DE10259714A1

DE10259714A1 - Verfahren zur Analyse des "Hornlos"(Polled)-Genotyps eines Nutztiers mittels genetischer Marker

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Publication number: DE10259714A1
Application number: DE2002159714
Authority: DE
Inventors: Udo Dr. Baron; Rowena Blind; Nicolas Cors; Sonja Hartmann; Ulrike Dr. Imhoff; Jürgen Dr. Koch; Marco Dr. Leuer; Stefan Martsch; Klaus Prof. Dr. Olek; Claudia Schütte; Jürgen Dr. Weber
Original assignee: BIOPSYTEC ANALYTIK GmbH
Current assignee: BIOPSYTEC ANALYTIK GmbH
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2004-07-08

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung des "Hornlos"(Polled)-Genotyps eines Nutztiers mittels der Analyse mindestens eines mit dem "Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers oder der Analyse einer Kombination von solchen Markern. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die genetischen Marker selber sowie Oligonukleotide zur Analyse dieser genetischen Marker. Zuletzt betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Nutztiers auf Basis einer Analyse mindestens eines mit dem "Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers der vorliegenden Erfindung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung des „Hornlos"(Polled)-Genotyps eines Nutztiers mittels der Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers oder der Analyse einer Kombination von solchen Markern. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Analyse mittels molekulargenetischer und/oder theoretischer Methoden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die genetischen Marker selber sowie Oligonukleotide zur Analyse dieser genetischen Marker. Zuletzt betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Nutztiers auf Basis einer Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers der vorliegenden Erfindung.
Hornansätze sind bereits bei der Geburt der Kälber vorhanden. Falls diese Ansätze nicht entfernt werden, was unter anderem durch das für die Tiere quälende und arbeitsintensive Ausbrennen geschehen kann, wachsen die Hörner während der Lebenszeit der Tiere weiter. Die Form und Größe der Hörner variiert unter den Rassen sehr stark, von sehr groß bei u.a. Texas Longhorn gegenüber den kurzhornigen Rassen, wie etwa Hereford oder anderen Kreuzungen.
Hornlos („Polled") ist die Bezeichnung für das Fehlen von Hörnern in Nutzvieh, wie zum Beispiel Rindern, Schafen und Ziegen. "Smooth polled" bedeutet, daß das Tier niemals jegliche Hörner oder Hornansätze oder sogenannte „Wackelhörner" („Scurs") aufwies. Einige Landwirte verwenden die Bezeichnung „doppelt hornlos" ("double polled"), um anzuzeigen, daß das Tier der Nachkomme von zwei hornlosen Elterntieren ist, dies bedeutet jedoch nicht eindeutig, daß das Tier auch homozygot Polled ist, sondern nur, daß dieses homozygot hornlos sein könnte. Weil es so scheint, als ob der Verlust dieser Genfunktion keine schädlichen Nebenwirkungen hervorruft, und viele Landwirte aufgrund geringerer Verletzungsgefahr der Tiere gegenseitig und der betreuenden Personen hornlose Tiere bevorzugen, ist „polled" ein wünschenswertes Merkmal. Polled ist als ein autosomaler, dominanter Marker in Rindern beschrieben. Das Gen, das das Fehlen von Hörnern verursacht, liegt zentromernah auf dem Rinder-Chromosom 1. Obwohl eine Reihe von DNA Markern in der Nähe dieses Locus kartiert wurden, ist der genaue Genort für Polled bisher unbekannt.
Bisher verwendete Standard-Züchtungsmethoden benötigen Jahre, um den echten genetischen Wert eines Zuchtrinds durch Tests der Nachkommen jedes Bullen festzustellen.
Daher besteht ein klarer Bedarf im Stand der Technik an einem Verfahren zur genetischen Evaluierung von Rindern und anderen Hörner-tragenden Nutztieren, um es den Züchtern zu ermöglichen, genauer diejenigen Tiere zur Zucht auszuwählen, die nicht nur den gewünschten Phänotyp zeigen, sondern die wünschenswerte genetische Polled-Information homozygot tragen.
Die Möglichkeiten ein bestimmtes genetisches Merkmal zu verfolgen umfassen die Identifizierung eines molekularen DNA-Markers für ein wesentliches Gen dieses Phänotyps. Der Marker kann mit einem einzelnen Gen mit wesentlichem Effekt oder mit einer Zahl von Genen gekoppelt sein (im Falle von multifaktoriellen Merkmalen), die z.B. additive Effekte aufweisen. DNA-Marker weisen verschiedene Vorteile auf, die eine Analyse erleichtern. So ist eine Segregation einfach zu messen und eindeutig und DNA-Marker sind ko-dominant, d.h. heterozygote und homozygote Tiere können unterscheidbar identifiziert werden. Sobald ein Markersystem etabliert ist, können Selektionsentscheidungen leicht getroffen werden, weil DNA-Marker zu jeder Zeit, nachdem eine Blutprobe von dem Nachkommen entnommen wurde, getestet werden können oder sogar Embryonen in vitro oder in utero getestet werden können.
Augenblicklich können ausgewählte Kühe superovuliert werden, die Eier gesammelt werden, in vitro unter der Verwendung von Samen von ausgesuchten Bullen befruchtet werden und in andere Kühe implantiert werden, was die Verwendung der gewünschten Genetik der Kuh und des Bullen ohne ein Warten auf die Geburt eines Kalbs ermöglicht. Dies wäre die Modifikation eines Selektionsschemas, „Multiple Ovulation und Embryotransfer" (MOET) genannt und kann mit genetischer Markertechnologie angewendet werden, wobei die sich entwickelnde Blastomere im 4-8 Zellstadium mittels PCR auf die Anwesenheit des/der Marker(s) getestet werden können und eine entsprechende Auswahl getroffen werden kann.
Die Marker-assistierte Selektion könnte daher die hohen Kosten der Nachkommentests, wie sie im Augenblick verwendet werden, um geeignete Tiere nachzuweisen, erheblich verringern, da junge Rinder, die durch genetische Tests als ungeeignet befunden werden niemals Nachkommen erzeugen würden weil diese sofort nach der Geburt auf die Anwesenheit/Abwesenheit der gewünschten Marker getestet würden.
Im allgemeinen schließt die Standard-Methodologie die Extraktion von DNA, Verdau mit Restriktionsenzymen, Abtrennung der resultierenden Fragmente, Hybridisierung an eine Radiomarkierte Sonde und zuletzt die Korrelation der identifizierten Marker mit Polled Markern ein, um so Marker zu identifizieren, die bei der Auswahl helfen. Eine neuere Technologie unter der Verwendung der „Polymerase Chain Reaction" (PCR), um so das relevante Genfragment für die weitere Analyse zu amplifizieren, ist ebenfalls erhältlich. Solche PCR-Technologie beschleunigt die Analyse erheblich, da (1) weniger genetisches Material erforderlich ist (Blut oder Gewebeprobe); (2) der Hybridisierungsschritt zum Nachweis spezifischer Genfragmente vermieden wird, (3) die Kosten einiger Materialien (radioaktive Marker, Röntgenfilm) beseitigt werden, was die Gesamtkosten verringert; und (4) die Analyseschritte sehr schnell sind. Genetische Marker wurden gefunden, die z.B. Rinder-Leukozyten-Adhäsionsdefizienz anzeigen; andere Marker wurden innerhalb des Rinder-Prolactingens identifiziert und bei kappa-Casein, das mit der Milchproduktion gekoppelt ist.
Einige ältere Literatur schlägt vor, daß unterschiedliche Gene für die Hornentwicklung in Brahma oder Zebu Rindern (Bos indicus) vorhanden wären. Jedoch hat eine Studie an der Texas A & M das Gen für Hörner in Brahma-Rindern auch auf dem zentromernahen Ende des Rinder-Chrmosoms 1 kartiert. Da dieses Gen bisher nicht gefunden wurde, ist es unmöglich zu sagen, ob es ein oder zwei Gene gibt, die nahe beieinander kartieren und die Hornentwicklung in Bos indicus und Bos taurus kontrollieren.
Weitere Literatur zur Hornlosigkeit und der Bestimmung von deren Marker findet sich unter anderem in Brenneman, R.A., S. K. Davis, J. O. Sanders, B. M. Burns, T.C. Wheeler, J. W. Turner, and J.F. Taylor. 1996. The polled locus maps to BTA1 in Bos indicus X Bos taurus cross. J. Heredity 87: 156-161; Georges, M., R. Drinkwater, T. King, A. Mishra, S.S. Moore, D. Nielsen, L.S. Sargeant, A. Sorensen, M.R. Steele, X. Zhao, J.E. Womack and J. Hetzel. 1993. Microsatellite mapping of a gene affecting horn development in Bos taurus. Nat. Genet. 3: 206-210; Harlizius, B, I. Tammen, K. Eichler, A. Eggen, and D.J.S. Hetzel. 1997. New markers on bovine Chromosome 1 are closely linked to the polled gene in Simmental and Pinzgauer cattle. Mamm. Genome 8: 225-227; Schmutz, S.M., F.L.S. Marquess, T.G. Berryere, and J.S. Moker. 1995. DNA marker assisted selection of the polled condition in Charolais cattle. Mamm. Genome 6: 710-713 und Stookey, J.M. and L.A. Goonewardene. 1996. A comparison of production traits and welfare implications between horned and polled beef bulls. Can. J. An. Sci. 76: 1-5.
Im Augenblick ist das Gen für Polled noch nicht identifiziert. Jedoch ist die Position des Gens als auf dem zentromernahen Ende des Rinder-Chromosoms 1 lokalisiert bekannt. Basierend auf dieser Information können verschiedene DNA Marker in der Nähe, sogenannte „gekoppelte" Marker dazu verwendet werden, auf homozygot Polled in einem Individuum zu testen.
Dabei bedeutet gekoppelt, daß die untersuchten Markerloci und Gene so dicht nebeneinander auf dem Chromosom liegen, daß sie im Spermium oder Ei eines Elternteils als ein „Paket" vererbt werden. Manche DNA kodiert für Proteine, während andere als Marker geeignet ist. Beide DNAs können für die Analyse verwendet werden, jedoch ist im Stand der Technik die Mikrosatelliten-Technik bevorzugt. Beschrieben sind bisher fünf DNA Marker, die dicht genug zu liegen scheinen, um ausreichend genaue Vorhersagen (∼90%) des Polled oder gehörnten Phänotyps eines Kalbs zu ermöglichen. Jedoch sind diese Marker immer noch mit ca. 10% Fehlerquote behaftet, was in der Tierzucht in großem Maßstab nicht ausreichend ist.
Von drei Markern ist beschrieben, daß diese so konstruiert wurden, daß sie in einer Multiplex PCR überprüft werden können. Gekoppelte Markertests erfordern die gesamte Familie, so daß die Forscher den Marker verfolgen können. Die bisher identifizierten Marker wurden bisher in Charolais, Limousin, und Simmental Rindern getestet und funktionieren in diesen Rassen gut (d.h. ∼95%). Weitere Literatur zu diesen Analysen kann in Marquess, F. L. S, T. G. Berryere, S. M. Schmutz. Jan. 18, 1999. Marker Assisted Selection for the polled trait in cattle. Plant and Animal Genome VII, San Diego, CA; Marquess, F.L.S., R.A. Brenneman, S.M. Schmutz, J.F. Taylor, S.K. Davis. 1997. A highly polymorphic bovine dinucleotide repeat SODIMICR02. Anim. Genet. 28: 70 und Schmutz, S. M., T. G. Berryere, F. L . S. Marquess, S. M. Kappes. 1996. Genetic markers linked to the polled locus in cattle. Animal Genetics 27, Suppl. 2:64 gefunden werden.
„Scurs" sind kleine Horn-ähnliche Auswüchse auf der Stirn an derselben Stelle, an der Hörner wachsen würden. Scurs werden im Deutschen als "Wackelhörner" bezeichnet und sind beweglich und nicht fest mit dem Schädel verwachsen. Scurs treten typischerweise nicht vor einem Alter von vier Monaten auf und stellen das Wachstum oft nach ein paar Zentimetern ein. Einige Scurs, auch "scab scurs" genannt, werden niemals größer als ein Daumennagel. Ein normales Hornwachstum würde das Auftreten von Scurs nicht ermöglichen, jedoch tragen auch gehörnte Tiere das Gen für Scurs.
Herkömmlich wurde der Marker für Scurs als geschlechts-beeinflußt beschrieben. Männliche Rinder benötigen nur ein verändertes Gen für Scurs, um das Merkmal auszuprägen, weibliche benötigen zwei (Long und Gregory, 1978). Es wurde vorgeschlagen, daß homozygot Polled den Scur-Phänotyp maskiert, bis diese homozygot für Scurs sind. Asai (2001) fand Hinweise darauf, daß dies auf dem DNA-Niveau stattfindet. Ihre Daten lassen auch vermuten, daß homozygot Polled sogar auch homozygot Scurs überdeckt. Asai's Untersuchungen belegen, daß das Gen für Scurs sich nicht auf dem Rinder Chromosom 1 befindet. Daher ist dies ein völlig unabhängiges Gen. Asai, M, Schmutz, S. M. August 12, 2002. Interaction of the scurred loci with the polled/horned loci and the influence of sex. International Society of Animal Genetics, Goettingen, Germany; Asai, M 2001. Mapping and characterisation of the scurred phenotype in Bos taurus breeds. M.Sc. Thesis, University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada; Asai, M and S. M Schmutz. 2000. Studies in the inheritance of scurs in Bos taurus breeds. poster at the International Society of Animal Genetics meeting, Minneapolis, MN und Long, C. R. and K. E. Gregory. 1978. Inheritance of the horned, scurred, and polled condition in cattle. J. Heredity. 69:395-400.
Im Hinblick auf das oben genannte besteht immer noch ein Bedarf an rassenübergreifenden Markern für die schnelle und zuverlässige Analyse des Polled-Phänotyps. Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diese genetischen Marker zur Verfügung zu stellen, die rassenübergreifend und zuverlässig mit dem Polled-Phänotyp gekoppelt sind. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung des „Polled"-Genotyps eines Rinds und der Anwesenheit dieser genetischen Marker zur Verfügung zu stellen. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Rinds zur Verfügung zu stellen.
Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der genauen Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden, die folgt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein V erfahren zur Identifizierung des „Polled"-Genotyps eines Rinds gelöst, wobei das Verfahren um faßt: a) Erhalten einer Probe einer Nukleinsäure des Rinds, und b) Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-C5fa (SEQ ID No. 2); 59A3-C5fb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7).
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse besteht weiterhin darin, daß eine Kombination von oben genannten Markern analysiert wird. Besonders bevorzugt sind dabei die folgende Kombination:

– 59A3-A3r, 59A3-D8f und 59A3-F8r.

Es können jedoch auch andere Kombinationen verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Kombination" eine Zusammenstellung von Markern des jeweiligen Rinds oder einer spezifischen Rindergruppe. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Analyse weiterhin den Vergleich von anderen mit dem Polled-Genotyp in Zusammenhang stehenden Merkmalen und/oder Markern umfaßt. Solche Marker können zum Beispiel die in 1 genannten sein. Die Untersuchungen können auch weitere genetische Analysen, wie z.B. Abstammungs-, Verwandtschafts- und Familienanalysen umfassen, können aber auch die Analyse weiterer Gene, insbesondere des Wackelhorn(„Scurs")-Genotyps umfassen.
Eine „Analyse" von Mikrosatelliten in einem mit dem genomischen „Polled" Lokus gekoppelten Marker oder einem Fragment davon bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung zunächst die Analyse eines der genannten spezifischen Mikrosatelliten, nämlich 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7). Ersatzweise oder ergänzend kann aber auch eine STS („sequence tagged site"), ein SNP oder ein weiterer Mikrosatellit analysiert werden, der mit einer Frequenz von im wesentlichen 100% mit einem Mikrosatelliten der genannten spezifischen Mikrosatelliten gekoppelt vorliegt. Dieser gekoppelte SNP oder Mikrosatellit liefert somit dieselbe statistische Information, wie der Mikrosatellit der genannten Marker (oder dem „Set"). Solche Marker können zum Beispiel die in 1 genannten sein. Weiterhin schließt der Begriff der Analyse auch die Untersuchung der oben genannten Mikrosatelliten in verschiedenen Rinderrassen ein. Alle hier erwähnten Marker können aufgrund Ihrer bekannten Positionierung auf dem Chromosom zum „comparative mapping" als Sonde verwendet werden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Analyse mittels Fragmentlängenanalyse, Sequenzierung der Allele, Hybridsierung oder MALDI-TOF erfolgen. Dabei kann die Sequenzierung nur nach vorheriger Klonierung erfolgen. Normalerweise werden Mikrosatelliten analysiert, in dem man eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchführt und die Amplifikate mittels Polyacrylamidgelen (Sequencer) oder speziellen Polymeren (Kapillar-Sequencer) nach ihrer Größe trennt (Fragmentlängenanalyse). Alle diese Techniken sind im Augenblick dem Fachmann bekannt und werden weiter unten genauer beschrieben.
Die Nukleinsäure, die einen Teil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bildet, kann genomische DNA sein.
Für einen bekannten Polymorphismus oder Mikrosatelliten ist normalerweise die direkte Bestimmung des jeweiligen Genotyps das Verfahren der Wahl. Ansätze des Stands der Technik für die industrielle „high-throughput" Genotypisierung beruhen heute auf der Fragmentlängenanalyse.
Andere Ansätze zum Nachweis von kleinen Sequenzvariationen, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.
Der Nachweis der Polymorphismen kann mit einer Amplifikation erreicht werden, zum Beispiel durch PCR, aus genomischer DNA und Sequenzierung der amplifizierten Nukleinsäure oder durch Klonierung der Marker und Sequenzierung der Varianten unter der Verwendung gut bekannter Techniken.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das zu untersuchende Nutztier ein Rind. Dabei wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter „Rind" oder „Rindern" ein Tier der Unterfamilie Bovinae verstanden. Dieses kann insbesondere ausgewählt sein aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos .Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann eine Analyse umfassen, die eine molekulargenetische und/oder theoretische Methode umfaßt. Theoretische Methoden sind insbesondere rechnergestützte Analysen, wie etwa neuronale Netzwerke und statistische Berechnungen, wie im Stand der Technik bekannt ist. Verfahren zur Auffindung von Beziehungen zwischen den erfindungsgemäßen Markern und dem Phänotyp sind spezielle Verfahren zur Genotyp-Phänotyp-Analyse und können durchgeführt werden mittels statistischer parametrischer Verfahren wie Korrelations-, Regressions- Varianz- oder Kovarianzanalysen, mittels nichtparametrischer Verfahren wie z.B. Kontingenztafelanalysen, Mann-Whitney U-Test oder Kruskal-Wallis-Test, mittels Klassifizierungsverfahren wie z.B. Clusteranalysen, Verfahren der künstlichen Intelligenz wie Neuronale Netze, genetische Algorithmen, algebraische Methoden z.B. der Kombinatorik, grafische Methoden oder alle möglichen anderen Methoden des Data-Mining, insbesondere auch durch geeignete Kombination dieser Methoden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Aufgabe der Erfindung durch einen mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Marker gelöst, der eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7) umfaßt. Die mittels der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Marker sind für eine gegenüber dem Stand der Technik genauere und rassenübergreifende und damit schnellere und billigere Analyse des Polled-Phänotyps geeignet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligonukleotid zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers der vorliegenden Erfindung, wobei die Sequenz des Oligonukleotids im wesentlichen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 8 bis SEQ ID Nr. 21.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Mikrosatellit nachgewiesen, indem der gesamte oder ein Teil eines Markers in der Probe unter der Verwendung eines Sets von konservierten Primern für den zu analysierenden Marker einer PCR unterzogen wird, um amplifizierte Marker-Nukleinsäure herzustellen, anschließendem Sequenzieren der amplifizierten Marker-Nukleinsäure und Nachweisen der Anwesenheit der Nukleotidveränderung(en). Dies ist jedoch nur möglich, wenn die Amplifikate vor der Sequenzierung kloniert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine Kombination (Set) von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei der Oligonukleotide nach SEQ ID Nr. 8 bis SEQ ID Nr. 21. Besonders bevorzugt sind die Kombinationen (Sets) von Oligonukleotiden gemäß der Erfindung, die eine Kombination, ausgewählt aus der Gruppe der Kombinationen SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9; SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11; SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13; SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15; SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17; SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19, und SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 21.umfassen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte Oligo- oder Polynukleotide, die im wesentlichen aus den kontinuierlichen Nukleotiden jeder der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 14 bestehen, und die für die Analyse des „Polled"-Genotyps in einem Säuger geeignet sind. Bevorzugterweise kann das isolierte Oligo- oder Polynukleotid weiterhin einen nachweisbaren Marker, z.B. ein Radionuklid, Fluorophore, z.B. FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX, CY3, CY5, Peptid, Enzym, Antigen, Antikörper, Vitamin oder Steroid aufweisen. Für die verbesserte Genauigkeit der Analyse ist eine Kombination von isolierten Polynukleotiden, bestehend aus einzelnen isolierten Polynukleotiden möglich. Es können aber auch weitere Oligo- oder Polynukleotide für die Analyse verwendet werden. Der erfindungsgemäße Genotyp kann auch durch Hinzunahme weiterer spezifischer Sequenzvarianten, die in der Natur existieren, um diese neuen Varianten erweitert werden, so daß durch die Betrachtung dieser erweiterten Haplotypen bzw. Haplotypenpaare die Qualität der Diagnose und Analyse noch weiter gesteigert werden kann.
Diese markierten Sonden lassen sich dann z. B in einem der o.g. Verfahren zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers in einem Rind verwenden, wobei das Rind ausgewählt aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos .Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana sein kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Nutztier, wobei das Kit einen erfindungsgemäßen Marker selber, ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäße Sets, zusammen mit geeigneten Hilfsstoffen enthalten kann. Solche Hilfsstoffe sind z.B. PCR Primer, die zwischen 12-30 durchgehende Basen auf beiden Seiten der Polymorphismen bzw. Mikrosatelliten darstellen, um ein Amplifikationssystem zur Verfügung zu stellen, daß den Nachweis der Polymorphismen durch PCR und Fragmentlängenanalyse erlaubt.
Der Kit kann außerdem noch andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, z.B. wie oben angegeben, enthalten. Bevorzugterweise enthält der Kit die erfindungsgemäß Kombination von Oligo- oder Polynukleotiden, zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Rinds. Das Verfahren umfaßt a) zur Verfügung stellen von potentiell geeigneten Elterntieren und/oder eines Nachkommen, b) Erhalten einer Nukleinsäureprobe der Elterntiere und/oder des Nachkommen und c) Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers der Elterntiere und/oder des Nachkommen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7) und d) Auswahl geeigneter Elterntiere und/oder eines Nachkommen zur Züchtung eines hornlosen Rinds auf Basis des analysierten „Polled"-Genotyps.
In einer bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Verfahrens wird eine Vielzahl von Markersequenzen aus verschiedenen Nachkommen analysiert, wobei der Nachkomme ein Embryo oder eine befruchtete Eizelle sein kann, durchgeführt und basierend auf dem Ergebnis werden Nachkommen für die Zucht ausgewählt oder ausgeschlossen. Ein ähnliches Auswahlverfahren kann für die Elternteile durchgeführt werden.
Wie oben für das erste Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereits beschreiben, kann auch bei diesem Aspekt eine Kombination von Markern analysiert werden. Besonders bevorzugt ist auch hier die Analyse der folgenden Kombinationen 59A3-A3r, 59A3-CSfb, 59A3-D3f und 59A3-D5f, 59A3-CSfa und 59A3-D8f und 59A3-A3r; und 59A3-D8f und 59A3-F8r. Es können aber auch andere Kombinationen analysiert werden, die aus 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 der Marker bestehen. Weiterhin kann die Analyse den Vergleich von anderen mit dem Polled-Genotyp in Zusammenhang stehenden Merkmalen und/oder Markern umfassen, insbesondere dem Wackelhorn(„Scurs")-Genotyp.
Bevorzugt ist ein Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Rinds, wobei die Analyse mittels Fragmentlängenanalyse, Hybridsierung, oder MALDI-TOF erfolgt. Weitere Einzelheiten sind bereits oben genannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Nutztiers kann bei Rindern angewandt werden. Im Falle von Rindern erlauben die erfindungsgemäßen Macker die rassenübergreifende Analyse insbesondere bei den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos .Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana. Dabei können die optional untersuchten Elterntiere sogar aus derselben oder verschiedenen Nutztierrassen stammen. Bevorzugterweise stammen diese Elterntiere aus derselben Familie.
Ein letzter Aspekt betrifft dann ein mittels eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung gezüchtetes hornloses Nutztier, ein Embryo oder eine befruchtete Eizelle davon, wobei das Nutztier ein Rind ist. Bevorzugt ist das Rind ausgewählt ist aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos, Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.
Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur und das Amplifikationsprotokoll näher erläutert werden. Dabei zeigt
1: Stammbaum einer Haplotypen-Untersuchung mittels der Marker der vorliegenden Erfindung. Es wurden sowohl erfindungsgemäße als auch bereits publizierte Marker verwendet. Anhand der Marker können die väterlichen Chromosomen (V1/V2) unterschieden werden, wobei V2 mit dem Polled-Phänotyp segregiert. Dieser Stammbaum dient als Beispiel für eine Familien-interne-Analyse.

SEQ ID No. 1: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-A3r; 207 bp;
SEQ ID No. 2: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-CSfa; 170 bp;
SEQ ID No. 3: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-CSfb; 200 bp;
SEQ ID No. 4: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-D3f 237 bp;
SEQ ID No. 5: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-D5f 208 bp;
SEQ ID No. 6: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-D8f 96 bp;
SEQ ID No. 7: Die DNA Sequenz für Marker 59A3-F8r; 124 bp;
SEQ ID No. 8: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-A3r; 5'-gga cat cag gga gcg tgg gag-3';
SEQ ID No. 9: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-A3r; 5'-ccc ttg caa cgc cat taa act cc-3 ';
SEQ ID No. 10: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-C5fa; 5'-gca aag agt tgg aca gga ctg-3';
SEQ ID No. 11: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-CSfa; 5'-gtg gtc cag tgg cta aga tc-3';
SEQ ID No. 12: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-CSfb; 5'-acc tgg gat cga acc cag g-3';
SEQ ID No. 13: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-CSfb; 5'-cag gac tgg cta gga gtg c-3';
SEQ ID No. 14: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-D3f 5'-aga ctg cgt acc act cat atg-3';
SEQ ID No. 15: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-D3f 5'-cta gag ctc aca ttc tag tgg-3';
SEQ ID No. 16: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-D5f 5'-aac agc aga gat gca tag tcc-3';
SEQ ID No. 17: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-D5f 5'-cag ggt aga gtt tat ggt att tc-3';
SEQ ID No. 18: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-D8f 5'-cac tcg gac atg act gag cac g-3';
SEQ ID No. 19: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-D8f 5'-gaa gct gcc acc att tcc agt gg-3';
SEQ ID No. 20: Primer-Sequenz 1 für Marker 59A3-F8r; 5'-cga atg agc gac tga act gaa c-3'; und
SEQ ID No. 21: Primer-Sequenz 2 für Marker 59A3-F8r; 5'-cta gtt gaa acc taa atg ccc ac-3';

Beispiele
In der folgenden Tabelle sind die Eigenschaften der gefundenen erfindungsgemäßen Marker und deren zur Analyse und Isolierung benötigten Primer nochmals zusammengefaßt: Tabelle 1: Eigenschaften der gefundenen erfindungsgemäßen Marker
Es ist dem Fachmann bekannt, daß die hier angegebenen Längen der Marker den auf dem BAC-Klon (siehe Beispiel 1) aufgefundenen Sequenzen entsprechen und daher nur beispielhaft sind, da es gerade die Eigenschaft von Mikrosatelliten-Markern ist, daß sich die verschiedenen Allele in ihrer Länge unterscheiden. Dabei können insbesondere die oben in der Sequenz angegebenen „Repeats" von z.B. „CA"-Sequenzen in ihrer Länge variieren.
Beispiel 1 Isolierung genomischer Rinder-DNA aus der Polled-Region
Genomische Rinder-DNA wurde kloniert und einer Analyse unterzogen. Dazu wurde eine BAC-Bank mit einer Sonde (Sonde für EST 1413, Zugangsnummer GenBank AW289292) durchsucht, die aus der Polled-Region zwischen TGLA 49 und BM 6438 stammt (siehe 1). Aufgrund der Lage dieses bekannten Markers wurde angenommen, daß eventuell auf dem Klon vorhandene weitere Marker mit dem Polled-Phänotyp gekoppelt sind.
Der isolierte Klon wurde dann anschließend nach Mikrosatelliten-Markern wie folgt untersucht: Zunächst erfolgte eine Hinfl-Restriktion. Anschließend wurden die Fragmente mit einer CA-Sonde gescreent. Diejenigen Fragment, die mit der CA-Sonde hybridisierten, wurden isoliert, kloniert und sequenziert.
Bei der Analyse wurde die sequenzierte DNA nach für Mikrosatelliten-Marker charakteristischen Sequenzrepeats („CA", siehe oben) durchsucht. Potentiell polymorphe Bereiche der Sequenz wurden mittels PCR amplifiziert und auf variable Länge der Sequenzen hin in verschiedenen Tieren untersucht. Längen-Polymorphismen wurden für alle in Tabelle 1 aufgelisteten Marker gefunden. Diese Marker wurden dann weiteren Analysen unterzogen, um deren Segregation mit dem Polled-Marker zu bestätigen.
Beispiel 2 PCR Amplifikationstest und Multiplex-PCR
Die Analyse des BAC-Klons und die Sequenzdaten ermöglichen die Erstellung eines in vitro Amplifikationssystems, das zum Nachweis der Marker mittels PCR verwendet werden kann. Mit den dann amplifizierten Mikrosatelliten kann eine schnelle Analyse des Polled Genotyps durchgeführt werden. Weiterhin dienen diese Satelliten als Hilfsmittel zur Auffindung der Gene/des Gens, der/die für den Polled-Phänotyp verantwortlich ist/sind.
Ein Verfahren unter Verwendung von PCR-Amplifikation wurde entwickelt, um schnell Tiere auf die Marker untersuchen zu können, so daß der genetische Status im Hinblick auf die Marker für Polled genau und schnell bestimmt werden kann.
Das Verfahren beinhaltet die Amplifikation der DNA unter der Verwendung von Nukleotidprimern, die spezifisch für Regionen auf beiden Seiten der Marker sind. Die ausgewählten Primer sind in SEQ ID NO: 8 bis 21 dargestellt und schließen Sequenzen auf beiden Seiten der Marker ein. Nukleotid Primer, so wie die explizit Beschriebenen können jedoch auch von den anderen hier als Marker beschriebenen Sequenzen (SEQ ID No. 1 bis 7) in der Nähe der Mikrosatelliten-Marker abgeleitet werden.
Die durchgeführten Multiplex-PCR Reaktionen waren wie folgt:

1) Amplifikation von Marker 59A3-A3r (SEQ ID No. 1), 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3), 59A3-D3f (SEQ ID No. 4) und 59A3-D5f (SEQ ID No. 5);
2) 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2) und 59A3-D8f (SEQ ID No. 6), und
3) 59A3-A3r (SEQ ID No. 1), 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7).

Das entwickelte PCR-Protokoll unter der Verwendung der Marker war wie folgt. Zuerst wurde genomische DNA aus Blut durch allgemein im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert. Als nächstes wurde die Konzentration der DNA durch Verdünnung von DNA in Wasser und Messen der Absorption bei 260 nm Wellenlänge in einem UV-Vis Spektrophotometer bestimmt und geeignet eingestellt. Dann wurden die folgenden Ansätze in einem PCR-Gefäß hergestellt:

Multiplex- PCR 1) 3 μl 10×PCR-Puffer (gemäß Hersteller) 2 μl MgCl₂ (25 mM) 3,2 μl dNTP's (1,25mM) 0,7 μl C5fb (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 12 und 13) 1,5 μl D3f (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 14 und 15) 0,1 μl D5f (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 16 und 17) 0,05 μl A3r (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 8 und 9) 0,2 μl Thermo-Start Taq (5 U/μl) 7,25 μl H₂O +je 2 μl DNA (ca. 20ng/μl)
Multiplex-PCR 2) 3 μl 10× Puffer (gemäß Hersteller) 2 μl MgCl₂ (25 mM) 3,2 μl dNTP's (1,25mM) 0,1 μl C5fa (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 10 und 11) 0,05 μl D8f (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 18 und 19) 0,2 μl Thermo-Start Taq (5U/μl) 9,45 μl H₂O
Multiplex-PCR 3) 3 μl 10×Puffer 2 μl MgCl₂ (25 mM) 3,2 μl dNTP's (1,25mM) 0,1 μl A3r (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 8 und 9) 0,05 μl D8f (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 18 und 19) 0,1 μl F8r (10 pmol/μl) (SEQ ID No. 20 und 21) 0,2 μl Thermo-Start Taq (SU/μl) 9,35 μl H₂O Anschließend wurden die PCR-Reaktionen gemäß dem folgenden Programm durchgeführt.

PCR-Programm
95°C 15 min.
94°C 1 min.
60°C 1 min. 30 Zyklen (Multiplex 1)
65°C 1 min. 27 Zyklen (Multiplex 2)
65°C 1 min. 27 Zyklen (Multiplex 3)
72°C 1 min.
72°C 10 min. (Elongation)
15°C 1 min.
Zur weiteren Analyse wurden 1 μl unverdünntes PCR-Produkt auf einen Sequencer aufgetragen.
Beispiel 3
Kopplung der erfindungsgemäßen Marker mit dem Polled-Phänotyp in Rindern Um die Kopplung der Marker der vorliegenden Erfindung mit dem Polled-Genotyp zu bestätigen, wurde die gemeinsame Vererbung bestimmter Marker-Allele mit dem Polled-Phänotyp in einer Familie bestimmt (Ein Beispiel ist in 1 dargestellt). Hier wurden die Nachkommen eines Bullen mit drei verschiedenen Kühen getestet. Es konnte gezeigt werden, daß die in diesem Beispiel getesteten Marker (D8f F8r und A3r) eindeutig mit dem Polled- Phänotyp segregierten. Die bisher bekannten Marker wurden als interne Kontrollen verwendet.
Ähnliche Experimente wurden mit den anderen Markern der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Auch hier zeigte sich, daß diese Marker eindeutig mit dem Polled-Phänotyp segregierten.
Die Rinder wurden künstlich nach herkömmlichen Verfahren befruchtet, und die Mikrosatelliten wurden unter der Verwendung von Standardtechniken identifiziert (Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Zur Analyse wurden Proben der genomischen DNA der Rinder erhalten und gereinigt. Die Marker wurden mittels PCR amplifiziert, dabei fluoreszenzmarkiert und gemäß der Fragmentlängen auf einem Polyacrylamidgel getrennt. Anhand der Ergebnisse wurden dann die Haplotypen ermittelt (siehe 1) und Stammbäume aufgestellt. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Identifizierung des „Polled"-Genotyps eines Rinds, wobei das Verfahren umfaßt: – Erhalten einer Probe einer Nukleinsäure des Rinds, und – Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Kombination von Markern analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die folgende Kombination analysiert wird: – 59A3-A3r, 59A3-D8f und 59A3-F8r.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Analyse weiterhin den Vergleich von anderen mit dem Polled-Genotyp in Zusammenhang stehenden Merkmalen und/oder Markern umfaßt, insbesondere dem Wackelhorn(„Scurs")-Genotyp.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Analyse mittels Fragmentlängenanalyse, Sequenzierung, Hybridisierung, und/oder MALDI-TOF erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäure genomische DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Rind ausgewählt ist aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos, Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Analyse eine molekulargenetische und/oder theoretische Methode umfaßt.
Mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängender genetischer Marker, der eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7) umfaßt.
Oligonukleotid zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers nach Anspruch 9, wobei die Sequenz des Oligonukleotids im wesentlichen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 8 bis SEQ ID Nr. 21.
Kombination (Set) von Oligonukleotiden nach Anspruch 11, umfassend mindestens zwei der Oligonukleotide nach SEQ ID Nr. 8 bis SEQ ID Nr. 21.
Kombination (Set) von Oligonukleotiden nach Anspruch 11, umfassend eine Kombination, ausgewählt aus der Gruppe der Kombinationen: SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9; SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11; SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13; SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15; SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17; SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19, und SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 21.
Kombination nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Oligonukleotide weiterhin einen nachweisbaren Marker umfassen, z. B. ein Radionuklid, Fluorophor, Peptid, Enzym, Antigen, Antikörper, Vitamin, FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX, CY3, CY5 oder Steroid.
Verwendung eines Markers nach Anspruch 9, eines Oligonukleotid nach Anspruch 10 oder Sets nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers in einem Rind oder für das „comparative mapping".
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Rind ausgewählt ist aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos, Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.
Kit zur Analyse eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers in einem Rind, umfassend einen Marker nach Anspruch 9, ein Oligonukleotid nach Anspruch 10 oder Sets nach einem der Ansprüche 11 bis 13, zusammen mit geeigneten Hilfsstoffen.
Verfahren zur Züchtung eines hornlosen Rinds, wobei das Verfahren umfaßt: – zur Verfügung stellen potentiell geeigneter Elterntiere und/oder eines Nachkommen, – Erhalten einer Nukleinsäureprobe der Elterntiere und/oder des Nachkommen, – Analyse mindestens eines mit dem „Polled"-Genotyp zusammenhängenden genetischen Markers der Elterntiere und/oder des Nachkommen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mikrosatellitenmarkern 59A3-A3r (SEQ ID No. 1); 59A3-CSfa (SEQ ID No. 2); 59A3-CSfb (SEQ ID No. 3); 59A3-D3f (SEQ ID No. 4); 59A3-D5f (SEQ ID No. 5); 59A3-D8f (SEQ ID No. 6) und 59A3-F8r (SEQ ID No. 7), und – Auswahl geeigneter Elterntiere und/oder eines Nachkommen zur Züchtung eines hornlosen Rinds auf Basis des analysierten „Polled"-Genotyps.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei eine Kombination von Markern analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die folgend Kombination analysiert wird: – 59A3-A3r, 59A3-D8f und 59A3-F8r.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Analyse weiterhin den Vergleich von anderen mit dem Polled-Genotyp in Zusammenhang stehenden Merkmalen und/oder Markern umfaßt, insbesondere dem Wackelhorn(„Scurs")-Genotyp.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei der Nachkomme ein Embryo oder eine befruchtete Eizelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die Analyse mittels Fragmentlängenanalyse, Sequenzierung, Hybridisierung oder MALDI-TOF erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das Rind ausgewählt ist aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chour-gau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos, Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei die Elterntiere aus derselben oder verschiedenen Rinderrassen stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei die Elterntiere aus derselben Familie stammen.
Ein hornloses Rind, ein Embryo oder eine befruchtete Eizelle davon, gezüchtet nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 25.
Hornloses Nutztier nach Anspruch 26, ausgewählt aus den Rassen Schwarzbunte West, Schwarzbunte Ost, Rotbunte, Fleckvieh, Rotvieh/Angler, Gelbvieh, Vorderwälder, Hinterwälder, Fleischfleckvieh, Charolais, Galloway, Angus, Limousin, Highland-Cattle, Hereford, Pinzgauer, Salers, Blonde d'Aquitaine, Piemonteser, Brahman, Zebu, Braunvieh, Sahiwal, Chianina, Fleckvieh, Simmentaler, Jersey, Pinzgauer, Santa Gertrudis, Ankole Longhorn, Dahomey, Butana, Baoulé, Fogera, Kenana, Nganda, Nguni, Nkone, Tuli, Watussi, Chourgau, Dhanni, Mahish, Hariana, Red Sindhi, Ongole (Nellore), Sahiwal, Toda, Vechur, Yak, Banteng, Malay Banteng, Myanmar, Sapi-Bali, Mythum, Shwe Ni, Seladang, Jiu Long, Aulie Ata, Tianzhu White Yak, Chino Santandereano, Casanareno, Criollo Lechero Tropical, Costeño con Cuernos, Dominican Criollo, Lucerna, San Martinero, Romosinuano und Vallecaucana.