JP2005535336A

JP2005535336A - ３’−５’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼを用いる配列決定方法

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Publication number: JP2005535336A
Application number: JP2004528265A
Authority: JP
Inventors: リ，カイ
Original assignee: Zhang xu
Current assignee: Zhang xu
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2005-11-24
Also published as: CN1414110A; EP1536019A1; EP1536019A4; US20060172307A1; WO2004016806A1; AU2003257798A1

Abstract

【課題】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることよる遺伝子配列決定方法を提供する。
【解決手段】前記方法は、（１）３’末端が修飾された特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセットを調製する工程と、（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び修飾されたプライマーからなる分子「オン／オフ」スイッチにより選択的プライマー伸長を行う工程と、（３）プライマー伸長反応の産物を可視化し遺伝子配列を決定工程とを含む。本発明で用いられる分子「オン／オフ」スイッチのフィデリティーは、校正活性を有さないポリメラーゼを用いる従来のプライマー伸長反応より高い。本方法は、既知でない配列を直接配列決定するのに用いることもでき、配列決定は既知の配列セグメントに依存しない。本方法において得られる各シグナルは、１個以上のヌクレオチドの配列情報を含む。本方法を用いて、単一ヌクレオチド多形分析及び遺伝子配列分析を大量処理スクリーニングで行うことができる。

Description

本発明は、配列決定方法に関し、具体的には、３’−５’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼの破壊能力及び化学修飾から受継したアレル特異的プライマーのヌクレアーゼ抵抗特性の組み合わせを用いることによる迅速な配列決定方法を提供する。

現在、配列分析では、プライマー伸長のために、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼを用いている。また、検出された各シグナルは、１個のヌクレオチドの情報しか提供しない。最も重大な問題は、通常の配列決定が単一ヌクレオチド多形の高処理量分析に適合していないことである。現在の配列決定方法はゲノムの配列分析での使用には成功しているが、研究で用いられているアフィメトリクス社のオリゴマイクロアレイなどの、費用効率が良く、かつ、迅速な配列決定方法が、生物工学発展における研究の最新の話題である。

典型的な配列分析は、近代の配列分析における主要な方法であるｄｄＮＴＰによる末端終結に基づくサンガーの酵素法である。この方法は、非常に信頼性がある。しかしながら、この方法由来のシグナルは、１個のヌクレオチドの情報しか提供せず、これによってその効率が制限される。この古典的な配列方法の根本的な問題のひとつは、該方法ではプライマー設計のために短い既知配列が必要なことである。既知配列に依存することによって、未知配列決定の速度は非常に遅くなる。さらに、古典的な配列決定方法は、配列決定される試料の最初の増幅が必要となるので効率が高くない。明らかに、本方法は時間がかかり、間接的配列分析であり、デノボ配列決定に用いることができない。

オリゴヌクレオチドマイクロアレイも配列決定に用いることができる。しかしながら、実験室研究で現在用いられているハイブリダイゼーションの不均一性によってその精度が決まる。この方法の実用上の適用は、そのうち評価されるであろう。

さらに、古典的な末端終結を含むすべての配列決定方法、及び最近開発された一塩基伸長はすべて、ターミネーターである標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いる。ｄｄＮＴＰは、さらに脱水されて、連続するプライマー伸長と結合を形成することができず、ゆえにそれが組み込まれることによってプライマー伸長の終結が引き起こされる。したがって、この種の化学反応は、反応のサイクル又は産物＝２ｎ（ここで、ｎは用いられるサイクルである）と一次の関係を有する。対照的に、ターミネーター（ｄｄＮＴＰ）がないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、反応サイクル（産物＝ｎ²）と指数的な関係を有するので、より効率的である。

本発明の目的は、従来の技術の欠点を解決し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた新規な配列決定方法を提供することである。本発明によれば、単一ヌクレオチド多形及び未知配列の双方を決定することができる（ＳＮＰアッセイ及びデノボ配列決定）。

本発明の技術的特徴は、
１）３’末端が特異的に修飾されたアレル特異的プライマー、
２）３’から５’へとプライマーを破壊する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び特異的な化学修飾から受継したエキソヌクレアーゼ抵抗特性を有するプライマーとからなる新規な「オン／オフ」スイッチを用いて、マッチした及びミスマッチした単位複製配列を識別するために、選択的プライマー伸長を行う工程と、
３）プライマー伸長産物を可視化して配列決定する工程
を含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する高フィデリティーポリメラーゼを使用する配列決定方法である。

本方法で用いるプライマーは、３’末端が異なる一連のプライマー（プライマーセット）を含む。

プライマーセットは、化学修飾されたプライマーのサブセット、及び化学修飾されていないプライマーのサブセットを含む。プライマーが化学修飾による標識を有する場合、単位複製配列がマッチする場合にはそれらの産物も標識される。標識されていないプライマーは、通常可視化されるか、または、標識されたｄＮＴＰを付加することにより標識を付加する。

プライマーセットは、プライマーを３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性にする化学修飾が施されたプライマーのサブセットを含む。ゆえに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、ミスマッチしたプライマーを破壊することができなくなり、ミスマッチしたプライマーを校正できず、ゆえにプライマー伸長を続行することができない。

このように、分子「オン／オフ」スイッチによって、エキソヌクレアーゼに感受性であるプライマー中の標識を保持又は除去することができ、エキソヌクレアーゼ抵抗性プライマーのためにプライマー伸長をオフ又はオンにすることができる。

本発明は、以下の利点を有する：
１）本方法は、プライマー伸長を行うために、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び化学修飾されたプライマーセットからなる分子「オン／オフ」スイッチを用いる。そのフィデリティーは、高フィデリティー校正ポリメラーゼに基づいた通常のプライマー伸長より高い；
２）本方法は、デノボ配列決定に用いることができる；
３）本配列決定は、配列が分からなくても行うことができる；
４）本方法では、得られた各シグナルは１個以上のヌクレオチドを解読することができる；
５）本方法を用いて、高処理量スクリーニングでＳＮＰアッセイを行うことができる。

図を参照して、本発明の適用例を詳細に説明する。

図１中、１は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより仲介されるプライマー伸長を表し、２は、通常のプライマーを表し、４は、特異的に化学修飾されたプライマーを表し、６は、産物を得ることができないこと又は標識された産物を得ることができないことを表す。

図２中、１は、未知配列を有する標的を表し、２は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより仲介されるプライマー伸長を表す。

図３中、−はＥｃｏＲＩ消化がない産物を表し、＋はＥｃｏＲＩ消化後の産物を表す。

図５中、産物は産物を表し、バックグランドはバックグランドシグナルを表す。

図６中、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２は異なるアニーリング温度を表し、それぞれ４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、及び６６℃である。

図７中、Ｐは、マッチしたプライマーを表し、１、２、３、４、５、６は、３’末端から−１、−２、−３、−４、−５及び−６上流のミスマッチしたプライマーを表す。

図８及び９中、ＰＭはマッチングしたプライマーを表し、ＭＭはミスマッチしたプライマーを表す。

図１０中、１はポリメラーゼドメインを表し、２は３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを表し、３は産物を表し、４はミスマッチ校正プロセスを表し、５は「オン／オフ」スイッチの「オン」状態を表し、６はオン／オフスイッチの「オフ」状態を表し、Ｙはポリメラーゼによるマッチング試験に通った複製複合体を表し、Ｎは校正プロセスを引き起こすマッチング試験がうまくいかなかったことを表す。

本発明は、アレル特異的プライマーセットとアッセイされる鋳型との間の完全にマッチした又は完全にはマッチしていないマッチ状態に従って分析される鋳型の配列情報を決定するため、３’−５’エキソヌクレアーゼ機能を有するポリメラーゼと、プライマー伸長のために３’末端が修飾されたアレル特異的プライマーからなる新規な「オン／オフ」分子スイッチを用いる。プライマー伸長過程において、本発明の方法は、高フィデリティーポリメラーゼの校正活性から３’末端における及び３’末端の上流における配列情報を直接解読する。このようにして、１個以上のヌクレオチドが配列決定され、これにより既知配列のための単一ヌクレオチド(single nucleotide)アッセイ法及び未知配列のためのデノボ配列決定法が提供される。

開始過程後の最初の新たに組み込まれたヌクレオチドに関して、校正活性のないポリメラーゼは、２／１０００の変異率を有する。しかしながら、プライマー伸長において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた場合、この変異率は８０〜９０％減少し得る。この重要な相違は、植物、動物、及び細菌のＤＮＡ複製において既知である。

より重要なことが、校正活性を有するポリメラーゼ及び校正活性のないポリメラーゼを用いたプライマー伸長の間の開始過程で起こる。開始過程においては、プライマー配列が変化したか否かが決定される。校正活性のないポリメラーゼを用いたプライマー伸長では、プライマーが鋳型とマッチするか否かに関係なく、プライマーの配列は１００％変化しない。したがって、この種のプライマー伸長の産物は、必ずしも鋳型の配列情報を忠実に反映するとは限らない。対照的に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたプライマー伸長は、プライマーと鋳型とのマッチ状態によって異なり、鋳型とマッチする場合にはプライマー配列は変化せず、ミスマッチしたプライマーはエキソヌクレアーゼ消化され、伸長前にマッチしたプライマーに変化する。したがって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを十分に設計して用いる場合には配列決定に用いることができる。

２つの異なる反応系と組み合わせた化学反応で重要なことは、異なる反応の反応条件に互換性がある必要があることである。本発明者らは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたプライマー伸長を研究し、高フィデリティーポリメラーゼが、４６〜６６℃の広範囲のアニーリング温度で、マッチした単位複製配列とミスマッチした単位複製配列を容易に識別できることを見出した。校正活性とｄＮＴＰの濃度は負の関係にあるので、１〜２倍のｄＮＴＰを用いた場合、完全にマッチした単位複製配列とミスマッチした単位複製配列の識別は、幾分、プライマー伸長の産物に基づく。ｄＮＴＰ濃度が通常の濃度の０．２〜０．８倍に低下した場合、相違が著しくなり、マッチした単位複製配列とミスマッチした単位複製配列の識別は、プライマー伸長産物の存在又は非存在により知ることができる。

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの適切な適用における他の重要な点は、鋳型配列の正確な認識を、高処理量スクリーニングアッセイのための検出可能なシグナルにいかにして転換するかである。本発明は、（１）校正ジェノタイピング後、２つのタイプのプライマー伸長産物を産生するためにエキソヌクレアーゼ感受性プライマーの３’末端を標識すること（マッチした単位複製配列由来の産物はプライマーから標識を受継し、標識はミスマッチした単位複製配列由来の産物の校正過程により消化される）；および、（２）化学修飾によりエキソヌクレアーゼ抵抗性プライマーを調製すること(該化学修飾により、エキソヌクレアーゼ消化が処理されないため、マッチした単位複製配列が伸長するが、ミスマッチしたプライマーは、重合ドメインからエキソヌクレアーゼ消化のためのエキソヌクレアーゼドメインに送られる)により上記目的を達成する。プライマーのエキソヌクレアーゼ抵抗特性は、校正過程を著しく遅延させるか阻害し、オフスイッチの効果をもたらし、プライマー伸長産物が得られない（図１を参照）。

広範な実験により、本発明者らは、用いたポリメラーゼのタイプ又はプライマーのエキソヌクレアーゼに対して感受性であるか抵抗性であるかには関わらず、マッチした単位複製配列が伸長されることを見出した。しかしながら、ミスマッチした単位複製配列では、伸長産物のタイプ及び量は、用いたポリメラーゼのフィデリティー、及びエキソヌクレアーゼに対するプライマーの抵抗性に依存する。

したがって、エキソヌクレアーゼ抵抗性プライマーが３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって伸長された場合に、早期終結が起こる。この早期終結はホスホロチオエート又はエキソヌクレアーゼ抵抗性をプライマーに与える他の修飾によって強められ、結果的に、プライマー伸長反応が完全に終結し、ＳＮＰアッセイに有用な「オフ」スイッチが形成される。互いに約３ｎｍ離れたポリメラーゼドメイン及びエキソヌクレアーゼドメインの２つの酵素ドメインによって、アレル特異的プライマーは最初の「オン／オフ」スイッチスクリーニングを受ける。マッチしたプライマーは、重合ドメイン内で、あるいは、図１０に図示した「オン」スイッチにより直接重合される。しかし、ミスマッチしたプライマーは重合ドメインからエキソヌクレアーゼドメインに移動し、そこで、化学修飾から受継したプライマーのエキソヌクレアーゼ抵抗特性により、長期又は終結することのない消化過程が起こる。そのため、プライマー伸長反応の間に重合ドメインが空となり、図１０に図示したように、ＤＮＡ重合が「オフ」状態に変わる。マッチしたプライマーが伸長され、ミスマッチしたプライマーが伸長されないというこの種の最終結果は択一的事象（yes or no phenomenon）であり、単一ヌクレオチド多形の要求を十分に満たす。

さらに、検出可能な標識を有するエキソヌクレアーゼ感受性プライマーは、２つのタイプの産物、すなわち、一方のタイプは検出可能なシグナルを有し、他方は有さない産物を産生し、シグナル検出の観点から、実質的に「オン／オフ」スイッチとして機能する。

配列分析に好適な本発明の新規な分子オン／オフスイッチは、ＳＮＰ研究にかなりの理論的及び実用的な影響を与える。

本発明の方法における検出可能なシグナルは、用いる標識方法によって変わる。アレル特異的プライマーの３つの末端を標識する方法、ｄＮＴＰを標識する方法、対合プライマーを標識する方法の異なる３つの方法がある。

標識されたｄＮＴＰを用いる場合、標識されたｄＮＴＰと標識されていないｄＮＴＰの割合は１：１０〜１：１００の間で変動する。

対合プライマーを標識供給源として用いる場合、標識を５’末端で行うか、３’末端以外の任意のヌクレオチドで行う。

プライマーがエキソヌクレアーゼ抵抗性である場合、可視化することによってプライマー伸長産物の存在又は非存在が検出される。産物の存在は、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン（Syber green）、又は他の染色方法などを用いた通常の方法により可視化される。

１）３’末端修飾を有するプライマーセットの調製
プライマーは、分析されるＤＮＡ配列を標的とする。その設計には、いくつかの状況が含まれる。

（１）ＳＮＰアッセイ用プライマー
一般に、各アレルは、２個のアレル特異的フォワードプライマー及び１個の対合用リバースプライマーを必要とする。プライマーセットの合計数は、実施上の必要性に応じて決まる。２つのアレル特異的フォワードプライマーはそれぞれ、鋳型と完全にマッチしているかミスマッチしており、プライマーのサブセットを形成する。標識方法は、可視化条件に応じて決まる。プライマーは、市販のＤＮＡシンセサイザーにより合成される。

例えば、以下のプライマーが設計される：
フォワードプライマー：５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’
５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ３’
リバースプライマー：５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’
Ｘは鋳型とのマッチを表し、Ｙは鋳型とのミスマッチを表し、Ｘ、Ｙは、修飾後のヌクレオチドを表す。

（２）未知配列を決定するためのプライマー設計：デノボ配列決定のための３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた数学モデル
プライマーのサイズは、５’変性配列及び３’配列特異的プライマーを有する４ⁿ個のプライマーからなる遺伝子特異的なヌクレオチドの数に応じて決まる。例えば、以下のプライマーセットは、３’に２個の配列特異的なヌクレオチドを有し、従って、４²個のプライマー又は１６個のプライマーを含有する（Ｘは、変性ヌクレオチドを表す）。
Ｘｘｘｘｘｘｘｘａａ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘａｇ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘａｃ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘａｔ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｔａ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｔｇ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｔｃ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｔｔ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｃａ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｃｇ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｃｃ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｃｔ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｇａ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｇｇ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｇｃ
Ｘｘｘｘｘｘｘｘｇｔ

配列分析は、いくつかの同一のヌクレオチドを有する隣接プライマー間の整列（alignment）又は架橋に基づく（図２を参照）。

２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び化学修飾されたプライマーからなる分子オン／オフスイッチを用いたプライマー伸長の実施
この方法において、反応条件は通常のプライマー伸長とはそんなに異ならない。

３）プライマー伸長産物の可視化及び配列分析
可視化及び検出の前に、ＤＮＡ分子に結合した標識をＤＮＡ分子に結合していない標識から分離する。分離方法は、特定の要件に依存する。電気泳動を本発明で用いる場合、分離段階を省くことができる。バイオチップを本発明で用いる場合、過酷な条件下での洗浄によってＤＮＡ分子に結合していない標識が除去される。標識シグナルが、標識されたプライマーから得られ、バックグラウンドノイズが高すぎる場合、低濃度のエキソヌクレアーゼとともに２５〜３７℃で１５分間〜１時間インキュベートすることができる。ＤＮＡ分子の標識シグナルは、公知の方法によって可視化及び検出することができる。該公知の方法は、特に標識方法に依存する。酵素標識又はジゴキシン又はビオチンなどの他の化学的標識を用いる場合、特定の化学的可視化がシグナル検出前に行われる。

可視化及び検出段階において、標識方法（例えば、硫化）によって直接の走査検出ができない場合には、エチジウムブロマイド又はＧＹＢＲ染色方法を用いることができ、続いて電気泳動ゲル上で分析するか、あるいは質量分析を用いて分析することができる。標識が放射性又は直接蛍光性である場合、産物を直接走査して放射能強度又は蛍光強度を検出することができるか、あるいは、オートグラフ、続いて画像走査分析を行うことができるので、可視化工程を省くことができる。化学発光又は間接蛍光の場合は、予備ブロッキング、可視化反応、及び洗浄をシグナル検出前に行う。

検出されたシグナルは、３’末端のヌクレオチド配列情報を反映する。手動で又はコンピュータプログラミングにより、配列分析を行うことができる。単一アレルがホモ接合又はヘテロ接合であるかを決定するために、以下のプライマーにより遺伝子型を決定することができる。例えば、
フォワードプライマー：５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’
５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ３’
リバースプライマー：５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’
Ｘはマッチしたプライマー（野生型）を表し、Ｙはミスマッチしたプライマー（多型遺伝子型又は変異遺伝子型）を表し、Ｘ、Ｙは修飾されていないヌクレオチドを表し、Ｘ、Ｙはそれぞれ修飾されたヌクレオチドを表す。

５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’を野生型の鋳型とともにプライマー伸長に用いた場合、産物が得られるか、標識を有する産物が得られ、５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ３’をプライマー伸長に用いた場合、産物又は標識された産物は得られず、このアレルがＸホモ接合遺伝子型であることを示す。５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹ３’を野生型の鋳型とともにプライマー伸長に用いた場合、産物が得られるか、標識を有する産物が得られ、５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’をプライマー伸長に用いた場合、産物又は標識された産物は得られず、このアレルがＹホモ接合遺伝子型であることを示す。双方のプライマーが産物を生ずる場合、鋳型の遺伝子型はヘテロ接合である。

本発明は、新しい配列決定方法を提供する。その利点は直接的、敏感、簡単、迅速であることである。本方法は配列分析のために事前の増幅を必要とすることなく、したがって直接的配列決定方法である。さらに、本方法の高い信頼性及び感度は、迅速な配列分析を可能にする。

実施例１
プライマー伸長における、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤｅｅｐＶｅｎｔ＋ポリメラーゼ及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤｅｅｐＶｅｎｔ−ポリメラーゼの適用。マッチしたプライマー及びミスマッチしたプライマーの試験。
この実験により、配列分析における校正活性の重要性を説明する（図３及び４を参照）。
１）プライマー設計：
以下の配列を有するマウスゲノム由来の２１７ｂｐフラグメントを使用：
ｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｔｃｃａｔｔｔａｇａａｇｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｔｃｔｃｔｇａｇｇｃａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃｔｔａｃｃｇｃａｃａａｃｔａｇａｇａｃｔｇａｇａｃｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｔｔｇｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇａａａａｇｃａｃｔｃａｔｇａｃａｃａｃａｃｔｔａｇａａｔａａｔａｇｔｇｃａｔｃｔｇａｇｃｃａｇｇａｃｔｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇｔｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔｃ
この配列を標的とするフォワードプライマーセット及びリバースプライマーセットを設計。これらのプライマー由来の産物のサイズは２１７ｂｐである。産物は、ＥｃｏＲＩ部位も有する。
マッチしたフォワードプライマー：
ＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣ
ミスマッチしたフォワードプライマー：
ＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣ
リバースプライマー：
５’ｇａａａｃａｇｃｔｇａａｔｇｇａｃｃｃａａ３’
これらのプライマーは、米国のＭＷＧ社により合成されたものである。

２）プライマー伸長反応：
アレル特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ有するＤｅｅｐＶｅｎｔ＋及びＤｅｅｐＶｅｎｔ−を用いてプライマー伸長を行った。反応条件は、９５℃で５分間変性し、次いで９５℃で１０秒間変性、５６℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１秒間伸長するサイクルを３０回行った。

３）結果：
ＰＣＲの結果は、エチジウムブロマイドを含有する２．５％アガロースゲルを０．５ＸＴＢＥバター(butter)とともに用いた１０Ｖ／ｃｍ直流下での電気泳動に基づく。図３に示す通り、マッチしたプライマーは、ＥｃｏＲＩ酵素により消化可能な正確なサイズの産物を産生した。しかし、ミスマッチしたプライマーは、用いたポリメラーゼに応じて２つのタイプの産物を産生した。すなわち、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる産物はＥｃｏＲＩで消化可能であったが、ＤｅｅｐＶｅｎｔ−による産物はＥｃｏＲＩ抵抗性であった。これらの産物を図４に示したようにさらに配列分析したところ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ＋由来の産物は、５’ＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣ_.........ＴＴＧＧＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣ３'の配列、ＤｅｅｐＶｅｎｔ−由来の産物は、５’ＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣ_.........ＴＴＧＧＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣ３'の配列を有していた。

これらの結果は、３’−５’校正活性のないポリメラーゼは、プライマー配列を変化しない（ジェノタイプ試験におけるエラー及び偽陽性）が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、伸長前にマッチした単位複製配列を再構成するためにプライマーでのミスマッチしたヌクレオチドを校正することができ、プライマー配列が変化することを示している。この校正機能は、特定のアルゴリズムとともに正しく用いれば、分析される鋳型の配列の解読に用いることができる。

実施例２
同位体標識したマッチしたプライマー及びミスマッチしたプライマーとともに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたＳＮＰ検出。
１）プライマー設計：
以下の配列を有するマウスゲノム由来の２１７ｂｐフラグメントを使用：
ｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｔｃｃａｔｔｔａｇａａｇｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｔｃｔｃｔｇａｇｇｃａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃｔｔａｃｃｇｃａｃａａｃｔａｇａｇａｃｔｇａｇａｃｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｔｔｇｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇａａａａｇｃａｃｔｃａｔｇａｃａｃａｃａｃｔｔａｇａａｔａａｔａｇｔｇｃａｔｃｔｇａｇｃｃａｇｇａｃｔｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇｔｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔｃ
この配列を標的とするフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計する。これらのプライマー由来の産物のサイズは２１７ｂｐである。５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔ３’の配列を有する標識されていないプライマー及び５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔＴ３’の同一の配列を有する３’末端に３［Ｈ］標識したプライマーの２つのフォワードプライマーがあり、リバースプライマーは、５’ｇａａａｃａｇｃｔｇａａｔｇｇａｃｃｃａａ３’の配列で標識されていなかった。これらのプライマーは、米国のＭＷＧ社により合成されたものである。

２）プライマー伸長：
アレル特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ有するＤｅｅｐＶｅｎｔ＋及びＤｅｅｐＶｅｎｔ−を用いてプライマー伸長を行った。反応条件は、９５℃で５分間変性し、次いで９５℃で１０秒間変性、５８．９℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長するサイクルを２５回行った。

３）結果：
ＰＣＲの結果は、エチジウムブロマイドを含有する２．５％アガロースゲルを０．５ＸＴＢＥバターとともに用いた１０Ｖ／ｃｍ直流下での電気泳動に基づく。ＰＣＲ産物をゲルから切断し、同位体活性を液体シンチレーション計数器により計数した。図５に示す通り、単位複製配列がミスマッチしている場合、放射性は対照と同程度のであり、同位体標識されたプライマーから放射性はほとんど検出されず、標識された末端ヌクレオチドが３’−５’エキソヌクレアーゼ消化によって除去されたことを示している。しかしながら、マッチした単位複製配列からの放射性は１０１９ｃｐｍであり、対照よりも１０倍以上高かった。

この実験の結果は、マッチした単位複製配列由来の産物が検出可能な同位体シグナルを有していたことを示している。しかしながら、プライマー及び鋳型がマッチしていない場合、プライマーの３’末端における同位体標識は３’−５’エキソヌクレアーゼ消化により除去され、産物は高い放射性を示さなかった。３［Ｈ］標識に加え、ＤｅｅｐＶｅｎｔ＋ポリメラーゼはＲｏｘ標識などの蛍光標識されたプライマーをともにＳＮＰを非常に効率的に識別した。３’末端標識プライマーの研究により、本発明者らは、ＤｅｅｐＶｅｎｔ＋などの高フィデリティーポリメラーゼによるミスマッチ校正機構は、ＳＮＰアッセイで十分に用いることができることが分かった。

実施例３
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをホスホロチオエート修飾されたマッチプライマー及びミスマッチプライマーと共に用いた配列分析。
１）プライマー設計：
以下の配列を有するマウスゲノム由来の２１７ｂｐフラグメントを使用：
ｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｔｃｃａｔｔｔａｇａａｇｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｔｃｔｃｔｇａｇｇｃａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃｔｔａｃｃｇｃａｃａａｃｔａｇａｇａｃｔｇａｇａｃｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｔｔｇｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇａａａａｇｃａｃｔｃａｔｇａｃａｃａｃａｃｔｔａｇａａｔａａｔａｇｔｇｃａｔｃｔｇａｇｃｃａｇｇａｃｔｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇｔｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔ
この配列を標的とする７個のフォワードプライマー及びリバースプライマー（プライマーセット）を設計。フォワードプライマーは、完全にマッチングしたプライマーを１個及び一塩基ミスマッチしたアレル特異的プライマーを６個含み（フォワードプライマーサブセット）、これらのプライマー由来の産物は２１７ｂｐであった。

完全にマッチしたプライマーは、５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃ３’の配列を有する。以下のプライマー中の大文字は、３’末端の−１〜−６上流のミスマッチしたヌクレオチドである：
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔＧ３’
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔＡｃ３’
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａＡｔｃ３’
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａＴｔｔｃ３’
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇＴａｔｔｃ３’
５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａＣａａｔｔｃ３’
すべてのフォワードプライマーを３’末端でホスホロチオエートにより修飾した。リバースプライマーは、ホスホロチオエートによる修飾をせず、その配列は５’ｇａａａｃａｇｃｔｇａａｔｇｇａｃｃｃａａ３’である。これらのプライマーは、米国のＭＷＧ社により合成されたものである。

２）プライマー伸長：
アレル特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ有するＤｅｅｐＶｅｎｔ＋及びＤｅｅｐＶｅｎｔ−を用いてプライマー伸長を行った。反応条件は、９５℃で５分間変性し、次いで９５℃で４０秒間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長するサイクルを２５回行った。

３）結果：
ＰＣＲの結果は、エチジウムブロマイドを含有する２．５％アガロースゲルを０．５ＸＴＢＥバターとともに用いた１０Ｖ／ｃｍ直流下での電気泳動に基づく。図７に示される通り、用いたポリメラーゼのタイプに関係なく、マッチしたプライマーは伸長した。しかしながら、ホスホロチオエート修飾したミスマッチプライマーは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をを有するポリメラーゼによっては伸長しなかったが、３’−５’校正活性のないエキソポリメラーゼによって伸長した。これらの結果により、分析される鋳型からＧＡＡＴＴＣが解読された。

この実験の結果は、マッチした単位複製配列由来の産物は、ＤｅｅｐＶｅｎｔ−によって変化せず、３’末端ヌクレオチドは消化されずに産物中に保持されることを示している。したがって、３’末端のホスホロチオエート修飾は、ＤｅｅｐＶｅｎｔ−によって媒介されるＰＣＲ反応に影響を及ぼさなかった。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤｅｅｐＶｅｎｔ＋ポリメラーゼを用いた場合、ホスホロチオエート修飾された３’末端または３’末端近傍のミスマッチしたヌクレオチドは、該修飾によってプライマーにエキソヌクレアーゼ抵抗特性が付与されるので、速やかに消化されず、ＤＮＡ複製が早期終結し、「オフ」スイッチ効果を示した。したがって、ホスホロチオエート修飾されていないミスマップライマーは、３’−５’エキソヌクレアーゼ機能を有する高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼによって伸長しなかった。本方法は、このように配列分析において有用であり、検出可能な同位体シグナルを有していた。

実施例４
ホスホロチオエート修飾されたマッチプライマー及びミスマッチプライマーと共に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたＳＮＰ分析（図６を参照）
１）プライマー設計：
以下の配列を有するマウスゲノム由来の２１７ｂｐフラグメントを使用：
ｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｃａｇｃｃｔｔｃｃａｔｔｔａｇａａｇｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｔｃｔｃｔｇａｇｇｃａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃｔｔａｃｃｇｃａｃａａｃｔａｇａｇａｃｔｇａｇａｃｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｔｔｇｔｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇａａａａｇｃａｃｔｃａｔｇａｃａｃａｃａｃｔｔａｇａａｔａａｔａｇｔｇｃａｔｃｔｇａｇｃｃａｇｇａｃｔｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇｔｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔｃ
２個のフォワードプライマー及び１個のリバースプライマーを設計した。フォワードプライマーはアレル特異的であって、１個のマッチプライマーと１個のミスマッチプライマーを含んでいた。マッチングしたプライマーは５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔｃ３’の配列を有し、ミスマッチした３’プライマーは５’ａｔｃｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇａｇａａｔｔＧ３’の配列を有する。双方のフォワードプライマーをホスホロチオエート修飾した。リバースプライマーは修飾せず、その配列は５’ｇａａａｃａｇｃｔｇａａｔｇｇａｃｃｃａａ３’である。これらのプライマー由来の産物のサイズは２１７ｂｐである。プライマーは、米国のＭＷＧ社により合成されたものである。

３）結果：
ＰＣＲの結果は、エチジウムブロマイドを含有する２．５％アガロースゲルを０．５ＸＴＢＥバターとともに用いた１０Ｖ／ｃｍ直流下での電気泳動に基づく。図６に示す通り、１０℃以上異なるアニーリング温度での３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたプライマー伸長において、正確かつ信頼性があるプライマー伸長が観察された。ミスマッチプライマーは、高フィデリティーポリメラーゼにより伸長しなかった。しかしながら、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤｅｅｐＶｅｎｔ−ポリメラーゼでは、６２℃を超えるアニーリング温度で、ＳＮＰの識別のみが観察された。この実験は、本発明の方法により、多くのプライマーが必要とする同じか同様の条件又は複合条件下で配列情報を解読することができることを示す。

実施例５
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するｐｆｕポリメラーゼを、マッチ及びミスマッチホスホロチオエート修飾プライマーと共に用いた難聴（sensual deaf)ＧＪＢ３遺伝子中のＣ→Ｔ点変異の検出
１）プライマー設計：
ＧＪＢ３遺伝子の野生型Ｃアレル及び変異体を標的とする。フォワードプライマーは、５’ｃａａｃａｔｃｇｔｇｇａｃｔｇｃｔａｃａｔｔｇｃｃｃ３’である。リバースプライマーは、５’ｇｔｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｃｇ３’である。５’ｃａａｃａｔｃｇｔｇｇａｃｔｇｃｔａｃａｔｔｇｃｃｔ’のフォワードプライマー及び５’ｇｔｇａａｇａｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｃａ３’のリバースプライマーは、難聴(Deafness)変異体Ｔアレルを標的とした。フォワードプライマーはホスホロチオエート修飾されいる。プライマーは、Sangon社（中国、上海）により合成されたものである。

２）プライマー伸長：
プライマー対をｐｆｕ及びｔａｑを用いたＰＣＲで用いた。後者は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がない。プライマー伸長は、９５℃で５分間の変性、次いで９５℃で４０秒間変性、５６℃で４０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長するサイクルを３０回行う条件で行った。

３）結果：
ＰＣＲの結果は、エチジウムブロマイドを含有する２．５％アガロースゲルを０．５ＸＴＢＥバターとともに用いた１０Ｖ／ｃｍ直流下での電気泳動に基づく。図８に示す通り、３’−５’エキソヌクレアーゼ機能を有していないｔａｑを用いた場合には、野生型ホモ接合ＤＮＡを鋳型として適用すると、野生型アレル及び変異アレルを標的とする双方のプライマーを伸長した。唯一の相違は、ミスマッチプライマーは比較的少量の産物を産生したことである。図９に示す通り、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するｐｆｕポリメラーゼは一塩基ミスマッチを区別する能力が高い。鋳型と完全にマッチした野生型アレルを標的とするプライマーは、ｐｆｕにより伸長した。しかしながら、野生型ゲノムＤＮＡと一塩基ミスマッチした変異アレルを標的とするプライマーは、ｐｆｕにより伸長されず、産物は観察されなかった。

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するｐｆｕと共にホスホロチオエート修飾されたプライマーを用いたプライマー伸長は、一ヌクレオチドレベルでゲノムＤＮＡを速やかかつ正確に分析することができる。

図１は、本発明の基本原理を説明する図である。図２は、「オン／オフ」スイッチを用いた配列分析に用いた手順である。図３は、実施例１のゲル電気泳動図である。図４は、実施例１で用いた配列図である。図５は、実施例２で用いた液体シンチレーション計数を示す図である。図６は、実施例３の電気泳動図である。図７は、実施例４の電気泳動図である。図８は、実施例５の電気泳動図である。図９は、実施例５の電気泳動図である。図１０は、分子「オン／オフ」スイッチの作動を示す図である。

Claims

ａ）３’末端が特異的に修飾されたアレル特異的プライマーを調製する工程、
ｂ）３’から５’へとプライマーを分解する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び特異的な化学修飾から受継したエキソヌクレアーゼ抵抗特性を有するプライマーとからなる新規な「オン／オフ」スイッチを用いて、マッチした単位複製配列とミスマッチした単位複製配列を識別するために選択的プライマー伸長を行う工程と、
ｃ）プライマー伸長産物を可視化して配列決定する工程と
を含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する高フィデリティーポリメラーゼを利用した配列決定方法。
前記アレル特異的プライマーが３’末端において異なる請求項１に記載の方法。
前記プライマーセットは化学修飾されたプライマーと化学修飾されていないプライマーからなる請求項１に記載の方法。
前記化学修飾されたプライマーは３’−５’エキソヌクレアーゼ感受性であるが標識されているか、ヌクレアーゼ抵抗性である請求項３に記載の方法。
前記分子「オン／オフ」スイッチは、前記ミスマッチした単位複製配列のためのヌクレアーゼ感受性プライマーから標識を「オフ」（除去）することができ、かつ、前記マッチした単位複製配列の標識を「オン」にすることができる、あるいは、前記ミスマッチした単位複製配列をミスマッチした単位複製配列中のヌクレアーゼ抵抗性プライマーに対してオフにし、かつ、前記プライマー伸長を前記マッチした単位複製配列のための前記ヌクレアーゼ抵抗性プライマーに対してオンにする請求項１に記載の方法。
前記プライマー伸長産物の可視化はＤＮＡに対して通常用いられる方法で行われるか、あるいは、前記可視化は前記標識が前記産物中で保持されているか否かに特異的である請求項３に記載の方法。
前記プライマー伸長産物の可視化に、前記標識されたプライマーから受継した特有の標識を直接用いるか、または、標識されたｄＮＴＰなどからの他の標識を用いる請求項３に記載の方法。