KR100673811B1 - 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법 및 이의 사용용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 내의 메틸 시토신의 정량 분석방법에 관한 것이다.

본 발명은 (1) 세포 또는 조직에서 추출한 게놈 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 반응시켜 메틸 시토신은 그대로 유지하고, 비메틸 시토신은 우라실(uracil)로 변형시키는 바이설파이트 처리 단계;

(2) 상기 (1) 단계에서 바이설파이트로 처리된 DNA를 주형(template)으로 하여 표적 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머와, dNTP 및 중합효소를 반응용액에 혼합하여 선별적으로 표적 유전자를 PCR 증폭하는 단계;

(3) 상기 (2) 단계의 증폭 산물에서 비특이적 증폭 산물, dNTP 및 프라이머를 제거하여 표적 유전자를 정제하는 단계;

(4) 상기 (3) 단계의 정제된 표적 유전자를 데옥시누클레오티드 일인산(dNMP)수준으로 분해하는 단계; 및

(5) 상기 (4) 단계의 분해된 dNMP 수준의 분해 산물을 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis)을 이용하여 분리하고 이로부터 표적 유전자 내의 메틸 시토신 함량을 정량 및 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법 및 상기 기재의 메틸 시토신의 정량 분석방법을 사용하여 피검체의 시료의 메틸 시토신 함량을 측정하고 데이타베이스화된 노화, 암, 병원균, 조직의 메틸 시토신 함량과 비교하여, 피검체의 노화, 암, 병원균 구분, 병원균의 오염 유뮤, 조직의 구분 또는 개인 구분 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 메틸화 정량 분석법은 지금까지 어떤 방법도 해결하지 못했던 고속, 고감도 및 자동화가 가능한 플랫폼으로 DNA 메틸화 정도를 정량할 수 있게 해 준다.

PCR, 바이설파이트, 모세관 전기영동, 메틸 시토신, 정량분석

Description

유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법 및 이의 사용용도{Method for quantitative analysis of methyl cytosine in DNA and uses thereof}

도 1은 바이설파이트 반응 및 PCR 반응에 의해 메틸 시토신을 비메틸 시토신으로부터 구분가능한 형태로 바뀌는 것을 나타낸 도면이고,

도 2는 발명에서 제시한 메틸시토신 정량분석법의 분석 절차를 간략하게 도식화 한 것이고,

도 3은 PCR 산물의 정제에 의해 분석의 방해 요인이 되는 dNTP 및 프라이머가 효율적으로 제거되고 있음을 나타내는 도면이고,

도 4는 바이설파이트 염기서열분석에 의해 메틸 시토신의 분포 및 양이 확인된 DNA 조각을 본 발명의 바람직한 일실시예의 방법에 의해 정량분석 하는 과정 중 모세관 전기영동 수행 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 내의 메틸 시토신의 정량 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피검체 시료에서 추출한 DNA를 바이설파이트로 처리하고 이를 PCR 증폭을 하며. 상기 증폭 산물은 데옥시누클레오티드 일인산(dNMP) 수준으로 분해한 다음, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 이용하여 분리하고 이로부터 표적 유전자 내의 메틸 시토신 함량을 정량 및 측정하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 메틸 시토신은 주로 유전자의 프로모터에 존재하는 CpG 디누클레오티드에 부여되며 메틸화의 결과로 해당 유전자는 발현이 억제되게 된다. 유전자의 메틸화는 생체의 발생 과정 중 특정 유전자를 시간적, 공간적으로 정교하게 발현/억제 조절을 함으로써 생체의 정상 발생을 매개한다. 따라서 유전자의 메틸화 조절 실패는 개체에게 각종 발생 장애, 태중 치사, 종양 발생, 노화 및 퇴행성 질환 같은 다양한 부정적인 결과를 초래하게 되는 것으로 알려져 있다.

그리고, DNA 메틸화가 암을 포함한 각종 질환의 발생 및 진행과 밀접한 연관성이 갖는다는 사실이 밝혀짐에 따라 DNA 메틸화 여부를 각종 질병의 진단 및 예후 판별의 표지자(marker)로 이용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 다양한 연구 사례에서 폐암, 대장암, 유방암에서 P16INK4a, BRCA1, hMLH1, e-카드헤린(e-Cadherin)과 같은 유전자가 비정상적으로 메틸화 된다는 사실이 밝혀진 바 있으며, uPA, 카스파제 9(Caspase 9), e-카드헤린(e-Cadherin)같은 유전자가 메틸화 되면 관련 암의 화학적 치료 효과가 현저하게 낮아진다는 사실이 알려져 있다.

이처럼, 특정 유전자의 메틸화 여부는 관련 질병의 진행 및 예후에 대한 정보를 주기 때문에 최근 DNA 메틸화 정보를 질병의 표지자 또는 예후 표지자로 이용하려는 연구들이 매우 활발하게 진행되고 있다.

그래서, DNA 메틸화의 생물학적, 임상적 중요성이 증대함에 따라 DNA 메틸화 양상을 분석하는 기술들도 급속하게 발전하고 있다. 현재까지 개발된 다양한 DNA 메틸화 분석법들의 몇 가지 분류 기준은 첫째, 게놈 상의 전체 DNA를 대상으로 하거나 또는 특정 목표 유전자만을 대상으로 하는지의 여부, 둘째, 특정 유전자에 대해서도 수십 개의 메틸화 가능 CpG를 전부 조사하느냐 아니면 특정한 한 두 CpG만을 조사하느냐의 여부, 셋째, 메틸화 분석이 정성적이냐 정량적이냐의 여부 등이 있다. 이러한 기준에서 볼 때 DNA 메틸화 분석이 임상적으로 편리하게 이용되기 위해서는 다음의 네 가지 조건이 만족되어야 한다.

1. 특정 표지 유전자 대상 분석

2. 일정 DNA 절편 내의 모든 CpG의 메틸화 분석

3. 정량적 분석

4. 분석의 편리성 및 경제성

현재까지 약 20여 종류의 다양한 메틸화 분석법이 개발되어 있지만 (Laird, P.W., Nature Rev. Cancer, 3, 253-266, 2003) 개발된 어떤 방법도 실제 임상에서 쓰일 수 있을 만큼 위에서 제시한 조건들을 만족시키지는 못하고 있는 실정이다. 예를 들어서 HPLC 또는 TLC 방법은 전체 게놈에 대해서 메틸 시토신의 양을 정량적으로 분석하는 데는 용이하지만 시료 요구량이 많은데다가 특정 유전자를 대상으로 분석할 수 없다는 단점이 있고 메틸화 민감성 제한효소(methylation sensitive restriction enzyme)를 이용한 Southern blot 법은 특정 유전자에 대해 정량적인 분석이 가능하지만 특정 유전자 절편의 수십 CpG 중 단 하나의 CpG의 메틸화 여부 만 알 수 있다는 점과 한번 수행에 최소 3일의 시간이 소요되기 때문에 분석의 경제성이 낮다는 약점이 있다. 개발된 다양한 방법들 중에서 가장 널리 응용되는 방법은 바이설파이트를 이용하는 방법이다. DNA에 3 내지 5 몰 정도의 고농도의 바이설파이트(bisulfite; 중아황산염)를 처리하고 탈황화(desulfonation) 시키면 메틸화된 시토신은 아무런 변화가 없는 반면에 메틸화 되지 않은 시토신은 우라실로 화학적 변환이 이루어진다(도 1 참조). 그리고, 현재 개발된 어떤 방법도 메틸 시토신의 위치와 양을 유지하면서 특정 유전자를 증폭할 수가 없는데 이 바이설파이트 방법을 적용하게 되면 "메틸 시토신/비메틸 시토신" 관계가 "시토신/우라실(또는 티민)" 관계로 대치되어 메틸 시토신의 위치와 양 정보를 유지하면서 특정 유전자를 증폭할 수 있는 상황으로 바뀌게 된다. 즉, 바이설파이트 처리 및 PCR 과정은 메틸화의 위치와 양을 유지하면서 특정 유전자만을 선택적으로 증폭하는 방법이다. 이러한 과정은 분석이 까다로운 DNA 수식화(modification) 정보를 분석이 용이한 염기서열 정보로 변환시켜 줄 뿐만 아니라 특정 유전자의 선택적 증폭에 따라 시료 요구량이 적어지고 다른 유전자의 메틸화 정보가 제외되기 때문에 의해 분석 결과의 해석이 명확해 지는 장점이 있다. 이런 이유로 대부분의 최신 메틸화 분석법은 바이설파이트 처리 및 PCR 증폭 과정을 전제로 하는 경우가 많다(표 1 참조).

[표 1]

그러나, 하기 표 1에 나열된 방법 중 일부는 비정상 메틸화 유전자를 찾아내기 위한 작업에 많이 쓰인다. 예를 들어서 RLGS 방법이나 MS-AP-PCR 방법은 두 개의 대조군이 있을 때 한 쪽에서 메틸화가 많게 혹은 적게 돼 있는 유전자들을 전체 게놈(genome) 수준에서 스크리닝하는 하는데 적합한 기술이다. 반면, 바이설파이트 및 PCR 반응 이후 수행하는 몇 가지 분석법들은 목표 유전자가 정해져 있을 경우 고속, 고감도로 특정 유전자의 메틸화 여부를 조사하는 목적으로 많이 이용되는데, 예를들어 MS-PCR, COBRA, MethyLight 같은 분석법들이 여기에 속한다. 그러나, 이 방법들은 고속, 고감도의 분석이 가능하긴 하지만 대부분 한 두 CpG의 메틸화 여부 만을 판별하기 때문에 분석 및 정량의 대표성이 다소 떨어지는 단점이 있다. 따라서 대개는 앞서 언급된 방법들로 일차 분석을 한 후에 검증(validation) 분석이 추가로 요구된다.

그리고, 현재 개발되어 있는 유일한 최종 검증법은 바이설파이트 처리-클로닝-염기서열분석(nicleotide Sequencing)방법이다. 이 방법은 특정 유전자를 바이설파이트 처리-PCR 증폭한 후 여기에서 나오는 PCR 산물을 개별 클론으로 클로닝하고 이들을 각각 염기서열분석함으로써, PCR 산물 내의 모든 CpG 부위의 메틸화 여부를 검증하는 것이다. 일반적으로 20 개 정도의 클론에 대한 염기서열분석 결과로 그 유전자의 메틸화 여부를 대표적으로 표시하게 된다. 그러나 상기 바이설파이트 처리-클로닝-염기서열분석 방법이 현재로서는 최선의 메틸화 분석 및 검증법이기는 하지만, 다수의 클론에 대한 클로닝, 염기서열분석 작업을 필요로 하기 때문에 시간 및 경제적인 측면에서 단점을 갖고 있다.

이에, 본 발명자는 지금까지 소개된 수많은 DNA 메틸화 분석법들은 정량성이 좋으면 개별 유전자 분석이 어렵고, 개별 유전자 분석이 용이하고 경제성이 높으면서 정량성이 떨어지는 단점을 보완하고, 개별 유전자 수준의 분석이 가능하며 유전자 내 한 두 부위가 아닌 전체 메틸화 부위에 대한 정량적인 정보를 얻을 수 있는 새로운 DNA 메틸화 정량분석 기술을 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 피검체 시료로 부터 추출한 게놈 DNA를 바이설파 이트로 처리하고, 상기 처리된 DNA에서 표적 유전자(target gene)를 PCR 증폭하고, 증폭된 표적 유전자 내에 포함된 시토신의 비율을 모세관 전기영동을 통해 정량적으로 측정함으로써, 표적 유전자 내의 메틸 시토신 비율을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 정량 분석 방법을 사용하여, 피검체의 노화, 암, 병원균 구분, 병원균의 오염 유뮤, 조직의 구분 또는 개인 구분에 쓰일 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 세포 또는 조직에서 추출한 게놈 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 반응시켜 메틸 시토신은 그대로 유지하고, 비메틸 시토신은 우라실(uracil)로 변형시키는 바이설파이트 처리 단계;

(2) 상기 (1) 단계에서 바이설파이트로 처리된 DNA를 주형(template)으로 하여 표적 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머와, dNTP 및 중합효소를 반응용액에 혼합하여 선별적으로 표적 유전자를 PCR 증폭하는 단계;

(3) 상기 (2) 단계의 증폭 산물에서 비특이적 증폭 산물, dNTP 및 프라이머를 제거하여 표적 유전자를 정제하는 단계;

(4) 상기 (3) 단계의 정제된 표적 유전자를 데옥시누클레오티드 일인산(dNMP)수준으로 분해하는 단계; 및

(5) 상기 (4) 단계의 분해된 dNMP 수준의 분해 산물을 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis)을 이용하여 분리하고 이로부터 표적 유전자 내의 메틸 시토신 함량을 정량 및 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 기재의 메틸 시토신의 정량 분석방법을 사용하여 피검체의 시료의 메틸 시토신 함량을 측정하고 데이타베이스화된 노화, 암, 병원균, 조직 또는 개인별 메틸 시토신 함량과 비교하여, 피검체의 노화, 암, 병원균 구분, 병원균의 오염 유무, 조직의 구분 또는 개인의 구분 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기의 질병에서 암을 진단할 수 있는 근거는 다음에 기재하는 대상 유전자의 메틸화에 의한 암 초래에 관한 공지된 참고문헌에 의해 지지를 받는다.

e-카드헤린는 그 형태가 점돌연변이나 프로모타 과메틸화가 혼합되어 나타나는 데, e-카드헤린의 이상은 급성 백혈병(빈도 70%), 유방암(30-75%), 식도암(84%), 간암(40-70%), 궤양성대장암에 속발된 대장암(40-70%) 등이 있으며, 이들 암의 경우 e-카드헤린의 변이 검사가 유용한 보조 진단법이 된다(Guliford, P. J et al. Hum.Mutat, 1999. 14: 249-255, 1999; Machado JC et al. Oncogene, 2001. 20(12):1525-1528; Droufakou S et al. Int J Cancer, 2001, 92(3):404-408).

FHIT(fragile histidine triad)는 프로모터의 CpG 아일랜드의 메틸화가 폐암과 두경부암, 식도암 등에서 좋은 진단 지표로 지적되고 있다(Inoue, H et al. Proc. Nat. Sci,1997. 94:12584-14589; Sozzi G et al. Cancer Res,1998. 58:5032- 7; Zochbauer-Muller S et al Cancer Res, 2001).

P 16 유전자의 프로모터 메틸화 검사는 폐암, 두경부암, 간암, 담관암 등 다수의 암진단에 가능하고, P15는 급성백혈병과 위암의 진단에 유용하다(Esteller M et al. Cancer Res,1999. 59:67-70;Melki JR et al. Cancer RES,2999. 59:3730-40;Liew CT et al. Oncogene, 1999. 18:789-93; Wong IH et al. Clin Cancer RES,2000. 6:3516-21; Kersting M. J Clin Oncol, 2000. 18:3221-4; Rosas SL et al. Cancer RES,2001. 61:939-42).

MGMT(methylguanine-DNA methyltransferase)는 프로모터의 과메틸화로 인하여 뇌교종, 대장암, 폐암 등의 진단지표가 될 수 있으며, 구미에서는 혈액이나 객담, 침에서 MGMT의 프로모터 과메틸화를 조사하여 폐암과 두경부암 진단에 이용하는 방법이 알려져 있다(Esteller M et al. Cancer Res,1999. 59:793-797;Esteller M et al. Cancer Res,2001. 61:4689-4692; Esteller M et al. Cancer Res,2001. 61:3225-9).

이외에도 유전자 프로모터의 과메틸화로 인하여 제대로 발현이 이루어지지 않아 암을 유발하거나 노화를 촉진하는 것은 잘 알려져 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 개별 유전자에 대한 메틸화 정도를 정량적으로 분석하는 방법으로, DNA에 바이설파이트(bisulfite) 처리를 하면 시토신은 우라실로 변환되지만 메틸 시토신은 그대로 메틸 시토신으로 남고, 다시 분석하고자 하는 유전자에 대한 PCR 증폭을 하게 되면 그 PCR 산물은 일반 시토신 위치에 티민, 메틸 시토신 위치에 시토신을 포함하게 되는 특성을 이용하여, 먼저, 피검체 시료로 부터 추출한 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 상기 처리된 DNA에서 표적 유전자(target gene)를 PCR 증폭하고, 증폭된 표적 유전자 내에 포함된 시토신의 비율을 모세관 전기영동을 통해 정량적으로 측정함으로써, 표적 유전자 내의 메틸 시토신 비율을 정량적으로 분석하는 것이다.

이때, 본 발명에서 사용되는 피검체 시료는 세포, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 피부, 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐 및 간으로 이루어진 군에서 선택된 피검체에서 추출한 DNA을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 상기 시료들이 본 발명의 목적인 노화, 암, 병원균 구분, 병원균의 오염 유무, 조직의 구분 또는 개인 구분 및 진단에 적합한 소재이기 때문이다.

또한, 본 발명에서는 시료 내 유전자의 메틸 시토신 함량을 정량하기 위해서, 상기 (4) 단계의 dNMP 분해는 핵산분해효소(nuclease), DNA 분해효소(DNase) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 효소를 사용하여 분해하는 생물학적 인 효소 분해 방법과, 산, 염기 처리 또는 가열을 포함하는 화학적 분해 방법, 초음파기(ultrasonic wave), 전단파기(Shearing wave) 및 입자가속기로 이루어진 군에서 선택된 분해기기를 사용하여 분해하는 물리적인 분해 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 사용량은 DNA의 함량에 따라 변동될 수 있으며, 통상적으로 공지된 방법에 의해 처리하도록 한다. 이는 본 발명의 통상의 분야에 있는 당업자라면 누구라도 알 수 있는 자명한 것이다.

그리고, 본 발명에서 상기 (5) 단계의 dNMP는 고성능액체크로마토그래피(HPLC), 액체크로마트그래피/질량분석기(LC/MS), 박막층 크로마토그래피(TLC) 및 가스크로마토그래피(GC)로 이루어진 군에서 선택된 측정기기를 사용하는 것이 바람직하다. 이는 상기와 같은 기기는 모세관 전기영동에 의해 분리한 DNA 염기서열 농도의 적은 함량(최초 농도(1㎍/50㎕)에서도 충분히 검출할 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법을 단계별로 다음과 같은 특징을 갖는다.

(1) 바이설파이트 처리단계

분석하고자 하는 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite)로 처리하고, 비메틸화된 시토신을 우라신으로 변환시키는 단계로서, 처리 농도는 통상적으로 공지된 방법으로 처리하고, 바람직하게는 4M의 바이설파이트를 pH는 4.0∼5.0, 온도는 50∼60℃에서 4∼5시간동안 처리하는 과정을 포함한다. 바이설파이트 처리에 있어서는 상기 농도 전후에서 DNA가 안정하고, 반응하기 유리하기 때문이다. 또한, 상기 목 적을 달성할 수 있는 것이라면 바이설파이트의 농도나 처리시간 등이 한정되는 것이 아니다.

이때, 분석하고자 하는 게놈 DNA는 먼저, 강염기 조건에서 단일가닥으로 변성시켜준다.

(2) 표적 유전자를 PCR 증폭하는 단계

바이설파이트로 처리 된 DNA를 주형으로 하여 분석 대상의 특정 유전자를 PCR을 통해 증폭하고 순수 분리하는 단계로 표적 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머를 선정하고, DNA 중합효소 및 dNTP를 통상의 공지된 반응 완충용액에 혼합하고 통상으로 공지된 PCR 방법을 수행한다.

(3) 증폭산물의 표적 유전자를 정제하는 단계

비특이적 증폭 산물, dNTP 및 프라이머를 제거하여 표적 유전자를 정제하는 데, 바람직하게는 상업적으로 판매하고 있는 정제 키트를 이용하여 모세관 전기영동 시, 표적 유전자 내의 메틸 시토신의 함량의 오차를 최대한 줄이도록 한다.

(4) 정제된 표적 유전자의 dNMP 수준으로의 분해

증폭 및 분리된 표적 유전자(PCR 산물)을 상술한 바와 같이, 생물학적인 방법으로 효소를 이용하거나, 산, 염기 처리 또는 가열 등을 통한 화학적인 분해 방법 또는 물리적인 분해 방법으로 초음파, 전단파 등을 사용하여 DNA의 구성의 단량체인 dNMP 수준으로 분해한다.

(5) 분해된 dNMP를 모세관 전기영동을 통해 분리하고 정량 분석하는 단계

이때, 본 발명에서는 메틸 시토신의 정량 측정값의 유효성을 검증하거나 보 정하기 위하여, 적절한 정량 기준물(염기서열이 공지된 올리고 DNA)을 이용해 상기 (5)의 정량 결과를 보정하여 최종적으로 대상 유전자의 메틸화 정도를 정량하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명을 도면을 참조하여 더 상세히 설명하고자 한다. 단, 본 발명의 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시한 것으로, 이에 한정되는 것이 아님은 자명한 것이다.

먼저, 도 2는 본 발명의 정량 분석 과정을 각 세부 절차 순서로 나열한 것이다. 더불어 각 세부 절차 별로, 정량 분석의 정확성을 높이고 불확실성을 최소화 하기 위해 검증해야 하는 검증 사항을 표시하였다. 기본적으로 본 발명의 DNA 메틸화 분석 과정은 위에 표시한 다섯 단계로 이루어진다.

그리고, 도 1에 나타낸 바와 같이, DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하면 시토신에 탈아민화(deamination) 반응이 일어나서 시토신과 메틸 시토신이 구분 가능하게 되는데 일반적으로 바이설파이트에 의한 변환 반응은 97% 이상의 효율을 갖는다고 알려져 있다. 특히, 최근에 개발된 저융점 아가로즈(low melting temperature agarose)방법이나 상업용으로 판매되는 바이설파이트 반응 키트(CpGenome kit, Chemicon, Temecula, CA, USA; EZ DNA methylation kit, Zymo Research, Orange, CA, USA)를 이용하면 99 % 이상의 변환 효율을 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다. 그리고, 바이설파이트 변환 이후에는 PCR을 통한 개별 유전자의 증폭 및 분리, 정제 과정이 포함된다. 본 발명에서는 PCR 증폭 시 비특이적 증폭 산물이 생성되는 것을 방지하기 위하여 경우에 따라서는 증폭 부위 내부 PCR 프라 이머(nested PCR primer)를 이용하여 PCR 증폭을 한번 더 수행하는 것이 바람직하다. 증폭된 PCR 반응물은 반응 시작 시 넣어준 프라이머와 dNTP 혼합물이 존재하는데 이것들은 본 발명에서 차후 분석하고자 하는 dNMP로 변환될 수 있는 화합물이다. 본 발명에서는 잔재한 프라이머와 dNTP를 효과적으로 제거해 주기 위하여 상용의 PCR 정제기(purification kit)(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였다. 다음으로는 정제된 PCR 산물을 모세관 전기영동에서 분석하고자 하는 형태인 dNMP로 분해하는 과정인데, 본 발명에서는 포스포디에스터라제(phosphodiesterase, AmershamBiosciences, Piscatawat, NJ, USA)를 이용하였다. 그리고, dNMP 수준으로 분해된 반응물은 별도의 정제 과정 없이 바로 모세관 전기영동(P/ACE MDQ CE system, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)을 이용하여 분리 및 정량 분석하였다. 모세관 전기영동을 과정에서는 절대적인 시토신의 양이 아니라 시토신/티민 상대적 비율을 정량 분석하였다.

본 발명에서 메틸 시토신에 대한 분석의 원리에서는 시토신의 양을 측정하면 원래 DNA의 메틸 시토신의 양을 알 수 있는 것으로 되어 있지만 실제 PCR 산물은 이중 나선으로 구성돼 있기 때문에, 한 쪽 가닥에 구아닌이 있으면 반대편 가닥에 불가피하게 시토신이 따라오게 된다. 따라서 모세관 전기영동에서 구해진 상대적인 시토신 비율에서 표적 유전자의 염기서열에 따라 반대편 가닥의 구아닌에서 나온 비율을 빼준 것이 최종적인 메틸 시토신 비율이 된다.

그리고, 본 발명에서는 무게법으로 정량 기준물을 만드는 대신, 이미 염기서열이 알려진 합성 올리고 프라이머를 정량 표준기준물로 사용하는 것이 바람직하 다. 이는 현재까지 dNMP에 대한 정확한 정량 기준물이 존재하지 않은 것을 국내 최초로 결정하여 시도한 것이다. 이때, 본 발명에서 분석하고자 하는 것은 시토신의 절대량이 아니라 시토신/티민 비율이기 때문에 단일 분자 내에 존재하는 시토신과 티민의 비율만 정확하면 정량의 기준물로 사용할 수 있다. 다만, 정량 기준물이 순도가 낮아 다른 분자가 섞일 수 있으므로 폴리아크릴아마이드 젤을 통해 순수 분리된 올리고 프라이머를 동일한 절차에 따라 분석하여 기준으로 삼고 분석값을 보정하는데 사용한다.

[실시예]

(1) 바이설파이트 처리

본 발명에서는 두 종류의 DNA를 바이설파이트로 처리하여 분석에 이용하였다. 하나는 원리 및 절차의 유효성을 검증하기 위하여 간단한 형태인 플라스미드 DNA(pUC19; NEB, Beverly, MA, USA) 를 인위적으로 메틸화 시킨 후 사용한 것이고 또 하나는 개발된 방법의 적용성을 검증하기 위해 간암 세포주에서 추출한 게놈 DNA를 사용하였다. 플라스미드 DNA의 인위적인 메틸화는 NEB 사의 Sss I 메틸화 효소, Hha I 메틸화 효소를 이용하였다. 바이설파이트 처리는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 제한 효소를 이용하여 적당한 크기로 절단한 약 1 ㎍/50㎕ 의 게놈 DNA를 0.3M NaOH 조건에서 15분간 처리하여 단일가닥으로 분리한 후 신선하게 준비한 4 M의 소듐 바이설파이트(Sigma, USA)와 1 mM의 하이도로퀴논 용액(pH 5.0) 500㎕ 와 섞어 주고 미네랄오일로 위층을 덮어준다. 반응물은 빛이 통하지 않게 덮개 로 감싸서 55℃ 에서 4시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 Microcon YM 30(Millipore, Bedford, MA, USA) 컬럼을 이용하여 반응물을 정제하고 0.3 M NaOH 조건으로 37℃ 에서 30분간 반응시켜 탈황화 반응(desulfonation)을 유도한다. 반응물을 다시 Microcon YM 30 컬럼을 이용하여 정제하고 50㎕의 3차 증류수를 이용하여 회수한다. 회수한 DNA 2 ㎕를 한번의 PCR에 주형으로 이용하였다.

(2) PCR 증폭 및 분리, 정제

다음과 같은 PCR 프라이머를 이용하여 바이설파이트로 처리된 플라스미드 DNA로부터 약 300 bp의 DNA 부위를 증폭하였다. p19bs f: AAGTGTAAAGTTTGGGGTGTTTAA, p19bs r: AACCTTTTACTCACATATTCTT TCCTAC. 증폭된 PCR 산물은 PCR 정제기(Qiaquick; Qiagen)을 이용하여 정제하였고 정제된 DNA는 아가로즈 젤을 통해 다른 종류의 DNA가 섞이지 않았음을 확인하였다. PCR 산물의 정제 시에는 100 ㎕의 PCR 반응물을 30 ㎕로 회수하여 정제 전후, 약 세 배 정도로 PCR 산물의 농축이 이루어지게 하였다. 염기서열분석(sequencing)을 통한 메틸화 분석을 위하여 일부 PCR 산물은 pCRSCRIPT II(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 벡터에 클로닝하였다. 각 클론들은 제노텍(대전, 대한민국)의 서비스를 통해 시퀀싱을 하였다.

(3) PCR 산물의 분해 및 모세관 전기영동을 통한 정량 분석

정제된 DNA는 PCR 버퍼 조건에서 0.05 유닛의 포스포디에스테라제 (phosphodiesterase)를 첨가하고 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켜 5'-dNMP 수준으로 완전 분해하였다. 반응 후, 효소를 불활성화 시키기 위하여 80℃에서 15분 동안 방치하였다. PCR 산물을 정제하지 않았을 경우 모세관 전기 영동 상에서 프라이머나 PCR 반응에 첨가하는 dNTP 혼합물에 의해 정량 결과를 방해할 수 있는 피크가 산출될 수 있어 이를 정제 전과 후로 나누어 잔여 프라이머나 dNTP가 완전히 제거된다는 사실을 확인하였다(도 3 참조). dNMP 수준으로 분해된 반응물은 별도의 정제 과정 없이 직접 모세관 전기영동 장치를 이용하여 각 dNMP들을 분리 및 정량 분석하였다. 분리에는 전체 길이 70 cm(검출 장치까지의 길이 약 60 cm)이며 내경 50 ㎛, 외경 365 ㎛의 용융 실리카 모세관(Polymicro Technology, Phoenix, AZ, USA)을 이용하였으며 분리 용 용매로는 8mM 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide ; CTAB), 100 mM 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(2- amino-2-methyl-1-propanol ; AMP), 46 mM NaCl 로 구성된 완충용액을 pH 10.1로 맞추어서 이용하였다. 시료의 주입은 전기역학적인 방법으로 -5 kV에서 10초 동안 주입되었으며 전기영동은 -20 kV, 25℃에서 수행하였다. 각 분자는 UV 260 nm에서 검출하였다. 이의 결과는 도 4에 도시된 바와 같이, 바이설파이트 염기서열분석에 의해 메틸화 정도를 알고 있는 DNA에 대해 본 발명에서 개발한 절차에 의해 모세관 전기영동을 실시한 결과를 보여 준다.

(4) 시토신/티민 정량 결과의 보정 및 최종 메틸화 정량

모세관 전기영동에서 정량하고자 하는 것은 시토신의 절대량이 아니라 시토 신/티민의 상대량이다. 따라서 정량의 기준물로는 순수한 dNMP들을 무게법에 의해 준비하는 방법 대신, 염기서열이 알려진 순순한 올리고 DNA를 이용하였다. 기준 올리고로는 폴리아크릴아마이드 젤을 통해 순순 분리된 T7: TAATACGACTCACTATAGGG 와 P16r: GTCTGCTGAAACTGCCAACA 올리고를 이용하였다. T7 올리고의 경우에는 염기서열에 의해 C/T 비율 1, G/A 비율 0.571로 측정되어야 하고 P16r 올리고의 경우는 C/T 비율 1.5, G/A 비율 0.5로 측정되어야 한다. 각 dNMP의 UV 흡광계수가 같지 않기 때문에 모세관 전기영동에서 피크의 넓이만으로 정량한 결과는 각 분자의 실제 비율과는 차이가 있다. 따라서 기준 올리고를 측정하여 각 올리고에서 측정된 C/T, G/A 비율을 염기서열에서 산출한 계산치로 나누어 주고 이를 보정계수로 하여 실제 메틸화 분석 대상물의 정량 결과를 다시 이 보정 계수를 이용하여 보정해 주었다. 상기의 방식에 의해 서로 다르게 메틸화 된 플라스미드 DNA의 메틸화 정도를 정량하고 이를 염기서열을 분석한 결과와 비교한 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

클론	C0		C9		C14		C24
	C/T	G/A	C/T	G/A	C/T	G/A	C/T	G/A
이론값	0.431	0.431	0.503	0.503	0.543	0.543	0.624	0.624
측정값	0.371±0.011	0.416±0.002	0.440±0.015	0.482±0.016	0.468±0.014	0.528±0.021	0.548±0.018	0.607±0.018
보정값	0.418	0.431	0.495	0.500	0.527	0.547	0.617	0.629
차이(%)	2.948	-0.043	1.514	0.644	2.966	-0.718	1.104	-0.766
차이(#mC)	1.605	-0.023	0.962	0.409	2.034	-0.492	0.870	-0.603

이때, 이론값(calculated)은 바이설파이트로 처리한 염기서열 분석으로 계산한 것; 측정(measured)은 정량(CE)을 통한 측정값; 보정값(calibration)은 보정요소를 사용하여 보정한 것, 차이(%)는 이론값에서 보정값의 차이고, 차이(#^mC)는 25 개의 메틸화 가능 CpG 중에서 이론치와 본 실시예에서 실제 정량 분석한 값의 차이에 해당하는 메틸 시토신 수의 차이를 나타낸 것이다.

상술한 결과와 예측된 비교에 의하면, 본 발명에서 개발한 메틸화 정량법은 약 5 %의 오차 내에서 특정 DNA 조각 내의 메틸화 정도를 정량할 수 있음을 알 수 있다. 이는 특정 DNA 조각 내에 실제 메틸화 되어 있는 CpG가 20개 있다고 가정하면 본 발명에서 제시하는 방법은 19 내지 21개의 메틸화 CpG가 있다고 예측한다는 것을 의미한다.

이상과 같이, 본 발명의 DNA 메틸화 정량 분석법은 지금까지 어떤 방법도 해결하지 못했던 고속, 고감도 및 자동화가 가능한 플랫폼으로 DNA 메틸화 정도를 정량할 수 있게 해 준다. 또한, 본 발명은 샘플 하나를 정량하는데는 필요한 시간은 게놈 DNA에서 시작할 경우 약 7시간 정도이며, 다른 메틸화 분석법도 대부분 수행해야 하는 바이설파이트 처리 및 PCR 증폭 과정을 제외할 경우에는 dNMP 분해에 약 1시간, 모세관 전기영동에 약 10분 정도이다. 이는 전례에 없는 고속의 메틸화 정량법이라고 할 수 있으며 더욱이 PCR 증폭, 정제, dNMP 수준으로의 분해, 모세관 전기영동 등 모든 과정이 수십 개의 샘플을 동시에 처리할 수 있게 돼 있으므로, 대규모 정량 분석 수행 시 개별 샘플 당 소요 시간은 훨씬 절감할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에서 제시된 정량의 불확도는 5 % 이내이며 이는 모세관 전기영동 조건의 최적화를 통해 좀 더 개선될 수 있기 때문에, 향후 동종업계 에 진출 시 큰 호응을 얻을 수 있을 것으로 판단된다.

Claims (9)

1. (1) 세포 또는 조직에서 추출한 게놈 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 반응시켜 메틸 시토신은 그대로 유지하고, 비메틸 시토신은 우라실(uracil)로 변형시키는 바이설파이트 처리 단계;

   (2) 상기 (1) 단계에서 바이설파이트로 처리된 DNA를 주형(template)으로 하여 표적 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머와, dNTP 및 중합효소를 반응용액에 혼합하여 선별적으로 표적 유전자를 PCR 증폭하는 단계;

   (3) 상기 (2) 단계의 증폭 산물에서 비특이적 증폭 산물, dNTP 및 프라이머를 제거하여 표적 유전자를 정제하는 단계;

   (4) 상기 (3) 단계의 정제된 표적 유전자를 데옥시누클레오티드 일인산(dNMP)수준으로 분해하는 단계; 및

   (5) 상기 (4) 단계의 분해된 dNMP 수준의 분해 산물을 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 이용하여 분리하고 이로부터 표적 유전자 내의 메틸 시토신 함량을 정량 및 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   염기서열이 알려진 올리고 DNA를 정량 표준물질로 하고, 상기 게놈 DNA 내 표적 유전자와 함께 동일한 방법으로 메틸 시토신의 함량을 정량 및 측정하여 메틸 시토신의 정량 및 측정값의 유효성을 검증하거나 보정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 피검체 시료는 세포, 혈액, 타액, 대변, 소변, 혈청, 피부, 눈, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐 및 간으로 이루어진 군에서 선택된 피검체에서 추출한 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 (4) 단계의 분해는 뉴클리아제(nuclease), DNA 분해효소(DNase) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 효소를 사용하여 분해하는 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
5. 제 1항에 있어서

   상기 (4) 단계의 분해는 산, 염기 처리 또는 가열에서 선택되는 화학적 방법에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석 방 법.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 (4) 단계의 분해는 초음파기(ultrasonic wave), 전단파기(Shearing wave) 및 입자가속기로 이루어진 군에서 선택된 분해기기를 사용하여 분해하는 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 (5) 단계의 dNMP는 고성능액체크로마토그래피(HPLC), 액체크로마트그래피/질량분석기(LC/MS), 박막층 크로마토그래피(TLC) 및 가스크로마토그래피(GC)로 이루어진 군에서 선택된 측정기기를 사용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 유전자 내 메틸 시토신의 정량 분석방법.
8. 삭제
9. 제 1항 내지 제 7항에서 선택되는 어느 한 항의 방법을 이용한 유전자내 메틸 시토신의 정량 분석 장치.

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