CN111621584B - 一种快速筛查饲料中转基因成分的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种专门用于饲料中转基因成分鉴定的PCR微流控芯片。本发明设计筛选得到一系列适用于微流控芯片的特异性高、准确度高的常见转基因部件PCR扩增引物，并通过冻干将所述引物结合至PCR微流控芯片，实现在一次PCR扩增反应中对内源基因和多种外源基因的高通量筛查检测。本申请提供的预冻存引物的PCR微流控芯片在常温及反复冻融情况下均具有良好的稳定性，具有良好的商业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及转基因检测技术领域，具体涉及一种同时筛查饲料中10种转基因元件的微流控实时荧光PCR芯片试剂盒及其相关应用。
背景技术
饲料作为动物性食品的重要物质保障,饲料的质量安全直接影响到动物性食品的安全。而目前，很多的饲料产品均会使用转基因作物作为原材料。
转基因作物于1996年开始大规模商业化种植，2017年全球种植面积达到1.898亿公顷。自转基因作物首次商业化以来，转基因作物一直伴随着不同的声音。一方面，转基因作物确实大大增加了农作物的产量，减少了农药的使用，保护了环境；但另一方面，转基因作物对环境、社会和经济所产生的潜在不确定性遭到了多方面的质疑。我国对于饲料粮的需求缺口非常大，而以当前的研究情况来看，许多转基因农作物在安全性上还无法完全得以确认，将这类转基因农作物用作饲料原材料，无疑将会增大其安全风险，间接对消费者的身体健康造成较为严重的影响。因此，加强检测饲料是否使用转基因作物作为原材料非常重要，即只要饲料中使用了转基因作物，无论含量多少都需要标识。
目前，转基因作物的检测方法主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法两类；前者主要包括免疫试纸条法、酶联免疫吸附法、蛋白印迹法等。而后者中，应用最为广泛的为定性和定量PCR检测技术。对转基因成分的PCR检测方法主要为TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、污染环境、灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是单通道TaqMan实时荧光PCR法检测成本较高，步骤繁琐，不适于转基因产品的多品系筛查检测。尤其对于业务量大的检测部门。因此，需要研发一种简单快捷、灵敏准确同时又省时省力的高效检测方法。
为解决上述问题，本发明将PCR微流控芯片检测技术应用于转基因饲料产品高通量筛查检测，实现在一次PCR扩增过程中，同时完成1个内源基因(18S基因)以及CaMV 35S启动子、CaMV35S终止子、NOS终止子、pat基因、PinII终止子、E9终止子、RbcS4启动子、DP305423 3’边界序列、CV127 5’边界序列等9个能覆盖大部分商业化转基因品系的外源基因的筛查检测。与单重检测方法相比，在一次PCR扩增反应中检测内源基因和外源基因，可有效减少因实验操作失误可能引起的误差；实现多样品、多基因靶点的高通量筛查检测。
发明内容
PCR微流控芯片是利用MEMS(Micro-Electro-Mechanical System)技术和微流控技术制备的微流控芯片，是一种先进的体外核酸扩增技术。微流控芯片具有体积小、比表面积大、集成度高、反应速度快、传热快等特性。通过在硅、玻璃、塑料、高聚物等基片材料上加工出一系列的微通道、微反应室及各种微控制器，从而使PCR在芯片上能够快速扩增。与常规的PCR扩增技术相比，PCR微芯片具备高效、快速、消耗试剂少、易于携带、集成度高等优点，是近年来研究的热点之一，在分子生物学、疾病检测、生物技术、免疫学、基因组工程、临床医学及环境检测等各个领域都有很广泛的应用。
本发明的PCR微流控芯片技术，在PCR扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时检测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，熔解曲线可反映PCR扩增过程中随着温度升高DNA双螺旋结构的降解程度，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的熔解温度(Tm值)上有一特征峰，利用不同熔解温度对应的特征峰的不同可将特异产物与其他产物分开。理想条件下，当每一通道的温度在没有任何差别的情况下，RTFQ-PCR仪的荧光探测器所接收的荧光信号是一致的或接近的，只形成一个特征峰，即所有的熔解曲线重叠在一起。总的DNA双螺旋结构解链一半时的温度称为熔解温度(melt temperature)，即Tm值，不同序列的DNA，Tm值不同。熔解曲线上扩增产物的熔解温度对应特征峰的高度称为峰值高度(peakheights)。
因此，本发明的目的是提供一种能够同时完成多种转基因外源基因筛查的微流控芯片及其应用技术，实现在一次PCR扩增反应中同时检测内源基因和多种外源基因，实现多基因靶点的高通量筛查检测。
首先，本发明提供一种用于饲料中转基因成分鉴定的引物对组合物，所述引物对组合物包含如下所述一个或多个引物对：
用于内源基因18S基因检测的上游引物SEQ ID NO.1、下游引物SEQ ID NO.2；
用于CaMV 35S启动子检测的上游引物SEQ ID NO.3、下游引物SEQ ID NO.4；
用于CaMV35S终止子检测的上游引物SEQ ID NO.5、下游引物SEQ ID NO.6；
用于NOS终止子检测的上游引物SEQ ID NO.7、下游引物SEQ ID NO.8；
用于pat基因检测的上游引物SEQ ID NO.9、下游引物SEQ ID NO.10；
用于PinII终止子检测的上游引物SEQ ID NO.11、下游引物SEQ ID NO.12；
用于E9终止子检测的上游引物SEQ ID NO.13、下游引物SEQ ID NO.14；
用于RbcS4启动子检测的上游引物SEQ ID NO.15、下游引物SEQ ID NO.16；
用于DP305423 3’边界序列检测的上游引物SEQ ID NO.17、下游引物SEQ IDNO.18；
用于CV127 5’边界序列检测的上游引物SEQ ID NO.19、下游引物SEQ ID NO.20。
表1：本申请引物序列表
在研究中，本申请的发明人发现，现有的引物对并不能直接适用到微流控芯片，存在难以将其结合到反应板、在反应板上扩增效率低、结果不准确的缺陷；基于上述原因，本申请的引物对组合是针对在应用微流控芯片进行检测的设计调整得到的，其更适合于微流控芯片检测。通过与欧盟CRL检测方法中的引物做比较发现，其能够取得与欧盟CRL检测方法同等检测准确度。
进一步的，本发明提供一种用于饲料中转基因成分鉴定的试剂盒，所述试剂盒含有上述一种或多种引物对。
优选的，本发明的试剂盒含有多通道PCR微流控芯片，进一步优选的，所述引物组合预先冻存在所述芯片的孔道中，所述芯片如图1所示，图中的图示1即为所述孔道；优选地，所述引物以与牛磺酸的混合液形式进行冻干，具体溶液中引物与牛磺酸浓度为：PCR正反向引物各10uM，牛磺酸20mmol/L；使用上述溶液制备的预先冻存引物的PCR微流控芯片不仅能够经过多达20次反复冻融，仍能保持良好的扩增性能，且在常温下长时间保存，也能很好的保持其扩增性能。
更为优选地，所述试剂盒中还包含预混液，所述预混液组成为：TTX酶、2xBuffer、EVA Green和DEPC水；优选的所述预混液组成中TTX酶1.6uL、2xBuffer 40uL、EVA Green4uL和DEPC水2.4uL。
本申请发明人意外发现，在本发明的芯片中，添加上述牛磺酸能够显著提高引物的稳定性，不仅使其在常温下具备良好的稳定性，在长达一周的时间内基本不会出现引物降解；同时芯片在冻干状态下，稳定性方面也显著优于未添加牛磺酸情况，甚至经过反复20次冻融也基本不影响其功能；而未添加牛磺酸溶液时，在冻融5-8次时引物已产生较大降解，失去其功能。
因此，本发明提供了一种具备良好稳定性的预先冻存有PCR引物的PCR微流控芯片，所述芯片在常温及冻干状态下均具备良好的稳定性，且能够反复冻融达20次以上。本发明的芯片和试剂盒具备良好的稳定性，特别适于商业化推广。
附图说明
图1：微流控芯片示意图：图中1即为所述检测孔道，可预冻存PCR引物；
图2：转基因油菜Topas19/2的PCR扩增曲线图：(1)为标准品检测扩增曲线图；(2)为转基因油菜Topas19/2样品检测曲线图。
具体实施方式
实施例1：PCR检测方法及灵敏度、特异性实验
(1)材料和方法
转基因标准品购买自美国标准物质AOCS或欧洲标准物质ERM，包括：购买自American Oil Chemists’Society(AOCS,Urbana,USA)的转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)、转基因油菜RF2(AOCS0711-C3)、转基因大豆A5547-127(AOCS 0707-C3)、转基因大豆A2704-12(AOCS 0707-B11)、转基因大豆MON87701(AOCS 0809-A)、转基因大豆CV127(AOCS0911-D)、转基因大豆MON87769(AOCS 0809-B)、转基因大豆FG72(AOCS 0610-A4)、非转基因油菜(AOCS 0304-A2)、非转基因大豆(AOCS 0906-A)、非转基因玉米(AOCS0411-CD)等转基因标准物质；购买自European Reference Materials(ERM)的转基因玉米59122(ERM-BF424d)、转基因大豆DP356043(ERM-BF425d)、转基因大豆DP305423(ERM BF426d)等标准品。12种饲料样品收集自日常检验中获得的阳性样品。
(2)模板DNA的提取
实验材料放入液氮中研磨。采用TaKaRa公司的DNA extraction kit ofgenetically modified organism(GMO)detection Ver2.0(No.D9093；TaKaRa,Dalian,China)试剂盒进行基因组DNA的提取。提取的基因组DNA溶于100μL Tris-EDTA(TE)溶液中。纯化后的DNA样品用紫外分光光度计(ND-1000；NanoDrop,Wilmington,DE)测定浓度。
(3)超快速荧光PCR微流控芯片设计
超快速荧光PCR检测系统是采用多通道微流控芯片技术，实现在几厘米的芯片上同时进行多个样本的快速检测，全部反应可在20分钟内完成。与现有多重PCR技术相比，可实现12个样本目标的多路诊断；因为每个反应室彼此完全隔离，使得每个反应完全独立，不会发生多重PCR检测技术中典型存在的引物竞争问题；测试程序简单-只需混合试剂和DNA模板，然后分布到芯片中。经过大量实验验证该快速检测系统具有很高灵敏度、高特异性、高稳定性。
(4)微流体芯片的工作流程
将提取好的样本核酸溶液12uL(60-100ng/uL)，与冻干型PCR预混液48uL混合，然后加入微流控芯片反应孔道中，加入芯片的预混液和核酸的总体积为55uL；所述预混液组成中TTX酶1.6uL、2xBuffer 40uL、EVA Green 4uL和DEPC水2.4uL。
上机设定好程序后进行扩增，20-30分钟后软件自动分析判断结果。
(5)微流体芯片检测的特异性
采用转基因油菜Topas19/2、转基因油菜RF2、转基因大豆A5547-127、转基因大豆A2704-12、转基因大豆MON87701、转基因大豆CV127、转基因大豆FG72、转基因玉米59122、非转基因油菜、非转基因大豆、非转基因玉米、转基因大豆DP356043、转基因大豆DP305423、等13种转基因标准品进行品系间交叉反应试验，验证引物的特异性。进行检测时，只有当荧光阈值(Ct值)和扩增产物的熔解温度(Tm值)均符合阳性判别标准时，才可判定转基因元件存在。就Tm值而言，当检测样品的Tm值在阳性样品的Tm值的±1℃范围内时，则可判定为扩增阳性，超出这个范围，则判定为扩增阴性。就Ct值而言，当检测样品呈指数形式扩增且荧光信号在阈值之上则可判定为扩增阳性。除此之外，其他的结果可判断为扩增阴性。
以转基因油菜Topas19/2的检测为例(使用引物SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.9-10)，检测结果如图2所示，以上述步骤(4)中检测流程及方法检测转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)阳性标准品和已知转基因油菜Topas19/2检测样品进行试验，验证引物的特异性。检测结果显示，转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)阳性标准品18S内源基因的Tm值为79.95，35S终止子的Tm值为76.36,Pat基因Tm值为81.26。已知转基因油菜Topas19/2检测样品18S内源基因的Tm值为79.4，35S终止子的Tm值为76,Pat基因Tm值为81.3。检测结果符合阳性结果的判定标准。18S内源基因阳性说明样品DNA符合检测标准，35S终止子和Pat基因阳性说明检出样品中含有特定的转基因元件。说明本申请的微流控芯片具备良好的特异性，能够准确检测样品是否含有转基因成分。
使用相同的方法分别验证本申请其他引物对，结果与上述实验结果相似，均是能够对相应转基因品种检测出阳性结果，而对其他类型转基因样品为阴性。本申请式样说明本申请的微流控芯片具备良好的特异性，能够准确检测样品是否含有转基因成分。具体检测结果如下表2所示。
表2：本申请微流控芯片样品检测结果
(6)本申请引物与已有引物序列比较
使用上述步骤(4)-(5)方法，分别验证欧盟CRL检测方法中的引物，发现其检测结果准确度相近，能够达到相同的检测精确度，但本申请的检测芯片能同时完成十几种样品检测，效率远高于原欧盟CRL检测方法。同时，本申请也尝试将欧盟CRL检测方法中的引物结合至本申请所述芯片中，并按照上述方法进行检测，结果发现，使用上述引物结合的芯片仅能对内源基因(18S基因)、CaMV 35S启动子、PinII终止子、RbcS4启动子达到相同精度的检测结果，而其他转基因部件的检测结果均呈阴性。分析原因，可能是因为欧盟CRL检测方法中的引物因长度不适于在微流控芯片中使用或其检测基因靶点位置原因，导致其大多不能用于微流控芯片。
(7)微流控芯片检测的灵敏度
采用转基因油菜RF2(AOCS0711-C3)、转基因大豆CV127(AOCS 0911-D)、转基因大豆MON87701(AOCS 0809-A)、转基因大豆FG72(AOCS 0610-A4)等4种标准品精提DNA(100％，100ng/μl)分别用非转基因油菜(AOCS 0304-A2)DNA和非转基因大豆(AOCS 0906-A)DNA分别稀释到1％，0.5％，0.1％，0.05％、0.01％几个梯度，将转基因大豆DP305423(ERMBF426d，10％浓度)、转基因玉米59122(ERM-BF424d，10％浓度)用ddH2O分别稀释到1％，0.5％，0.1％，0.05％、0.01％几个梯度，每个稀释度分别取12μl进行微流控芯片实验，按照设定程序进行反应，以确定检测的灵敏度。所有试验重复三次，结果中所有Tm值和Ct值均为所有重复试验的平均值。由灵敏度试验数据可知，在检测样品DNA浓度稀释至0.1％时，仍可被稳定检出。确定该检测芯片的最低灵敏度为0.1％。
实施例2：微流控芯片稳定性验证
对本发明的微流控芯片进行稳定性验证，并以未添加牛磺酸成分进行冻干的微流控芯片作为对照，验证所述芯片在常温(25℃)、-20℃及反复冻融情况下的芯片检测性能。
采用0.1％浓度的转基因大豆DP305423(ERM BF426d，10％浓度)样品和针对检测18sRNA内源性基因和DP305423 3’边界序列的检测芯片进行实验，检测试剂盒的稳定性。实验结果如下表3所示，本发明微流控芯片在常温(25℃)下放置3个月、6个月、12个月，Ct值和Tm值未发生明显差异，检测灵敏度也未见明显差异；-20℃下放置3个月、6个月、12个月，Ct值和Tm值未发生明显差异，检测灵敏度也未见明显差异。而对照组，虽然在-20℃时同样具备良好的稳定性，能够保存12个月仍保持良好的灵敏度，但在常温(25℃)下，放置3个月时，其Ct值和Tm值已经产生较大变化，而在6个月时，已经完全无法进行相关检测。结果表明，本申请的微流控芯片具备明显优于对照的稳定性。
表3：引物稳定性实验结果
另外，以采用0.1％浓度的转基因大豆DP305423(ERM BF426d，10％浓度)样品和针对检测18sRNA内源性基因和DP305423 3’边界序列的检测芯片对本申请的微流控芯片和对照组分别进行反复冻融，具体实验结果见表4。实验表明，本申请的微流控芯片在反复冻融20次时，Ct值和Tm值未发生明显差异，但对照组在冻融5次后，结果已经出现明显差异，而10次后更是无法检测出有效Ct值和Tm值。
表4：PCR微流控芯片反复冻融稳定性检测结果
Claims (3)
1.一种用于饲料中转基因成分鉴定的试剂盒，所述试剂盒包含用于饲料中转基因成分鉴定的微流控芯片引物对组合物和微流控芯片，所述引物对冻存于所述芯片的检测孔道中，其特征在于，所述引物对组合物包含如下引物对：
用于内源基因18S基因检测的上游引物SEQ ID NO.1：CCTGAGAAACGGCTACCAT，下游引物SEQ ID NO.2：CGTGTCAGGATTGGGTAAT；
用于CaMV 35S启动子检测的上游引物SEQ ID NO.3：TTCCAACCACGTCTTCAAAGC，下游引物SEQ ID NO.4：GGAAGGGTCTTGCGAAGGATA；
用于CaMV35S终止子检测的上游引物SEQ ID NO.5：TCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTA，下游引物SEQ ID NO.6：CAACACATGAGCGAAACCCTA；
用于NOS终止子检测的上游引物SEQ ID NO.7：GCATGACGTTATTTATGAGATG，下游引物SEQID NO.8：TCCTAGTTTGCGCGCTATATTT；
用于pat基因检测的上游引物SEQ ID NO.9：GAGGAGACCAGTTGAGATTAG，下游引物SEQ IDNO.10：GTGTTTGTGGCTCTGTCCTAAAG；
用于PinII终止子检测的上游引物SEQ ID NO.11：GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG，下游引物SEQ ID NO.12：CACACAACTTTGATGCCCACAT；
用于E9终止子检测的上游引物SEQ ID NO.13：TCTTGTACCATTTGTTGTGCTTGT，下游引物SEQ ID NO.14：ACCATATCATTCATTAACTCTTCTCC；
用于RbcS4启动子检测的上游引物SEQ ID NO.15：CCACTCCACCATCACACAATTTC，下游引物SEQ ID NO.16：GGAGAGGTGTTGAGACCCTTATC；
用于DP305423 3’边界序列检测的上游引物SEQ ID NO.17：CGTGTTCTCTTTTTGGCTAGC，下游引物SEQ ID NO.18：CAATGAATACATAACACAAACTA；
用于CV127 5’边界序列检测的上游引物SEQ ID NO.19：AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTC，下游引物SEQ ID NO.20：CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC；
其中，引物对以与牛磺酸的混合液形式进行冻干，具体溶液中引物对与牛磺酸浓度为：PCR上下游引物各10uM，牛磺酸20mmol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所示试剂盒还含有预混液，所述预混液包含TTX酶、2xBuffer、EVA Green和DEPC水。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述预混液中TTX酶1.6uL、2xBuffer40uL、EVA Green 4uL和DEPC水2.4uL。
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