환시킨 후, 로이신(Leu) 또는 트립토판(Trp)이 결여된 배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 베이트 벡터가 형질전환되어 있는 효모는 트립토판이 결여된 배지에서 성장할 수 있다. 성장이 된 효모를 필터 페이퍼에 옮긴 후 액체질소에 담그어 급속 냉동처리한 후에 꺼내어 상온에서 녹여 효모의 세포벽을 용해시킨 후에 베타 갈락토시다아제의 기질인 X-gal(Sigma)을 처리하여 청색으로 발색되는 정도를 관찰하였다(표 2).

베이트 벡터인 pGBT9-TRAF6 전체길이만으로 형질전환된 효모와 pGBT9-TRAF6 전체길이와 프레이 벡터인 pGAD424 벡터(Clontech)로 동시에 형질전환된 효모는 청색으로 발색하여 어느 정도 베타 갈락토시다아제 전사 활성 능력을 가지고 있는 양성군으로서 판명되었다. 반면에 pGBT9-TRAF6 dm 베이트 벡터만으로 형질전환시킨 효모 및 상기 베이트 벡터와 함께 프레이 벡터인 pGAD424 벡터로 동시에 형질전환시킨 효모는 발색하지 않음으로서, 베타 갈락토시다아제 전사 활성 능력을 간직하고 있지 않는 음성군으로 판명되었다. 향후 효모 2중 하이브리드 검색에서는 pGBT9-TRAF6 dm 벡터를 베이트 벡터로서 사용하였다.

TRAF6 베이트 작제물의 기본 활성에 대한 시험

pGBT9 중의 결합도메인(BD)	pGAD424중의 전사활성화도메인(AD)	상호작용
TRAF6 전체길이		양성
TRAF6 전체길이	pGAD424	양성
TRAF6 dm		음성
TRAF6 dm	pGAD424	음성

<실시예 3>

효모 2중 하이브리드 시스템을 이용한 TRAF6 단백질에 결합하는 신규 아연 핑거 단백질의 클로닝

TRAF6과 상호작용하는 단백질을 얻기 위하여, 효모 2중 하이브리드 시스템을사용하였다. 효모 2중 하이브리드 분석은 매치메이커 프로토콜(Clontech)에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 먼저 실시예 1에서 제조한 베이트 벡터 pGBT9-TRAF6 dm으로 효모 Y190(Clontech)을 형질전환시킨 후, 상기 효모를 이용하여 컴피턴트(competent) 세포를 제작하고, pGADGH(Clontech)로 만든 HeLa cDNA 라이브러리(프레이 벡터)와 함께 열처리(42℃, 15분)하여 연속 형질전환시켰다. 형질전환된 효모를, 10mM 3-아미노트리아졸(3-AT)(Sigma)이 첨가되고, 로이신, 트립토판 및 히스티딘(His)이 결실된 SD 배지(아미노산이 제거된 0.67% 효모 질소 염기, 1.5% 아가, 10% 10x드롭아웃 용액, 2% 덱스트로스)에서, 30℃하에 배양하였다. 효모 형질전환체를 히스티딘(His) 원영양성(prototropy)과 β-갈락토시다제의 발현에 기초하여 선발하였다. 즉, 히스티딘(His)이 결실된 배지에서 급속히 성장한 효모를 선택하여 필터 베타 갈락토시다아제 검사를 시행하여 14개의 양성 클론을 얻었다.

생육성이 강한 1개의 양성 클론으로부터 미지의 유전자가 결합된 프레이 벡터를 분리하였다. 각종 제한효소로 분해하여 결합된 미지의 유전자의 크기가 약 750 bp인 것을 확인하였다. 자동 서열분석기(ABI PRISM 310 Genetic Analyser)를 사용하여 서열을 확인하고, 진뱅크(GeneBank) BLAST 상동성 조사 프로그램을 이용하여 상기 cDNA 서열을 분석하였다. BLAST 상동성 조사 결과, 상기 클론이 아직까지 보고되지 않은 새로운 단백질임을 알 수 있었다. 상기 단백질은 아연 핑거 부분을 포함하고 있기 때문에 본 발명자들은 처음에 이를 인간 "TRAF6 결합 아연 핑거 (TRAF6-binding zinc finger: TBZF) 단백질"이라고 명명한 바 있으나, 아래 실시예에서 예시된 바와 같이, TRAF6 단백질을 억제하는 활성을 고려하여 본원에서 TRAF6억제 단백질로 표기된다.

TRAF6 억제 단백질의 전체길이를 클로닝하기 위하여 HUVEC cDNA를 사용하여 5' RACE (cDNA 5'-말단의 급속 증폭) 및 3' RACE PCR(GIBCO BRL 제품)을 실시한 결과 1757bp의 TRAF6 억제 단백질 유전자를 얻었다. 이때 유전자 특이적 프라이머 5'-GTTAACAGCTTTTTCACATTCTTC-3' 및 5'-GGCCAGAGCAGAACCATAAAAGAT-3'가 각각 5'RACE 및 3'RACE를 위해 사용되었다. 이로부터 얻은 TRAF6 억제 단백질 전체길이의 cDNA 서열과 이로부터 추론된 아미노산 서열을 각각 도 5(서열 번호 6)와 도 6a(서열 번호 7)에 나타내었다. TRAF6 억제 단백질은 두 개의 특징적인 부분인 KRAB 도메인(아미노산 1에서 63)과 Cys2-His2 유형의 아연 핑거 (C₂H₂) 도메인을 포함하고 있으며(도 6a), 인간 아연 핑거 단백질 85와 상동성을 나타내었다(도 6b 및 6c).

상기한 바와 같이 수득한 TRAF6 억제 단백질의 전체길이 cDNA를 pCR2.1TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하여 TRAF6 억제 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이에 따라 수득된 재조합 플라스미드는 pCR2.1TOPO-TBZF로 명명하고 부타페스트 국제조약하에 국제기탁기관 한국 미생물 배양물 수집소(Korean Collection for Type Cultures)에 2001년 2월 16일에 기탁되어 기탁번호 KCTC-0963BP가 부여되었다. 또한, 본 발명의 재조합 플라스미드 pCR2.1TOPO-TBZF는 이의 유전자 지도가 참고로 도 11에 도시되어 있다.

TRAF6 억제 단백질의 전체길이 cDNA(1757 bp)를 OKpGAD424 벡터의 EcoRI - BamHI 부위에 클로닝하여 TRAF6 억제 단백질을 발현하는 발현 벡터 OKpGAD424-TBZF를 제작하고, 이를 열충격 방법으로 효모 Y190에 클로닝하여 효모에서 GAL4의 전사 활성 도메인과 융합된 재조합 TRAF6 억제 단백질을 발현시켰다.

추가로, 상기 재조합 플라스미드 pCR2.1TOPO-TBZF를 주형으로 하여 PCR 증폭에 의해 약 50bp의 조각 cDNA를 얻었다. 이때 사용한 프라이머는 5'-CGGGATCCCGCATAAGATAAAACATAT-3' 및 5'-AACTGCAGTCACACATTCCAGTTCTG-3'이었다. 이를 제한효소 PstI으로 절단 한 후 단면 말단화시키고 이를 다시 제한효소 BamHI으로 절단하여, 제한효소 BamHI과 SmaI으로 절단한 GST 벡터 pGEX5X-3(Pharmacia) 에 클로닝하였다. 수득된 재조합 플라스미드는 pGEX5X-3-TBZF로 명명하였고 이의 유전자 지도는 도 12에 도시되어 있다.

<실시예 4>

효모 2중 하이브리드 시스템을 이용한 TRAF6 억제 단백질과 TRAF6와의 상호작용 확인

TRAF6 억제 단백질의 결합 특이성을 확인하기 위하여 TRAF 상과에 속하는 TRAF2, TRAF3 그리고 TRAF 상과와 관련이 없는 단백질인 LRRY1과 실시예 3에서 얻은 본 발명의 재조합 TRAF6 억제 단백질과의 상호작용성을 조사하였다.

O-니트로페닐-D-갈락토피라노사이드(Sigma)를 기질로 사용하여 액체 베타 갈락토시다아제 분석을 실시하였다(도 4). TRAF6 dm만이 발현되거나, TRAF6와 GAL4의 전사활성 도메인(AD)만이 발현된 경우의 베타 갈락토시다아제 활성 값은 기저 수준에 머무른 반면 TBZF와 C-말단이 결실된 TRAF6(TRAF6 dm)가 동시에 발현된 경우에는 베타 갈락토시다아제 활성 값이 21 유니트를 나타내었다. TRAF2(아미노산 1-501), TRAF3(아미노산 1-569), TRAF3 dm(아미노산 1-268), LRRY1 또는 GAL4의 DNA 결합 도메인 (pGBT9 벡터)과 TRAF6 억제 단백질이 발현된 경우에도 베타 갈락토시다아제 활성은 매우 낮은 값을 나타내었다. 위 실험은 TRAF6 억제 단백질과 TRAF6 dm간에 특이적 상호작용성이 있음을 나타내는 것이다. 도 4에 나타난 TRAF6 억제 단백질의 결합 특이성은 필터 베타 갈락토시다아제 분석 결과에서도 재확인되었다(표 3).

효모에서의 TRAF6 dm(아미노산 1-274)과 TRAF6 억제 단백질 사이의 상호작용

베이트벡터 (pGBT9)	프레이벡터 (pGAD424)	상호작용
TRAF6 dm		음성
TRAF6 dm	pGAD424	음성
TRAF6 dm	TRAF6 억제 단백질	양성
TRAF2 전체길이	TRAF6 억제 단백질	음성
TRAF3 전체길이	TRAF6 억제 단백질	음성
TRAF3 dm	TRAF6 억제 단백질	음성
LRRY1	TRAF6 억제 단백질	음성
pGBT9	TRAF6 억제 단백질	음성

<실시예 5>

293T 세포에서의 TRAF6과 TRAF6 억제 단백질의 아세포적 분획화

효모 2중 하이브리드 시스템을 통해 TRAF6 억제 단백질이 TRAF6과 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었는 바, TRAF6 억제 단백질과 TRAF6이 동일한 아세포적 위치에 존재하는 지를 조사하기 위하여, 전체길이 TRAF6 억제 단백질 cDNA를 프라이머4 및 프라이머5(표 1)을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 서열을 TRAF6 억제 단백질의 N-말단에 Flag가 표지될 수 있는 포유동물세포 발현 벡터인 pRK-Flag에 삽입하여 pRK-Flag-TBZF 벡터를 제작하였다(도 2a). 또한 증폭된 서열을, TRAF6 억제 단백질의 N-말단에 HA(헤마글루티닌)을 표지할 수 있는 포유동물 세포 발현 벡터 pSRαNtHA에 삽입하여 pSRαNtHA-TRAF6 벡터를 제작하였다(도 2b).

벡터 pRK-Flag-TBZF(도 2a)를 포유동물 세포인 293T 세포(Invitrogen)에 인산칼슘 침전법으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 저온 TMNS 완충액(10mM Tris-Cl, pH 6.8, 100mM NaCl, 3mM MgCl₂, 300mM 슈크로오스)으로 세척하고, 프로테아제 억제제와 포스파타제 억제제를 첨가한 저온 TMNS에 재현탁시켰다. 형질감염된 세포를 재현탁시킨 후, 원심분리(600 x g, 4℃, 5분)하여 핵을 침전시키고, 상청액을 100,000 x g, 4℃에서 75분 동안 재원심분리하였다. 얻어진 상청액(supernatant)은 가용성 단백질을 포함하고, 펠릿(pellet)은 막 기질(membrane matrix) 또는 불용성 물질을 포함한다(Berezney and Coffey, Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 1410-1417, 1974). 핵을 분별하기 위하여, 프로테아제 억제제를 첨가한 완충액 A(10mM Hepes, pH 7.9, 10mM KCl, 300mM 슈크로스, 1.5mM MgCl₂, 0.5mM DTT, 0.5% NP-40)에 600 x g 펠릿을 재현탁시키고, 14,000 rpm, 4℃에서 10초 동안 원심분리하였다. 얻은 2차 펠릿을 완충액 A로 세척하고, 프로테아제 억제제를 첨가한 완충액 B (20mM Hepes, pH 7.9, 20% 글리세롤, 100mM KCl, 100mM NaCl, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 0.5mM DTT)에 재현탁시켰다. 핵 추출물(neclear extract)은 액체 질소로 동결시키고, 얼음상에서 해동시킨 뒤, 초음파처리하고, 14,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 핵은 불용성 핵 기질(insoluble nuclear matrix)과 가용성 염색질 함유 분획(soluble chromatin containing faction)으로 분별 분리하였다.

각각의 분획화된 시료를 SDS-PAGE로 분석하고, 이를 막에 전달시켜 웨스턴 블롯을 수행하였다. 웨스턴 블롯에서는 TRAF6에 대해서는 항-TRAF6 항체(Santa Cruz Biotechnology)로, TRAF6 억제 단백질에 대해서는 항-Flag 항체(Kodak), 그리고 불용성 분획에 나타나는 튜블린(tublin)에 대해서는 항-튜블린 항체(Cedarlane)를 1차 항체로 사용하였다(도 7). 도 7이 나타내는 분획은 다음과 같다: [(N): 핵; 1'S: 가용성 염색질 함유; 2'S: 가용성 핵단백질; P: 불용성 핵기질)], [(C): 세포질; S: 가용성 단백질; P: 막기질 또는 불용성 단백질)].

TRAF6은 핵[(N)]과 세포질[(C)] 양 분획에서 모두 발견되는데 반해, TRAF6 억제 단백질은 세포질 가용성 분획[100,000 x g sup(s)]에서는 검출되지 않았다 (도 7의 레인 15, 16). 이와 같은 결과를 통해 핵 분획과 세포질 불용성 분획에는 TRAF6과 TRAF6 억제 단백질이 공동으로 존재한다는 것을 알 수 있다(도 7).

<실시예 6>

공촛점 현미경에 의한 TRAF6 및 TRAF6 억제제 단백질의 세포내 분포 검증

TRAF6 및 TRAF6 억제제 단백질의 세포내 분포를 확인하기 위하여, TRAF6 억제 단백질 및 TRAF6의 전체길이 cDNA를 각각 pDsRed1-C1 및 pEGFP-C2 벡터내로 아클로닝하여 pDsRed-C1-TBZF 및 pEGFP-C2-TRAF6으로 명명한 재조합 플라스미드를 생성하였다. 사용된 벡터는 Clontech으로부터 구입한 것이다. 제조업체의 지침에 따라 Superfect(Qiagen)을 사용하여 COS-7 세포주를 pDsRed-C1-TBZF 및 pEGFP-C2-TRAF6로 별도로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간이 경과하여, 각 형질감염체를 한국 기초 과학 연구소(한국 대전광역시에 소재)에서 Carl Zeiss Axiovert 135M 형미경 및 LSM410으로 공촛점 검경을 실시하였다. TRAF6 및 TRAF6 억제 단백질은 RFP 및 GFP 융합 단백질로 발현되었다. 도 13에서 보는 바와 같이, TRAF6 및 TRAF6 억제 단백질은 모두 점-유사 구조로서 핵주변 세포질 영역에서 탐지되었다. 또한, TRAF6 억제 단백질의 약한 신호가 핵에서도 관찰되었다(도 13b). 모든 부위에서 나타난 것은 아니지만 많은 부위에서 적색과 녹색 채널이 겹쳐 황색 신호를 나타냈다. 이것은 TRAF6 억제 단백질 및 TRAF6이 분리된 세포내 영역에 공동으로 위치해 있음을 가리킨다(도 13d).

<실시예 7>

포유 동물 세포에서의 TRAF6과 TRAF6 억제 단백질의 상호작용

효모에서뿐만 아니라 포유동물 세포에서도 TRAF6 억제 단백질이 TRAF6과 상호작용하는지를 확인하기 위하여, 공동면역침전 실험을 수행하였다. pRK-Flag-TBZF와 pSRαNtHA-TRAF6 벡터를 상기 실시예 5의 방법에 따라 293T 세포에 인산칼슘 침전법으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 모든 세포를 수집한 후 이 세포로부터 실시예 5의 방법으로 추출한 핵 추출물을 항-Flag 항체 2㎕와 1시간 동안 항온 배양하고, 단백질 A 아가로스(PIERCE) 25㎕와 1시간 동안 항온 배양하였다. 면역침전물을 실시예 5에서 사용한 용균 완충액 B로 5회 세척하였다. 공동침전 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 항-TRAF6 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다(도 8a).

도 8a에 도시된 바와 같이, TRAF6은 TRAF6 억제 단백질과 공동침전하였다. 항-Flag 항체가 TRAF6 억제 단백질을 인식하고, TRAF6 억제 단백질이 TRAF6과 결합하며, TRAF6이 항-TRAF6 항체에 의하여 인식된 것이므로 위 실험은 동물 세포 내에서 이들이 결합하여 작용한다는 것을 시사하는 것이다.

TRAF6과 TRAF6 억제 단백질이 결합하는지에 대하여 포유동물 2중 하이브리드 분석을 추가로 수행하였다. 전체길이 TRAF6의 cDNA를 GAL4 DNA 결합 도메인(DB)를 함유하는 pM 벡터에 서브클로닝하여 pM-TRAF6 전체길이(도 3a)를 작제하였다. TRAF6 억제 단백질의 전체길이 cDNA를 VP16 전사 활성화 도메인(AD)을 함유하는 pVP16 플라스미드에 서브클로닝하여 pVP16-TBZF(도 3b)를 작제하였다. 사용된 발현 벡터인 pM 벡터, pVP16 벡터 및 Gal4/Tx-luc 작제물은 한국의 전남대학교 소속 이재운 교수로부터 제공받았다.

포유동물 2중 하이브리드 분석은 매치메이커 프로토콜(Clontech)에 기재된방법에 따라 실시하였다. 포유동물 세포인 293/EBNA(Invitrogen) 세포를, GAL4 DNA 결합 도메인, VP16 활성화 도메인 및 GAL4/Tx-luc 리포터 유전자를 코딩하는 각 발현 벡터 pM-TRAF6 전체길이(도 3a) 및 pVP16-TBZF(도 3b)로 함께 순간 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 용해 완충액(Reporter lysis buffer, Promega) 150㎕에 용해시켰다. 용해물 20㎕를 루시퍼라제 분석 시약(루시퍼라제 분석 키트, Promega) 50㎕와 혼합하였다. 루시퍼라제 활성은 발광분석계를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 8b에 도시하였다. 수치는 대조군 형질감염에 상대적인 규정화된 루시퍼라제 활성으로서, 3반복으로 실시한 실험의 평균값±SD(표준편차)를 나타낸다.

TRAF6-융합 단백질이 형질감염된 경우(도 8b의 중간 막대)에, 약한 리포터 유전자 활성화가 관찰된 반면, TRAF6과 TRAF6 억제 단백질의 융합 단백질을 공동발현하는 세포에서는 (도 8b의 세 번째 막대) 증가된 높은 활성을 나타내었다. 위 결과는 TRAF6이 포유동물 세포에서 TBZF와 상호작용한다는 것을 다시 한번 증명하는 것이다.

<실시예 8>

TRAF6 억제 단백질에 의한 TRAF6 매개의 NF-κB 활성화 및 AP-1 활성화 억제

TRAF6은 과잉 발현시 핵전사인자인 NF-κB와 AP-1을 모두 강력하게 활성화시킨다. 따라서, 본 실시예에서는 TRAF6 매개의 NF-κB 및 AP-1 활성화에 TRAF6 억제 단백질의 발현이 미치는 효과를 분석하기 위하여 루시퍼라제 활성검사를 실시하였다.

293/EBNA (Invitrogen) 세포 (1x 10⁵⁾를 24 웰 평판에서 Superfect(QIAGEN 제품)를 사용하여 형질감염시켰다. 각 형질감염 반응물에는 NF-κB-luc 50 ng 또는 AP-1-luc 50 ng과 TRAF6 억제 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 첨가하였다. 24시간 후, 세포를 실시예 6에서 사용한 용해 완충액 150㎕에서 용해시켰다. 용해물 20㎕를 루시퍼라제 분석 시약 50㎕와 혼합하고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 9a(NF-κB) 및 도 9b(AP-1)에 도시하였다. Y 축에 나타낸 수치는 대조군 형질감염에 상대적인 규정화된 루시퍼라제 활성으로서, 3반복으로 실시한 실험의 평균값±SD(표준편차)를 나타낸다.

293/EBNA 세포에서 TRAF6의 과잉발현은 NF-κB 의존적 리포터 유전자를 강력하게 활성화시킨 반면, TRAF6 억제 단백질의 공동발현은 TRAF6 매개의 NF-κB 활성화를 용량 의존적 방식으로 억제하였다(도 9a). 또한, 293/EBNA에서의 TRAF6의 과잉발현 역시 AP-1 의존적 리포터 유전자를 활성화시켰고, TRAF6 억제 단백질의 과잉발현은 TRAF-6 매개의 AP-1 활성화를 용량 의존적 방식으로 차단하였다(도 9b).

RANK 및 IL-1R에 의한 NF-κB 활성화는 TRAF6에 의해 매개되는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, TRAF6 억제 단백질이 RANK 및 IL-1R 과잉발현 이후 NF-κB 활성화를 차단할 수 있는 지를 전술한 루시퍼라제 활성 검사를 통해 조사하였다. 그 결과, TRAF6 억제 단백질은 RANK 매개의 NF-κB 활성화를 강력하게 억제하였고(도 9c), IL-1R 매개의 NF-κB 활성화는 약하게 억제하였다(도 9d).

결론적으로, TRAF6 억제 단백질은 TRAF6 매개의 NF-κB 및 AP-1 활성화와RANK 및 IL-1R 매개의 NF-κB 활성화를 차단한다는 것을 알 수 있었다(도 9a 내지 도 9d). TRAF6은 RANK 및 IL-1R을 NF-κB 활성화 과정에 관련시킬 뿐만 아니라, CD40, IL-17, IL-8 및 다른 TNFR 상과에 의한 NF-κB 활성화에도 관련시키는 것으로 시사되었다(Bocker et al., J.Biol.Chem. 275, 12207-12213, 2000; Kashiwada et al., J.Exp.Med., 187, 237-244, 1998; Schwandnet et al., J.Exp.Med., 191, 1233-1240, 2000). 따라서, TRAF6에 대한 TRAF6 억제 단백질의 결합은 TNF 및 IL-1 수용체 상과의 다양한 구성원들에 의한 NF-κB 활성화에 있어서 억제 조절성 기구를 제공할 수 있다.

<실시예 9>

TRAF6 억제 단백질에 의한 TNF 매개 및 IL-1β 매개의 NF-κB 활성화 억제

TNF 매개의 NF-κB 활성화에 미치는 TRAF6 억제 단백질의 효과를 실시예 7에 기재한 바와 같이 루시퍼라제 활성 검사를 이용하여 조사하였다. 도 10a를 통해 알 수 있듯이 293/EBNA(Invitrogen) 세포는 TNF 처리시 NF-κB 리포터 유전자 활성의 증가를 나타낸다(도 10a의 백색 막대). 그러나, TRAF6 억제 단백질을 공동발현시킨 결과 TNF 매개의 NF-κB 활성화는 상당히 감소하였다.

본 발명자들은 나아가, IL-1β 매개의 NF-κB 활성화 경로에 미치는 TRAF6 억제 단백질의 효과를 전술한 바와 같이 조사하였다. IL-1β는 TNF와는 다른 경로를 통해 NF-κB를 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Cao et al., Nature, 383,443-446, 1996). IL-1β 처리 후 NF-κB 활성이 유도되었지만 TRAF6 억제 단백질을 공동발현시킨 결과 IL-1β에 의해 유도된 NF-κB 활성이 TNF의 경우보다 더욱 강하게 감소되었다(도 10b). 이와 같은 결과는 TRAF6 억제 단백질이 상이한 자극에 의해 유발된 NF-κB 활성화의 억제제로서도 사용될 수 있음을 입증하는 것이다.

<실시예 10>

TRAF6 억제 단백질에 의한 파골세포 분화의 억제

파골세포 분화에 미치는 TRAF6 억제 단백질의 효과를 다음과 같이 시험하였다. RANKL(NF-κB의 수용체 활성화제 리간드)와 4 내지 5일간의 배양에 의해 파골세포로 분화할 수 있는 Raw264.7 세포를 DMEM/10% FBS중에 현탁시키고, 24-웰 평판에 4 x 10⁴/웰로 접종한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, Raw264.7 세포를 대조 벡터 DNA 또는 TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드 pCR2.1TOPO-TBZF 1 μg, Tfx^®-50 시약(Promega) 및 혈청-유리 배지 200 μl의 혼합물과 배양하였다. 배지를 50 ng/ml의 RANKL(NF-κB의 수용체 활성화제 리간드)이 함유된 α-MEM/10% FBS로 교체하였다. 배양 3일 후 배지를 보충하고 배양을 계속하였다. 다음 날 세포를 세척하고 Leukocyte Acid Phosphatase Assay Kit(Sigma)를 사용하여 파골세포의 마커로서 타르트레이트-내성 산 포스파타제(TRAP)에 대해 염색하였다.

도 14a에서 보는 바와 같이, TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드로의 형질감염은 대조 벡터 형질감염에 비하여 다핵성 TRAP-양성 파골세포의 수를 유의적으로 감소시켰다. 모의 형질감염은 비형질감염된 대조 세포에 비하여 거의 효과를 나타내지 못했다. 이것은 사용된 형질감염 방법이 실험 조건하에서 Raw264.7 세포의 분화에 영향을 미치지 않았음을 제시한다. TRAP-양성 파골세포의 정량 결과 TRAP6 억제 단백질 발현 플라스미드로 형질감염되었을 때 10개 이상의 핵이 함유된 파골세포의 수가 약 40% 감소한 것으로 나타났다(도 14b). 이들 결과는 TRAP6 억제 단백질 발현의 적절한 조절이 파골세포 분화에 중요하다는 것을 제시한다.

본 발명의 신규한 TRAF6 억제 단백질 및 그 유전자 등은 TRAF6, NF-κB 또는 AP-1이 관여하는 질병 또는 골대사성 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

N-말단에 KRAB 도메인과 C-말단에 14개의 C₂H₂형 아연 핑거 모티브를 포함하고, TRAF6와 결합하되 TRAF2 및 TRAF3과는 결합하지 않으며, TRAF-6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 활성을 억제하는 분리된 TRAF6 억제 단백질.
제1항에 있어서, 사람에서 유래하는 것이 특징인 분리된 TRAF6 억제 단백질.
제1항에 있어서, 서열 번호 7에 기재되는 서열을 가진 분리된 TRAF6 억제 단백질.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 기재된 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
제4항에 있어서, 상기 핵산 서열이 gDNA, cDNA 또는 RNA인 것이 특징인 핵산 서열.
서열 번호 6에 기재된 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 서열.
제1항에 기재된 TRAF6 억제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제7항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 번호 6의 TRAP6 억제 단백질 유전자인 벡터.
제7항 또는 제8항에 기재된 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포 또는 세포주.
제9항에 있어서, 숙주가 효모, 293T 세포 또는 293/EBNA인 숙주 세포 또는 세포주.
제9항에 기재된 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포 또는 세포주를 배양하고 배양물로부터 TRAF6 억제 단백질을 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 분리된 TRAF6 억제 단백질의 제조 방법.
제1항에 기재된 TRAF6 억제 단백질을 후보 분자와 혼합하여 배양하고, 이에 따라 형성된 복합체를 분리하며, 분리된 복합체로부터 TRAF6 억제 단백질을 유리 제거함을 특징으로 하여, 상기 TRAF6 억제 단백질과 선택적으로 결합하는 분자를 정제하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 후보 분자가 TRAF6인 방법.
TRAF6 및 TRAF6 억제 단백질을 포함한 혼합물을 후보 분자와 배양하고 후보 분자가 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 결합을 조절하는 능력을 억제하거나 TRAF6/TRAF6 억제 단백질 복합체의 해리를 방지 또는 억제하는 능력을 검출함을 특징으로 하여, TRAF6 억제 단백질의 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제1항의 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체.
TRAF6 억제 단백질 발현 벡터, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 TRAF6 억제 단백질 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고 치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는, TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과다 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 질병이 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 천식, 관절염, 악액질, 암, 당뇨병, 장염 질환, 발작 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
TRAF6 억제 단백질 안티 센스 RNA 또는 TRAF6 억제 단백질에 대한 항체 및 이들의 둘 이상의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 것을 활성 성분으로 하고치료학적 또는 예방학적 유효량의 활성 성분을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 TRAF6 또는 NF-κB 또는 AP-1의 과소 활성에 의한 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 약제학적 조성물.
제18항에 있어서, 상기 질병이 AIDS, 신경퇴행성 질환, 자가면역질환, 면역결핍증 및 발작으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
기탁번호 KCTC-0963BP로 기탁된 재조합 플라스미드.
TRAF6 억제 단백질 발현 플라스미드, 분리된 TRAF6 억제 단백질 mRNA 또는 분리된 TRAF6 억제 단백질 또는 이들의 둘 이상의 혼합물을 활성 성분으로 포함함을 특징으로 하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제21항에 있어서, 골대사성 질환이 골다공증, 뼈전이암 병소, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환 및 파게트 질병(Paget's disease)중에서 선택된 것인 약제학적 조성물.