CN110806488B - Drd5及其激动剂在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DRD5蛋白及其激动剂在制备治疗炎症性疾病治疗的药物或试剂盒中的应用。本发明还公开了DRD5蛋白作为治疗TRAF6相关炎症性疾病药物的靶点的应用。本发明通过蛋白激动剂在抑制TRAF6介导的NFκB的炎症信号通路的激活中的用途，确定抗炎靶点的确定，可以为多种TRAF6相关的炎症性疾病提供治疗思路和理论依据，更可以为筛选和制备治疗炎症性疾病的药物提供分子靶点和制备思路。

Description

DRD5及其激动剂在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及DRD5及其激动剂在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用。
背景技术
炎症是机体免疫系统抵抗病原感染的关键生物学效应，促进损伤组织修复，清除损伤及肿瘤细胞(Medzhitov et al,2008,Nature)。近年来的研究表明在正常情况下炎症反应发挥有益的作用，然而，当机体处于病理状态时，异常的炎症反应则会加重机体的病理状况，甚至会产生诸如败血症、动脉粥样硬化以及炎症性肠病等疾病。因此，探究炎症反应在不同病理状态下的调控机制则尤为重要。
TNF受体相关因子6(TRAF6)在生物过程是必不可少的，包括髓系分化初级应答基因88(MyD88)信号网络、先天性免疫系统RANK配体(RANKL)依赖性信号传导、破骨细胞形成、淋巴结器官发生，以及毛囊，汗腺和皮脂腺的发育。TRAF6的异常活化会促进多种人类重大疾病的发生发展，包括成骨样细胞炎、肝炎、心肌炎、胰腺炎、肠炎、动脉粥样硬化或相关肿瘤等。尽管关于TRAF6的机制研究已经进行了很多但是，迄今为止，还没有有效的针对TRAF6的抗炎药物问世。
近年来，多项研究表明神经和免疫系统之间存在重要联系，迷走神经可以通过抑制全身性炎症，抑制致命性败血症的产生。已有研究报道在巨噬细胞，树突细胞以及T细胞等免疫细胞的表面也可以表达产生乙酰胆碱、去甲肾上腺素、多巴胺等神经递质的受体。另外，研究证实胆碱能和儿茶酚胺类信号通路在调控炎症性疾病过程中发挥重要作用。因此，神经递质作为治疗炎症的药物开发具有很大的前景。
多巴胺(DA)是儿茶酚胺能神经递质的重要成员，主要通过其受体发挥作用，多巴胺受体共有五个亚型，分别是Drd1，Drd2，Drd3，Drd4和Drd5，其中，Drd1和Drd5被称为D1样多巴胺受体，而Drd2,，Drd3和Drd4被称为D2样多巴胺受体。近年来，多项研究表明DA可以作为一个重要的调节子，通过作用于其受体参与免疫系统中免疫细胞的活化和趋化。
发明内容
发明目的：本发明提供了DRD5在调控炎症反应中的用途，本发明还提供DRD5蛋白作为制备治疗TRAF6相关的炎症性疾病治疗的药物应用。
技术方案：本发明的第一个方面提供了DRD5蛋白(核苷酸序列参见SEQ ID NO.1)在筛选或制备治疗炎症性疾病治疗的药物或试剂盒中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为TRAF6相关的炎症性疾病。
本发明第二方面提供了DRD5蛋白在筛选或制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物或试剂盒中的用途。
本发明第三方面提供了了DRD5蛋白用作治疗TRAF6相关炎症性疾病的药物的靶点的用途。
在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为成骨样细胞炎、风湿性关节炎、心肌炎、胰腺炎、肠炎、脑膜炎、脓毒血症或神经退行性疾病。
在一个优选的实施方案中，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症，优选为中枢脑膜炎和外周脓毒血症。
本发明的第四方面提供DRD5蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途。
在一个优选的实施方案中，所述激动剂通过DRD5蛋白发挥治疗作用。
在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为TRAF6相关的炎症性疾病。
在一个优选的实施方案中，所述炎症性疾病为成骨样细胞炎、风湿性关节炎、心肌炎、胰腺炎、肠炎、脑膜炎、脓毒血症或神经退行性疾病
在一个优选的实施方案中，所述炎症包括中枢系统炎症和外周系统炎症，优选为中枢脑膜炎和外周脓毒血症。
在一个优选的实施方案中，所述DRD5蛋白的激动剂选自多巴胺和A-68930。
本发明第六方面提供了DRD5蛋白的激动剂在制备NFκB信号通路抑制剂中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述NFκB信号通路是由TRAF6介导的。
在一个优选的实施方案中，所述DRD5蛋白的激动剂抑制NFκB信号通路的激活，是通过其膜上受体DRD5招募TRAF6负调节子ARRB2，进而抑制TRAF6的活化，最终抑制NFκB信号通路的激活，从而实现治疗炎症性疾病，尤其是TRAF6相关的炎症性疾病。
有益效果：(1)本发明通过蛋白激动剂在抑制TRAF6介导的NFκB的炎症信号通路的激活中的用途，确定抗炎靶点的确定，可以为多种TRAF6相关的炎症性疾病提供治疗思路和理论依据，更可以为筛选和制备治疗炎症性疾病的药物提供分子靶点和制备思路；(2)本发明发现了DA可以通过作用于DRD5抑制TLR2诱导的NFκB的激活来发挥抑炎作用。
附图说明
图1显示多巴胺可以抑制Pam3csk4引起的IL6的基因表达(A)和蛋白表达(B),并且呈现浓度依赖性；
图2显示多巴胺抑制p-IKK和p-IκBα的激活；
图3显示多巴胺不依赖多巴胺受体1(Drd1)和多巴胺受体2(Drd2)抑制Pam3csk4引起的IL6的基因表达；
图4显示多巴胺受体5(Drd5)缺失后，多巴胺的抑炎效果消失；
图5显示多巴胺发挥抑炎作用依赖β-arrestin2；
图6显示多巴胺发挥抑炎作用依赖PP2A；
图7显示多巴胺依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A提高脓毒血症小鼠存活率；
图8显示多巴胺依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A降低脓毒血症小鼠血清中IL6和TNFα的表达；
图9显示多巴胺受体5的激动剂依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A抑制脑膜炎小鼠小胶质细胞的激活和外周巨噬细胞的浸润；
图10脑组织免疫荧光结果显示多巴胺受体5的激动剂依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A降低脑膜炎小鼠小胶质细胞和巨噬细胞IBA1的表达。
具体实施方式
以下的实例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一、实验试剂及材料
BMDM(骨髓来源的巨噬细胞)：制备方法见文献(Shen et al.,2019，The journalof experimental medicine)；
DA(多巴胺)：Sigma，H8502；
Pam3csk4：Invivogen，Tlrl-pms；
SKF-38393hydrobromide：TOCRIS，092；
抗phosphorylated IKKα/β抗体：Cell Signaling，2697；
抗phosphorylated IκBα抗体：Cell Signaling，9246；
抗phosphorylated JNK抗体：Cell Signaling，9251
抗phosphorylated p38抗体：Cell Signaling，9211
抗phosphorylated IKKα/β抗体：Cell Signaling；
抗JNK抗体：Cell Signaling，9252；
抗IKKβ抗体：Cell Signaling，2370；
抗p38抗体：Cell Signaling，9212；
抗β-actin抗体：Sigma，AC-15；A 1978；
IL-6ELISA试剂盒：R&D Systems，DY406；
TNF ELISA试剂盒：R&D Systems，DY410。
实施例1：DA对体外抑制巨噬细胞促炎因子的表达的影响
1.1DA抑制IL-6的表达
1.1.1实验方法
第一天，将骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞，过夜培养。
将隔夜培养的细胞，吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基，分成七组，每组设置三组重复。
第一组：阴性对照组。
第二组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4，培育六小时。
第三组：每孔加入终浓度为10μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第四组：每孔加入终浓度为50μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第五组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第六组：每孔加入终浓度为250μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第七组：每孔加入终浓度为400μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
1.1.2实验结果
将1.1.1处理后的细胞，TRIZol法提取细胞中总的RNA，通过实时定量PCR(qPCR)法检测细胞中IL6的含量。结果见图1A，第一列为第一组(-)，第二列为第二组(1μg/ml的Pam3csk4)，第三列为第三组(10μM的DA)，第四列为第四组(50μM的DA)，第五列为第五组(150μM的DA)，第六列为第六组(250μM的DA)，第七列为第七组(400μM的DA)。在Pam3csk4作用下，促炎因子IL-6产生(第二列)，DA的加入，有效地抑制了IL-6产生，并且，这种效果是呈剂量依赖性的(第三列，第四列，第五列，第六列，第七列)。
1.2DA抑制IL-6的分泌
1.2.1实验方法
第一天，将BMDM分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞，过夜培养。
1.2.2第二天，先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基，分成七组，每组设置三组重复。
第一组：阴性对照组。
第二组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4十二小时。
第三组：每孔加入终浓度为10μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育十二小时。
第四组：每孔加入终浓度为50μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育十二小时。
第五组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育十二小时。
第六组：每孔加入终浓度为250μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育十二小时。
第七组：每孔加入终浓度为400μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育十二小时。
1.2.2实验结果
将1.2.1部分处理后的细胞，收集细胞上清，ELISA法检测细胞上清中细胞分泌的IL6的蛋白表达见图1B(，第一列为第一组(阴性对照)，第二列为第二组(1μg/ml的Pam3csk4)，第三列为第三组(10μM的DA)，第四列为第四组(50μM的DA)，第五列为第五组(150μM的DA)，第六列为第六组(250μM的DA)，第七列为第七组(400μM的DA)。在Pam3csk4作用下，促炎因子IL-6分泌产生(第二列)，DA的加入，有效地抑制了IL-6的分泌，并且，这种效果是呈剂量依赖性的(第三列，第四列，第五列，第六列，第七列)。
1.3DA对NFκB信号通路的影响
1.3.1实验步骤
第一天：将BMDM分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天：先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。分成十组，每组设置三组重复。
第一组：阴性对照组。
第二组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4，培育半小时。
第三组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育一小时。
第四组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育两小时。
第五组：每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育四小时。
第六组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时。
第七组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育半小时。
第八组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育一小时。
第九组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育两小时。
第十组：每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育四小时。
1.3.2实验结果
将1.3.1处理后的细胞，收集细胞裂解液用抗鼠IL-1β抗体和抗鼠p-IKK，IKK,p-IκBα，IκBα，p-JNK，JNK，P-P38，P38，Actin抗体进行western blotting分析。结果见图2(泳道1为第一组，泳道2为第二组，泳道3为第三组，泳道4为第四组，泳道5为第五组，泳道6为第六组，泳道7为第七组，泳道8为第八组，泳道9为第九组，泳道10为第十组)。
从图2中可以看出，Pam3csk4作为TOLL样受体2的激动剂能够激活NFκB和MAPK信号通路(泳道2，泳道3，泳道4和泳道5)，DA的加入，有效地抑制了NFκB信号通路，但不影响MAPK信号通路(泳道7，泳道8，泳道9和泳道10)。
1.4DA不依赖DRD1抑制促炎因子的表达
1.4.1实验方法
第一天：将野生鼠(WT)和Drd1缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天：先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。两种骨髓来源的巨噬细胞各分成三组，共六组，每组设置三组重复。
第一组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第二组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第三组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第四组：我们从Jackson lab购买了Drd1敲除小鼠，分离出该小鼠的BMDM细胞(方法同上)，阴性对照组。
第五组：Drd1敲除小鼠的BMDM细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4六小时。
第六组：Drd1敲除小鼠的BMDM细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
1.4.2实验结果
将1.4.1部分处理后的细胞，TRIZol法提取细胞中总的RNA，通过实时定量PCR(qPCR)法检测细胞中IL6的含量。结果见图3A，第一列为第一组(阴性对照)，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组。
对于野生型鼠骨髓来源的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了Pam3csk4所诱导的IL6的表达。而对于Drd1缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，DA的加入，仍能有效的抑制Pam3csk4所诱导的IL6的表达。因此，DA不依赖膜上受体DRD1抑制促炎因子的表达。
1.5DA不依赖DRD2抑制促炎因子的表达
1.5.1实验方法
第一天，将野生鼠(WT)和Drd2缺陷鼠(广州赛业生物公司购买)的骨髓来源的巨噬细胞分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天，先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。两种骨髓来源的巨噬细胞各分成三组，共六组，每组设置三组重复。
第一组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第二组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第三组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第四组：Drd2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第五组：Drd2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4六小时。
第六组：Drd2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4六小时。
1.5.2实验结果
将1.5.1部分处理后的细胞，TRIZol法提取细胞中总的RNA，通过实时定量PCR(qPCR)法检测细胞中IL6的含量。结果见图3B，第一列为第一组(阴性对照)，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组。
对于野生型鼠骨髓来源的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了Pam3csk4所诱导的IL6的表达。而对于Drd2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，DA的加入，仍能有效的抑制Pam3csk4所诱导的IL6的表达。因此，DA不依赖膜上受体DRD2抑制促炎因子的表达。
1.6DA依赖DRD5抑制促炎因子的表达
1.6.1实验方法
第一天，将野生鼠(WT)和Drd5缺陷鼠(广州赛业生物公司购买)的骨髓来源的巨噬细胞分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天，先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。两种骨髓来源的巨噬细胞各分成三组，共六组，每组设置三组重复。
第一组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第二组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第三组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第四组：Drd5缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第五组：Drd5缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第六组：Drd5缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
1.6.2实验结果
将1.6.1处理后的细胞，TRIZol法提取细胞中总的RNA，通过实时定量PCR(qPCR)法检测细胞中IL6和TNF的含量。结果见图4A、图4B(其中，图4A与图4B的第一列为第一组即阴性对照，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组)。
对于野生型鼠骨髓来源的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了Pam3csk4所诱导的IL6的表达。而对于Drd5缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，DA的加入，并不能有效的抑制Pam3csk4所诱导的IL6的表达。因此，DA依赖膜上受体DRD5抑制促炎因子的表达。
1.7DA依赖β-arrestin2抑制促炎因子的表达
1.7.1实验方法
第一天：将野生鼠(WT)和β-arrestin2缺陷鼠(jackson lab购买)的骨髓来源的巨噬细胞分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天：先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。两种骨髓来源的巨噬细胞各分成三组，共六组，每组设置三组重复。
第一组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第二组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4十二小时。
第三组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4十二小时。
第四组：β-arrestin2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第五组：β-arrestin2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4十二小时。
第六组：β-arrestin2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4十二小时。
1.7.2实验结果
将1.7.1部分处理后的细胞，收集细胞上清，ELISA法检测细胞上清中细胞分泌的IL6和TNF的蛋白表达见图5A、5B，第一列为第一组(阴性对照)，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组。对于野生型鼠骨髓来源的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了Pam3csk4所诱导的IL6和TNF的表达。而对于β-arrestin2缺陷鼠骨髓来源的巨噬细胞，DA的加入，并不能有效的抑制Pam3csk4所诱导的IL6的表达。因此，DA依赖β-arrestin2抑制促炎因子的表达。
1.8DA依赖PP2A抑制促炎因子的表达
1.8.1实验方法
第一天：将野生鼠(WT)和特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞分到十二孔板上，每个孔1.5×106个细胞。
第二天；先吸去上清，每孔加入1ml DMEM培养基。两种骨髓来源的巨噬细胞各分成三组，共六组，每组设置三组重复。
第一组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第二组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第三组：WT鼠骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第四组：特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞，阴性对照组。
第五组：特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
第六组：特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞，每孔加入终浓度为150μM的DA培育两个小时，再加入终浓度为1μg/ml的Pam3csk4培育六小时。
1.8.2实验结果
将1.8.1部分处理后的细胞，TRIZol法提取细胞中总的RNA，通过实时定量PCR(qPCR)法检测细胞中IL6和TNF的含量。结果见图6A、图6B，图6A和图6B的第一列为第一组(阴性对照)，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组。
对于野生型鼠骨髓来源的巨噬细胞来讲，DA的加入，有效的抑制了Pam3csk4所诱导的IL6的表达。而对于特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠的骨髓来源的巨噬细胞，DA的加入，并不能有效的抑制Pam3csk4所诱导的IL6的表达。因此，DA依赖髓系细胞上的PP2A抑制促炎因子的表达。
实施例2：DRD5蛋白可以抑制外周系统炎症
2.1多巴胺依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A提高脓毒血症小鼠存活率。
2.1.1实验方法
第一组：对WT小鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况
第二组：对WT小鼠进行每天两次50mg/kg的多巴胺注射，在第一天第二次注射多巴胺后的第六个小时，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第三组：对β-arrestin2缺陷小鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第四组：对β-arrestin2缺陷小鼠进行每天两次50mg/kg的多巴胺注射，在第一天第二次注射多巴胺后的第六个小时，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第五组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠(jackson lab购买)进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第六组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠进行每天两次50mg/kg的多巴胺注射，在第一天第二次注射多巴胺后的第六个小时，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第七组：对Drd5缺陷小鼠(广州赛业生物公司购买)进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
第八组：对Drd5缺陷小鼠进行每天两次50mg/kg的多巴胺注射，在第一天第二次注射多巴胺后的第六个小时，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，观察小鼠的存活情况。
2.1.2实验结果
结果见图7，腹腔注射多巴胺的WT小鼠生存率比未注射多巴胺的小鼠明显提高，而缺失β-arrestin2、PP2A、Drd5后，多巴胺提高小鼠生存率的现象消失，提示多巴胺依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A提高脓毒血症小鼠存活率。
2.2多巴胺依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A降低脓毒血症小鼠血清中IL6和TNF的表达
2.2.1实验方法
第一组：对WT小鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第二组：对WT小鼠注射50mg/kg的多巴胺，六小时后，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第三组：对β-arrestin2缺陷小鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第四组：对β-arrestin2缺陷小鼠注射50mg/kg的多巴胺，六小时后，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第五组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第六组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠注射50mg/kg的多巴胺，六小时后，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第七组：对Drd5缺陷小鼠进行腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
第八组：对Drd5缺陷小鼠注射50mg/kg的多巴胺，六小时后，腹腔注射1x108CFU的金黄色葡萄球菌，六小时后，小鼠眼眶取血。
收集小鼠全血，4度过夜后，1500转/分钟离心10分钟，吸取血清部分进行ELISA法检测血清中IL6和TNF的蛋白表达。
2.2.2实验结果
见图8(第一列为第一组，第二列为第二组，第三列为第三组，第四列为第四组，第五列为第五组，第六列为第六组，第七列为第七组，第八列为第八组)。对于野生型鼠，DA的加入，有效的抑制了金黄色葡萄球菌所诱导的IL6和TNF的表达。而对于Drd5、β-arrestin2、PP2A缺陷鼠，DA的加入，并不能有效的抑制金黄色葡萄球菌所诱导的IL6和TNF的表达。因此，DA依赖Drd5、β-arrestin2、PP2A降低脓毒血症小鼠血清中IL6和TNFα的表达。
实施例3：DRD5蛋白可以抑制中枢系统炎症
3.1多巴胺受体5的激动剂依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A抑制脑膜炎小鼠小胶质细胞的激活和外周巨噬细胞的浸润
3.1.1实验方法
第一组：对WT小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第二组：对WT小鼠进行静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第三组：对β-arrestin2缺陷小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第四组：对β-arrestin2缺陷小鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第五组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第六组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第七组：对Drd5缺陷小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第八组：对Drd5缺陷小鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
将经过上述处理的小鼠，取的小鼠脑组织，研磨消化后得到单细胞悬液，过Percoll分层液后得到单个核细胞，加入相应的流式抗体避光染色30min后上机检测(图9)。
3.1.2实验结果
对于野生型鼠，SKF-38393的加入，有效的抑制了金黄色葡萄球菌所诱导的外周巨噬细胞浸入到脑组织和小胶质细胞的激活。而对于Drd5、β-arrestin2、PP2A缺陷鼠，SKF-38393的加入，并不能有效的抑制外周巨噬细胞浸入到脑组织和小胶质细胞的激活。因此，Drd5激动剂依赖Drd5、β-arrestin2、PP2A抑制脑膜炎小鼠小胶质细胞的激活和外周巨噬细胞的浸润。
3.2多巴胺受体5的激动剂依赖DRD5、β-arrestin2和PP2A降低脑膜炎小鼠小胶质细胞和巨噬细胞IBA1的表达。
3.2.1实验方法
第一组：对WT小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第二组：对WT小鼠进行静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第三组：对β-arrestin2缺陷小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第四组：对β-arrestin2缺陷小鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第五组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第六组：对特异性髓系细胞上PP2A缺陷鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第七组：对Drd5缺陷小鼠进行静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
第八组：对Drd5缺陷小鼠静脉注射10mg/kg的SKF-38393，六小时后，静脉注射5x108CFU的金黄色葡萄球菌，三十六时后取小鼠脑组织。
将按照3.2.1部分处理后取的小鼠脑组织，4％多聚甲醛固定过夜后进行冰冻切片，随后进行免疫荧光染色检测IBA1的表达情况(图10)。
3.2.2实验结果
对于野生型鼠，SKF-38393的加入，有效的抑制了金黄色葡萄球菌所诱导的小胶质细胞和巨噬细胞IBA1的表达。而对于Drd5、β-arrestin2、PP2A缺陷鼠，SKF-38393的加入，并不能有效的抑制小胶质细胞和巨噬细胞IBA1的表达。因此，Drd5激动剂依赖Drd5、β-arrestin2、PP2A抑制小胶质细胞和巨噬细胞IBA1的表达。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> DRD5及其激动剂在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人类DRD5基因序列(human DRD5)
<400> 1
atgctgccgc caggcagcaa cggcaccgcg tacccggggc agttcgctct ataccagcag 60
ctggcgcagg ggaacgccgt ggggggctcg gcgggggcac cgccactggg gccctcacag 120
gtggtcaccg cctgcctgct gaccctactc atcatctgga ccctgctggg caacgtgctg 180
gtgtgcgcag ccatcgtgcg gagccgccac ctgcgcgcca acatgaccaa cgtcttcatc 240
gtgtctctgg ccgtgtcaga ccttttcgtg gcgctgctgg tcatgccctg gaaggcagtc 300
gccgaggtgg ccggttactg gccctttgga gcgttctgcg acgtctgggt ggccttcgac 360
atcatgtgct ccactgcctc catcctgaac ctgtgcgtca tcagcgtgga ccgctactgg 420
gccatctcca ggcccttccg ctacaagcgc aagatgactc agcgcatggc cttggtcatg 480
gtcggcctgg catggacctt gtccatcctc atctccttca ttccggtcca gctcaactgg 540
cacagggacc aggcggcctc ttggggcggg ctggacctgc caaacaacct ggccaactgg 600
acgccctggg aggaggactt ttgggagccc gacgtgaatg cagagaactg tgactccagc 660
ctgaatcgaa cctacgccat ctcttcctcg ctcatcagct tctacatccc cgttgccatc 720
atgatcgtga cctacacgcg catctaccgc atcgcccagg tgcagatccg caggatttcc 780
tccctggaga gggccgcaga gcacgcgcag agctgccgga gcagcgcagc ctgcgcgccc 840
gacaccagcc tgcgcgcttc catcaagaag gagaccaagg ttctcaagac cctgtcggtg 900
atcatggggg tcttcgtgtg ttgctggctg cccttcttca tccttaactg catggtccct 960
ttctgcagtg gacaccccga aggccctccg gccggcttcc cctgcgtcag tgagaccacc 1020
ttcgacgtct tcgtctggtt cggctgggct aactcctcac tcaaccccgt catctatgcc 1080
ttcaacgccg actttcagaa ggtgtttgcc cagctgctgg ggtgcagcca cttctgctcc 1140
cgcacgccgg tggagacggt gaacatcagc aatgagctca tctcctacaa ccaagacatc 1200
gtcttccaca aggaaatcgc agctgcctac atccacatga tgcccaacgc cgttaccccc 1260
ggcaaccggg aggtggacaa cgacgaggag gagggtcctt tcgatcgcat gttccagatc 1320
tatcagacgt ccccagatgg tgaccctgtt gctgagtctg tctgggagct ggactgcgag 1380
ggggagattt ctttagacaa aataacacct ttcaccccga atggattcca ttaa 1434

Claims (6)

1.DRD5蛋白在筛选或制备治疗TRAF6相关炎症性疾病药物或试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，所述炎症性疾病为成骨样细胞炎、风湿性关节炎、心肌炎、胰腺炎、肠炎、脑膜炎、脓毒血症或神经退行性疾病。
3.如权利要求1所述的用途，所述炎症性疾病包括中枢系统炎症和外周系统炎症。
4.如权利要求1所述的用途，所述炎症性疾病包括中枢脑膜炎和外周脓毒血症。
5.DRD5 蛋白的激动剂用于制备治疗炎症性疾病的药物或试剂盒的用途；所述DRD5 蛋白的激动剂选自多巴胺和A-68930；所述炎症性疾病为TRAF6相关的炎症性疾病。
6.DRD5蛋白的激动剂在制备NFκB信号通路抑制剂中的用途。
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