KR20090035298A

KR20090035298A - 서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 ｐｃｒ 증폭용프라이머

Info

Publication number: KR20090035298A
Application number: KR1020070100507A
Authority: KR
Inventors: 김현배; 김성열; 길준모; 박해준; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2009-04-09
Also published as: JP2010539971A; WO2009045067A2; JP5518719B2; US20110008845A1; CN101861402B; WO2009045067A3; EP2195464B1; EP2195464A4; CN101861402A; US8513399B2; KR101110013B1; EP2195464A2

Abstract

본 발명은 서열 내에 어베이직 염기를 포함하는 PCR 증폭용 프라이머 및 상기 프라이머를 이용한 PCR 증폭 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자의 다형성 부위에 어베이직 부분을 포함한 한 쌍의 프라이머로, 돌연변이 부위를 갖는 서로 다른 주형을 공통적으로 증폭시킬 수 있는 PCR 증폭용 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물에 핵산 주형을 혼합한 후, 상기 혼합물에 대해 PCR 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR 증폭용 프라이머는 염기서열 내에 특정한 코딩 정보를 갖고 있지 않는 어베이직 부분을 포함시킴으로써, 돌연변이 부위를 갖는 서로 다른 주형을 공통적으로 증폭할 수 있다는 장점이 있다.

어베이직 부분, 프라이머, 돌연변이, 실시간 PCR

Description

서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 ＰＣＲ 증폭용 프라이머{PRIMERS FOR PCR AMPLIFICATION COMPRISING ABASIC PARTS WITHIN THE PRIMER SEQUENCES}

본 발명은 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 주형 DNA의 돌연변이 또는 다형성(polymorphism) 부위에 상보적인 프라이머 내에 어베이직(Abasic) 부분을 가지며 서로 다른 주형을 공통적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭 방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(이하, "PCR"이라 함)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al, 1985). PCR에 이용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNAN의 반대쪽 가닥에 어닐링되도록 디자인되며, 프라이머의 DNA 중합효소 연장 생성물은 다른 프라이머를 위한 주형 가닥으로 작용한다. PCR 증폭 과정은 DNA 서열의 지수적 증가를 초래하며, 증폭된 DNA 서열의 길이는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단에 의해 결정된다.

핵산증폭, 특히, PCR 증폭에서의 성공은 프라이머가 자신의 타깃 서열에만 어닐링하는 특이성에 의존하기 때문에, 상기의 분자 사호작용을 최적화하는 것이 중요하다. 프라이머가 그의 완전한 상보체에만 어닐링하는지 또는 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 뉴클레오타이드 서열을 갖는 서열에도 어닐링하는지 여부는 어닐링 온도에 따라 결정된다. 일반적으로, 어닐링온도가 높으면 완전한 매치 주형에 대한 프라이머의 특정 어닐링 가능성이 더욱 높아지고, 이에 타깃 서열만 증폭될 가능성이 더욱 높아진다. 어닐링 온도가 낮으면, 주형과 프라이머간의 보다 많은 미스매치에 대하여 내성(tolerance)이 발생하고, 결국 비-타깃 서열에 대한 증폭이 증가한다. 어닐링 온도를 조절하면, 주형과 프라이머 사이의 페어링 특이성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 프라이머만 존재하는 대조군에서 다른 생성물이 발생한다면, 이러한 결과는 상기 단일 프라이머가 주형의 하나 이상의 부위에 어닐링한다는 것을 나타낸다. 이러한 경우, 어닐링 온도를 상승시키는 것이 바람직하다. 프라이머의 어닐링 특이성에 대한 어닐링 온도의 상기 효과를 고려하면, 어닐링 온도에 따라 프라이머 어닐링을 조절할 수 있어 프라이머 디자인에 무관하게 프라이머의 어닐링 특이성을 개선시킬 수 있는 어닐링 조정 프라이머 시스템에 대한 강한 요구가 있음을 알 수 있다.

어닐링 온도뿐만 아니라, 프라이머 길이, GC양 및 PCR 생성물의 길이와 같이 프라이머 파라미터들은 프라이머의 어닐링 특이성을 위해 고려되어야 한다. 만일, 상술한 파라미터를 만족하는 프라이머가 이용되면, 프라이머 어닐링은 특정화되며, 타겟 DNA 증폭에서 프라이머의 어닐링 특이성은 상당히 개선되며, 프라이머에 의해 초래되는 백그라운드 문제와 비-특이성 생성물의 문제가 해결된다. 잘 디자인된 프라이머는 비-특이성 어닐링 및 백그라운드 문제를 해결할 뿐만 아니라 RNA-PCR에서 cDNAs 또는 게놈 주형들을 구별할 수 있게 한다.

많은 경우에 있어서, 프라이머 서열은 주형 서열에 대한 완전한 상보물이 되는 것을 요구하지 않는다. 주형과 완전하게 매치되어야 하는 프라이머의 부위는 3‘-말단이며, 이는 상기 말단이 DNA 중합효소에 의해 연장되는 부위이기 때문이며, 이에 정확한 타겟 서열에 대한 어닐링 특이성을 담보하는데 상기 말단이 가장 중요하다. 프라이머의 5’-말단은 타겟 서열에 대한 어닐링의 특이성을 결정하는데 덜 주용하며, 주형에 대하여 비상보적인 추가서열, 예컨대, 제한효소 위치와 프로모터 서열을 운반하도록 변형될 수 있다.

분자진단검사 또는 핵산진단검사는 체외진단검사 시장 중 가장 빠른 속도로 성장하는 분야로 세계시장에서 약 20%의 연평균 성장률을 보이고 있다. 분자진단검사는 2003년 30조원 가량의 체외진단검사 시장 중에서 8%의 점유율을 보이고 있지만, 2008년에는 13% 이상을 차지하고 매출 규모는 5조원 이상, 연평균 성장률은 19% 정도가 될 것으로 전망된다. 분자진단검사법은 질병을 일으키는 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등을 PCR로 검사하는 것으로서, 특정 병원균 유전자 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드(프라이머, 프로브)를 이용하여 병원균의 감염 여부를 확인한다. PCR을 이용한 병원균 감염여부 진단법은 주형이 되는 유전자에 특이적인 프라이머만을 이용하여 상기 유전자만을 특이적으로 검출함으로써 양성 및 음성을 판정하기 위한 적용법에 이용되고 있으며, ELISA (enzyme-linked immuno- sorbent assay)를 이용한 항원항체 검출법에 비해 높은 민감도와 경제성을 확보할 수 있다는 장점이 있다.

멀티플렉스(multiplex) PCR은 PCR의 다른 변형 형태로서, 동일한 반응물에서 하나 이상의 프라이머쌍을 이용하여 하나 이상의 타겟 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 1988년에 최초로 소개된 이후(Chamberlain et al., Deletion Screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA Amplificationm Nucleic Acids Res., 16, 11141-11156, 1988), 이 방법은 유전자 결실의 분석(Anonymous, Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction, A multicenter study. JAMA 267, 2609-2615, 1992; Henegariu, et al., Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis, Andrologia, 26, 97-106, 1994), 변이 및 유전자 다형성 분석(Shuber et al., Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis, Hum. Mol. Geenet., 2, 153-158, 1993; Mutirangura et al., Mutiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy, Hum . Mol . Genet ., 2, 143-151, 1993), 정량분석(Zimmermann et al., Quantitative multiplex competitive PCR of HIV-1 DNA in a single reaction tube, BioTechniques 21, 480-484, 1996) 및 RNA 검출(Zou et al., Identification of new influenza B virus variants by multiplex reverse transcription-PCR and the heteroduplex mobility assay, J. Clin . Microbiol ., 36, 1544-1548, 1998)을 포함하는 DNA 분석의 다양한 분야에 성공적으로 이용되고 있다. 감염 질환의 분야에서, 이 기술은 바이러스, 박테리아, 균류 및/또는 기생충의 동정을 하는 데 가치 있는 방법으로 평가되고 있다.

그러나, 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나온다. 이러한 오류의 결과로서, 반응실패에 의한 '위음' 결과 그리고, 가짜 생성물의 증폭과 같은 '위양' 결과를 포함하며, 상기 위양 결과는 진실된 인지서열과 관련되어 있지만, 그와는 명백히 다른 서열에 프라이머가 어닐링하기 때문에 발생된다. 멀티플렉스 PCR에서 프라이머는 그의 혼성화 카이네틱스(kinetics)가 동일한 멀티플렉스 반응물에 이용되는 다른 프라이머의 혼성화 카이네틱스와 유사하도록 디자인되어야 한다. 어닐링 온도 및 프라이머의 농도는 어느 정도 계산될 수 있지만, 일반적으로 조건들은 각각의 멀티플렉스 반응에 대하여 경험적으로 결정되어야 한다. 프라이머쌍이 증가될수록 비특이 프라이밍 가능성이 증가되기 때문에, 각각의 프라이머쌍을 추가할 때마다 조건들을 변형시켜야 한다. 더욱이, 반응물에 대한 경쟁(예컨대, 프라이머의 고갈)으로부터 초래되는 인위적 요소는 멀티플렉스 PCR에서 더욱 증가되며, 동일하지 않게 증폭된 산물의 수율의 차이는 사이클이 진행될수록 더욱 커지기 때문이다. 따라서, 멀티플렉스 PCR의 반응 조건을 최적화하는 것은 인력과 시간이 많이 소요되는 작업이다. 서로 다른 멀티플렉스 PCR은 독특한 반응조건들을 갖기 때문에, 새로운 진단시험 방법의 개발은 비용을 많이 요구한다.

단일염기변이(single nucleotide polymorphism, 이하 "SNP"이라 함)는 인종, 연령 또는 성별간 염색체가 갖고 있는 염기서열중 개인편차를 나타내는 염기변이 중에서 한 염기쌍이 차이가 나는 경우를 말하며, DNA 염기서열 다형성 중에서 가장 많이 존재한다. 사람의 유전자는 대략 1,000개당 1개 변이가 나타나는데, 동일한 질병이라고 해도 개인 편차가 있는 것은 모두 SNP의 차이 때문인 것으로 생각된다. 현재까지 개발된 SNP 분석방법에는 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Allele-specific PCR (AS-PCR), GC-tail 프라이머를 이용한 Tm-shift 지노타이핑(genotyping), DASH (Dynamic allele-specific hybridization), Taqman (5'-exonuclease assay), Molecular Beacons, OLA (Oligonucleotide ligase assay), 피로시퀀싱(Pyrosequencing), 단일 염기 연장(single base extension), Fluorescence Polarization 및 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) 등이 있으며, 이들 분석법은 각각의 주형에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드나 형광이 표지된 프로브 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일염기변이에 대한 비교분석을 한다.

한편, 검출하기 원하는 유전자가 그 서열내에 돌연변이 위치를 포함하는 다수의 다형성 유전자 형태로 존재하는 경우, 정확한 유전자의 증폭을 위해서는 해당 돌연변이 위치에 상보적인 서열을 다형성의 종류대로 프라이머로서 제작한 후 실험을 수행하여야 한다. 이를 위해서는 특정한 유전자에 대한 다형성 서열 모두를 알고 있어야만 하므로, 서열이 밝혀지지 않은 다형성 유전자가 존재할 경우에는 원하 는 유전자 모두를 검출하지 못하게 되는 문제점이 있다. 따라서, 제한된 돌연변이 또는 다형성이 존재하는 특정한 염기서열들에 있어서, 이들 돌연변이 부위를 한 쌍의 프라이머를 이용하여 공통적으로 증폭할 수 있는 간편한 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 PCR 방법상의 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로서, 증폭하고자 하는 유전자의 서로 다른 다형성 부위를 어베이직 부분으로 치환시킨 PCR 증폭용 프라이머 및 상기 프라이머를 이용하여 염기서열 내에 돌연변이 또는 다형성 부위를 갖는 서로 다른 주형의 핵산을 공통적으로 증폭할 수 있는 PCR 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 PCR 증폭용 프라이머를 제공한다.

본 명세서에 있어서, "어베이직 부분"은 특정한 염기 코딩 정보를 갖고 있지 않은 뉴클레오시드를 말하는 것으로서, 코딩 정보가 없기 때문에 대응하는 주형 DNA의 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 중 어느 것이어도 상관이 없다. 상기 어베이직 부분은 본 발명의 프라이머 내에서 유전자의 돌연변이 부위 및/또는 다형성 부위에 해당하는 곳에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 어베이직 부분으로는 디스페이서(dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1',2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl) -(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 메톡시디스페이서(1'-OMe-dSpacer, 5'-O- dimethoxytrityl-1'-methoxy-2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 피씨스페이서 포스포아미다이트(PC Spacer Phosphoamidite, [4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2- nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite), 알스페이서 씨이 포스포아미다이트(rSpacer CE Phosphoamidite,5'-O-Dimethoxytrityl-1'-Deoxyribose-2'-O-Triisopropylsilyloxymethyl-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 씨12 씨이 포스포아미다이트(Spacer C12 CE Phosphoamidite, 12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 18(Spaer Phosphoamidite 18, 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 9(Spacer Phosphoamidite 9,9-O-Dimethoxytrityl-triethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 씨3(Spacer Phosphoamidite C3,3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diiso-propyl)]-phosphoramidite) 등으로 시작되어 합성된 어베이직 부분을 포함한 PCR 증폭용 프라이머이다. 그러나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이는 약간의 구조 변화로 다른 포스포아미다이트를 이용하더라도 합성되어 이용되는 유전자(프라이머)내의 어베이직 부분이 같은 구조라면, 본 발명이 어베이직 부분을 포함한 증폭용 프라이머이므로 당연히 본 발명의 범주에 속한다.

상기와 같이 프라이머 서열 내에 어베이직 부분을 포함함으로써 동일한 유전자 내에 서로 다른 다형성 부위를 갖는 주형들을 하나의 프라이머 쌍으로 모두 증폭할 수 있게 된다. 프라이머 내의 어베이직 부분의 수는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 3' 말단, 내재(internal) 서열 및 5' 말단을 통틀어 1 내지 10개 범위인 것이 바람직하며, 1 내지 3개 범위인 것이 더욱 바람직하다. 어베이직 부분의 수가 10개를 초과하게 되면 프라이머의 Tm 값이 현저하게 낮아지게 되어 주형 DNA 염기서열에 어닐링이 잘 되지 않아 PCR 반응이 되지 않는 큰 문제점이 발생할 수 있다. 이로 인하여, 돌연변이 부위를 갖는 서로 다른 주형을 공통적으로 증폭한다는 본 발명의 목적을 달성할 수 없게 된다.

또한, 본 발명은 반응용 완충용액, 4종의 dNTP, DNA 중합효소, 프로브, 및 상기 PCR 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물을 제공한다.

상기 반응용 완충용액으로는 Tris-HCl, KCl, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, MgCl₂ 등의 성분을 포함하는 통상의 PCR 증폭용 완충용액을 적절히 변형하여 사용할 수 있다. 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 의미하며, 사용할 수 있는 DNA 중합효소 또한 특정한 효소로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Taq DNA 중합효소, Klen Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 또한, 상기 PCR 증폭용 프라이머는 20uL PCR 반응액 기준으로 1pmole 내지 50pmole 범위의 농도로 사용할 수 있으며, 적절한 프라이머 농도는 당업자가 용이하게 결정할 수 있음이 자명하다.

본 발명의 PCR 증폭용 조성물은 실험상의 편의, PCR 반응산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소와 dNTP의 안정화 및 반응성 향상을 도모하기 위하여 염료 및/또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 염료로는 브로모페놀 블루(Bromophenol blue), 크실렌 시아놀(Xylene cyanole), 브로모크레졸 레 드(Bromocresol red) 또는 크레졸 레드(Cresol red) 중 하나 이상을 사용할 수 있고, 안정화제로는 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000 또는 다가 알콜(Polyol) 중 하나 이상을 사용할 수 있지만, 염료 및 안정화제가 반드시 이들 화합물에 한정되는 것은 아니다. 조성물 내의 염료의 함량은 최종 조성물에 대해 0.0001~0.01 중량% 범위이며, 0.001~0.005 중량%인 것이 바람직하고, 0.001~0.003 중량%인 것이 보다 바람직하다. 또한, 조성물 내의 안정화제는 최종 조성물내의 농도가 2~1,000 mM 범위이며, 100~500 mM 범위인 것이 바람직하고, 100~300 mM 범위인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 상기 PCR 증폭용 프라이머를 이용한 PCR 증폭 방법을 제공한다.

상기 방법은 서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 상기 PCR 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물에 주형 DNA를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 대해 PCR 증폭을 수행하는 단계를 포함한다.

본 발명의 PCR 증폭 방법은, 바람직하게는 염기서열 내에 돌연변이 부위 및/또는 다형성 부위를 가진 서로 다른 핵산 주형을 공통적으로 증폭하기 위한 목적으로 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, PCR 증폭에 사용되는 프라이머쌍은 양쪽 프라이머 모두를 본 발명의 어베이직 부분을 포함하는 프라이머로 사용해도 되고, 어느 하나만을 본 발명의 어베이직 부분을 포함하는 프라이머를 사용하고 다른 하나는 어베이직 부분을 포함하지 않는 정상 프라이머를 사용해도 무방하다.

상기 PCR 증폭은 변성, 어닐링 및 연장 단계를 반복함으로써 수행되며, 이러한 PCR 증폭의 원리는 당업자에게 있어서 자명하다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 온도는 각각 85 내지 95℃에서 1 내지 60초, 40 내지 70℃에서 1 내지 60초 및 50 내지 75℃에서 1 내지 60초간 수행하는 것이 바람직하며, 온도 범위 및 시간은 반응 조건에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 프라이머 내부에 어베이직 부분이 1개 치환되는 경우에는 멜팅 온도(이하, "Tm"이라 함)가 약 8℃ 낮아지고, 3' 말단에 어베이직 부분이 1개 치환되는 경우에는 Tm이 약 1.5℃ 낮아진다. 한편, 어베이직 부분에 의해 낮아진 Tm을 보상하기 위해 프라이머의 양 말단에 주형에 대해 상보적인 염기를 추가하여 PCR의 반응성을 조절할 수 있다. 예컨대, 3' 말단에 상보적인 염기가 추가되는 경우에는 2염기 추가시마다 Tm이 약 0.5℃ 상승한다. 또한, 프라이머 내에 어베이직 부분이 1개, 2개, 3개 치환되고 동시에 5' 말단에 상보적 5염기가 추가된 경우에는 각각 약 4℃, 약 10℃ 및 약 18℃ 정도 Tm이 낮아진다. 이러한 Tm의 온도 변화는 사용하는 DNA 중합효소의 종류, 프라이머의 길이, 프라이머내 염기의 종류, 반응 조건 등에 따라 다소 변화될 수 있다. 상기와 같은 Tm 변화 정도를 토대로 그 내부에 돌연변이 부위를 포함하는 프라이머를 디자인할 때 온도 동등성을 부여하는 프라이머 제작 조건을 확립할 수 있게 되고, 어베이직 부분을 도입하고 적절하게 프라이머의 길이를 길게 함으로써 PCR 반응의 특이성을 제어할 수 있으며, 따라서 염기서열 내에 돌연변이 부위를 가진 서로 다른 주형을 한 쌍의 프라이머 만으로 공통적으로 증폭할 수 있게 된다.

본 발명의 한 실시예에 따르면, 인간 게놈 DNA를 주형으로 하고 어베이직 부분으로 치환된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소별로 PCR 증폭한 결과, Taq DNA 중합효소의 경우에는 1염기 치환의 경우에서만 약 13℃의 Tm 감소가 관찰되었고, Pfu DNA 중합효소의 경우에는 1염기 치환의 경우에서만 약 17℃의 Tm 감소가 관찰되었으며, Klen Taq DNA 중합효소의 경우에는 1염기 치환에서 약 7℃의 Tm 감소가 관찰되었으나, PCR 반응에는 문제가 없음을 확인하였다. 따라서, 어베이직 부분을 포함하는 프라이머는 다양한 종류의 DNA 중합효소에 적용이 가능함을 알 수 있다. 또한, 각 DNA 중합효소에 따른 적정 및 최적의 어베이직 프라이머 조건을 설정할 수 있으며, 이들 선정조건들을 토대로 DNA 중합효소별로 돌연변이를 포함하는 프라이머 디자인시에 온도 동등성을 부여하는 프라이머 제작조건을 확립할 수 있게 된다.

본 발명의 다른 실시예(실시예 4)에 따르면, 1염기 치환의 경우, 프라이머의 3' 말단에 1염기를 어베이직 부분으로 치환하면 대조군 프라이머 쌍에 비해 Tm이 약 1.5℃ 감소하고, 내재 염기서열에 1염기를 치환하면 약 8℃ 감소한다. 또한, 내재 1염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 5염기를 추가하면 대조군 프라이머 쌍에 비해 Tm이 약 4℃의 감소하고, 내재 2염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 5염기를 추가하면 약 10℃ 감소하며, 내재 3염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 5염기를 추가하면 약 18℃ 감소한다. 내재 1염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 1염기를 추가하면 약 5℃ 감소하고, 내재 1염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 3염기를 추가하면 약 4.5 ℃ 감소하며, 내재 1염기를 치환하고 3' 말단에 주형에 대해 상보적인 5염기를 추가하면 약 4℃ 감소한다. 상기 결과를 요약하면 표 1과 같다.

실시예 4의 시료번호	프라이머의 변형			ΔTm (대조군 대비 값)
	어베이직 부분으로 치환된 염기의 갯수		상보적 염기 추가 수
	내재	3' 말단	3' 말단
시료 2	-	1	-	-1.5℃
시료 3	1	-	-	-8℃
시료 4	2	-	5	-10℃
시료 5	3	-	5	-18℃
시료 6	1	-	1	-5℃
시료 7	1	-	3	-4.5℃
시료 8	1	-	5	-4℃

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 양 말단에 1염기를 치환하는 경우에 비해 내재 1염기를 치환할 경우 약 6.5℃의 Tm 값이 감소된다. 내재 1염기 치환, 2염기 치환 및 3염기 치환시에 각각 3' 말단에 상보적 염기를 5개 추가한 경우에는 내재에 치환되는 염기수가 증가할수록 약 6℃ 내지 8℃ Tm 값이 감소하였으며, 내재 1염기 치환에 대해 3' 말단에 각각 1염기 추가, 3염기 추가 및 5염기 추가와 같이 3' 말단에 2염기씩 추가됨에 따라 Tm 값이 약 0.5℃씩 증가된다.

상기 결과를 이용함으로써 프라이머 위치에 대한 프라이머 디자인시에 온도 동등성을 부여하는 프라이머 제작조건을 확립할 수 있고, 어베이직 부분을 도입함으로써 발생할 수 있는 Tm 값의 현저한 차이를 최소화한 염기서열을 제작할 수 있게 되며, 이로 인한 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있게 된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 서열 내에 어베이직 부분을 포함하는 본 발명의 PCR 증폭용 프라이머는 프라이머 염기서열 내에 어베이직 부분을 포함시킴으로써 염기서열내에 돌연변이 부위를 갖는 서로 다른 주형을 한쌍의 프라이머를 이용하여 공통적으로 증폭할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 어베이직 부분을 포함하는 p55 / p53 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 유효성 검증

Taq DNA 중합효소(바이오니아사, 이하 "Taq"이라 약칭함) 및 Klen Taq . DNA 중합효소(바이오니아사, 이하 "Klen Taq"이라 약칭함)를 이용하여 p55/p53 프라이머 쌍을 기준으로 제작된 어베이직 프라이머에 의한 핵산증폭 반응성 및 특이성을 확인하였다. 이를 위하여, 주형 DNA로는 인간 게놈 DNA를 사용하였고, 프라이머 쌍으로는 하기와 같은 3종의 프라이머쌍을 사용하였다: 대조군 프라이머 쌍으로는 증폭 크기가 211 bp인 p55 프라이머(염기서열: 5'-CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3', 서열번호 1) 및 p53 프라이머(염기서열: 5'-GCC CCA GCT CAC CAT CGC TA-3', 서열번호 2)를 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다. 첫 번째 시료군 프라이머 쌍으로는 p55 프라이머의 5' 말단으로부터 10번째 염기서열인 "C" 대신에 "N" (디스페이서, Glen Research사, Cat. No. 10-1914-xx)으로 치환한 No2-1F(서열번호 3)와 p53 프라이머의 5' 말단으로부터 9번째 염기서열인 "T" 대신에 "N" (디 스페이서)으로 치환한 No2-1R(서열번호 4)을 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다. 두 번째 시료군 프라이머 쌍으로는 p55 프라이머의 5' 말단으로부터 10번째와 11번째 염기서열인 CA 대신에 "NN" (디스페이서)으로 치환한 No2-2F(서열번호 5)와 p53 프라이머의 5' 말단으로부터 9번째와 10번째 염기서열인 TC 대신에 "NN"(디스페이서)으로 치환한 No2-2R(서열번호 6)을 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다.

PCR 반응을 위한 효소로는 20 ㎕ 반응당 1U(U, unit)의 Taq DNA 중합효소 또는 20 ㎕ 반응당 0.4U(U, unit)의 Klen Taq DNA 중합효소(바이오니아사, 이하 "Klen Taq"이라 약칭함)를 사용하였다. 이외의 반응 첨가물로는 dNTP 혼합물(2.5 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 혼합물)을 20 ㎕ 반응당 2 ㎕ 넣어 주었고, Taq과 Klen Taq 효소에 대한 10x 반응버퍼로 100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0를 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어주었다.

PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. Taq의 경우에는 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 점진적으로 45℃에서 59℃ 조건에서 50초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 50초 동안 신장 단계를 1반응 주기로 하여 총 38회 반응 주기로 수행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. 또한, Klen Taq의 경우는 37℃에서 5분간 비특이 반응을 유발하고 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 점진적으로 45℃에서 59℃ 조건에서 50초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 50초 동안 신장 단계를 1반응 주기로 하여 총 38회 반응 주기로 수행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 증폭 결과는 2.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼(Trizma base, Borice Acid 및 0.5M EDTA, pH 8.0)를 이용한 전기영동으로 확인하였다.

도 1은 Taq에 대한 대조군 프라이머 쌍과 첫 번째 시료군 프라이머 쌍 및 두 번째 시료군 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과이다. 레인 1에서 레인 10, 레인 11에서 레인 20 및 레인 21에서 레인 30은 각각 대조군 프라이머 쌍, 첫 번째 시료군 프라이머 쌍 및 두 번째 시료군 프라이머 쌍을 이용한 경우를 나타낸 것으로, 어닐링 온도가 순차적으로 각각 45.1℃, 45.3℃, 46.3℃, 47.7℃, 49.4℃, 51.4℃, 53.3℃, 55.3℃, 57.6℃ 및 59.0℃일 때의 반응 결과이며, M은 100~2,000 bp의 범위를 확인할 수 있는 DNA 크기 마커(바이오니아사)이다. 상기 DNA 크기 마커는 총 13개의 DNA 이중 나선의 DNA 조각을 포함하고 있으며, 세부적으로는 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1,200 bp, 1,600 bp 및 2,000 bp 크기의 DNA 이중 나선 조각을 포함하고 있다. 대조군의 경우 두가지 밴드가 강하게 나타나는데 상단의 밴드가 목적 밴드를 나타내며, 하단의 밴드는 프라이머 다이머 밴드의 결과를 나타내며, 비특이 반응물은 목적 밴드의 위쪽에서 보여지는 끌리면서 확인되는 밴드를 나타낸다.

도 1의 결과로부터, 첫 번째 시료군 프라이머 쌍과 두 번째 프라이머 쌍 조건에서 비특이 반응과 프라이머 다이머 양상이 감소되었으며, 특히 첫 번째 프라이 머 쌍의 경우에 두 번째 프라이머 쌍보다 비특이 반응과 프라이머 다이머 양상이 보다 감소됨을 확인하였다. 또한, 높은 PCR 반응산물을 확인하였다.

도 2는 Klen Taq에 대한 대조군 프라이머 쌍과 첫 번째 시료군 프라이머 쌍 및 두 번째 시료군 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과이다. 레인 1 내지 레인 30 및 M에 대한 설명은 상기 실시예 1에서와 동일하다. 도 2의 결과로부터, 첫 번째 시료군 프라이머 쌍과 두 번째 시료군 프라이머 쌍 조건에서 비특이 반응과 프라이머 다이머 양상이 감소됨을 확인하였다.

상기 결과로부터, 첫 번째 시료군 프라이머인 내재 1염기 치환의 경우, Taq 효소와 Klen Taq 효소에서 비특이 반응이 감소함을 확인하였으며, 두 번째 시료군 프라이머인 내재 2염기 치환의 경우에도 Taq 효소와 Klen Taq 효소에서 비특이 반응이 감소한 것을 확인하였다. 즉, 어베이직 부분을 도입함으로써 비특이 반응이 증가하는 것이 아니라 오히려 감소하는 것을 알 수 있으므로 주형에 상보적이 아닌 어베이직 부분을 도입한 본 발명의 프라이머는 프라이머로서의 반응 특이성을 유지하고 있음을 검증하였다. 시료군 프라이머 염기서열상에서 특정 염기를 어베이직 부분(디스페이서)으로 치환한 조건에서는 적용된 모든 DNA 중합효소에 있어서 PCR 반응을 위한 어닐링 온도가 다소 낮아짐을 확인하였다.

실시예 2. 어베이직 부분을 포함하는 p63 / p55 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 유효성 검증

Taq 및 Pfu DNA 중합효소(바이오니아사, 이하 "Pfu"라 약칭함)를 이용하여 p63/p55 프라이머 쌍을 기준으로 제작된 어베이직 프라이머에 대한 핵산증폭 반응 성 및 특이성을 확인하였다. 이를 위하여, 주형 DNA로는 인간 게놈 DNA를 사용하였고, 프라이머 쌍으로는 하기와 같은 3종의 프라이머 쌍을 사용하였다: 대조군 프라이머 쌍으로는 증폭크기가 447 bp인 p55 프라이머(염기서열: 5'-CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3', 서열번호 1)와 p63 프라이머(염기서열: 5'-GGC CAC TGA CAA CCA CCC TTA CC-3', 서열번호 7)를 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다. 첫 번째 시료군 프라이머 쌍으로는 상기 No2-1F와 p63 프라이머의 5' 말단으로부터 10번째 염기서열인 "C" 대신에 "N" (디스페이서)으로 치환한 No3-1R(서열번호 8)을 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다. 두 번째 시료군 프라이머 쌍으로는 상기 No2-2F와 p63 프라이머의 5' 말단으로부터 10번째와 11번째 염기서열인 "CA" 대신에 "NN"(디스페이서)로 치환한 No3-2R(서열번호 9)을 20 ㎕ 반응당 각각 15 pmole씩 사용하였다.

PCR 반응을 위한 효소로는 20 ㎕ 반응당 1U의 Taq 또는 Pfu를 사용하였다. 이 외의 반응 첨가물로는 dNTP 혼합물(2.5 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 혼합물)을 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어 주었고, Taq 효소에 대한 10x 반응버퍼로 100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0를 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어 주었으며, Pfu 효소에 대한 10x 반응버퍼로는 200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, 1 ㎎/㎖ 아세틸화된 BSA, pH 8.8을 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어 주었다.

PCR 반응을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 37℃에서 5분 동안 인위적 비특 이 반응을 유도하고 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 점진적으로 45℃에서 59℃ 조건에서 50초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 50초 동안 신장 단계를 1반응 주기로 하여 총 38회 반응 주기로 수행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 증폭 결과는 2.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼를 이용한 전기영동으로 확인하였다.

도 3은 Taq에 대한 대조군 프라이머 쌍과 첫 번째 시료군 프라이머 쌍 및 두 번째 시료군 프라이머 쌍에 대한 PCR 반응물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과이다. 레인 1 내지 레인 30 및 M에 대한 설명은 상기 실시예 1에서와 동일하다. 도 3의 결과로부터, 첫 번째 시료군 프라이머 쌍과 두 번째 시료군 프라이머 쌍 조건에서 비특이 반응과 프라이머 다이머 양상이 감소되었으며, 특히 첫 번째 프라이머 쌍의 경우에 보다 양호한 결과를 확인하였다.

도 4는 Pfu에 대한 대조군 프라이머 쌍과 첫 번째 시료군 프라이머 쌍 및 두 번째 시료군 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과이다. 레인 1 내지 레인 30 및 M에 대한 설명은 상기 실시예 1에서와 동일하다. 도 4의 결과로부터, 첫 번째 시료군 프라이머 쌍과 두 번째 시료군 프라이머 쌍 조건에서 비특이 반응과 프라이머 다이머 양상이 감소되었으며, 특히 두 번째 프라이머 쌍에서 보다 양호한 결과를 확인하였다.

상기 결과로부터, Taq와 Pfu를 이용한 경우 모두에서 첫 번째 프라이머 쌍과 두 번째 프라이머 쌍의 반응성이 증가되고, 비특이 반응은 감소되었다. 이로부터, 어베이직 프라이머에서도 PCR 반응성과 특이성에서 그 유효성이 있음을 확인하였으며, 특정 염기를 어베이직 부분(디스페이서)으로 치환할 경우 적용된 모든 DNA 중합효소에 있어서 PCR　반응을 위한 어닐링 온도가 다소 낮아짐을 확인하였다.

실시예 3. 어베이직 프라이머 제작 조건에 대한 DNA 중합효소의 유효성 검증

대조군 프라이머 쌍을 기준으로 3' 말단에 1염기 치환(시료 2), 내재 염기서열에 1염기 치환(시료 3), 내재 염기서열에 2염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가(시료 4), 내재 염기서열에 3염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가(시료 5), 내재 염기서열에 1염기 치환과 3' 말단에 상보적인 1염기 추가(시료 6), 내재 염기서열에 1염기 치환과 3' 말단에 상보적인 3염기 추가(시료 7) 및 내재 염기서열에 1염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가(시료 8)의 7가지 경우로 어베이직 프라이머를 제작하였다.

주형 DNA로는 인간 게놈 DNA를 사용하였고, 프라이머 쌍은 20 ㎕ 반응당 12 pmole~40 pmole을 사용하였다. 먼저, 시료 1은 대조군 프라이머로서 증폭 크기가 127 bp인 F_AP_CONT 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GG-3', 서열번호 10)와 R_AP_CONT 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTC CTG CTT GC-3', 서열번호 11) 쌍을 사용하였고, 시료 2는 상기 대조군 프라이머에 3' 말단 1염기가 치환된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_3-1N 프라이머(염기서열:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3', 서열번호 12)와 R_AP_CONT_3-1N 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTC CTG CTT GN-3', 서열번호 13) 쌍을 사용하였으며, 시료 3은 대조군 프라이머에 내재 염기서열 1염기가 치환된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-1N 프라이머 (염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GG-3', 서열번호 14)와 R_AP_CONT_I-1N 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GC-3', 서열번호 15) 쌍을 사용하였고, 시료 4는 대조군 프라이머에 내재 염기서열 2염기가 치환되고 3' 말단에 상보적인 5염기가 추가된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-2N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TNT GCN TGT CCT GGG AGA G-3', 서열번호 16)와 R_AP_CONT_I-2N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT NTT GTN CTG CTT GCT TAC C-3', 서열번호 17) 쌍을 사용하였고, 시료 5는 대조군 프라이머에 내재 염기서열 3염기가 치환되고 3' 말단 5염기가 추가된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-3N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TNT GCN TGT NCT GGG AGA G-3', 서열번호 18)와 R_AP_CONT_I-3N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT NTT GTN CTG NTT GCT TAC C-3', 서열번호 19) 쌍을 사용하였으며, 시료 6은 대조군 프라이머에 내재 염기서열 1염기가 치환되고 3' 말단 1염기가 추가된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-1N_3+1M 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG-3', 서열번호 20)와 R_AP_CONT_1N_3+1M 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT-3', 서열번호 21) 쌍을 사용하였고, 시료 7은 대조군 프라이머에 내재 염기서열 1염기가 치환되고 3' 말단 3염기가 추가된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-1N_3+3M 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AG-3', 서열번호 22)와 R_AP_CONT_I-1N_3+3M 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT TA-3', 서열번호 23) 쌍을 사용하였으며, 시료 8은 대조군 프라이머에 내재 염기서열 1염기가 치환되고 3' 말단 5염기가 추가된 프라이머 쌍으로서 F_AP_CONT_I-1N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3', 서열번호 24)와 R_AP_CONT_I-1N_3+5M 프라이머(염기서열: 5'-CCG CTT CTT GTN CTG CTT GCT TAC C-3', 서열번호 25) 쌍을 사용하였다.

PCR 반응을 위한 효소로는 20 ㎕ 반응당 0.4 U(U, unit)의 Klen Taq을 사용하였다. 이외의 반응 첨가물로는 dNTP 혼합물(2.5 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 혼합물)을 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어 주었고, Klen Taq 효소에 대한 10x 반응버퍼로 100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0를 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어주었다.

PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 점진적으로 55℃에서 70℃ 조건 또는 46℃에서 61℃ 조건에서 50초 동안 어닐링단계 및 72℃에서 50초 동안 신장 단계를 1반응주기로 하여 총 40회 반응주기를 진행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 반응증폭 결과는 2.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼를 이용한 전기영동으로 확인하였다.

도 5 및 도 6은 Klen Taq에 대한 상기 8종의 프라이머 쌍에 대한 PCR 반응물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과로서, M에 대한 설명은 상기 실시예 1에서와 동일하다.

도 5에서 레인 1에서 레인 8은 시료 1 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 59.4℃, 61.4℃, 63.3℃, 65.3℃, 67.6℃, 69℃, 69.7℃ 및 70.2℃일 때의 반응 결과이고, 레인 9에서 레인 16은 시료 2 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 55.5℃, 56.3℃, 57.1℃, 59.4℃, 61.4℃, 63.3℃, 65.3℃ 및 67.6℃일 때의 반응 결과이며, 레인 17에서 레인 24는 시료 3 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 46.1℃, 46.5℃, 47.3℃, 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃ 및 56.3℃일 때의 반응 결과이고, 레인 25에서 레인 32는 시료 4 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃, 56.3℃, 58.6℃, 60℃ 및 60.7℃일 때의 반응결과이며, M은 100 bp DNA 크기 마커이다.

또한, 도 6에서 레인 1에서 레인 8은 시료 5 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 46.1℃, 46.5℃, 47.3℃, 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃ 및 56.3℃일 때의 반응 결과이고, 레인 9에서 레인 16은 시료 6 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 46.1℃, 46.5℃, 47.3℃, 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃ 및 56.3℃일 때의 반응 결과이며, 레인 17에서 레인 24는 시료 7 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 46.1℃, 46.5℃, 47.3℃, 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃ 및 56.3℃일 때의 반응 결과이고, 레인 25에서 레인 32는 시료 8 프라이머 쌍에 대하여 어닐링 온도가 순차적으로 48.7℃, 50.4℃, 52.4℃, 54.3℃, 56.3℃, 58.6℃, 60℃ 및 60.7℃일 때의 반응 결과이다.

도 5 및 도 6의 결과로부터, 시료 1 프라이머 쌍은 ~63.3℃까지 PCR 증폭산물을 확인하였고, 시료 2 프라이머 쌍은 61.4℃~63.3℃ 조건에서만 PCR 증폭산물을 확인하였으며, 시료 3 프라이머 쌍, 시료 5 프라이머 쌍 및 시료 6 프라이머 쌍은 PCR 반응물을 확인할 수 없었고, 시료 4 프라이머 쌍은 ~52.4℃까지 PCR 증폭산물을 확인하였으며, 시료 7 프라이머 쌍은 ~47.3℃까지 PCR 증폭산물을 확인하였고, 시료 8 프라이머 쌍은 ~52.4℃까지 PCR 증폭산물을 확인하였다.

상기 결과로부터, 대조군 프라이머 쌍에 대해 3' 말단의 1염기 치환(시료 2) 및 내재 염기서열 2염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가(시료 4)에서도 PCR 반응이 가능하며, 이때 대조군 프라이머 쌍에 비해 각각 약 11℃ 내지는 약 10℃의 반응온도가 감소됨을 확인하였다. 또한, 대조군 프라이머 쌍에 대해 내재 염기서열 1염기 치환과 3' 말단에 상보적인 3염기 추가(시료 7) 및 내재 염기서열 1염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가(시료 8)에서도 PCR 반응이 가능하며, 이 경우에는 대조군 프라이머 쌍에 비해 각각 약 16℃ 및 약11℃의 반응온도가 감소됨을 확인하였다.

실시예 4. 어퓨린 프라이머 제작조건에 대한 디소시에이션 단계를 통한 멜팅 커브 검증실험

실시예 3에서 확인된 총 8종의 어퓨린 프라이머 쌍에 대하여 멜팅 커브(melting curve) 방법을 이용하여 각각에 대한 Tm 값을 측정하였다. 반응당 20 ㎕ 반응액 기준으로 실시예 3에서의 시료 1의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GG-3', 서열번호 10) 0.3 nmole과 시료 2의 포워드 프라이머(염기서열:5'-CGT GTT TGT GCC TGT CCT GN-3', 서열번호 12) 0.5 nmole과 시료 3의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GG-3', 서열번호 14) 1.0 nmole과 시료 4의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3', 서열번호 16) 0.5 nmole과 시료 5의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TNT GCN TGT NCT GGG AGA G-3', 서열번호 18) 1.0 nmole과 시료 6의 포워드 프라이 머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG-3', 서열번호 20) 1.0 nmole과 시료 7의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AG-3', 서열번호 22) 1.0 nmole 및 시료 8의 포워드 프라이머(염기서열: 5'-CGT GTT TGT GCN TGT CCT GGG AGA G-3', 서열번호 24) 0.5 nmole 각각에 대하여 공통적인 상보적 리버스 프라이머(염기서열: 5'-G GTA AGC AAG CAG GAC AAG AAG CGG-3', 서열번호 26) 0.3 nmole을 사용하였다. 이외의 반응첨가물로는 10x 반응버퍼로 100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 50 mM MgCl₂, pH 9.0를 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를, 10x SYBR Green 2 ㎕를 넣어주었다. 상기 SYBR Green은 DNA 이중나선 가닥의 마이너 그루브(minor groove) 영역에 끼어드는 형광염료로서, 온도가 낮으면 강하게 이중나선 가닥을 형성하기 때문에 형광 염료가 많이 끼어들게 되어 형광값이 높아지게 되고, 온도가 높으면 이중나선 가닥이 풀리게 되어 단일가닥으로 되므로 형광 염료가 끼어들지 못하게 되어 형광값을 검출할 수 없게 된다. 실시간 유전자 증폭장치(엑시사이클러(ExcyclerTM), 바이오니아사)를 이용하여 멜팅 커브를 작성하였으며, 이에 대한 반응 조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계 진행 후 20℃에서 5분 동안 유지하였고, 30℃에서 97℃까지 1초씩 증가할 때마다 각 온도당 10초 머문후 형광값을 측정하였다.

도 7은 대조군 프라이머 쌍(시료 1)에 대하여 어퓨린 부분의 치환 위치에 따른 멜팅 커브 결과를 보여주는 그래프로서, 선 1은 대조군인 시료 1 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이고, 선 2는 시료 2 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커 브 값이며, 선 3은 시료 3 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이다. 도 8은 대조군 프라이머 쌍에 대하여 내재염기 서열 치환 개수에 따른 멜팅 커브 결과를 보여주는 그래프로서, 선 1은 대조군인 시료 1 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이고, 선 2는 시료 8 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이며, 선 3은 시료 4 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이고, 선 4는 시료 5 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이다. 도 9는 대조군 프라이머 쌍에 대하여 내재염기 1염기 치환과 3' 말단에 추가된 상보적인 염기 개수에 따른 멜팅 커브 결과를 보여주는 그래프로서, 선 1은 대조군인 시료 1 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이고, 선 2는 시료 8 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이며, 선 3은 시료 7 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이고, 선 4는 시료 6 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이며, 선 5는 시료 3 프라이머 쌍에 대해 작성된 멜팅 커브 값이다.

상기 결과로부터, 대조군 프라이머 쌍에 대해 3' 말단에 어베이직으로 1염기가 치환되는 경우에는 약 1.5℃ 정도 Tm이 감소하고, 내재 염기서열에 1염기가 치환되는 경우에는 약 8℃ 정도 Tm이 감소하였다(도 7 참조). 또한, 3' 말단에 5개의 상보적인 염기가 추가된 경우에 있어서, 내재 염기서열이 1개, 2개, 3개 치환되는 경우에는 대조군 프라이머 쌍에 비해 Tm이 각각 약 4℃, 약 10℃ 및 약 18℃ 감소함을 확인하였다(도 8 참조). 아울러, 내재 염기서열이 1염기 치환된 경우에 있어서, 3' 말단에 상보적인 염기가 추가되는 경우에는 2염기 추가시 마다 Tm이 0.5℃씩 증가하는 것을 확인하였다(도 9 참조).

실시예 5. B형 간염 바이러스( HBV )의 S 유전자 부위에서 다형성을 보이는 내재 1염기서열을 치환한 어베이직 프라이머를 통한 PCR 반응 유효성 검증 실험

B형 간염 바이러스의 S 유전자 부위의 다형성을 보이는 내재 1 염기서열을 치환한 어베이직 프라이머 및 그에 맞는 프로브를 사용하여 본 발명의 어베이직 프라이머를 통한 PCR 반응 유효성을 검증하고자 하였다. 디스페이서의 종류에 따른 영향을 검토하기 위하여 2종류의 디스페이서, 즉 디스페이서와 메톡시디스페이서를 이용하여 동일한 서열의 어베이직 프라이머를 제작하였다(도 10 참조). 제작된 프라이머 및 프로브의 염기서열은 하기 표 2와 같으며, 프로브는 5' 말단에 FAM 형광 염료와 3' 말단에 TAMRA 형광 염료를 표지한 후 사용하였다.

내재 1 염기치환 프라이머	정방향 프라이머	역방향 프라이머	프로브
디스페이서 프라이머	서열번호 27	서열번호 30	서열번호 33
메톡시디스페이서 프라이머	서열번호 28	서열번호 31	서열번호 33
정상염기를 갖는 프라이머	서열번호 29	서열번호 32	서열번호 33

상기 어베이직 프라이머와 프로브을 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7500 FAST 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈, USA)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 반응당 20 ㎕ 반응액 기준으로 정방향 프라이머(농도 10 pmol) 1 ㎕, 역방향 프라이머(농도 10 pmol) 1 ㎕, 프로브(농도 5 pmol) 1 ㎕, 1 U의 Taq 효소를 사용하였으며, 이외의 반응 첨가물로는 dNTP 혼합물(2.5 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 혼합물)을 20 ㎕ 반응당 1 ㎕를 넣어 주었고, Taq 효소에 대한 10x 반응버퍼로 200 mM Tris-HCl, 350 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0를 20 ㎕ 반응당 2 ㎕를 넣어주었다. 아래 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. ① 95℃에서 12분, ② 95℃에서 20초, ③ 57℃에서 40초, ④ ②~③ 단계에서 40회 반복. 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다.

도 11a에 나타난 바와 같이, 내재 1염기를 디스페이서로 치환한 프라이머와 메톡시디스페이서로 치환한 프라이머로 사용한 경우 두 조건에서 동일한 Ct 값을 보였다. 또한, 도 11b에 나타난 바와 같이, 내재 1염기를 메톡시디스페이서로 치환한 프라이머와 동일한 위치의 내재 1염기를 메톡시디스페이서로 치환하지 않고 정상 염기의 프라이머를 사용한 경우 동일한 Ct 값을 보였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 어베이직 프라이머를 이용하여 B형 간염 바이러스를 검출해 낼 수 있음을 확인하였다.

도 1은 어베이직 부분을 포함하는 p55/p53 프라이머 쌍을 이용하여 Taq. DNA 중합효소로 핵산증폭방법(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 함)으로 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 2는 어베이직 부분을 포함하는 p55/p53 프라이머 쌍을 이용하여 Klen Taq. DNA 중합효소로 PCR 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 3은 어베이직 부분을 포함하는 p63/p55 프라이머 쌍을 이용하여 Taq. DNA 중합효소로 PCR 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 4는 어베이직 부분을 포함하는 p63/p55 프라이머 쌍을 이용하여 Pfu DNA 중합효소로 PCR 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 5는 대조군 프라이머 쌍 및 상기 대조군 프라이머 쌍에 대해 어베이직 부분이 3' 말단에 1염기 치환된 프라이머 쌍, 내재 염기서열에 1염기 치환된 프라이머 쌍, 내재 염기서열에 2염기 치환과 3' 말단에 상보적인 5염기 추가된 프라이머 쌍을 각각 이용하여 Klen Taq . DNA 중합효소로 PCR 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 6은 대조군 프라이머 쌍에 대해 어베이직 부분이 내재 염기서열에 3염기 치환되고 3' 말단에 상보적인 5염기 추가된 프라이머 쌍, 내재 염기서열에 1염기 치환되고 3' 말단에 상보적인 1염기 추가된 프라이머 쌍, 내재 염기서열에 1염기 치환되고 3' 말단에 상보적인 3염기 추가된 프라이머 쌍 및 내재 염기서열에 1염기 치환되고 3' 말단에 상보적인 5염기 추가된 프라이머 쌍을 각각 이용하여 Klen Taq . DNA 중합효소로 PCR 증폭한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 7은 어베이직 부분의 치환위치가 다른 프라이머 쌍을 실시간 유전자 증폭장치를 이용하여 작성한 멜팅 커브 결과 그래프이고, 도 8은 어베이직 부분의 내재 염기서열 치환 개수가 다른 프라이머 쌍을 실시간 유전자 증폭장치를 이용하여 작성한 멜팅 커브 결과 그래프이며, 도 9는 어베이직 부분이 내재 1염기 치환되고 3' 말단에 추가되는 염기 개수가 다른 프라이머 쌍을 실시간 유전자 증폭장치를 이용하여 작성한 멜팅 커브 결과 그래프이다. 도 7 내지 도 9에서, 자주색 선은 각 도면의 x축인 온도 증가 변화에 따른 y축인 형광값의 감소 변화를 나타내는 선이다.

도 10은 B형 간염 바이러스의 S 유전자의 다형성 부위에 대한 프라이머에 대해 어베이직 부분이 내재 1염기 치환된 위치를 보여주는 도면이다.

도 11a 및 도 11b는 내재 1염기가 디스페이서로 치환된 프라이머(dS), 메톡시디스페이서로 치환된 프라이머(Me-dS), 또는 정상염기로 된 프라이머(Reg) 및 프로브로 실시간 PCR을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 각각의 선들은 농도가 다른 세 종류의 스탠다스 샘플에 대해서 PCR 증폭 싸이클(cycle) 수의 증가에 따른 형광값의 변화를 나타내는 선이다.

<110> BIONEER Corporation <120> PRIMER FOR PCR AMPLIFICATION COMPRISING ABASIC PARTS WITHIN THE PRIMER SEQUENCE <130> 2006-dpa-0139 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p55 primer <400> 1 ctcttcctgc agtactcccc tgc 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 primer <400> 2 gccccagctc accatcgcta 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No2-1F primer <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 3 ctcttcctgn agtactcccc tgc 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No2-1R primer <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 4 gccccagcnc accatcgcta 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No2-2F primer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 5 ctcttcctgn ngtactcccc tgc 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No2-2R primer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 6 gccccagcnn accatcgcta 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p63 primer <400> 7 ggccactgac aaccaccctt acc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No3-1R primer <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 8 ggccactgan aaccaccctt acc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> No3-2R primer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 9 ggccactgan naccaccctt acc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT primer <400> 10 cgtgtttgtg cctgtcctgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT primer <400> 11 ccgcttcttg tcctgcttgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_3-1N primer <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 12 cgtgtttgtg cctgtcctgn 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_3-1N primer <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 13 ccgcttcttg tcctgcttgn 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-1N primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 14 cgtgtttgtg cntgtcctgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_I-1N primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 15 ccgcttcttg tnctgcttgc 20 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-2N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 16 cgtgtttntg cntgtcctgg gagag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_I-2N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 17 ccgcttnttg tnctgcttgc ttacc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-3N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 18 cgtgtttntg cntgtnctgg gagag 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_I-3N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 19 ccgcttnttg tnctgnttgc ttacc 25 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-1N_3+1M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 20 cgtgtttgtg cntgtcctgg g 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_1N_3+1M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 21 ccgcttcttg tnctgcttgc t 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-1N_3+3M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 22 cgtgtttgtg cntgtcctgg gag 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_I-1N_3+3M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 23 ccgcttcttg tnctgcttgc tta 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_AP_CONT_I-1N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 24 cgtgtttgtg cntgtcctgg gagag 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_AP_CONT_I-1N_3+5M primer <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 25 ccgcttcttg tnctgcttgc ttacc 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common reverse primer <400> 26 ggtaagcaag caggacaaga agcgg 25 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer having dSpacer <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 27 tcgtgttaca ngcggggttt ttc 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer having 1'-OMe-dSpacer <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> "n" is abasic part (1'-OMe-dSpacer) <400> 28 tcgtgttaca ngcggggttt ttc 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer having normal bases <400> 29 tcgtgttaca ggcggggttt ttc 23 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer having dSpacer <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> "n" is abasic part (dSpacer) <400> 30 tagaaaantg agagaagtcc accacgag 28 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer having 1'-OMe-dSpacer <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> "n" is abasic part (1'-OMe-dSpacer) <400> 31 tagaaaantg agagaagtcc accacgag 28 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer having normal bases <400> 32 tagaaaattg agagaagtcc accacgag 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence <400> 33 tgttgacaag aatcctcaca ataccgca 28

Claims

어베이직 부분을 포함하는 PCR 증폭용 프라이머.
청구항 1에 있어서,

상기 어베이직 부분은 디스페이서(dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1',2'- dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 메톡시디스페이서(1'-OMe-dSpacer, 5'-O-dimethoxytrityl-1'-methoxy-2'-dideoxyribose- 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 피씨스페이서 포스포아미다이트(PC Spacer Phosphoamidite, [4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite), 알스페이서 씨이 포스포아미다이트(rSpacer CE Phosphoamidite, 5'-O-Dimethoxytrityl-1'-Deoxyribose-2'-O-Triisopropylsilyloxymethyl-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 씨12 씨이 포스포아미다이트(Spacer C12 CE Phosphoamidite, 12-(4,4'-Dimethoxy trityloxy)-dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 18(Spaer Phosphoamidite 18, 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 9(Spacer Phosphoamidite 9, 9-O-Dimethoxytrityl-triethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) 및 스페이서 포스포아미다이트 씨3(Spacer Phosphoamidite C3, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2 -cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
청구항 1에 있어서,

프라이머 내의 어베이직 부분의 수는 1 내지 10개 범위인 것을 특징으로 하는 프라이머.
청구항 3에 있어서,

프라이머 내의 어베이직 부분의 수는 1 내지 3개 범위인 것을 특징으로 하는 프라이머.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,

어베이직 부분에 의한 Tm 감소를 보상하기 위하여 상기 프라이머의 말단에 주형에 상보적인 염기를 추가한 것을 특징으로 하는 프라이머.
청구항 1에 있어서,

상기 어베이직 부분은 혼성화될 핵산 주형의 돌연변이 염기 부위에 대응되는 부분인 것을 특징으로 하는 프라이머.
청구항 1에 있어서,

상기 어베이직 부분은 혼성화될 핵산 주형의 다형성 염기 부위에 대응되는 부분인 것을 특징으로 하는 프라이머.
반응용 완충용액, 4종의 dNTP, DNA 중합효소 및 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 PCR 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물.
청구항 8에 있어서,

상기 조성물은 염료 및 안정화제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 9에 있어서,

상기 염료는 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 9에 있어서,

상기 안정화제는 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000 및 다가 알콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 PCR 증폭용 프라이머를 포함 하는 PCR 증폭용 조성물에 핵산 주형을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 대해 PCR 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 증폭 방법.
청구항 12에 있어서,

염기서열 내에 돌연변이 부위를 가진 서로 다른 핵산 주형을 공통적으로 증폭하기 위한 방법인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
청구항 12에 있어서,

염기서열 내에 다형성 부위를 가진 서로 다른 핵산 주형을 공통적으로 증폭하기 위한 방법인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.
청구항 12에 있어서,

PCR 증폭용 프라이머쌍 중 하나는 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 PCR 증폭용 프라이머이고, 다른 하나는 어베이직 부분을 포함하지 않는 정상 프라이머인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 방법.