JPH07502657A

JPH07502657A - 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈｔｌｖ−１プローブ

Info

Publication number: JPH07502657A
Application number: JP5511958A
Authority: JP
Inventors: コルバーグ，ジャニス　エイ．; アーデア，マイケル　エス．
Original assignee: バイエル　コーポレイション
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1995-03-23
Also published as: TW293844B; WO1993013225A1; EP0672174A4; CA2125144A1; US6235465B1; EP0672174A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】サンドイッチバイブ１　イゼーションア・セイにいるためのＨＴｖ−プローブ技ＪｌｊＬ野本発明は、核酸ハイブリダイゼーシ璽ンアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、ＩＩＴＬＶ−１を検出するための新規な核酸プローブに関する。

１１艮歪１１ＴＬＶ−１は、ヒトリンパ栄養系レトロウィルスであり、成人のＴ細胞の白血病／リンパ騰、および熱帯性痙性麻痺（ｔｒｏｐｌｃｓｐａｓｔｉｃ　ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）／ＨＴＬＶ−１関連の骨髄症を引き起こす。

これらの）ＩＴＬＶ−１関連の疾患は、米国での散在発生と共に、日本およびカリブ海での地方病的流行とがある。ＨＴＬＶ−１の検出は、典型的に免疫学的アッセイまたはポリメラーゼ連鎖反応アッセイ　（例えば、Ｍｅｙｔｅｓら、Ｌａｎｃｅｔ　３３６（８７３０）−１５３３〜１５３５．１９９０を参照）により行われている。

同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号には、溶液相核酸サンドイソチハイブリグイゼーションアノセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに実質的に相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一水路セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。

同一人に譲渡された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８８３０９６９７６号には、米国特許第４．８６８．１０５号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、１ｍプローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ盟肝炎ウィルス、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒ　０ｅａｅ％　Ｎ、ｏｎｏ　ｈｏｅａｅのペニシリンおよびテトラサイクリン耐性、およびｑ山徂Ｂｈ工Ｕａｃｈｏｍａｔｉｓについて開示されている。

１９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願第５５８．８９７号には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分岐ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりもより強いシグナル増強を提供する。

λ匪旦皿丞本発明の１つの局面は、Ｉ’１ＴＬＹ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、オリゴヌクレオチド酸マルチマーに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＴＬＶ−１核酸に対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、）ＩＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＴＬＶ −１に対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、試料中のＩＩＴＬＶ−１核酸の存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する：（ａ）　該試料を、過剰の（１）ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、（ｉｉ）ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）　工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｅ）　その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）　工程（ｅ）の生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；（ｅ）　非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、該標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）　非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）　工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。

本発明の別の局面は、試料中のＨＴＬＶ−１核酸の検出のためのキットであって、このキットは以下の組合せを含む：（ｉ）　増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、　）ＩＴＬＶ −１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントとを含む、セクト；（ｉｉ）　捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで該捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＩＩＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；（ｉｉ＋）　核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、マルチマー；および（ｉｖ）　標識オリゴヌクレオチド。

「を　るための≦ 定員「溶液相核酸ハイブリダイゼーシ曹ンアッセイ」トハ、同一人に譲渡された米国特許第４，８６１１．１０５号、およびＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。

「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加的な官能基を育するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレオチドは、そのＮ４位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている５゜−シチジンである。

「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（すなわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は共有結合によりつくられ、マルチマーは、２つの型のオリゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズする核酸に、および多数の標識プローブにハイブリダイズし得る。このようなマルチマーの組成物および調製は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、。

および１９９０年７月２７日に出願された米国特許出願第５５８，６９７号に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。

用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメントと、増幅マルチマーに特異的にハイブリダイズする第二セグメントの反復とを有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチドとして意図される。

用語「捕獲プローブ」は、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相補的であるセグメントとを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。

本明細書中で本発明のコーム型分枝ポリヌクレオチドを記載するのに用いられる「大きな（Ｌａｒｇｅ）Ｊとは、少なくとも約１５個の分枝部位と、標識プローブ結合配列の少なくとも約２０個の反復とを有する分子を意味する。

本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられる「コーム型」とは、バックボーンから伸長している多数の側鎖を宵する直鎖状のバックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。

「切断可能なリンカ−分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断され得る共有結合を含む分子を意味する。

本明細書中に開示された全ての核酸配列は、５°から３°への方向に記載されている。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−１ｔｌＢ生化学命名委員会によって推奨されたヌクレオチド記号に従って示す。

開示された全てのヌクレオチド配列は、他に指示がない限り、相補的な配列を含むことを意図する。

（以下余白）ハイプリ　イゼー／タンア・・セイ溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションの一般的なプロトフルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一本鎖核酸プローブセットを入れたマイクロタイターウェル中に入れる＝（１）捕獲プローブのセ・ノド、それぞれ、分析物に実質的に相補的な第一結合配列、および、固体支持体く例えばウェル表面またはビーズ）に結合した核酸に実質的に相補的な第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。

プローブの第二結合配列は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕獲プローブの第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。

次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーシヲン条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列に／・イブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーがらも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの実質的に相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。

次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。

分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体）由来であり得、種々の手段（例えば、ブロティナーゼに／　ＳＤＳ、カオトロビ／り塩など）によりハイブリダイゼーシブン分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、Ｏ，ｌｋｂ程に小さくあり得、通常少な（とも約０．５ｋｂであり、そしてｌｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一水路形聾で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約０゜０５〜０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの組合せ）により行われ得る。

分析される配列に実質的に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌクレオチド、そして約５ｋｂ以下、通常約１ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、冬型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。

用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影響する。なぜなら、これは用いられるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提供されるシグナルが強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用いるほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられるようになり、それによって偽陽性結果の発生率が減少する。従って、セット中のプローブ数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、より好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好ましくは５〜１００個の捕獲プローブおよび５〜１００個の増幅プローブである。

ＨＴＬＶ−１のオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＪａｐａｎｅｓｅおよびＣａｒｉｂｂｅａｎ単離株ならびにＧｅｎＢａｎｋから入手可能なＨＴＬＶ−２のｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列を並べることにより設計した。ＨＴＬＶ−１単離株の間で相同性が最も高い領域を捕獲プローブとして選択する一方、より相同性の低い領域を増幅プローブとして選択した。従ってＨＴＬＶ−１の添加株または単離株力（有効とされるように、適当なプローブの設計が、新規の株または単離株を本発明のプローブを設計するために用いたヌクレオチド配列と並べること、そして捕獲プローブとして用いる相同性が最も高い領域を増幅プローブとして選択されたより相同性の低い領域と共に選択することにより行われた。本発明の好ましい構造の捕獲プローブは、２つのクラスターを、２つの捕獲プローブクラスターの間でクラスター化した増幅プローブと共に形成する。本発明の好ましいプローブセットのヌクレオチド配列を実施例に示す。

捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。

捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。

結合配列は、完全に相補的であってホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％未満の塩基がミスマツチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる、用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基が正確に対応するような正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、９０％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。

！！オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端ティルとして存在し得る。オリゴヌクレオチド配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳΔ（１９８３）　８０：４０４５；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ％Ｎｕｃ１．　ｃ　ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　１２：３４３５；　ＲｉｅｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ、　Ｎｕｃｌ、、＾」；」」ｊｊＬ−」ｌ」Ｌ５−（１９８３）１１：６１６７；　Ｓｍ１ｔｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ’ｄｓ、ａｓ、（１９８５）　ｌｉ：２３９９；　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃ　ｔａ、（１９８４）　１３８：２６７を参照のこと。標識は、実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。

例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）、　フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，α−β−ガラクト７ダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが包含される。

分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約１．５：ｌであり、より好ましくは少な（とも２：１である。通例、２：ｌから１０’：１の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約１０ −５〜１０−９Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１０−２１〜１０−１２Ｍまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約１０分から２０時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約２０”Ｃから８０”Ｃの範囲で、より通常には約３５℃から７０”Ｃまでで、特に６５℃で行われ得る。

ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント（０，０１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０，０１７〜０、１７Ｍ））、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、一般的に２〜５０％の範囲内の量で存在する。

ハイブリダイゼーション媒体のストリンジエンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジエンシーを変化させる。

標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメータ−またはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメータ−１分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。

本発明に基づく増幅した核酸ノーイブリダイゼーションアツセイを行うためのキットは、以下の試薬の−まとめの組み合わせを包含する：増幅プローブまたはプローブのセ・ノド；捕獲プローブまたはプローブのセ・ノド；増幅マルチマー；および適当な標識オリゴヌクレオチド。これらの試薬は、典型的にキット内の分離容器中に存在する。このキ・ノドはまた、分析物を変性させるための変性試薬、ノ＼イブリダイゼーシロン緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、陰性および陽性のコントロール、およびアッセイを行うための記述された指示書を含有し得る。

以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施用でＡ運出へ一−−ノＩｉ−尤ＪＫ　ｊＴｌ　１−１制御　＋・例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。

支鬼勇支立且エコームリ　ポリヌクレオチドのム本実施例は、１５個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸長とを有する、コーム型分岐ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌクレオチドは、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載の溶液相ハイブリダイゼーションに用いられるように設計した。

オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ、　Ｉｎｃ、、　（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ）で行った。βンアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、Ｐｈｏｓｔｅｌ”試薬（ＡＢＮ）を用いる５°リン酸化が包含される。

示したこと以外は、標準的なＡＢＩプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた（例えば、１．２サイクル）と示されている場合、ＡＢＩにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０ＢＤＮＡ合成機で行われる、サイクル１．２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。

（以下余白）がロー２Ｍであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロ以下の構造のコーム俸’ｌ：　ＲｆＪＪ　ｌ−嗣λしＩこ：３’Ｔ、８（’ＩＴＸ’）１５ＧＴｖｒＧＴＧＧ−５’−スルー（ｓｔｅｐｐｅｄ　Ｎｏｖｔｈｒｏｕｇｈ）を用いて、塩化メチＬ／７中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５°ＤＭＴをアセチル基ューキャ、プＷｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０℃で１２時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒を５ｐｅｅｄ−Ｖａｅエバポレーターで除去し、残渣を１００μｌの水に溶解した。

以下の構造の３゛バツクボーン伸長（セグメント＾）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカ−もまた、自動合成機を用いて作成した。

４’！’１４象４＋７！　３’−（ＪＬＴＧＣＧ（ＴｒＣＡＴＧＣＴＧＴｒＧＧＴＧＴＡＧ）３−５’　（牝テ）’７１８：ｒ　＝３）粗製のコーム体を！ｌｌデポリアクリルアミドゲル法７％、７Ｍ尿素およびＩＸ　ＴＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。

３°バツクボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４ｐ■０１／μｍ）、３°）＜ｙクボーン伸長（６，２５ｐｍｏｌ／　ｕ　ｌ）、側鎖伸長（９３，７５ｐｍｏｌ／　ＩＩ　１）、側鎖連結テンプレート（７５ｐｍｏｌ／μｌ）および／（・ツクボーン連結テンプレート（５ｐｌａｌ／　ｕ　ｌ）を、１　ｍＭ　ＡＴＰ／　５　ｓ＋Ｍ　ＤＴＴ／　ＳｏｗＭトリスＨＣＩ％ｐＨ８，０／　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　２■Ｍスペルミジン中で、０．５単位／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで水浴中で９５℃に加熱し、次いで１時間かけて３５℃未満までゆっくりと冷却した。２諷Ｍ　ＡＴＰ、　１０■Ｍ　ＤＴＴ、　１４％ポリエチレングリコール、および０．２１単位／μｌ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。ＤＮＡをＮａｃｔ／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ　ＡＴＰ、　５ｇ＋Ｍ　ＤＴＴ。

１４％ポリエチレングリコール、５０醜關トリスＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１０■ ＭＭｇＣｈ、２ｍＭスペルミジン、Ｏ，Ｓ単位／μｌ　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μＩ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３ ℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。

連結反応および精製を行った後、生成物の一部を３２ｐで標識し、Ｒ部位での切断を行い、これは、水性Ｎａ１Ｏａで１時間酸化することにより達成された。次いで、試料をＰＡＧＥにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で４５個の標識プローブ結合部位を有していることが分かった。

（以下余白）実ＪＬＩＬＬＩＨＴＬＶ−１７ノセイのためのｒ　１５ｘ　３Ｊ増幅溶液相核酸サンドイツチノ〜イブリダイゼーシ目ンアノセイ形式を、本アッセイで用いた。ｒ１５Ｘ３Ｊの呼称は、この形式が２つのマルチマーを用いることに由来する；（１）増幅プローブは、１（ＴＬ’／−１に結合する第一セグメント（Ａ）と、（２）増幅マルチマーにハイブリダイズする第二セグメント（Ｂ）とを有し、（２）増幅マルチマーは、セグメント（Ｂ）にノーイブリダイズする第一セグメント（Ｂ＊）と、セグメント（Ｃ）の１５個の反復とを有し、ここでセグメントＣは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。

本アッセイで用いた増幅プローブセグメントおよび捕獲プローブのセグメント、ならびにそれらの個々の名称は以下のＹＣＴＧＧＧＣＴｆＴＡＡＴｒＡＣＧＧＧＹｒＬｖ、ａ　ｔ　′ｗ７′ｍ’＋　ニア）ＡＴＣＴにπＡＲＡＧＣＩπαムτ χπσ買弱ａ弱σＹｒＸＪｖ、９（１チ１重％　：８）ＧＧＣＴＡπαＷＧ論ｃｒＧＴＱπ五工ｔにＣ％Ｔｒｎ＋ｖ、ｚｏ　（’ｆｆ１ｆｆｌＩ／ｋ１５：９）ＡＴＣＴｒＧＧＧ’ｍ’ＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＡＹＡα℃ＡＨＴＬＶ、１２　＜肋ｆｌ＠８　：ｘｌ）τＡＴＴＡＧＣＡ　ＴＧＡＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＨＴＬｖ−１３（（Ｅｌ’ｌ＃’３　＝１２＞τＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＣＧＴＹＧＴＣＣＧ１（ＴＬＶ、１４　ｔｇｕ°ｌ１％　＝１３）ＣＹＡＧＴｒＧＴＴｍ’ＧＧＴＡＴＣＡＡＣＴＡＧＧＣＡＡＧＡ’１ｌＧＴ槓：’ＬＶ、１５　（痘’１％ら　＝１４）ＧＣＡＴＴＧＴＴＧτＡＡＧＧＣＡＴＣ’ＲＣＧＡＣＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣ罰−Ｖ、１６（ｌ財漫う　：１５）ＣＩＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＣＧＣＣＹＴＧ）ｒｒＬｖ−ｘｌ（ｌＥｎｆｉｊ＞　：１ｇ）ＲＧＣＴＧＧＣＧＣＣＴＧＴＡＴｒＧＧＣＡＡＧＡＴｒＡＣＡＧＧＣＧＧ罰７ＬＶ、１Ｂ　（参第１市ら　：１７）ＧＧＧＧＧＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＡＧＹＣＣＡＡＧＧＡＣＷＬＶ、１９　（、ｖｕｌｉ弓、＝１ｓ＞ｃｃｃｃｒｒｃ’ｒｃＧｒｒｒＡＡＡｃＧＧＡＡｃ”ｘにｍ’ ｍ’５）ｒｒＬｖ−２ｏ　（ｆ＃７ｔｆｔ’＋　：１９）ＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＡＣｅＡＡＧＴＧＴｒＧｃＡＡＧＧｃｃＴＧＧＡＨＴＬｖ、２１（極オ）も％　、＝２０）ＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＲ’１ＴＣＧＡＴＡＴｃＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡ）ｒｒＬｖ、２２（ｖ沸も：２１）！ＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＡＩ：”ＩＴχｒＡＴＴＹｃｃＴＧＨＴＬＶ、２３　（配Ｑｙ＠５　：２２）ＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＴＴＧＧＨＴＬＶ、２４　＜　ｔｉｒ１僚３　；：２３）にａＡＧＲＴＣＴＡＴＧＧＴｒＡＧＡＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＣＣＣ而、２５（賄縁）多も；２４）、−ＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＧＧＣＣαｍＡＴＧｍＶ、２ｇ　（街ひ）重も：２５）ＣＴＡＴＡＧｆｆｆ’ＧＹＡＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＴＧＴＲＧＴｒＧＧＣＡ１ｍ、Ｖ、２７　（断〃）■も：２６））ｒｒＩＪｖ、２ｓ　（ｉ！ｌｌ＋Ｊｌ示ｇ　：２８）ＴＡＡＡＣＣＣｒＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡ　ＣＴＹＴＣＣＡＧＧＣＧＴＡＴＣｎｖ、３１４特１ｆＬ％　：３０３ＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣｒＧＡＡＧＡＡＴＡＧＴＧＣＡＴ％ＧＧローＶ、３４　（訛１ｒ１工ろ　：３３）ＧＹＡＧＧＴＣＣＫＣＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＣＹＡＧＧＡＧ品）ｒｎｌｖ、３ｓ　＜　！１７Ｉト）＆”ｙ　＝３’３ＴｆｆＩ’ＧＴｒＴｒＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＴｒＣＣＴｒＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣｒＧＡＡＴＣＴＹｒＬｖ、４２１Ｍ１１品も：４１）ＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＧＡＩ込コπ晶篤田ロ弱■ＴＡｆｎ、Ｖ、３　（配列光も：４４） α：ＴＡＴＧＲＡＧｎＴＧＴＧＧＲＡＴＧＴαＧＣＧＨＴＬＶ−４（１１ｉＪ’ ｌｆ＋’＋　：４５１ＣＴＧＴＡＡＴＧ　弱ＴｒＡＡＡα：”ｒｃｃｃｃｃ）ｒｒＬｖ、５＜　ｂＪ’ｌ子’＋　：４６）ＡＡＴＡＧＡＴＧＹＴＧＧＧＴσ口刀Ｇ貫減ＧＡＪ■ＧＡσ：℃ＨＴＬＶ、６　．１４１Ｍ３　：４７）ＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＣＧＧＴＡＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧ）ｍ、Ｖ、４３　（鶴？）番ろ　：４８）ＡＴＡＴｒＴＧＧＴＣＴＣＧＧＧＧＡＴＣＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴｒＧＴＡＨＴＬＶ、４４　＜　ｌ＋１ｆｆｉ’３　：４９１ＧＣＡＣｒＡＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴｒＧＡＧＭＧＧＡＴＴＴＭＡＴ）ｍ、Ｖ−４５＋配を４号　＝５０）ＴＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＨＴＴ、Ｖ−４６（１！１ｔｌｉ％　七−二５１）ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴｒＴＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＣＨＴＬＶ、４７　（ＷＩＭ”）ｔｉ８　：５２）ＣＡＧＴＲＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧｒコＶｔＧＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＹｒＬｖ、４ｓ　（［１ｌｉ９）Ｉ’３　：５３）ＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＳσｒＴＧＧＡＣＴ’ＧＧＡＡＣＡＣＹＡひ又干イ勤自）各増幅プローブは、ＨＴｔｖ−を配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、増幅マルチマーのセグメントに相補的な以下の５°伸長を含んでいる：ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＯ；７３７０７丁　（白ｔテ）番”＋　：５４）４１各捕獲プローブは、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＤＮＡに対して実質的に相補的な配列に加えて、固相に結合したＤＮＡに対して相補的な以下の下流配列（ＸＴ１＊）を含んでいた：ｃ’ｒｒロπ弱χＷＷπ刀π（暖情も；５５）Φマイクロタイタープレートを以下のようにして調製した。

Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　Ｒｅｍｏｖａｖｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウエル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、から購入した。各ウェルに２００μｍのｌＮＨＣｌを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いで、このプレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに２００ μｌのＩ　Ｎ　ＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。

プレートを再びＬＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

ポリ（ｐｈｅ−１ｙｓ＞をＳｉｇ＋Ｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、から購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ・ｌｙｓを１：１のモル比で有しており、平均分子量は４７．９００ｇｍ／ｍｏｌである。平均長さは３０９アミノ酸であり、１５５アミン／１１ｏｌを含む。ポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２Ｍ　ＮａＣ１／ＩＸ　ＰＢＳと混合し、最終濃度０．１ｍｇ／ｎ＋１（ｐＨ６，０）にした。

各ウェルに、この溶液をｌＯＯμＬずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、３０℃で一晩インキコベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。

プレートにオリゴヌクレオチドＸＴＩ中をカップリングするのに、以下の手順を用いた。ＸＴＩ参の合成は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載された。２０１Ｉｇのジスクシンイミジルスベレートヲ、３゜Ｏμｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ＸＴＩ　＊の２６０Ｄ２６８単位を、１００μｍカップリング緩衝液（５ｈＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，ｉｆ）に加えた。次いで、カップリング混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に加え、マグネチ１クスクーラーで３０分間攪拌した。

ＮＡＰ−２Ｓカラムを１０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５で平衡化した。

カップリング混合物ＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を２ｍｌの１０議Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５に４℃で加えた。この混合物をポルテックスにかけて混合し、平衡化したＮＡＰ−２５カラムにかけた。ＤＳＳ活性化ＸＴＩ傘ＤＮＡを、３．５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５でカラムから溶出した。溶出したＤＳＳ活性化ＸＴＩ牟ＤＮＡの５．６００２ａｅ単位を、１５００ｍｌの５０＋ｇＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，８に加えた。各ウェルに、この溶液を５０ｔ１１ずつ加え、プレートを一晩インキユベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。

プレートの最終的なストリアピングは、以下のようにして行った。０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２００μＬの０．２Ｎ　ＮａＯＨを各ウェルに加えた。

プレートをプラスチックで包み、６５℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。

テスト試料を以下のようにして調製した。Ｉ　Ｘ　１０’個のＨＴＬＶ−を感染したＭＴ−２細胞または非感染のＨｕＴ細胞（ヒトＴ細胞リンパ球細胞）を、以下のアッセイにおいて直接用い、そして標準フェノール：クロロホルム抽出手順によって抽出した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒａｔ　ｒ　Ｍａｎｕａｌ、１９８９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹを参照のこと）。陰性コントロールは、Ｄｕｌｂｅｃｅｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｌｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕ醜（ＤＭＥＭ）、陰性ヒト血清（ｎｅｇ、　ＨＳ）、緩衝液（１０■Ｍ　トリスＨＣ１，ｐＨ８，０）、および蒸留水であった。６０μｌのＰ−Ｋｉｌ衝液（１０＋ｓＭ　）リスＨＣＩ、ｐＨ８，０１０，１５Ｍ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，Ｏ／１％ＳＤＳ／４０μｇン■１中の２■ｇ／膳ｌプロテイナーゼにで音波処理したサケの精子ＤＮＡ）を各試料のマイクロフユージチューブに加え、アッセイした。テスト試料５０μｍを各チューブに加えた。

上記に挙げたＩＩＴＬＶ−１特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液を各ウェルに加えた（　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨに希釈された２５μｌ中の各プローブ／チューブＩＱｆｍｏｌ）。チューブを６５°Ｃで３０分間インキュベートした。

次いで、中和緩衝液６５μｌを各チューブに加えた（０．７７Ｍ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸／　１．８４５Ｍ　ＮａＣ１／　０．１８５Ｍ特表千７−５０２６５７　（１１）クエン酸ナトリウム）。混合した後、そのチューブを６５℃で一晩インキユベートした。凝縮をそれぞれのチューブの壁面で遠心分離により行い、そしてチューブの内容物を、上記のように調製したマイクロタイターウェルに移した。そのマイクロタイタープレートを、６５℃で４時間インキュベートした。

さらに室温で１ｏ分間おいた後、各ウェルの内容物を吸引して、全ての液体を除去し、モしてウェルを洗浄用緩衝液（０゜１％ＳＤＳ／　０．ＯＩＳＭ　ＮａＣ１／　０．（１０１５Ｍ　りｘ　７酸ナトリウム）テ２回洗浄する。

次いで増幅マルチマーをそれぞれのウェル（５０％のウマ血清（０，０６Ｍ　ＮａＣ１１０，０８Ｍ　り−ｃ　：／酸ナト！ｊ　’７　Ａ／４Ｘ　ＳＳＣと１：１テ混合しりｏ、１％　５ＤＳ１０．１％　ＳＤＳ／、５％　「ブロッキング試薬」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ番号１０９６１７Ｇ）ＳＯμｌ中に２０ｆ■ｏｌ）に添加した。プレートをカバーし、攪拌してウェル中の内容物を混合した後、そのプレートを３０分間５５℃でインキュベートする。室温でさらに５分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄する。

次ｕ％テＥＰ第８８３０９６９７６号で開示されたアルカリホスファターゼ標識プローブを、各ウェルに加える（５０μｌ／ウエルに２０ｆ■ｏｌ）。５５℃で１５分間インキュベートした後、室温で５分間おき、ウェルを上記のように２回洗浄し、次いで０．０１５Ｍ　ＮａＣ１１０，００１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄する。

酵素をトリガーとするジオキセタン（ｄｌｏｘｅｔａｎｅ）　（Ｓｃｈａａｐら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　（１９１１７）　２８：１１５９〜１１６２およびＥＰＡ公開第０２５４０５１号）をＬｕｌｉｇｅｎ、　Ｉｎｃ、から得、これを用いた。５０μｌのＬｕｍ１ｐｈｏｓ　５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を、各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩い゛て、試薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。ウェルをカバーし、そして３７℃で４０分間インキュベートした。

次いでプレートをＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＬ　１０００ルミノメータ−で読み取る。出力は、反応の間に生じた光の総積分として与えられる。

結果を以下の表に示す。これらの結果は、抽出した感染細胞および抽出されていない感染した細胞の両方で）ＩＴＬＶ−Ｉ　ＤＮＡを検出する能力を示し、そして非感染のフントロールの成分とクロスハイブリダイゼーシロンしないことを示す。

（↓・人）イ勤自う実ｍＬＶ−Ｉ　ＲＮのＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒ）ＩＡを、上記と本質的に同じ手順を用いて、以下の改変を行って検出した。

ＨＴＬＶ−Ｉ　ＲＮＡの標準曲線を、ＨＴＬＶ−１ウィルス貯蔵品を正常ヒト血清で１２５〜５０００ＴＣＩＤ５０／■ｌの間の範囲に連続的に希釈することにより調製する。１０ｍｇのブロティナーゼＫを、−２０”Ｃで貯蔵したホルムアミド中で７％にした５ｓｌの１（ＴＬ’／−１捕獲希釈剤（５３ｍＭ　）　’）　スＨＣ１，ｐＨ８／　１０．６ｍＭ　ＥＤＴＡ／　１．３％ＳＤＳ／　１６Ｍｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ／　５．３Ｘ　ＳＳＣ／　１ｍｇ／ｍｌブロティナーゼＫ）に加えることにより、プロテイナーゼに溶液を：Ａｌ８ｉする。捕獲プローブおよび標識プローブの等モル混合物を、各プローブの最終濃度が１６７０ｆ＊ｏｌ／ｍｌとなるようなプロテイナーゼに溶液に加える。上記のように調製したマイクロタイタープレートの各ウェルに、プローブ／プロテイナーゼに溶液を３０μｌずっ加えた後、各ウェルに適当なウィルス希釈物を１０μｍずつ加えた。

プレートを覆い、振盪して混合し、次いで６５℃で１６時間インキュベートした。

プレートをインキユベーターから取り出し、ベンチトップで１０分間冷却した。

ウェルを、上記実施例２に記載のようにして２回洗浄した。１５×３マルチマーをＡ１１）／　Ｌａｂｅｌ希釈剤で１ｆｍｏｌ／μｌに希釈する（２．２２ｍＩ　ＤＥＰＣ処理Ｈ２０（ＤＥＰＣはジエチルピロカルボネート）、１．３５ｍ１の１０％ＳＤＳ、　２４０μｌのＩＭ）リスｐＨｌ１　。

０．２０μｌのウマ血清を混合することにより調製し、プロテイナーゼに中２飄ｇ／■１に調整して６５℃で２時間加熱し、次いでこれを２４０μｌの０．１Ｍ　ＰＭＳＦに加えて３７℃で１時間加熱し、この後、４ｍｌのＤＥＰＣ−）１２０．４ｍｌの１０％ＳＤＳ、および１ｌｓｌの２０Ｘ　ＳＳＣを加える）。希釈した１５Ｘ３マルチマーを４０μｌ／ウエルで加え、プレートをカバーし、振盪し、５５℃で３０分間インキュベートする。

次いでプレートを室温で１０分間冷却し、上記のように洗浄する。アルカリホスファターゼ標識プローブをＡ＋ａｐ／　Ｌａｂｅｌ希釈剤で２゜５ｆ−０１７μ ｍに希釈し、各ウェルに４０μｌを加える。プレートをカバーし、振盪し、５５ ℃で１５分間インキュベートする。

プレートを室温で１０分間冷却し、上記のように２回洗浄し、次いで０．１５Ｍ　ＮａＣｌ／　Ｏ，０１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄する。基質を加え、発光を上記のようにして測定する。

上記の本発明を実施するための生化学、核酸ハイブリダイゼー７−Ｉン、および関連分野における当業者に明らかな上記態様の改変は、以下の請求の範囲の範囲内にあることが意図配列表（１）一般的情報：（ｉ）出１１人：フルバーグ、ジャニスエイ。

アーデア、マイケルニス。

（ｉｉｉ）配列数＝５５（ｉｖ）連絡住所：（＾）住所人：モリソンアンドフォースター（Ｂ）番地二ページ　ミルロード７５５（Ｃ）市：パロアルト（Ｆ）郵便番号：　９４３０４−１０１８ｈ）コンビニ−ター読み出し形態：（＾）＆［体型：フロノビ−ディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（ｖｉ）現在の出願データ：（Ｃ）分類：（ｉＸ）１１話回線情報：（＾）１１話：　４１５−８１３−５６００ＣＢ）テレファックス：　４１５− ４９４−０７９２（Ｃ）テレックス：　７０６１４１（２）配列番号＝１の情報：（ｘｉ）６己タ電　１ロ己タリ分弓　ｌ　：（Ｃ）＄１！ｌの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号９：可１ゴＩＴ’ＰＣ超ωＧ２Ａ？τ−ｃ１（２）配列番号１０の情報：（ｉ）配列の特色・（＾）長さ＝３３塩基対（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号ｌｏ：Ａｍ　ＴＧＧＣＣＣＣＣ’ｒ’ＧαｒｃＴＡＡＹＡｃ　ＧＣＡ（２）配列番号１１のｔ＾報：（１）配列の特色２（Ａ）長さ：３３塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１１：（２）配列＃号Ｉ２の情報；（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ＝３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号・１２：（２）配列番号１３の情報・（ｉ）配列の特色；（Ａ）長さ：３３塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トヂロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１３：（２）配列番号、１４の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１４：ＧＣＡＴ式１１℃τ入颯χｉＣＡπスｃ　ａｓｘ：ｃτＡｍＡτα℃（２）配列番号１５の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トヂロジ一二＋１［鎖状３３　（ｘｉ）配列：配列番号１５：ＣＣＹ’！？！”！’Ｇｅｅ　Ｔこ＆Ｇ（χ−４ｃテＷＣ丁Ｔ。

（２）配列番号−１６の情報：（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号・１６：（２）配列番号１７の情報：ＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡ　σｐ；−×ｍζａｍχｍ　Ａｍ（２）配列＃号２５の情報；〈１）配列の特色：（＾）長さ：３３塩基対（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号、２５：ＣＴＡＴλ７０１つＹ入Ｎ７代に心ｄ　λ７代ｔ１σロ’ＧＧＣＡ（２）配列番号２６の情報：（ｉ）配列の特色：（＾）長さ＝３３塩基対（Ｂｌ型：Ｉｔ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２６：ＣｒｒＭαにステー弱ＡｊｌＡＡＡＧ（でπα費貼απ（２）配列番号２７の情報：（１）配列の特色：（＾）長さ：３３塩基対（Ｄントボロジー：直鎖状（頁ｉ）配列：配列番号２７：ＣＮ７バリーＪｉＧＣＡλＮ７υ１℃＜＜Ｔり一υＶコ℃了τ丁Ａ１１ｍ（２）配列番号２８の情報：（Ｄ）トポロノー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号２８二３３　ｎコ父ＱφＧＣＣｆｆｒＡＧＴＴＡ　ｏコＴ四司ＧＧＡ（２）配列番号２９の情報：（＋）配列の特色：（＾）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖〈Ｄ）トヂＯジー：ｒｎ鎖状（ｘｌ１配り＋７．配列番号ｚ９：３３　τ崩χコテ再ＧＧＧ？Ａｌ７ｒＡＣＴ　ｎ”Ｃ０α恒πＡπ（２）配列番号３０の情報：（＋）配列の特色：（Ａ）長さ二３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ１鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３０：（２）配列番号３１の情報：（Ｂｊ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（２）配列番号３２の情報：（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖ｆｘｉ）配列：配列番号４０：扉焔ωごπごゴ〃超にＣＣローμπゴ（２）配列番号４１の情報：（ｘｉ）配列：配列番号４１：６ＭθンＣＡＧＴＡωひロア９ｄαに℃つχπＡ（２）配列番号４２の情報・（ｘｌ）配列：配列番号４２゜ τ冷「τｍαｍエム１φゴπ妬公φ（３）（２）配列番号４３の情報。

（ｘｉ）配列：配列番号４３・Ｇ（に−１ｉＧＲ’ＴｃＴＡｋＴＭＡＭａｊ：ＡＴＣＩＴＯコＴＣＴＧＧＣ１コ（２）配列番号４４の情報：（＋）配列の特色：（＾）長さ＝３３塩基対（Ｂｌ型：核酸）３　（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号・４４：（２）配列番号４５の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ＝３３塩基対（Ｂ）型：核酸（ｘｉ）配列：配列番号４５゜（２）配列番号４６の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ；３３塩基対（Ｂ）型：核酸３３　（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号４６：入ＡτＭτｃ丁τＯン７■コ１℃心τｉυと五人χ−ζ丁ＴＯ３〈２）配列番号４７の情報：（＋）配列の特色：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列、配列番号、４７：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（買ｉ）配列：配列番号５５： σπ−πル１λ−７ＴＯ＋７司　２゜（、以−丁分千〇ＩＳＸ　Ｃｏｍｂを合成するために用いた全てのサイクル、手順、および配列のリスト３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機用３・１／２”フロッピーディスクに収容されている４ｉ）ｒ／１１す〒、４し２ド）ノ１／１１しへフイ７′：　ｔゝｘ　？（７１し７？イル−フイ７゛、お）＋１．／如襲＋”１ｅＳＴＤＦＰＩＥＰ　ａｌ　２７．　■１　＠１１　２７．１！！Ｉ　ｏ＋ｗ＊昏１ゴ　＠７　１１．Ｉ！Ｉｌｌ；　３７　１１．１！１！（τ １雪）〈フ心η−フイ７１し々ｆｅｚ　７４７＋し心へ’７１７１しく以下泳、負）／らｐ４ｔ２Ｆしんへ１２−′ ２７’：ｌ　７−’ｆｒン、　ヨ２（＝Ｑ）：イ支く）な吸フイ７ＩＶん］１５ハ′？１し１１’し、／Ｚ、Ｚｌ’Ｊ＾ンｈ７４ノ１し′ （／Ｔ　！！　＋−１も７Ｃ（）す１゛ノｃしん１二（つ−５す、）・、セ・　＋２＋１０フ　２　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＦＬｕｔｒ＋　５　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ　Ｙａｓ　ｒｓｓ　Ｙｅｓ　Ｙｖｓ　ずｅｓ　マ・Ｓいス）合、白）４Ｍ’　ＩＡ：２Ｚ（・【（１オド（）Ｃヘリ４′フルスナー、７フ１力　や　８ｚ（Ｌｘ率守り略）１・１ｔ！（Ｌ−ＡＴｒへゆ）哨う１゛中（秩Ｔ全９）ｐｄＡｉ＋也シ）Ｓ’−’ｓＧＴ　；＋＋　７；；　７τＨＴ−、’ｓ　Ｔ−４ＴＴａ　ＴＴｔｉｉ　ＴＴ７ｓ’　ＴＴ７ｓ　ＴＴｉ　Ｔ７ＳＴＴＢ　ＴＴ；　Ｔ’７７ｉ　ＴＴ；ｓ　ＴＴｉ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ｎ了　肩τ　−Ｔ９口了　ＴＴ　−３”５−　右τ　６ＡＣＴＨＳＴ　−３” フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：９２）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＴＬＶ−１に対するサンドイッチハイブリダイゼーシコンァッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実費的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＴＬＶ−１核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１）２．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５４）を含む、請求項１に記載の合成オリゴヌクレオチド。３．ＨＴＬＶ−１に対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、該合成オリゴヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、核ＨＴＬＶ−１核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド：【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３）【配列があります】（配列番号：４４）【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８）【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２）【配列があります】（配列番号：５３）４．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）を含む、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチド。５．ＨＴＬＶ−１に対するサンドイッチハイブリダイゼーションアツセイにおけろ増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットが２つのオリゴヌクレチドを含み、ここで、各オリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実貧的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＴＬＶ−１核酸セグメントが、以下の配列である、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：６）【配列があります】（配列番号：７）【配列があります】（配列番号：８）【配列があります】（配列番号：９）【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５）【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７）【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９）【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１）【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３）【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３）【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５）【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１）６．前記第二セグメントガ、【配列があります】（配列番号：５４）を含む、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチド。７．ＨＴＬＶ−１に対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、核セットが２ツのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各オリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＹ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＴＬＶ−１核酸セグメントが、以下の配列である、合成オリゴヌクレオチドのセット：【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３）【配列があります】（配列番号：４４）【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８）【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２）【配列があります】（配列番号：５３）８．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）を含む、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチド９．試料中のＨｔｌＶ−１の存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：（ａ）核試料を、過剰の（ｉ）請求項５に記載のオリゴヌクレオチドのセットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセツトと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した核オリゴヌクレオチドと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、核マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実貧的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。１０．試料中のＨＴＬＶ−１の存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：（ａ）核試料を、（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットおよび（ｉｉ）請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブと、ハイプリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、核マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的な相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。１１．試料中のＨＴＬＶ−１の検出のためのキツトであって、以下の組み合わせを含む、キット：（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、該増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、セット；（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、捕獲プ口幅ブオリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−１核酸のセグメントに実費的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セツト；（ｉｉｉ）核酸マルチマーであって、核マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的な相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、核酸マルチマー；および（ｉｖ）標識オリゴヌクレオチド。１２．それらの使用のための指示書をさらに含む、請求項１１に記載のキツト。１３．前記増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットである、請求項１１に記載のキット。１４．前記増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項７に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットである、請求項１１に記載のキット。