JP2004113241A - 複数の核酸配列バリエーションの検出のための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 サンプル中の核酸検体における多型部位における遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法を提供すること。
【解決手段】 (a)サンプル中に含まれる核酸分析物から標識アンプリコンを調製する工程;(b)標識アンプリコンと複数の第1および第2のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;(c)工程(b)において形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体と、複数の第1および第2の捕捉プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;(d)工程(c)において形成された、任意の捕捉された野生型および改変体複合体を検出および計数する工程;ならびに(e)工程(d)において検出された、捕捉された野生型および改変体複合体の相対量を比較することにより遺伝子バリエーションの存在の有無を決定する工程を包含する、方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 (a)サンプル中に含まれる核酸分析物から標識アンプリコンを調製する工程;(b)標識アンプリコンと複数の第1および第2のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;(c)工程(b)において形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体と、複数の第1および第2の捕捉プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;(d)工程(c)において形成された、任意の捕捉された野生型および改変体複合体を検出および計数する工程;ならびに(e)工程(d)において検出された、捕捉された野生型および改変体複合体の相対量を比較することにより遺伝子バリエーションの存在の有無を決定する工程を包含する、方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、概して、多型部位における核酸標的の配列を決定するための方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸標的の直接ハイブリダイゼーションを使用して配列を決定する方法に関する。本発明は、診断アッセイ、多重(マルチプレックス)技術、および遺伝子分析の分野において有用性を有する。
生存する生物は、ヌクレオチドの特定の配列の形態で遺伝情報を保有する。同じ種内でも、特定の個体をコードするヌクレオチド配列は、異なり得る。これらのバリエーションを調べることにより、科学者は、特定の形質、状態、または疾患を、遺伝子配列における特定のバリエーションと相関させることが出来る。結果として、特定の位置(一般的に多型部位といわれる)における遺伝子配列の決定は、特定の遺伝疾患の診断を可能にし得、そして個体に関する豊富なさらなる情報を明らかにし得る。
多型部位における特定の配列を決定するためのいくつかの技術は、文献に報告されている。具体的な方法としては、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよびプライマー伸長アッセイに基づく方法が挙げられる。
オリゴヌクレオチドライゲーションに基づくアッセイは、2つの別個のオリゴヌクレオチドプローブを使用し、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、核酸標的上に縦列配置でハイブリダイズし、それにより両方のオリゴヌクレオチドプローブおよび標的の間に完全な相補性が存在する場合にオリゴヌクレオチド二重鎖を形成するように設計される。しなわち、各オリゴヌクレオチドプローブの一方の端は、標的およびオリゴヌクレオチドプローブ対が互いに相補的である場合に、他方に直接隣接する。一旦、ハイブリダイゼーションに十分なインキュベーション時間が経過すると、標的上で互いに対して(結合していないが)隣接するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの対を、酵素により結合するかまたは連結するために、酵素(例えば、DNAリガーゼ)を添加する。結果として、ライゲーションは、標的に対して両方のオリゴヌクレオチドが相補的である場合に成功するが、正確な相補性がない場合は失敗する(または起こる可能性が低い)。その後の加熱は、ハイブリダイズした鎖の変性を生じ、元のオリゴヌクレオチドプローブが、結合して単一のより大きなオリゴヌクレオチドを形成するか、または2つの別個のオリゴヌクレオチドプローブとして残るようにする。得られたより大きなプローブのサイズの検出は、このプローブと標的との間に正確な相補性が存在するか否かを示す。オリゴヌクレオチドライゲーションに基づく同様のアッセイは、特許文献1(Yagerら)および非特許文献1に記載される。
プライマー伸長アッセイは、標的配列における単一のオリゴヌクレオチドのバリエーション(一般的に一塩基多型または「SNP」と呼ばれる)を同定するために頻繁に使用される別の技術を代表する。プライマー伸長アッセイは、文献(例えば、非特許文献2)に記載されている。この技術において、詳細に設計されたプライマーは、目的の単一ヌクレオチド位置の3’に隣接する標的配列にハイブリダイズされる。DNAポリメラーゼは、過剰の1種の標識されたヌクレオチド(例えば、標識されたアデノシン三リン酸)の存在下で添加される。一連のカップリングしていない標識されたヌクレオチドではなく標識されたプライマーの検出は、DNAポリメラーゼを用いて付加された標識されたオリゴヌクレオチドの相補的残基に基づいて、標的における目的の位置におけるヌクレオチドの決定を可能にする。
上記の認められた技術の両方が、標的配列におけるバリエーションを区別する能力を提供するが、両方のアプローチが、重大な欠点を有する。例えば、両方の工程が、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイのための酵素(例えば、DNAリガーゼ)、およびプライマー伸長アッセイのためのDNAポリメラーゼの存在を必要とする。これらの酵素は、アッセイ全体の費用を増大し、そしてさらにアッセイを複雑化しがちな洗浄のような更なる工程を必要とする。さらに、これらのアプローチは、時間がかかり、そしてそれ自体では、クラスターまたは別個の多型が同時に検出される多重(マルチプレックス)形式にはならない。
競合ハイブリダイゼーションに基づく第3の技術は、これらの欠点の少なくとも一部を克服するために提案されてきた。競合ハイブリダイゼーションアプローチは、2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用し、一方は、目的の改変体に相補的であり、そして他方は、天然または「野生型」の配列に相補的である。ハイブリダイゼーション結果に基づいて、どちらの配列(すなわち、改変体か野生型)が、標的に含まれるかを決定することが可能である。この技術の具体例は、特許文献2(Eastmanら)に記載されている。標的を増幅するためにポリメラーゼを使用する以外は、さらなる酵素は必要でない。
競合ハイブリダイゼーションアッセイはまた、多重(マルチプレックス)形式に適合されてきた。特許文献3(Fulton)は、オリゴヌクレオチドプローブ競合に基づくDNA配列のフローサイトメトリー決定のための方法を記載している。この記載された方法において、特化されたビーズセットが使用され、ここで独自に標識されたビーズが、目的の多型領域に呼び掛け(interrogate)するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブに直接カップリングされる。最初に、このビーズセットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的な標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。標的における多型領域もまたプローブに相補的である場合、標識されたオリゴヌクレオチドの競合的置換が起こり、それにより多型部位における配列を区別する手段をもたらす。一義的に(uniquely)標識されたビーズにより「捕捉される」複合体は、元のハイブリダイズされた相補的な標識オリゴヌクレオチド(存在する場合)由来の標識の検出およびビーズの種類の決定のためにフローサイトメーターに通される。配列の区別は、元のハイブリダイズされた相補的な標識プローブからの標識が、捕捉された複合体から検出されるか否かに基づく:期待される標識シグナルの減少(例えば、コントロールから決定された場合)は、その配列が、元の標識されたプローブと同一であることを示す。なぜなら、標識されていない標的は、標識されたオリゴヌクレオチドを置換するからである。一方、標識シグナルが変化しないことは、置換が全く起こらないので、異なる配列を示す。
しかし、上記のような競合ハイブリダイゼーションに基づくアッセイもまた欠点を有する。例えば、このビーズセットは、同定されるべき特定のバリエーションの各々に一義的であり、それにより、一義的プローブを各ビーズにカップリングする際に莫大な量の調製物を必要とする。従って、それにもかかわらず、多重(マルチプレックス)化はこのアプローチにおいて可能であり、このような競合ハイブリダイゼーションアッセイは、他の部位における配列決定に容易に適合されない。従って、核酸配列を容易に、かつ他の多型部位を検出するために容易に適合され得る様式で決定するアッセイを提供する必要性が残っている。
米国特許第6,025,139号
米国特許第6,187,538号
米国特許第6,057,107号
Iannoneら(2000),Cytometry,39:131−140
Syvaenenら(1990)Genomics8(4):684−692
従って、本発明の主要な目的は、サンプル中の核酸検体における多型部位における遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法を提供することにより、当該分野における上述の必要性に取り組むことである。この方法は、以下の工程を包含する:(a)このサンプル中に含まれる核酸検体から標識されたアンプリコンを調製する工程;(b)ハイブリダイゼーション条件下で、この標識されたアンプリコンを、複数の第1差次的ハイブリダイゼーションプローブおよび第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブと接触させて、野生型複合体および改変体複合体を形成する工程;(c)ハイブリダイゼーション条件下で、工程(b)で形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体を、複数の第1の捕捉プローブおよび第2の捕捉プローブと接触させて、捕捉された野生型複合体および改変体複合体を形成する工程;(d)工程(c)において形成された任意の捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体を検出し、そして計数する工程;ならびに(e)工程(d)で検出された、捕捉された野生型複合体と捕捉された改変体複合体との相対量を比較することにより、遺伝子バリエーションの存在または非存在を決定する工程であって、ここでより多量の捕捉された野生型複合体は、遺伝子バリエーションの非存在を示し、そしてより多量の捕捉された改変体複合体は、遺伝子バリエーションの存在を示す、工程。
本発明のなお別の目的は、捕捉された野生型複合体および改変体型複合体が、固体基材に生じる検出可能なシグナルにより検出されるような方法を提供することである。
本発明の別の目的は、この固体基材がビーズであるような方法を提供することである。
本発明のなお別の目的は、各検出可能なシグナルが、2つの異なる蛍光色素の比率に基づくような方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、本発明の方法を実行するためのアッセイキットを提供することである。
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、以下の詳細な説明において述べられ、そして部分的に、以下を調べることにより当業者に明らかとなり、そして本発明の実施により確認され得る。
本発明は、サンプル中の核酸分析物における多型部位での遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法であって、方法は、以下の工程:
(a)サンプル中に含まれる核酸分析物から標識アンプリコンを調製する工程;
(b)標識アンプリコンと複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、野生型複合体が、第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、多型部位で野生型配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成され、改変体複合体が第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、多型部位での改変体配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成される、工程;
(c)工程(b)において形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体と、複数の第1捕捉プローブおよび第2捕捉プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、第1の検出可能なシグナルを有する捕捉された野生型複合体は、野生型複合体の各々と単一の第1捕捉プローブとの間で形成され、第2の検出可能なシグナルを有する捕捉された改変体複合体は、改変体配列の各々と単一の第2捕捉プローブとの間で形成される、工程;
(d)工程(c)において形成された、任意の捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体を検出および計数する工程;ならびに
(e)工程(d)において検出された、捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体の相対量を比較することにより遺伝子バリエーションの存在または非存在を決定する工程であって、捕捉された野生型複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの非存在を示し、捕捉された改変体複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの存在を示す、工程、を包含する。
(a)サンプル中に含まれる核酸分析物から標識アンプリコンを調製する工程;
(b)標識アンプリコンと複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、野生型複合体が、第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、多型部位で野生型配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成され、改変体複合体が第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、多型部位での改変体配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成される、工程;
(c)工程(b)において形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体と、複数の第1捕捉プローブおよび第2捕捉プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、第1の検出可能なシグナルを有する捕捉された野生型複合体は、野生型複合体の各々と単一の第1捕捉プローブとの間で形成され、第2の検出可能なシグナルを有する捕捉された改変体複合体は、改変体配列の各々と単一の第2捕捉プローブとの間で形成される、工程;
(d)工程(c)において形成された、任意の捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体を検出および計数する工程;ならびに
(e)工程(d)において検出された、捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体の相対量を比較することにより遺伝子バリエーションの存在または非存在を決定する工程であって、捕捉された野生型複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの非存在を示し、捕捉された改変体複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの存在を示す、工程、を包含する。
好適な実施形態において、上記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々は、第1捕捉配列部分および上記野生型配列に対応する上記多型部位に相補的な領域から構成され、上記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々は、第2捕捉配列部分および上記改変体配列に対応する上記多型部位に相補的な領域から構成される。
好適な実施形態において、上記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび上記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々が、スペーサー部分を有する。
好適な実施形態において、上記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび上記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各スペーサー部分が、上記捕捉配列部分と上記多型部位に相補的な上記領域との間に位置する。
好適な実施形態において、上記第1捕捉プローブの各々が、(i)上記第1捕捉配列部分に相補的な領域から構成され、かつ(ii)上記第1の検出可能なシグナルを提供する単一の固体基材に結合され、そして上記第2捕捉プローブの各々は、(i)上記第2捕捉配列部分に相補的な領域から構成され、かつ(ii)上記第2の検出可能なシグナルを提供する単一の別個の固体基材に結合される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナルが、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬(electron−dense reagent)および放射性同位体からなる群より選択される部分により提供される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナルが、1種類以上の蛍光色素により提供される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナルが、2種類の蛍光色素により提供される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルが、2種類の異なる蛍光色素の一定の比により提供され、上記第2の検出可能なシグナルが、2種類の異なる蛍光色素の異なる比により生成される。
好適な実施形態において、上記工程(c)が、上記捕捉された野生型複合体および改変体複合体を、上記検出可能なシグナルおよび上記標識アンプリコンの標識の両方を検出および計数するように設計されたフローサイトメーターに通す工程により実施される。
好適な実施形態において、上記工程(c)は、上記捕捉された野生型複合体および改変体複合体を、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナル、ならびに上記標識アンプリコンの標識を検出および計数するように設計されたフローサイトメーターを通す工程によって行われ、標識アンプリコンの標識および第1の検出可能なシグナルの検出が、捕捉された野生型複合体を示し、そして標識アンプリコンの標識および第2の検出可能なシグナルの検出が、捕捉された改変体複合体を示す。
好適な実施形態において、上記標識アンプリコンが、標識プライマーを用いたPCR合成により生成されたPCR産物である。
好適な実施形態において、上記標識プライマーが、ビオチン化プライマーである。
好適な実施形態において、上記標識アンプリコンが、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬および放射性同位体からなる群より選択される部分により、直接的または間接的に標識される。
好適な実施形態において、上記サンプルが、患者から得られる。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、一ヌクレオチド多型である。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、多型のクラスタである。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、遺伝子障害と関連する。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、対立遺伝子バリエーションと関連する。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、エキソン配列と関連する。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、イントロン配列と関連する。
好適な実施形態において、上記遺伝子バリエーションが、遺伝子サブタイプと関連する。
好適な実施形態において、上記核酸分析物が、患者に属する遺伝子から得られる。
好適な実施形態において、上記核酸分析物が、ウイルス生物、細菌生物および真菌生物からなる群より選択される感染性因子の遺伝子に属する。
好適な実施形態において、表現型を推定するために使用される。
好適な実施形態において、多重(マルチプレックス)形態において、複数の遺伝子バリエーションが、複数の異なるディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび捕捉プローブの使用を通じて検出される。
好適な実施形態において、多型のクラスタを検出するために使用される。
本発明は、サンプル中の核酸分析物における多型部位での遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するためのアッセイキットであって、以下:
(a)第1捕捉配列部分および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(b)第1捕捉配列部分とは異なる第2捕捉配列部分およびバリエーション配列に対応する多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(c)各々が、(i)第1捕捉領域に相補的な、結合された第1捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第1の検出可能なシグナルを有する、複数の第1固体基材;ならびに
(d)各々が、(i)第2捕捉領域に相補的な、結合された第2捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第2の検出可能なシグナルを有する、複数の第2固体基材、を含む。
(a)第1捕捉配列部分および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(b)第1捕捉配列部分とは異なる第2捕捉配列部分およびバリエーション配列に対応する多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(c)各々が、(i)第1捕捉領域に相補的な、結合された第1捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第1の検出可能なシグナルを有する、複数の第1固体基材;ならびに
(d)各々が、(i)第2捕捉領域に相補的な、結合された第2捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第2の検出可能なシグナルを有する、複数の第2固体基材、を含む。
好適な実施形態において、上記第1固体基材および上記第2固体基材の各々が、ビーズである。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナルが、1種類以上の蛍光色素により提供される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルおよび上記第2の検出可能なシグナルが、2種類の色素により提供される。
好適な実施形態において、上記第1の検出可能なシグナルが、2種類の異なる色素の一定の比により提供され、そして上記第2の検出可能なシグナルが、2種類の異なる色素の異なる比により生成される。
好適な実施形態において、核酸を増幅するためのポリメラーゼをさらに含む。
好適な実施形態において、PCRを実行するためのプライマーをさらに含む。
好適な実施形態において、上記プライマーが標識されている。
好適な実施形態において、上記標識プライマーが、ビオチン化プライマーである。
好適な実施形態において、遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するためのアッセイを実行するための説明書をさらに含む。
本発明によれば、サンプル中の核酸検体における多型部位における遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出することができる。
第1の実施形態において、本発明は、サンプル中の核酸検体における多型部位における遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法を提供する。この方法は、サンプル中に含有される核酸検体から、標識されたアンプリコンを調製する工程を包含する。一般的に(必ずしも必要ではないが)、核酸増幅工程は、代表的にビオチン化プライマーのような標識されたプライマーの補助を用いる従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を使用して行われる。
次に、標識されたアンプリコンは、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の、第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブおよび第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブと接触される。複数の第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブにおける各プローブは、第1の捕捉配列部分、および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域を含む。複数の第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブにおける各プローブは、第1の捕捉部分と異なる第2の捕捉部分を含む。さらに、各第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブはまた、バリエーション配列に対応する多型部位に相補的な領域を含む。従って、この差次的ハイブリダイゼーションプローブが、ハイブリダイズ条件下で標識されたアンプリコンに接触される場合、野生型複合体は、第1のハイブリダイゼーションプローブと、野生型配列に対応する多型部位を有する標識されたアンプリコンとの間に形成される。同様に、改変体複合体は、第2のハイブリダイゼーションプローブと、改変体配列に対応する多型部位を有する標識されたアンプリコンとの間に形成される。
一旦形成されると、この野生型複合体および/または改変体複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で複数の、第1の捕捉プローブおよび第2の補足プローブと接触される。この第1の捕捉プローブは、それぞれ、第1の捕捉配列部分に相補的な領域を含む。さらに、各第1の捕捉プローブは、第1の検出可能なシグナルを有する単一の固体基材に結合される。次に、第2の捕捉プローブは、それぞれ、第2の捕捉配列部分に相補的な領域を含む。同様に、各第2の捕捉プローブは、第2の検出可能なシグナルを有する単一の固体基材に結合される。従って、捕捉された野生型複合体は、任意の野生型複合体と第1の捕捉プローブの間に形成され、そして捕捉された改変体複合体は、改変体複合体と第2の捕捉プローブとの間に形成される。この方法において使用される全ての固体基材は、好ましくは、ビーズであるが、他の形状が使用され得る。
次いで、この捕捉された複合体(野生型および/または改変体)は、検出され、そして計数される。捕捉された野生型複合体と捕捉された改変体複合体との相対量を比較することにより、その核酸サンプルが、探索される遺伝子バリエーションについて陽性か陰性かを決定し得る。詳細には、より多量の捕捉された野生型複合体は、遺伝子バリエーションの非存在を示し、一方より多量の捕捉された改変体複合体は、バリエーションの存在を示す。ヘテロ接合条件は、等量または実質的に等量の両方の型の複合体が検出される場合に、サンプルにおいて存在し得る。
第二の実施形態において、アッセイキットが提供され、このキットは、以下を備える:(a)複数の第一のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブであって、その各々は、第一の捕捉部分および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域からなる、複数の第一のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;(b)複数の第二のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブであって、その各々は、第一の捕捉部分とは異なる第二の捕捉部分およびバリエーション配列に対応する多型部位に相補的な領域からなる、複数の第二のディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;(c)複数の第一の固体基材であって、その各々は、(i)第一の捕捉部分に相補的な、結合した第一の捕捉プローブからなり、そして(ii)第一の検出可能なシグナルを有する、複数の第一の固体基材;および(d)複数の第二の固体基材であって、その各々は、(i)第二の捕捉部分に相補的な、結合した第二の捕捉プローブからなり、そして(ii)第二の検出可能なシグナルを有する、複数の第二の固体基材で。このアッセイキットは、必要に応じて、さらなる成分(例えば、核酸を増幅するためのポリメラーゼ;PCRを実行するための(好ましくは標識された)プライマー;およびアッセイを実行するための指示書を備える。
本発明は、先行技術を上回る多くの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、全ての型の遺伝的バリエーション(単一ヌクレオチド多型ならびに個々の多型または多型のクラスターを含む)を検出する能力を提供する。さらに、本発明の方法は、核酸標的の増幅が一旦起きると、酵素の使用を必要としない。さらに、本発明の方法は、「ワン−ポット(one−pot)」アプローチで、異なるプローブを用いて同時に実行され、それによって簡便な多重(マルチプレックス)化を可能にし得る。さらに、ここで使用される方法および成分は、大規模の商業的適用に十分適切である。例えば、ビーズに結合した既知の捕捉プローブ配列を含む独自に蛍光性のビーズは、多数の遺伝的アッセイの検出のために適合され得る。なぜなら、ビーズに独自のプローブを結合することなくディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブだけが調節される必要があるからである。
(発明の詳細な説明)
本発明を詳細に記載する前に、他に示されない限り、本発明が、DNAの特定の供給源、特定の配列、または特定のアッセイ様式(これらは、変化し得るので)に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。
本発明を詳細に記載する前に、他に示されない限り、本発明が、DNAの特定の供給源、特定の配列、または特定のアッセイ様式(これらは、変化し得るので)に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの」(「a」、「an」および「the」)は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の言及を含むことに留意すべきである。
本発明を記載および特許請求する際に、以下の用語は、以下に示される定義に従って使用される。
本明細書中で使用する場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のプリン塩基およびピリミジン塩基(すなわち、アデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)、グアニン(G)およびウラシル(U))だけでなく、改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドもまた含む、ヌクレオシドおよびヌクレオチドをいうことが理解される。このような改変としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:プリン部分もしくはピリミジン部分のメチル化もしくはアシル化、ピリミジン環またはプリン環系中の1つもしくは両方の環の、異なる複素環式環構造による置換、および1以上の官能基の保護(例えば、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどの保護基を使用する)。改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドはまた、糖部分での改変を含む。例えば、ここで、1以上のヒドロキシル基は、ハライドおよび/またはヒドロカルビル置換基(後者の場合、代表的には、脂肪族基)で置換されるか、またはエーテル、アミンなどのように官能基化される。一般的なアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1−メチルアデニン、2−メチルアデニン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチル−アデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンチルアデニン、N,N−ジメチルアデニン、8−ブロモアデニン、2−チオシトシン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、5−エチルシトシン、4−アセチルシトシン、1−メチルグアニン、2−メチルグアニン、7−メチルグアニン、2,2−ジメチルグアニン、8−ブロモ−グアニン、8−クロログアニン、8−アミノグアニン、8−メチルグアニン、8−チオグアニン、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、5−エチルウラシル、5−プロピルウラシル、5−メトキシウラシル、5−ヒドロキシメチルウラシル、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−(メチル−アミノメチル)ウラシル、5−(カルボキシメチルアミノメチル)−ウラシル、2−チオウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−(2−ブロモビニル)ウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、1−メチルプソイドウラシル、キューオシン、イノシン、1−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、2−アミノプリン、6−ヒドロキシアミノプリン、6−チオプリンおよび2,6−ジアミノプリン。イソ−グアニンおよびイソ−シトシンは、ハイブリダイゼーションが所望でない場合に、配列間の潜在的な交差反応性を低減するために、オリゴヌクレオチドに取り込まれ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含む)、任意の他の型のポリヌクレオチド(プリン塩基またはピリミジン塩基のN−グリコシドである)および他のポリマー(非ヌクレオチド骨格(例えば、タンパク質核酸およびNeugeneTMポリマーとしてthe Anti−Gene Development Group、Corvallis、Oregonから市販される合成の配列特異的核酸ポリマー)または非標準的な結合を含む)を包含するが、但し、このポリマーは、DNAおよびRNAにおいて見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含む。従って、本明細書の「オリゴヌクレオチド」は、二本鎖DNAおよび一本鎖DNA、ならびに二本鎖RNAおよび一本鎖RNA、そしてDNA:RNAハイブリッドを含み、そしてまた公知の型の改変オリゴヌクレオチド(例えば、天然に存在するヌクレオチドの1以上が、アナログにより置換されているオリゴヌクレオチド;ヌクレオチド間改変(例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど)、負に荷電した結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)および正に荷電した結合(例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル))を含むオリゴヌクレオチド、ペンダント部分(例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなどを含む))を含むオリゴヌクレオチド、介在因子(intercalator)(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有するオリゴヌクレオチド、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など)を含むオリゴヌクレオチド、およびアルキル化剤(alkylator)を含むヌクレオチドを含む。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間には、意図された長さの区別はなく、これらの用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。本明細書中で使用する場合、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドについての記号は、the IUPAC−IUB Commission of Biochemical Nomenclature recommendations(Biochemistry 9:4022、1970)に従う。
「PCR」は、本明細書中において、米国特許第4,683,195号(Mullisら)および同第4,683,202号(本明細書中で参考として援用される)においてMullisにより開示されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を意味する。PCR技術において、所望の配列の反対側の末端と一致する短いオリゴヌクレオチドプライマーが調製される。プライマー間の配列は、既知である必要はない。DNA(またはRNA)のサンプルが抽出され、そして(好ましくは熱によって)変性される。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーは、dNTPおよびポリメラーゼ(好ましくは、熱に対して安定なTaqポリメラーゼ)と共に、モル濃度過剰で添加される。DNAは複製され、次いで再び変性される。これにより、2本の「長い産物」(これは、それぞれのプライマーで始まる)および2本の元の鎖(二重鎖DNA分子1個当たり)が生じる。次いで、この反応混合物は、重合条件に戻され(例えば、温度を低下させるか、変性剤を不活化させるか、またはさらにポリメラーゼを添加することによって)、そして第二のサイクルが開始される。第二のサイクルは、2本の元の鎖、サイクル1由来の2本の長い産物、2本の新たな長い産物(元の鎖から複製された)および長い産物から複製された2本の「短い産物」を提供する。この短い残物は、各末端のプライマーと共に、標的配列(センスまたはアンチセンス)の配列を有する。各さらなるサイクル毎に、さらに2本の長い産物が産生され、そして短い産物の数は、前のサイクルの終了時に残っている長い産物および短い産物の数と等しい。従って、短い産物の数は、各サイクル毎に指数関数的に増加する。特定の分析物配列のこの増幅により、非常に少量のDNAの検出が可能となる。
用語「3SR」は、本明細書中で使用する場合、欧州特許公開番号373,960(1990年6月20日公開)に記載されるような、「自己維持配列複製(self−sustained sequence replication)」系としても公知の、標的核酸の増幅法をいう。
用語「LCR」は、本明細書で使用する場合、Barany(1991)、Proc.Nat.Acad.Sci.88:189−193によって記載されるような「リガーゼ連鎖反応」としても公知の、標的核酸の増幅法をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも1つの配列と標的配列との相補性に起因して、分析を受けるサンプル中の分子(「標的分子」)に含まれる標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドからなる構造をいう。任意の特定のプローブのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/または合成ヌクレオチドアナログであり得る。用語「プライマー」は、精製制限消化において天然に生成されるか、または合成的に生成されるかにかかわらず、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下(すなわち、適切な緩衝液中の適切なヌクレオチドおよび重合のための薬剤(例えば、DNAポリメラーゼ)の存在下ならびに適切な温度)に配置される場合に、合成の開始点として作用し得る、オリゴヌクレオチドを含む分子をいう。本明細書中で使用するための好ましいプライマーは、以下に記載される、二目的プライマーである(第1国米国出願第60/412,263号に基づき優先権主張して、平成15年9月19日に出願された日本国特許出願(出願代理人の事務所整理番号F103C26B0T−発明の名称「二次構造形成の破壊による向上したハイブリダイゼーションアッセイを提供するための二目的プライマーおよびプローブ」)。
結合配列は、安定なハイブリッドを提供するために、完全に相補的である必要はないことは明らかである。多くの場合、安定なハイブリッドは、4ヌクレオチド以上のループは無視して、約10%より少ない塩基がミスマッチである場合に形成される。しかし、このアッセイの高感受性は、通常、標的ヌクレオチド配列の第一および第二の改変体にハイブリダイズするプローブおよびコントロールヌクレオチド配列が、その標的に対して100%の相同性を有することを必要とする。従って、本明細書中で使用する場合、用語「相補的」は、一般に約100%の相同性が存在する場合に、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいうことを意図するが、一方、用語「実質的に相補的」は、一般に約90%以上の相同性が存在する場合に、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいうことを意図する。
用語「ハイブリダイズ条件」は、相補的配列の少なくとも一部を互いにアニーリングさせるのに十分な、時間、温度およびpH、ならびに反応物および試薬の必要量および濃度の条件を意味することを意図する。当該分野で周知のように、時間、温度およびpHの条件は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブのサイズ、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション反応混合物中の他の物質の存在に依存して、ハイブリダイゼーションを達成するために必要とされる。各ハイブリダイゼーション工程に必要な実際の条件は、当該分野において周知であるか、または過度な実験を伴わずに決定され得る。
代表的なハイブリダイゼーション条件は、約7〜約8.5のpHに緩衝化された溶液、および約1秒〜約1日、好ましくは約15分〜約16時間、最も好ましくは約15分〜約3時間の間の、約30℃〜約60℃、好ましくは約37℃〜約55℃の温度の使用を含む。
「ハイブリダイゼーション条件」はまた、有効な緩衝液を含む。プローブおよび他の成分に関して適合性の、すなわち、化学的に不活性であるが、なお相補塩基対間のハイブリダイゼーションを可能にする任意の緩衝液が、使用され得る。1つの特に好ましい緩衝液は、3×SSC、50% ホルムアミド、10% 硫酸デキストラン(MW500,000)、0.2% カゼイン、10μg/mL ポリA、および100μg/mL 変性サケ精子DNAおよび0.015Mクエン酸ナトリウムを含み、ここで、1×SSCは、0.15M 塩化ナトリウムである。別の特に好ましい緩衝液は、5×SSC、0.1〜0.3% ドデシル硫酸ナトリウム、10% 硫酸デキストラン、1mM ZnCl2、および10mM MgCl2を含み、ここで、1×SSCは、上で定義された通りである。他の適切な緩衝液が、当業者に公知である。
本明細書中で使用される場合、「患者」とは、核酸分析物が得られる生物、好ましくは、哺乳動物をいう。好ましい患者は、哺乳生物(例えば、ヒト)である。
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」とは、特徴付けされるべき核酸分析物を含む生物(例えば、ヒトのような哺乳生物)から得られる流体または組織をいう。このようなサンプルは、当該分野で公知であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない:血液;血漿;血清;髄液;リンパ液;細胞溶解物;精液;皮膚または気道、腸管もしくは尿生殖器管の分泌物;涙;唾液;乳汁;および白血球。
用語「結合された」とは、共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用(例えば、疎水性相互作用、水素結合など)による連結をいう。供給結合としては、例えば、エステル結合、エーテル結合、ホスホエステル結合、アミド結合、イミド結合、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などが挙げられる。オリゴヌクレオチドを基材に結合するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、オリゴヌクレオチドを基材上にブロットする工程を包含する。
用語「基材」とは、所望のオリゴヌクレオチドが係留され得る任意の固体表面または半固体表面をいう。適切な基材としては、オリゴヌクレオチドを固定しそして取り囲み得る任意の材料、例えば、ガラス、ニトロセルロース、ポリ塩化ビニルを含むプラスチック(例えば、シートまたはマイクロタイターウェルにおいて)、ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートにおいて)、ポリフッ化ビニリデン(例えば、マイクロタイタープレートにおいて)、ポリスチレン(例えば、ビーズにおいて)、金属、ポリマーゲルなどが挙げられる。
「任意の」または「必要に応じて」とは、引き続いて記載される事象または状況が、生じても生じなくても良いことを意味し、そしてこの記載は、この事象または状況が起こる場合およびこの事象または状況が起こらない場合を含む。例えば、アッセイキット中の「任意の成分」との言及は、このような成分が、このアッセイキット中に存在してもしなくても良いことを意味し、そしてこの記載は、この成分が存在するアッセイキットおよびこの成分が存在しないアッセイキットを含む。
任意の類似のまたは等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。
本発明の方法は、サンプルから得られた核酸分析物中の遺伝的バリエーション(例えば、変異)の存在または非存在を検出するための手段を含む。遺伝的バリエーションは、変更された配列(例えば、欠失ヌクレオチド、変化したヌクレオチド、または付加したヌクレオチド)を生じるので、その配列自体は、「多型」であると考えられ、そして変更が生じる部位は、「多型部位」と称される。従って、目的の核酸分析物は、多型部位を含むかまたは多型部位を含むことが疑われる遺伝的物質の一部である。
この方法は、サンプル中に含まれる核酸分析物から標識アンプリコンを調製することを含む。標識アンプリコンを調製する実際の工程は、当業者に周知である。例えば、サンプル中に含まれる目的の核酸分析物は、しばしば、細胞またはウイルス内に存在する。この核酸分析物は、DNA、RNA、またはいくつかの他の核酸含有ポリマーであり得、これらは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであり得る。
目的の核酸分析物を含む細胞は、従来の技術(例えば、針生検またはスワッビング)を使用して、生物学的組織サンプルまたは生物学的流体サンプルから得られ得る。このように得られた細胞は、宿主の遺伝的物質を含み得るか、またはこれらは非宿主遺伝的物質を含み得る。従って、例えば、ヒト個体から得られるサンプルは、ヒト遺伝的物質および/または感染病原体(例えば、細菌、ウイルスまたは真菌)の遺伝的物質を含み得る。
一旦得られると、次いで、この核酸分析物は、従来の技術を使用して、増幅、すなわち、コピーされる。任意の公知の増幅方法が使用され得るが、好ましい方法としては、PCR、3SRおよびLCRが挙げられ、PCRが最も好ましい。
上記のように、PCR増幅を、核酸分析物、ポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)、オリゴヌクレオチドプライマー、4種の過剰なオリゴヌクレオチド(dNTP)モノマー、およびPCRを実施するために適切な緩衝液(Tris−HCl、KClおよびMgCl2を含む従来の緩衝液を含む)を含む水を含有する混合物中で実施する。次いで、この混合物を、温度に基づく一連の複製サイクルに曝露する。例えば、この混合物を、約94〜96℃まで、数分間加熱し、この時間の間に、任意の二本鎖DNAが一本鎖DNAに変性される。次いで、この混合物の温度を、約50〜65℃に下げ、この間にオリゴヌクレオチドプライマーが水素結合を介して相補配列にハイブリダイズする。最後に、この混合物の温度を約72℃まで上げ、この間に、このポリメラーゼが相補鎖に結合して各プライマーから相補鎖を伸長する。複製される配列は、各サンプルの後に二倍になるので、10億の理論的増幅を試み得、それにより、本発明の方法のために十分な核酸分析物を提供する。
核酸分析物を増幅するために適切な任意のプライマーを、PCRプロセスにおいて使用し得る。プライマーは、増幅される核酸の一部に相補的な比較的短いオリゴヌクレオチド(例えば、10〜30塩基長)である。このプライマーは、変性核酸にアニールされ、そして新たなDNA分子の伸長のための開始部位を提供する。いくつかのプライマーは、特定の核酸配列に特異的であり得、一方、他のプライマーは、普遍的な性質であり、その結果、これらは単一の生物のゲノムまたはいくつかの生物のゲノム全体にわたって見出される位置で、アニールする。適切なPCRプライマーは、当業者に公知の手段によって(例えば、適切な配列のクローニングおよびこの配列の制限を実施することによって、または直接化学合成によって)調製される。例えば、S.A.Narangら(1979)Meth.Enzymol.68:90および米国特許第4,356,270号(Itakura)により記載されるホスホトリエステル法を用い得る。プライマーはまた、Sigma−Aldrich,Co.(St.Louis,Missouri)および他の市販の供給業者から入手可能である。所望しない二次構造を回避するために、核酸分析物の他の部分にハイブリダイズするように設計されたプライマーのような、他のプライマーもまた使用され得る。
本発明の方法における使用について、増幅された核酸分析物(本明細書中で、「アンプリコン」と称される)は、標識されなければならない。第1の技術において、標識プライマーは、増幅工程の間に使用され、それにより、標識プライマーがアンプリコンに組み込まれた場合に、標識アンプリコンを生じる。標識プライマーは、市販の供給業者(例えば、CPG,Inc.(Lincoln Park,New Jersey)から入手可能であるか、またはこれらは、標識を非標識プライマーに結合体化することによって調製され得る。オリゴヌクレオチド(例えば、プライマー)の標識は、従来の連結手順を使用して実施され得る。しかし、特定の連結手順は、標識上および/またはオリゴヌクレオチド上に存在する活性基に依存して変わる。
例えば、当業者に公知のニックトランスレーション手順は、DNase Iおよび他の酵素の使用を介して非標識ヌクレオチドを標識ヌクレオチドで置換し、それにより標識アンプリコンを提供するために利用可能である。標識のための別の方法としては、DNAフラグメントの3’末端への標識デオキシヌクレオチドの付加を触媒し得るDNAポリメラーゼである、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT、PanVera Corp.,Madison,Wisconsinのような市販の供給業者から入手可能)での標識デオキシヌクレオチドの付加が挙げられる。
標識アンプリコンを調製するための第2の技術は、非標識アンプリコンが標識に後に連結される別個の標識工程を含む。プライマーの標識に関して上で記載された技術もまた、標識を非標識アンプリコンに結合するために使用され得る。
任意のタイプの標識が、アンプリコンに結合され得る。好ましい標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出可能な部分を含む。このような標識としては、蛍光体、化学発光体、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、根祖インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体(例えば、32P)が挙げられるが、これらに限定されない。標識部分は、アンプリコンに直接的または間接的に結合され得る。好ましくは、標識は、プライマーに直接結合される場合、変性条件に耐えるように選択されるべきである。必要ではないが、この標識が、蛍光体に結合されたストレプトアビジン(例えば、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体)との結合を介して検出され得るビオチンであることが、好ましい。
一旦調製されると、標識アンプリコンは、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、複数の第1および第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブと接触される。この第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブは、2つの結合領域:第1の捕獲配列部分、および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域、を含む。必要に応じて、この第1のハイブリダイゼーションプローブは、スペーサー部分をさらに含む。従って、核酸分析物の多型部位が「天然」形態または野生型形態である場合、野生型複合体が、第1のハイブリダイゼーションプローブと核酸分析物との間に形成される。
同様に、2つの結合領域および任意のスペーサー部分を含む第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブもまた、ハイブリダイゼーション条件下で、標識アンプリコンと接触される。しかし、これら2つの結合領域は、第2のハイブリダイゼーションプローブの各々が、第2の捕獲配列部分および改変体配列に対応する多型部位に相補的な領域を含むという点で、第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブとは異なる。従って、多型部位に改変体配列を有する核酸分析物から作製される任意の標識アンプリコンは、第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブの対応する相補的領域にハイブリダイズし、それにより改変複合体を形成する。
これらのハイブリダイゼーションプローブ中の任意のスペーサー部分は、プローブの任意の部分に位置し得る。しかし、スペーサー部分が、捕獲配列部分と、多型部位に相補的な領域との間に位置することが好ましい。このスペーサーは、ハイブリダイズすることも、本発明の方法を実施するために必要なハイブリダイゼーション事象を妨害することもないように特別に設計された、すなわち、他のプローブへの結合を妨害しないように設計された、一連のヌクレオチドを含み得る。さらに、非ヌクレオチドスペーサーが、使用され得る。任意のスペーサーを調製するために適切な方法は、文献から公知である。ポリエチレングリコールスペーサーの調製は、例えば、Kernら(1979)Makromol.Chem.150:2539に記載される。他のスペーサーが、類似の様式で調製され得る。
第1および第2のハイブリダイゼーションプローブの各々の添加量、およびハイブリダイゼーションに必要な時間は、実験的に決定され得るが、あるモル濃度過剰の各プローブ型が使用されることが好ましい。しかし、一般に、第1および第2のハイブリダイゼーションプローブの各々は、約1分〜約1日のハイブリダイゼーションインキュベーション期間で、約0.01pmol〜約100pmolの量で添加される。しかし、第1および第2のハイブリダイゼーションプローブの各々が、各型のプローブについて、約0.1pmol〜約10pmolの量で添加され、約5分〜約30分にわたる時間のインキュベートを可能にすることが好ましい。
一旦、十分なインキュベーション期間が過ぎると、改変複合体および/または野生型複合体は、核酸分析物の多型形態に依存して、形成される(上で考察するように)。次いで、これらの複合体は、存在する場合、1つの固体基材または複数の固体基材に連結された捕獲プローブを使用して、「捕獲」される。各野生型複合体は、第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブの第1の捕獲配列部分に相補的な領域を含む第1の捕獲プローブによって、捕獲される。第1の捕獲プローブは、固体基材に連結される。複数の第1の捕獲プローブは、野生型複合体の実質的に全てを捕獲するために使用される。改変複合体は、類似の様式で捕獲され、複数の第2の捕獲プローブ(この各々は、第2の捕獲配列部分に相補的な領域を含み、そしてこの各々は、複数の第2の固体基材の各々に結合している)が、改変体配列を捕獲するために使用されることが認識される。複合体を捕獲するために使用される好ましいモル濃度量および時間は、複合体の形成について上記で開示された量および時間と同じである。この工程によりこのように捕獲された複合体は、「捕獲された野生型複合体」および「捕獲された改変複合体」と称される。
捕獲された野生型複合体および捕獲された改変複合体の検出および計数を、任意の従来の方法を使用して実施し得る。この捕獲された複合体が、標識(標識アンプリコン由来)および検出可能なシグナルを有する固体基材(捕獲されたプローブ由来)を含む場合、検出は、一般に、この標識およびシグナルの両方を検出することによって、進行する。
標識化は、任意の当該分野で公知の手段によって達成され得、そして標識の性質に依存する。蛍光体(fluorecer)について、多数の蛍光測定器が利用可能である。化学発光体について、照度計またはフィルムが利用可能である。酵素を用いる場合、蛍光生成物、化学発光生成物または着色生成物が提供され得、そして蛍光定量的、発光定量的、分光光度的、または可視的(好ましくは、顕微鏡を用いて)に検出される。例えば、ビオチン化標識は、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を添加し、続いて、フィコエリトリン誘導性の蛍光を検出することによって、検出される。
固体基材により提供される各シグナルは、任意の従来の手段によって検出される。例えば、このシグナルは、基材の形状に基づき得、ここで、第1の検出可能なシグナルおよび第2の検出可能なシグナルは、対応する固体基材の異なる形状によって区別される。しかし、固体基材(例えば、複数の第1の固体基材)の各セットが、その複数に固有のシグナルを生成することが、好ましい。従って、例えば、第1の固体基材の各々は、第1の検出可能なシグナルを有し、そして第2の固体基材の各々は、第2の検出可能なシグナルを有する。また、この第1および第2の検出可能なシグナルは、蛍光体、化学発光体、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補体、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬(electron−dense reagent)、および放射性同位体からなる群から選択される部分によって、提供され得る。
しかし、固体基材がビーズであり、ここで、検出可能なシグナルが、1つ以上の蛍光色素によって提供されることが、最も好ましい。適切な着色基材の例(例えば、ビーズ)は、米国特許第6,268,222号(Chandlerら)に記載される。本明細書中で記載されるように、この固体基材は、蛍光色素または有色色素の組み合わせを含む。好ましい色素としては、シアニン色素(これは550nm〜900nmの間の発光波長を有することにより特徴付けられる)が挙げられる。いくつかのシアニン色素は、青色〜青緑色の蛍光を有し、一方、他のシアニン色素は、緑色〜黄緑色の蛍光を有する。さらに他のシアニン色素は、赤色またはさらには赤外の蛍光を有する。シアニン色素、または任意の他の従来の色素は、基材に共有結合されるか、または吸着される(例えば、この基材上で「染色」される)。さらに、この基材は、これに結合した蛍光染色されたナノ粒子の1つ以上の集団を有し得、ここで、所定の集団中の全てのナノ粒子は、同じ色素濃度を有する。基材に結合したナノ粒子の異なる集団に特異的な異なる色素の量および割合を変えることによって、固有の発光スペクトルを有する基材の多数の目立たない集団を確立し、そして区別することが可能である。このように固有に標識された基材は、配列の多重(マルチプレックス)分析に特に有用であり、そしてフローサイトメトリーを使用して簡便に検出および分析され得る。このようなビーズはまたは、市販の供給業者(例えば、Luminex Corporation(Austin,Texas))から入手可能である。
必要に応じて、1つ以上の検出手段と連結されたフローサイトメーターが、この複合体を検出するために使用され得るが、捕獲された複合体を検出および計数するための他の手段もまた、標識およびシグナルのタイプに依存して、使用され得る。ハイブリダイゼーション溶液中の複合体は、フローサイトメーターを通過し、それにより、各々の複合体の検出が可能となる。好ましくは、このフローサイトメーターは、(標識アンプリコンの)標識を検出するための第1の検出手段、および固体基材に関連するシグナルを検出するための第2の検出手段に連結される。フローサイトメトリーを使用して標識およびシグナルを検出するために適切であり、かつ多重(マルチプレックス)分析を実施する能力を有する装置および方法は、Chandlerらの米国特許第5,981,180号、ならびにChandlerの米国特許第6,046,807号および同第6,139,800号に記載される。市販のシステムはまた、Luminex Corp.(Austin,Texas)から入手可能であり、例えば、LuminexTM100マシンが挙げられる。
1mm未満の直径を有する基材が、フローサイトメーターにおいて使用され得るが、他のサイズの粒子もまた使用され得る。しかし、球形の形状の基材(例えば、ビーズ)が使用されることが好ましい。このようなビーズは、約0.1〜1,000μm、好ましくは1〜100μm、より好ましくは2〜50μm、さらにより好ましくは3〜25μmの範囲のサイズを有し、約6〜12μmの直径を有するビーズが、最も好ましい。このサイズのビーズは、フローサイトメーターにおける使用に適しており、それにより、複合体を検出および計数するための容易な手段を提供する。
ポリスチレンのようなポリマー材料から作製された固体基材が好ましいが、必ずしもその必要はない。他の有用なポリマー材料としては、ブロモ化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリホソファーゼ(polyphosophaze)、ポリスルホン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらのポリマーはまた、超常磁性、常磁性、フェリ磁性、反強磁性および強磁性の金属酸化物からなる群から選択される磁性または磁気的に反応性の金属酸化物を組込み得る。
一旦、捕獲された野生型複合体および捕獲された改変複合体の全てが検出され、計数されると、遺伝的バリエーションの存在および非存在が、決定され得る。詳細には、より多数の捕獲された野生型複合体は、遺伝的バリエーションの非存在を示し、一方、より多数の捕獲された改変複合体は、バリエーションの存在を示す。このような相対的な比較は、既知の多型部位における配列を決定するのに十分である。しかし、さらに多くの情報を得るために、さらなる技術が使用され得る。
例えば、サンプルが野生型配列および改変体配列の両方の混合物を含むか否かを決定するための割合が、開発され得る。この結果は、log(正味のシグナル)の割合として表され得、ここで、カットオフは、どの配列または配列の組み合わせがサンプル中に含まれるかを同定するために使用され得る。このような割合の例を、以下の表1に示す:
本発明はまた、本明細書中に記載される方法を実施するためのアッセイキットを提供する。このアッセイキットは、包装された組み合わせ中に、以下を含む:(a)複数の第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブであって、各々が、第1の捕獲配列部分、および野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域を含む、第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブ;(b)複数の第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブであって、各々が、この第1の捕獲配列部分とは異なる第2の捕獲配列部分、および変異配列に対応する多型部位に相補的な領域を含む、第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブ;(c)複数の第1の固体基材であって、各々が、(i)この第1の捕獲領域に相補的な結合した第1の捕獲プローブを含み、そして(ii)第1の検出可能なシグナルを有する、第1の固体基材;および(d)複数の第2の固体基材であって、各々が、(i)この第2の捕獲領域に相補的な結合した第2の捕獲プローブを含み、そして(ii)第2の検出可能なシグナルを有する、第2の固体基材。
このキットはまた、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、またはアンプリコンを作製するための類似のポリメラーゼ)を含み得る。PCRを実施するためのプライマー(好ましくは、標識される)もまた、このアッセイキットに含まれ得る。標識される場合、このプライマーは、好ましくはビオチン化プライマーである。ハイブリダイゼーション緩衝液、酵素基質、ネガティブコントロール、ポジティブコントロールおよび本明細書中に記載される方法を実施するための使用説明書もまた、このアッセイキットに都合良く含まれ得る。
このキットに含まれ、本明細書中に記載の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当業者に公知である。従って、従来の技術が、必要なプライマー、第1のハイブリダイゼーションプローブ、第2のハイブリダイゼーションプローブ、第1の捕獲プローブ、第2の捕獲プローブなどを調製するために使用される。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成によって、またはクローニングによって調製され得、前者が好ましい。例えば、直接合成法は、代表的には、3’ブロックヌクレオチドモノマーおよび5’ブロックヌクレオチドモノマーを、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端ヒドロキシル基に連続的に付加することを包含し、ここで、付加の各々は、付加したモノマーの3’位の成長中の鎖の5’末端ヒドロキシル基の求核攻撃によって起こり、この付加したモノマーは、代表的には、リン誘導体(例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイトなど)である。
オリゴヌクレオチドの実際の配列は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して決定される。差次的ハイブリダイゼーションプローブの各々について、各多型部位についての配列、すなわち、野生型配列および改変体配列を決定することが、初めに必要である。野生型配列および改変体配列は、初めに、目的の多型部位を含む核酸分析物のサンプルを得、次いで、この核酸分析物を、市販のシーケンサー(例えば、Global IR2 System(LI−COR,Inc.,Lincoln,Nebraska))を使用して配列決定することによって、手動で決定され得る。さらに、多くの核酸分析物の配列は、関連の文献ならびに野生型配列および改変体配列を提供するデータベース(例えば、GenBankデータベース(Bethesda,Maryland))を参照することによって、決定され得る。一旦、配列が決定されると、対応する相補配列が、適切な差次的ハイブリダイゼーションプローブに含まれる。すなわち、野生型配列に対応する多型部位に相補的な領域が、第1の差次的ハイブリダイゼーションプローブに含まれ、そして改変体配列に相補的な領域が、第2の差次的ハイブリダイゼーションプローブに含まれる。
捕獲のために使用される配列(すなわち、捕獲部分およびそれに相補的な捕獲プローブ上の領域の配列)は、固体基材に直接結合され得るか、またはスペーサーによってこの固体基材から間隔をあけられ得る。差次的ハイブリダイゼーションプローブに関して上で考察された同じタイプのスペーサーは、固体基材と捕獲配列との間で使用され得る。捕獲領域について、天然のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチド(例えば、イソ−Cおよびイソ−G)で置換され得、そしてこの捕獲領域にハイブリダイズするように設計される配列は、特異性を増大し、かつ捕獲ハイブリダイゼーション工程のバックグラウンドを減少する対応する相補的な非天然ヌクレオチドを有し得る。非特異的ハイブリダイゼーションを減少するために非天然ヌクレオチドを使用するための方法は、米国特許第6,232,462(Collinsら)に記載される。
結合に関与することが意図されるオリゴヌクレオチドの領域(従って、プローブまたは分析物のいずれかのオリゴヌクレオチドの別の配列に相補的である)は、各々、少なくとも15ヌクレオチド、通常は、少なくとも20ヌクレオチドであり、かつ約100ヌクレオチド以下である。代表的には、結合配列は、約25ヌクレオチド長である。
本明細書中に記載される方法は、多くの用途を有する。例えば、この方法は、核酸改変体(例えば、SNP)、および他の有用な遺伝データまたはエピゲノム(epigenomic)データ(例えば、遺伝子サブタイプ)を検出する能力を提供する。さらに、この方法は、適切なプローブおよび基質が使用される場合、多重(マルチプレックス)形式へと容易に適応され得る。すなわち、記載された方法に基づく多重(マルチプレックス)化されたアプローチは、第1および第2のハイブリダイゼーションプローブ、第1および第2の捕捉プローブ、ならびに目的の各多型部位についての第1および第2の検出可能なシグナルを提供する基質の異なるセットを含む。さらに、本発明は、適切なプローブおよび基質が使用される場合、多型クラスターを同時に検出し得る。さらに、一旦特定の核酸標的の遺伝子型が既知になると、当業者に公知の遺伝的原理に基づいて、対応する表現型を予測することが、しばしば可能であり得る。さらに、この方法は、野生型に対する改変体型の相対量を比例的に定量する能力を提供する。適切なコントロールの追加は、さらなる量的情報を提供し得る。核酸標的内のDNAメチル化の分布および程度もまた、本発明の方法を使用して決定され得る。もちろん、他の適用および用途が、当業者に明らかとなる。
本発明の方法は、任意の型の遺伝的バリエーションの存在を検出し得、そして本発明は、この点で限定されない。本方法を使用する検出に特に適切な遺伝的バリエーションの型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:単一ヌクレオチド多型、多型クラスター、遺伝的障害、対立遺伝子バリエーション、エキソン配列、イントロン配列、および遺伝子サブタイプ。例えば、シトクロムP450 CPY2D6サブタイプは、異なる4つのSNP(そのシトクロムP450 CPY2D6サブタイプ内の異なる4つのエキソンの各々に1つのSNP)を有することが知られている。シトクロムP450 CPY2D6サブタイプのこれらのバリエーションは、差示的な薬物代謝速度が原因である。本発明の方法は、シトクロムP450 CPY2D6サブタイプのどの改変体が個体において生じるかを検出し得、これによりその個体が薬物をどのように十分代謝するかを決定するのを補助し得る。
核酸分析物は、ほぼ任意の供給源より得られ得る。例えば、核酸分析物は、患者に属する遺伝子より得られ得るか、またはウイルス生物、細菌生物または真菌生物より得られ得る。他の供給源は、当業者に明らかである。
本発明がその好ましい特定の実施形態と合わせて記載されているが、上記の記載および以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが本発明の範囲を限定することは意図されないことが、理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、および刊行物(上述および下述の両方)は、本明細書中に参考として援用される。
(実験手順)
以下の実験手順は、本明細書中に開示されそして特許請求されるハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーをいかに作製しそして使用するのかについて、そしてこの同じハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを使用する方法をどのように実施するのかについての完全な開示および記載を、当業者に提供するために示される;実施例は、本発明者らが自身の発明であると認識する発明の範囲を制限することを意図されない。数(例えば、量、温度など)に関する精度を保証するように努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は、重量部であり、温度は、摂氏度(℃)であり、そして圧力は、海面での大気圧またはほぼ大気圧である。
以下の実験手順は、本明細書中に開示されそして特許請求されるハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーをいかに作製しそして使用するのかについて、そしてこの同じハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを使用する方法をどのように実施するのかについての完全な開示および記載を、当業者に提供するために示される;実施例は、本発明者らが自身の発明であると認識する発明の範囲を制限することを意図されない。数(例えば、量、温度など)に関する精度を保証するように努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は、重量部であり、温度は、摂氏度(℃)であり、そして圧力は、海面での大気圧またはほぼ大気圧である。
以下および本明細書全体を通じてに示される手順において、使用される略語は、以下のような一般的に受け入れられているその略語の意味を有する:
C 摂氏または百分度
mM ミリモル濃度
μM マイクロモル濃度
pmol ピコモル(10−12モル)
mg ミリグラム
μg マイクログラム
mL ミルリットル
μL マイクロリットル
μm マイクロメートル
Tm 融解温度
U 単位。
C 摂氏または百分度
mM ミリモル濃度
μM マイクロモル濃度
pmol ピコモル(10−12モル)
mg ミリグラム
μg マイクログラム
mL ミルリットル
μL マイクロリットル
μm マイクロメートル
Tm 融解温度
U 単位。
下記の手順を実施するために、Primer3、GCG(登録商標)、VNTI、Primer Express(登録商標)およびHybsimulatorを含む、種々のソフトウェアが、プライマーの設計およびTmの推定のために使用された。Hybsimulatorは、Tmの推定のために好ましいソフトウェアであることが見出された。
(シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9のための野生型対立遺伝子または変異体対立遺伝子の検出)
(CPY2D6多重(マルチプレックス)SNPアッセイのためのプライマー配列)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子および改変体対立遺伝子の検出の際の第1工程として、以下の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを調製した:
(CPY2D6多重(マルチプレックス)SNPアッセイのためのプライマー配列)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子および改変体対立遺伝子の検出の際の第1工程として、以下の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを調製した:
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子および改変体対立遺伝子の検出の際の第2工程として、ヒトゲノムDNAを、QIAamp(登録商標)DNA Blood Mini Kitを製造業者(Qiagen)によって記載されるように使用して、EDTA処理した200μLの全血より抽出した。
(CPY2D6多重(マルチプレックス)SNPアッセイのための差示的ハイブリダイゼーションプローブの設計)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子および改変体対立遺伝子の検出の際の第3工程として、対立遺伝子ハイブリダイゼーションプローブを、多重(マルチプレックス)様式において使用するために設計した。エキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9の各々におけるSNPの存在または非存在を、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して決定した。このプローブは、野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子のいずれかに相補的な配列を含み、さらに独特な色コードを有するLuminexTMビーズに付着した配列に相補的である独特な捕捉配列を含んだ。この検出された色は、対立遺伝子特異的配列の正体、よって標的ヌクレオチド配列中の野生型配列または改変体配列の存在を示した。この捕捉配列は、捕捉プローブとLuminexTMビーズに付着した相補的配列とにイソシトシンおよびイソグアニンを組み込むことによって、増幅した配列中に存在し得るゲノムDNA配列への潜在的な非特異的結合を最小化するように設計した。
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子および改変体対立遺伝子の検出の際の第3工程として、対立遺伝子ハイブリダイゼーションプローブを、多重(マルチプレックス)様式において使用するために設計した。エキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9の各々におけるSNPの存在または非存在を、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して決定した。このプローブは、野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子のいずれかに相補的な配列を含み、さらに独特な色コードを有するLuminexTMビーズに付着した配列に相補的である独特な捕捉配列を含んだ。この検出された色は、対立遺伝子特異的配列の正体、よって標的ヌクレオチド配列中の野生型配列または改変体配列の存在を示した。この捕捉配列は、捕捉プローブとLuminexTMビーズに付着した相補的配列とにイソシトシンおよびイソグアニンを組み込むことによって、増幅した配列中に存在し得るゲノムDNA配列への潜在的な非特異的結合を最小化するように設計した。
以下に示される配列を設計し、そして目的の配列を増幅するために上記に示されたプライマーを使用して、それらの下記配列が、増幅したゲノムDNAのサンプル中の野生型シトクロムP450遺伝子型と変異体シトクロムP450遺伝子型との間を識別する能力について試験した。各対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド配列−標的ヌクレオチド配列二重鎖の融解についてのTmが、野生型配列と比較して示される。よって、以下に示されるように、野生型アンプリコン配列とハイブリダイズするように設計された対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブは、変異体アンプリコン配列とハイブリダイズするように設計した対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブよりも少なくとも10℃安定である(すなわち、少なくとも10℃高い温度で融解する)。これらの融解温度は、1塩基対ミスマッチ配列についての融解温度において予想される差異約10℃と一致する。同様に、変異体アンプリコン配列についての対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブは、この変異体アンプリコン配列が存在する場合に、少なくとも10℃安定である。
(多重(マルチプレックス)ではない(singleplex)ポリメラーゼ連鎖反応および多重(マルチプレックス)ポリメラーゼ連鎖反応)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子の検出の際の第4工程は、多重(マルチプレックス)ではないポリメラーゼ連鎖反応または多重(マルチプレックス)ポリメラーゼ連鎖反応の実施である。本実施例において、多重(マルチプレックス)ではないPCRまたは多重(マルチプレックス)PCRを、2μL(50〜70ng)の単離したゲノムDNAを用いて実施した。1×Titanium Taq PCR緩衝液、各2.5mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP);各0.2μMの順方向(ビオチン化)プライマーおよび逆方向のプライマー、ならびに2.5U TitaniumTaq DNAポリメラーゼを含む25μlの反応容量を、調製した。PE9600サーモサイクラーを使用した。熱サイクリング条件は、94℃で2分間、その後に95℃で30秒間と、68℃で1分間とを30サイクル、その後の最終伸長68℃で5分間であった。
(シトクロムP450 SNPアッセイ)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子の検出の際の最終工程は、図1に示したSNPアッセイであり、そして以下のように実施した。PCR反応を完了した後、25μLの多重(マルチプレックス)作業試薬を、多重(マルチプレックス)PCR産物を含有する個々のウェルに添加した。このプレートを、mylarでシールし、そしてインキュベーションを、PE9600サーモサイクラー中で継続した。多重(マルチプレックス)作業試薬は、最終pH7.5を有する50mM Hepes(500mM LiCl、1%LDS、1%BSA、10mM MgCl2、0.01mM ZnCl2、ならびに防腐剤としての0.5%アジ化ナトリウムおよびProclin−300(HIV3.0 Label Diluent,Bayer Diagnostics)を含む)25μL当たり、4つのSNP領域についての各々0.1pmolの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)プローブと、各々2000個の個別のLuminexTMミクロスフェアとを含んだ。多重(マルチプレックス)ASH作業試薬を含むこのPCRプレートを、95℃で10分間インキュベートして、二本鎖DNAを解離させ、その後、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを達成するために50℃で30分間インキュベートした。このプレートを取り出し、そして100μLの洗浄緩衝液(HIV3.0 Wash A,Bayer Diagnostics)を、各ウェルに添加した。このウェルの内容物を、予め湿らせた96ウェルのフィルタープレート(Multiscreen(登録商標)−BV1.2μm,Millipore,Bedford MA)に移した。洗浄緩衝液を、穏やかな減圧で吸引し、そして200μLでの洗浄を繰り返した。ミクロスフェアを、50μLのストレプトアビジン−フィコエリトリン(0.05μg/50μL)TTL緩衝液(50mM Tris、400mM LiCl、0.1% Tween−20(pH8.0))混合液中で再懸濁した。次いで、このプレートを、アルミニウムホイルで被い、そして穏やかに振盪しながら25℃で15分間インキュベートした(Titer Plateシェーカー、Labline Instruments)。上記洗浄工程を繰り返し、そしてミクロスフェアを、80μLのTTL緩衝液中に再懸濁し、そしてLuminexTM100で読み取った。ここで、フィコエリトリン(つまり、元々の順方向プライマー)および特定のASH各々に特異的なミクロスフェアの存在を検出した。図2は、シトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9の各々について野生型識別プローブおよび改変体識別プローブについての捕捉領域を示す;図3は、SNPアッセイが、異なる色のLuminexTMビーズをどのようにして生じるかを示す;そして図4は、4人の患者個々についてのSNP P450アッセイの結果を示す。
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子の検出の際の第4工程は、多重(マルチプレックス)ではないポリメラーゼ連鎖反応または多重(マルチプレックス)ポリメラーゼ連鎖反応の実施である。本実施例において、多重(マルチプレックス)ではないPCRまたは多重(マルチプレックス)PCRを、2μL(50〜70ng)の単離したゲノムDNAを用いて実施した。1×Titanium Taq PCR緩衝液、各2.5mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP);各0.2μMの順方向(ビオチン化)プライマーおよび逆方向のプライマー、ならびに2.5U TitaniumTaq DNAポリメラーゼを含む25μlの反応容量を、調製した。PE9600サーモサイクラーを使用した。熱サイクリング条件は、94℃で2分間、その後に95℃で30秒間と、68℃で1分間とを30サイクル、その後の最終伸長68℃で5分間であった。
(シトクロムP450 SNPアッセイ)
シトクロムP450 CPY2D6のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子または改変体対立遺伝子の検出の際の最終工程は、図1に示したSNPアッセイであり、そして以下のように実施した。PCR反応を完了した後、25μLの多重(マルチプレックス)作業試薬を、多重(マルチプレックス)PCR産物を含有する個々のウェルに添加した。このプレートを、mylarでシールし、そしてインキュベーションを、PE9600サーモサイクラー中で継続した。多重(マルチプレックス)作業試薬は、最終pH7.5を有する50mM Hepes(500mM LiCl、1%LDS、1%BSA、10mM MgCl2、0.01mM ZnCl2、ならびに防腐剤としての0.5%アジ化ナトリウムおよびProclin−300(HIV3.0 Label Diluent,Bayer Diagnostics)を含む)25μL当たり、4つのSNP領域についての各々0.1pmolの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)プローブと、各々2000個の個別のLuminexTMミクロスフェアとを含んだ。多重(マルチプレックス)ASH作業試薬を含むこのPCRプレートを、95℃で10分間インキュベートして、二本鎖DNAを解離させ、その後、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを達成するために50℃で30分間インキュベートした。このプレートを取り出し、そして100μLの洗浄緩衝液(HIV3.0 Wash A,Bayer Diagnostics)を、各ウェルに添加した。このウェルの内容物を、予め湿らせた96ウェルのフィルタープレート(Multiscreen(登録商標)−BV1.2μm,Millipore,Bedford MA)に移した。洗浄緩衝液を、穏やかな減圧で吸引し、そして200μLでの洗浄を繰り返した。ミクロスフェアを、50μLのストレプトアビジン−フィコエリトリン(0.05μg/50μL)TTL緩衝液(50mM Tris、400mM LiCl、0.1% Tween−20(pH8.0))混合液中で再懸濁した。次いで、このプレートを、アルミニウムホイルで被い、そして穏やかに振盪しながら25℃で15分間インキュベートした(Titer Plateシェーカー、Labline Instruments)。上記洗浄工程を繰り返し、そしてミクロスフェアを、80μLのTTL緩衝液中に再懸濁し、そしてLuminexTM100で読み取った。ここで、フィコエリトリン(つまり、元々の順方向プライマー)および特定のASH各々に特異的なミクロスフェアの存在を検出した。図2は、シトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9の各々について野生型識別プローブおよび改変体識別プローブについての捕捉領域を示す;図3は、SNPアッセイが、異なる色のLuminexTMビーズをどのようにして生じるかを示す;そして図4は、4人の患者個々についてのSNP P450アッセイの結果を示す。
本発明により、サンプル中の核酸分析物において多型部位での遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法が提供される。この方法は、検出および計数される、捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体を形成するために使用される一連の工程を包含する。この方法は、第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ、第1捕捉プローブおよび第2捕捉プローブ、ならびに各々が検出可能なシグナルを有する第1固体基材および第2固体基材を使用して行われる。本発明はまた、このアッセイを行うためのキットを提供する。
Claims (37)
- サンプル中の核酸分析物における多型部位での遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該サンプル中に含まれる該核酸分析物から標識アンプリコンを調製する工程;
(b)該標識アンプリコンと複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、野生型複合体が、第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、該多型部位で野生型配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成され、改変体複合体が第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々と、該多型部位での改変体配列を有する単一の標識アンプリコンとの間で形成される、工程;
(c)工程(b)において形成された任意の野生型複合体および改変体型複合体と、複数の第1捕捉プローブおよび第2捕捉プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、第1の検出可能なシグナルを有する捕捉された野生型複合体は、野生型複合体の各々と単一の第1捕捉プローブとの間で形成され、第2の検出可能なシグナルを有する捕捉された改変体複合体は、改変体配列の各々と単一の第2捕捉プローブとの間で形成される、工程;
(d)工程(c)において形成された、任意の捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体を検出および計数する工程;ならびに
(e)工程(d)において検出された、捕捉された野生型複合体および捕捉された改変体複合体の相対量を比較することにより遺伝子バリエーションの存在または非存在を決定する工程であって、捕捉された野生型複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの非存在を示し、捕捉された改変体複合体のより多い量は、遺伝子バリエーションの存在を示す、工程、
を包含する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々は、第1捕捉配列部分および前記野生型配列に対応する前記多型部位に相補的な領域から構成され、前記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々は、第2捕捉配列部分および前記改変体配列に対応する前記多型部位に相補的な領域から構成される、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび前記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各々が、スペーサー部分を有する、方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび前記第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブの各スペーサー部分が、前記捕捉配列部分と前記多型部位に相補的な前記領域との間に位置する、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記第1捕捉プローブの各々が、(i)前記第1捕捉配列部分に相補的な領域から構成され、かつ(ii)前記第1の検出可能なシグナルを提供する単一の固体基材に結合され、そして前記第2捕捉プローブの各々は、(i)前記第2捕捉配列部分に相補的な領域から構成され、かつ(ii)前記第2の検出可能なシグナルを提供する単一の別個の固体基材に結合される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナルが、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬および放射性同位体からなる群より選択される部分により提供される、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナルが、1種類以上の蛍光色素により提供される、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナルが、2種類の蛍光色素により提供される、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記第1の検出可能なシグナルが、2種類の異なる蛍光色素の一定の比により提供され、前記第2の検出可能なシグナルが、該2種類の異なる蛍光色素の異なる比により生成される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記工程(c)が、前記捕捉された野生型複合体および改変体複合体を、前記検出可能なシグナルおよび前記標識アンプリコンの標識の両方を検出および計数するように設計されたフローサイトメーターに通す工程により実施される、方法。
- 請求項10に記載の方法であって、前記工程(c)は、前記捕捉された野生型複合体および改変体複合体を、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナル、ならびに前記標識アンプリコンの標識を検出および計数するように設計されたフローサイトメーターを通す工程によって行われ、該標識アンプリコンの標識および該第1の検出可能なシグナルの検出が、捕捉された野生型複合体を示し、そして該標識アンプリコンの標識および該第2の検出可能なシグナルの検出が、捕捉された改変体複合体を示す、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標識アンプリコンが、標識プライマーを用いたPCR合成により生成されたPCR産物である、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記標識プライマーが、ビオチン化プライマーである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標識アンプリコンが、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬および放射性同位体からなる群より選択される部分により、直接的または間接的に標識される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記サンプルが、患者から得られる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、一ヌクレオチド多型である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、多型のクラスタである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、遺伝子障害と関連する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、対立遺伝子バリエーションと関連する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、エキソン配列と関連する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、イントロン配列と関連する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子バリエーションが、遺伝子サブタイプと関連する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記核酸分析物が、患者に属する遺伝子から得られる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記核酸分析物が、ウイルス生物、細菌生物および真菌生物からなる群より選択される感染性因子の遺伝子に属する、方法。
- 表現型を推定するために使用される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、多重形態において、複数の遺伝子バリエーションが、複数の異なるディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブおよび捕捉プローブの使用を通じて検出される、方法。
- 多型のクラスタを検出するために使用される、請求項24に記載の方法。
- サンプル中の核酸分析物における多型部位での遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するためのアッセイキットであって、以下:
(a)第1捕捉配列部分および野生型配列に対応する該多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第1ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(b)該第1捕捉配列部分とは異なる第2捕捉配列部分およびバリエーション配列に対応する該多型部位に相補的な領域から各々構成される、複数の第2ディファレンシャルハイブリダイゼーションプローブ;
(c)各々が、(i)該第1捕捉領域に相補的な、結合された第1捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第1の検出可能なシグナルを有する、複数の第1固体基材;ならびに
(d)各々が、(i)該第2捕捉領域に相補的な、結合された第2捕捉プローブから構成され、かつ(ii)第2の検出可能なシグナルを有する、複数の第2固体基材、
を含む、キット。 - 請求項28に記載のアッセイキットであって、前記第1固体基材および前記第2固体基材の各々が、ビーズである、アッセイキット。
- 請求項28に記載のアッセイキットであって、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナルが、1種類以上の蛍光色素により提供される、アッセイキット。
- 請求項30に記載のアッセイキットであって、前記第1の検出可能なシグナルおよび前記第2の検出可能なシグナルが、2種類の色素により提供される、アッセイキット。
- 請求項31に記載のアッセイキットであって、前記第1の検出可能なシグナルが、2種類の異なる色素の一定の比により提供され、そして前記第2の検出可能なシグナルが、該2種類の異なる色素の異なる比により生成される、アッセイキット。
- 請求項28に記載のアッセイキットであって、核酸を増幅するためのポリメラーゼをさらに含む、アッセイキット。
- 請求項28に記載のアッセイキットであって、PCRを実行するためのプライマーをさらに含む、アッセイキット。
- 請求項34に記載のアッセイキットであって、前記プライマーが標識されている、アッセイキット。
- 請求項35に記載のアッセイキットであって、前記標識プライマーが、ビオチン化プライマーである、アッセイキット。
- 請求項28に記載のアッセイキットであって、遺伝子バリエーションの存在または非存在を検出するためのアッセイを実行するための説明書をさらに含む、アッセイキット。
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