JP5543065B2 - 核酸増幅のためのプライマー、プローブおよび方法 - Google Patents
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Description
(式中、Lはヌクレオチドの長さであり、[M]は1価陽イオンのモル濃度である。)
直鎖プローブ又はランダムコイルプローブの融解温度は、プライマーについてと同様に算定される。構造化したプローブ、例えばモレキュラービーコン(Molecular beacon)プローブは、経験的に決定され得る。
(後述の「図面の簡単な説明」の項を参照のこと。)
様々な図にある類似の記号は、同じような要素を示している。
本発明は、フルオロフォアに強く吸収される波長の光(可視光、又は不可視光)を当てることで直接励起されるのではなく、SYBR Green、又は好ましくはSYBR Gold等の近傍の蛍光性DNA色素を励起する波長の光を当てることにより間接的に励起される少なくとも一つのフルオロフォアで標識されたプライマーからの蛍光放出の検出を含む、例えばPCRアッセイのような核酸増幅アッセイを含む。加えて、本発明は、全ての及びいくつかの増幅試薬を含む完全キット及び部分キット、及び前記標識プライマーを含むオリゴヌクレオチドセット、そしてプライマーそれ自身を含む。
(式中、Ft=最高温度での蛍光、Fb=最低温度での蛍光、Fs=任意の所与の第三の温度での蛍光を表す。)
ヒトp53遺伝子中のSNP部位の同型接合体及び異型接合体遺伝子型に適用した該三温度法を実施例6に記載し、また図13で例証している。
インターカレート色素の性能と、インターカレートフルオロフォアを含むプライマーと組み合わせて用いる色素の性能とを比較するために伸長アッセイを行った。使用した色素は、SYBR Green Iを1:40,000で希釈したものである。
ミコバクテリアの16SリボソームRNA 遺伝子に相補的なコンセンサス配列を有するように標識プローブを設計した。二次構造は、70mMのナトリウム濃度、及び3mMのマグネシウム濃度で、Mfoldプログラム(Zucker, M、2003,「Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction」Nucleic Acids Res 31: 3406-3415)に従って予想された。本プローブの配列は、Cy5-AATACTGGATAGGACC ACG AGG(配列番号1)で、下線領域のハイブリダイゼーションによって形成される予想二次構造をもつ。本プローブの二次構造の予想されるTmは、37℃であった。本プローブは、SYBR Green I色素を包含する混合物中に、ターゲットなし、M.ゴルドナエ、又はM.アジアティカムを含んだサンプルでテストされた。Cy5蛍光と温度との結果を図3のパネルAに示している。線31(ターゲットなし)は、高いバックグラウンド蛍光を示しているが、線32(M.ゴルドナエ)及び線33(M.アジアティカム)は、バックグラウンドよりも高い識別可能なシグナルを示している。バックグラウンド蛍光を消すために、非蛍光性クエンチャー(Black Ho1eTM II quencher:BHQII)をプローブの3'末端ヌクレオチドに付加した。本改変プローブを同様にテストして、その結果を図3のパネルBに示している。見ての通り、バックグラウンド蛍光(線34:ターゲットなし)は著しく下がり、またM.ゴルドナエ(線35)及びM.アジアティカム(線36)由来のシグナルは、バックグラウンドよりも一層高くなった。
本例は、リアルタイムLATE-PCR増幅、及びSYBR色素からの放出によって間接的に励起されるCy5標識低温Tmミスマッチ寛容性直鎖状プローブを用いて、テイ−サックス病の原因であるヒトヘキソサミニダーゼA(Hex A)遺伝子のG269アレルに関する同型接合体サンプルと異型接合体サンプルの同定を例証している。プローブハイブリダイゼーションを、LATE-PCRの検出温度空隙内でそれぞれの増幅サイクル期間に二回モニターした。すなわち、まず本アッセイにおいてアレル識別性であるプローブが完全マッチするターゲットにのみ結合する温度である55℃で、そして、その後ミスマッチ寛容性であるプローブが増幅反応におけるターゲット配列のアレルの全てに結合する温度である40℃で行った。特異的アレルとミスマッチ寛容性プローブを用いた全アレルの検出は、レプリカサンプル間のアンプリコン収量における確率論的なチューブ間の変動の補正を可能にする。反応における全アレルに対する特異的アレルの比率(55℃でのCy5/40℃でのCy5)は、エンドポイント遺伝子型決定用のレプリカサンプルの標準化を可能にする。遺伝子型の情報は、比率値から導き出される。同型接合体サンプルの場合、アレル識別条件下で検出されるプローブシグナルはミスマッチ寛容条件下で検出されるプローブシグナルと同じである。前記プローブが両ケースでターゲット配列アレルに100%結合するからである。これに対して、異型接合体サンプルの場合、アレル識別条件下で検出されるプローブシグナルはミスマッチ寛容条件下で検出されるプローブシグナルの強さの半分程度である。これは、プローブがミスマッチ寛容条件下ではアレルの100%に結合するが、アレル識別条件下ではターゲット配列アレルの50%のみに結合するからである。このように、同型接合体サンプルは、異型接合体サンプルよりも高い(55℃でのCy5/40℃でのCy5)比を有する。遺伝子型タイプ分けの本方法は、単一アレルの検出にのみ依存している。
それぞれが同じフルオロフォアで標識されている複数のプローブを組み合わせて利用することで、単一の、より長いオリゴヌクレオチド(例えば、非対象PCR法、LATE-PCR法、又はローリングサークル増幅法の産物)に沿って、又は異なるオリゴヌクレオチドで異なる配列を検出し、また定量することができる。低温Tmプローブの使用によって、ミスマッチターゲットから生じるシグナルが大幅に減少または排除されることで前記ターゲットに対する特異性が増加する。この技術で応用可能な一つに、ヒトDNAの遺伝子型を決定し、遺伝病の原因となる既知のアレルを同定する方法がある。本例はプローブ設計と産物検出についての温度解析を説明している。
rs858521 SNPのQE LATE-PCR遺伝子型決定をCy5標識したミスマッチ寛容性プローブ1種を用いて未知DNAサンプル、同型接合体コントロールrs858521(CCアレル)及び異型接合体コントロール(CGアレル)で行った。増幅及び検出は、一般にベースライン補正された蛍光シグナルを発生する。ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア、フォスターシティー)を使用して行われた。しかし、比率を利用する本発明者らの解析では、蛍光シグナル比がベースライン補正された蛍光シグナル(図11)及び生の蛍光シグナル(図12)の両方から得られている。図11は、前記装置でベースライン補正された蛍光シグナルを利用した増幅反応のサイクル数の関数として、25℃でのプローブ蛍光に対する50℃でのプローブ蛍光の比を示している。図11で、丸印113は同型接合体コントロールのレプリカであり、丸印114は異型接合体コントロールのレプリカである。そして、丸印111及び112が前記未知のものである。図12は、生の蛍光シグナルを利用した同様の結果を示している。図12で、丸印116は同型接合体コントロールのレプリカであり、丸印117は異型接合体コントロールのレプリカである。そして、丸印115が前記未知のものである。標準化のためのベースライン補正された蛍光シグナルの利用により、サンプルの一つ、図11の丸印112に不明瞭な遺伝子型タイプ分けの結果が生じた。一方、標準化に生の蛍光シグナルを使用すると、全サンプルについて正確な遺伝子型タイプ分けができた。この結果は、ABI Prism 7700 Sequence Detectorのソフトウェアがシグナル標準化に影響を及ぼすアーチファクトを持ち込み得ること、そして好ましくは該ソフトウェアを使用すべきではないことを立証している。
rs858521遺伝子SNPプライマー、及び単一ミスマッチ寛容性のレゾンセンス(resonsense)プローブを含む反復LATE-PCR増幅反応を、rs858521遺伝子SNPの各遺伝子型に対する精製されたゲノムDNAを用いて行った(1800ゲノム相当、また同型接合性CC遺伝子型、異型接合性CG遺伝子型、及び同型接合性GG遺伝子型のそれぞれについて18反復反応)。増幅した産物は、図13のパネルAで示す融解曲線で、及びパネルBとパネルCで示すようにデータを標準化することで解析した。図13Aは、LATE-PCR増幅に続く融解曲線解析中に回収された生の蛍光シグナルのプロットを示している。使用したプローブは、高温ではアレル識別性であるが、温度が下がると段々とミスマッチ寛容性になるタイプである。レプリカサンプル間の産物収量における内因的な変動性によって、本プローブのアレル識別の温度枠内(40℃〜60℃、以前に合成オリゴヌクレオチドターゲットを用いて測定されたもの、データは示さず)で、生の蛍光シグナル(丸印113)による遺伝子型の識別が妨げられる。図13Bは、該サンプルに関して完全にミスマッチ寛容性の温度(25℃)で回収したシグナルに対する温度ごとに標準化されたそれぞれのサンプルからのシグナルを示している。図13Bで、前記同型接合性CCアレルの標準化シグナルは丸印132であり、前記異型接合性CGアレルの標準化シグナルは丸印133である。そして、前記同型接合性GGアレルの標準化シグナルは丸印134である。図で示すように、標準化によりシグナルの分散が減少し、アレル識別の枠内でそれぞれの遺伝子型の同定が可能となる。使用したResonSenceプローブのTmに一致する52℃で、最大の分離が見られた。シグナル分散は図13Aと比べて図13Bではかなり減少しているが、動力学プロットにおける広がりから判断すると、レプリカサンプル間でシグナル強度にまだ若干の変動が見られる。図13Cは、図13Bで見られたアレル識別枠内の、融解曲線が分岐し始める最大及び最低温度(それぞれ40℃と60℃)で回収された蛍光シグナルに対してそれぞれの温度での蛍光シグナルを標準化することが前記残ったシグナル分散を除去する最良の方法があることを示している。図13Cでは、同型接合性CCアレルの標準化シグナルは丸印135であり、異型接合性CGアレルの標準化シグナルは丸印136である。そして、同型接合性GGアレルの標準化シグナルは丸印137である。Fb及びFtをそれぞれアレル識別温度枠の底部と頂部に対する蛍光読み取り値とし、またFsを融解解析中に与えられるいずれかの温度の蛍光読み取り値とすれば、標準化蛍光比は式3のように計算される。
いずれのサンプル内でも40℃と60℃での蛍光シグナルに対する各温度での蛍光シグナルの同時標準化は、蛍光シグナル分散をさらに減少し、また各遺伝子型の反復融解曲線を非常にタイトにする結果となった(図13C参照)。単一温度で算出された蛍光比、すなわちアレル識別枠の最高及び最低温度(例えば、60℃と40℃)に対する蛍光シグナルを用いて標準化されたプローブのTm(52℃)が、99.7%以上の確からしさでそれぞれの遺伝型を一意的に決める(例えば、各遺伝子型の可能な全ての蛍光比率の99.7%を網羅する三標準偏差からなるエラーボックスが、お互い十分に分離される。データ示さず)。同様に、蛍光シグナルが、アレル識別の対応する最高及び最小温度(例えば71℃と45℃で)に対して標準化されたプローブのTm(57℃)で算出されたときに改善された結果がrs2270517SNPについて得られた。
反復LATE-PCR増幅を、1×PCRバッファ、3mM MgCl2、20ナノモル(nM) dNTP、25nM 制限プライマー、1000nM 過剰プライマー、1.25ユニット プラチナTaq DNAポリメラーゼ、及びヒトゲノムDNA 100ゲノムからなる25μl中で行った。前記制限プライマーの配列は、5' CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3'(配列番号6)、また前記過剰プライマーの配列は、5' GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3'(配列番号7)である。これらの配列は、ヒトヘキソサミニダーゼA(Hex A)遺伝子のエクソン11から94塩基対のセグメントを増幅する。LATE-PCR増幅について、サーマルサイクラーのプロファイルは、95℃3分後に、95℃10秒と72℃20秒を10サイクル、続いて95℃10秒、67℃20秒及び72℃20秒を55サイクルである。反応後、16.6μl(以前のピロシークエンス実験から経験的に見積もると一本鎖DNA(ssDNA)3pmolsに相当する)を20マイクロリットル(μl)の10mM Tris-HCl(pH8.5)と共に混合し、ピロシークエンス用に使用されるマイクロタイタープレートのウェル内に入れた。LATE-PCR増幅産物から持ち込まれたdNTP及びピロホスファターゼを除去するために、PSQ96 SNP Reagent Kit(Pyrosequencing Inc.社、マサチューセッツ、ウェストボロ)に付属されているような、エキソヌクレアーゼ欠損型Klenow DNAポリメラーゼ、アピラーゼ、ルシフェラーゼ、ATPスルフリラーゼからなる一般的なピロシークエンス酵素混合物、並びにルシフェリン及びアデノシン5’ホスホ硫酸からなる一般的なピロシークエンス基質混合物を、使用説明書に従いPSQ96装置(Pyrosequencing Inc.社、マサチューセッツ、ウェストボロ)を使用して、LATE-PCRサンプルを含むウェル内に連続的に分注した。その後、37℃で60秒間インキュベートした。PSQ96装置で自動的に行われるその後のdNTPの添加については、前記装置にプログラムされたデフォールト量を用いて10mM Tris-HCl(pH7.5)の一回の添加と置き換えた。本ステップに続いて、LATE-PCRサンプルを含むウェルに10μMシークエンスプライマー(5' CTGGTACCTGAACCGTAT 3')(配列番号8)を25μl加えた。LATE-PCRサンプルに添加されるピロシークエンス酵素及び基質混合物の量を考慮すると、シークエンスプライマーの終濃度は、0.5pM、また最終容量50plと見積もられた。シークエンスプライマーを加えた前記サンプルを、PSQ装置に再度戻した。そして、装置で通常実行されるピロシークエンスと基質の添加を同様の容量の10mM Tris-HCl(pH7.5)の添加で置き換え、続いてdNTPの添加したことを除き、使用説明書に従って続行した。その結果のパイログラムを図14パネルAに示す。この図は、特定のヌクレオチドの組み込みによって生じる光シグナルを示している。ピークの高さは、各付加期間内に組み込まれたヌクレオチド数に相当する。図14のパネルCについて述べると、最初の二つのヌクレオチド(A,T)のそれぞれ一つが鋳型に取り込まれ、続いて次の二つのヌクレオチド(C,C)が取り込まれたこと等がわかる。前記ピークの高さとヌクレオチド付加の順番に基づいて、一つの配列、すなわち5' ATCCTATGGCCC3'(配列番号9)を導き出し、その後GenBank配列を用いてヒトヘキソサミニダーゼA遺伝子(GenBankアクセッション番号:S62068)で確認した。本結果は、ピロシークエンスに用いられる酵素及び基質混合物を用いたLATE-PCRサンプルの前処理と、それに続くプライマーアニーリング及び再度のdNTP添加により、LATE-PCR増幅産物の直接的な配列決定が可能となることを立証している。上記プロトコルを変更して、使用説明書に従った場合(例えば、プライマーアニーリングの実行に続いて、ピロシークエンス酵素及び基質混合物を添加すること)、dNTPの添加時に鋳型に組み込まれるべきでない80%の擬陽性ピークが生じる結果となる。前記擬陽性ピークは、ピロシークエンス前にLATE-PCR増幅から持ち込んだdNTP由来のシークエンスプライマーの部分的伸長によるものである。
単一細胞の遺伝子型を決定するために、反復LATE-PCR増幅を1×PCRバッファ、3 mM MgC12、100μM dNTP、100nM 制限プライマー、1000nM過剰プライマー、1.25ユニットAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems社、米国)からなる25μlの溶液中で行った。それぞれの反応を、IVS-110変異に関して可能性のある3つの遺伝子型の一つと共に、Pierceらの(2002) Biotechniques 32(5): 1106-1111(米国特許公開番号2003-022231-A1号参照)に記載されているように調製した単一ヒトリンパ芽球で開始した。制限プライマーの配列は5' GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3'(配列番号10)とし、また過剰プライマーの配列は5' GGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3'(配列番号11)とした。これらの配列は、ヒト11番染色体短腕(11p)上のβ-グロビン遺伝子から191塩基対を増幅する。LATE-PCR増幅のためのサーマルサイクラープロファイルは、95℃10分、続いて95℃10秒、66℃15秒、そして72℃20秒を65サイクルとした。増幅後、5μlを6.64μlの20mM Tris-酢酸 (pH7.6)と混合し、ピロシークエンスに使用される光学プレートのウェル内に入れた。LATE-PCR増幅の産物から持ち込んだdNTPとPPiの除去のために、Pyro Gold Reagent Kit(Biotage AB社、スウェーデン、ウプサラ)に付属されているような、標準量のピロシークエンス酵素混合物(エキソヌクレアーゼ欠損型Klenow DNAポリメラーゼ、アピラーゼ、ルシフェラーゼ、ATPスルフリラーゼから成る)と標準量の約2倍の基質混合物(ルシフェリン及びアデノシン5’ホスホ硫酸からなる)を、PSQ HS 96A装置(Biotage AB社、スウェーデン、ウプサラ)を使用して、LATE-PCRサンプルを含む前記ウェルに連続的に分注した。装置設定は以下を用いた。酵素混合パルス時間:23.5ms;基質混合パルス時間:44.0 ms;試薬分注圧:400mbar。出力光がバックグラウンドよりも下がるまでサンプルを28℃で60秒間インキュベートした。これに続いて、0.36μlの10μMシークエンスプライマー:5' GACCACCAGCAGCCTAAG 3'(配列番号12)を各サンプルに加えて、総反応量12μlとした。その後、80℃で2分間後、室温で10分間冷却してアニールさせた。さらに、ここでLATE-PCR制限プライマー(配列番号7)の3’リン酸化バージョンを900μMの濃度で加えて、鋳型鎖3’末端の自己折りたたみと伸長を防いだ。シークエンスプライマーを加えたサンプルを、その後、PSQ HS 96A装置に再び戻し、標準の酵素及び基質混合物を添加することを含め、使用説明書に従って続行した。同型接合性野生型、異型接合性変異遺伝子型及び同型接合性変異遺伝子型の細胞から得られた結果のパイログラムをそれぞれ図15のパネルA〜Cに示す。光ユニットとピーク高についての説明は、実施例7と同様である。ピークの相対的な高さは、それぞれの位置で組み込まれたヌクレオチド数に相当する。図15のパネルAについて述べると、2番目のピーク(T)は、1番目のピーク(G)の高さの半分であり、3番目のピーク(G)の三分の一であり、4番目のピーク(A)の四分の一であり、そして5〜8番目のピーク(TAGA)と同じ高さであることがわかる。したがって、最初の8つのピークの配列は、GGTGGGAAAATAGA(配列番号13)と読まれる。前記ピークの高さと追加ヌクレオチドの順番に基づいて図15のパネルAにおける野生型β-グロビン配列を導き、続いてヒトβグロビン遺伝子に関してGenBankの配列を用いて確認した。異型接合性(パネルB)又は同型接合性(パネルC)変異については、矢印で示したIVS-110部位で確認した。パネルBで特記すべきことは、1.5ユニットの「C」ピークに続く0.5ユニットの「T」ピークが、両アレル「C」塩基の次に一方のアレルは「C」で他方のアレルは「T」であることを示しているということである。これらの結果は、ピロシークエンス法に使用される酵素及び基質混合物を用いたLATE-PCRサンプルの前処理と、それに続くプライマーアニーリング及び再度のdNTP添加により、LATE-PCRの直接的ピロシークエンスが可能となることを立証している。上記プロトコルを変更して、使用説明書に従った場合(例えば、プライマーアニーリングの実行に続いて、ピロシークエンス酵素及び基質混合物を添加すること)、dNTPの添加で鋳型に組み込まれるべきでない80%の擬陽性ピークが生じる結果となる。前記擬陽性ピークは、ピロシークエンス前にLATE-PCR増幅から持ち込んだdNTP由来のシークエンスプライマーの部分的伸長によるものである。
LATE-PCR増幅を、本発明者らが出願した米国仮特許出願、発明の名称「PCR増幅での再現性の改善とミスプライミングの低減のための試薬及び方法」で開示したような、1×PCRバッファ、3 mM MgC12、100μM dNTP、100nM 制限プライマー、1000nM過剰プライマー、1.25ユニットAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems社、米国)、及び50nM ミスプライミング低減試薬9-22DDからなる25μlの溶液中で行った。試薬9-22DDは、9ヌクレオチド長のステム1つと、22ヌクレオチド長の一本鎖ループをもつヘアピン型オリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、5’末と3’末をダブシル(Dabcyl)部の付加によって修飾されている。該ヌクレオチドの配列は、5' CGCGGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGACAGACGCCGCG 3'(配列番号14)である。ヒトゲノムDNAの20ゲノム相当で反応を開始した。制限プライマーの配列は、5' GGTCAGCGCCGGGCTGCAAGTGTAGA 3'(配列番号15)とし、また過剰プライマーの配列は、5' GATGGGTGGAGCTTGTCTTGAGG 3'(配列番号16)とした。これらの配列は、ヒト17番染色体短腕(17p)上のp53遺伝子に近い78塩基対のセグメントを増幅する。LATE-PCR増幅のためのサーマルサイクラープロファイルは、95℃10分、続いて95℃10秒、66℃10秒、そして72℃20秒を60サイクルとした。増幅後、7.5μlの産物を9.96μlの20mM Tris-酢酸 (pH7.6)と混合し、ピロシークエンス法に使用される光学プレートのウェル内に入れた。LATE-PCRから持ち込んだdNTPとPPiの除去のために、Pyro Gold Reagent Kit(Biotage AB社、スウェーデン、ウプサラ)に付属されているような、標準量のピロシークエンス酵素混合物(エキソヌクレアーゼ欠損型Klenow DNAポリメラーゼ、アピラーゼ、ルシフェラーゼ、ATPスルフリラーゼから成る)と標準量の約2倍の基質混合物(ルシフェリン及びアデノシン5’ホスホ硫酸からなる)を、PSQ HS 96A装置(Biotage AB社、スウェーデン、ウプサラ)を使用して、LATE-PCRサンプルを含む前記ウェルに連続的に分注した。装置設定は以下を用いた。酵素混合パルス時間:23.5ms;基質混合パルス時間:44.0 ms;試薬分注圧:400mbar。出力光がバックグラウンドよりも下がるまでサンプルを28℃で60秒間インキュベートした。本アンプリコンでは、制限プライマー(配列番号10)をピロシークエンスプライマーとして使用し、その10μM溶液0.54μlを各サンプルに加えて、総反応量18μlとした。その後、80℃2分間のアニーリングの後、室温まで10分間冷却した。シークエンスプライマーを加えたサンプルを、その後、PSQ HS 96A装置に再び戻し、通常の酵素及び基質混合物を添加することを含め、使用説明書に従って続行した。結果のパイログラムを図16に示す。実施例8に記載したように、ピークの相対的な高さはそれぞれの位置で組み込まれたヌクレオチド数に相当する。GenBankデータベースから決定された、正しくマッチングしている予想配列を、一列に並べた所与の塩基の数を下付きで示しながら(すなわち、G1C1A1G2=GCAGG)、ピークの上に記載した。これらの結果は、ピロシークエンス法に使用される酵素及び基質を用いたLATE-PCRサンプルの前処理により、50塩基対以上の長さを読むことが可能となることを立証している。
PCR増幅を、ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア、 フォスターシティー)を用いて行い、テイ−サックス(Tay-Sachs)病の原因であるG269変異を含むヒトヘキソサミニダーゼA遺伝子のエクソン7のセグメントを増幅した。配列は、GenBankアクセッション番号M16417と一致する。増幅の一つとしてLATE-PCR増幅を行い、その産物を直接ジデオキシシークエンスにかけた。コントロールとしてプライマーの濃度を等モルに変えて、従来の対称性PCR増幅を行った。その後、増幅産物をジデオキシシークエンスする前に従来法で精製した。
容量:25μl
1×PCRバッファ(Invitrogen社、米国、カリフォルニア、カールスバッド)
3 mM MgC12
10 μM dNTP
0.6 μM プローブ (LATE−PCRのみ)
1:40,000希釈 SYBR Gold色素 (Molecular Probes社、米国、オレゴン、ユージーン)
1.25ユニット プラチナTaq DNA ポリメラーゼ (Invitrogen社)
6 ng ヒトゲノムDNA(1000ゲノムに相当)
プライマー:LATE-PCR用、25 nM 制限プライマー、及び1000 nM 過剰プライマー(コントロールとして、同一プライマーをそれぞれ300nM )
<オリゴヌクレオチド配列>
制限プライマー:5' CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3'(配列番号17)
過剰プライマー:5' TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3' (配列番号18)
プローブ:5' Cy5 GGGACCAGGTAAGAA-リン酸 3'(配列番号19)
<サイクルシークエンス反応混合物>
容量:20 μl
100 フェムトモル(fmol) シークエンス用産物
5ピコモル(pmol) シークエンスプライマー(制限プライマーまたは過剰プライマーのいずれか)
1×DTC5 Quick Start Master Mix(Beckman Coulter, Inc.社、米国、カリフォルニア、フラトン)
(dNTP、ddNTP、バッファ、MgC12を含む)
<ジデオキシシークエンス法>
シークエンス反応混合物をサイクルシークエンスにかけた後、使用説明書に従ってCEQ 2000 Due Termination Cycle Sequencing Kit(Beckman Coulter, Inc社)を用いてCEQ 2000XL DNA Sequence(Beckman Coulter, Inc社、米国、カリフォルニア、フラトン.)でキャピラリー電気泳動にかけた。
LATE-PCR増幅反応混合物を以下のサーマルサイクルにかけた。すなわち、95℃3分;95℃10秒、65℃20秒、そして72℃20秒を20サイクル、続いて95℃10秒、65℃20秒、72℃20秒、55℃20秒、そして40℃20秒を70サイクルである。二本鎖アンプリコンの合成については、SYBR色素を励起することでモニターし、72℃のプライマー伸長中におけるその蛍光を読み取った。制限プライマーの枯渇に続く一本鎖産物の合成については、SYBR色素を励起することでモニターし、40℃の低温検出ステップ中に低温TmプローブのCy5フルオロフォアからの蛍光を読み取った。
前記5温度サイクルを18サイクル(70サイクルではなく)だけ行ったことを除き、前記増幅反応混合物を同じ前記サーマルサイクラープロファイルにかけた。なぜなら、インターカレートした色素シグナルのリアルタイムプロットが、この時点で増幅がプラトーに達したこと、またその時点までに所望の増幅産物だけが作られていることを示したからである。増幅終了時における反応混合物中の増幅産物をQUIAquick PCR Purification Kit(Qiagen社、カリフォルニア、バレンシア)を用いて、使用説明書に従い従来法で精製した。精製されたアンプリコンを、種々の既知量のDX174 Hind III DNAマーカーに対して0.5×TBE中の3%アガロースゲルで電気泳動し、その後、エチジウムブロミド染色(0.5μg/ml)で視覚化して定量化した。100fmolを含む量を、各プライマーと共にサイクルシークエンス反応混合物に使用した。
前記LATE-PCR法及びコントロール法の双方は、GeneBank配列情報(アクセッション番号M16417)に一致する配列を生成した。図17は、ジデオキシシークエンス法から得られた4つのクロマトグラフを含んでいる。パネルAは、シークエンスプライマーとして制限プライマーを利用したサイクルシークエンスを含むLATE-PCR法由来のものである。パネルBは、シークエンスプライマーとして過剰プライマーを利用したサイクルシークエンスを含むLATE-PCR法由来のものである。パネルCは、シークエンスプライマーとして過剰プライマーを利用したサイクルシークエンスを伴うコントロール法由来のものである。パネルDは、シークエンスプライマーとして制限プライマーを利用したサイクルシークエンスを伴うコントロール法由来のものである。それぞれのクロマトグラフは、標識されたジデオキシヌクレオチドから得られた蛍光曲線と、決定されたヌクレオチド配列を含んでいる。
PCR増幅を、ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア、 フォスターシティー)を用いて行い、過剰プライマーを用いて増幅された配列に基づいてヒトミトコンドリアDNAのd-loop領域内において同一の二重反応でHV1及びHV2H鎖とHV2L鎖を示す549塩基及び464塩基の二つのアンプリコンを増幅した。
容量:25μl
1×PCRバッファ(Invitrogen社、米国、カリフォルニア、カールスバッド)
3 mM MgC12
250 μM dNTPs(Promega社)
1.0 μM プローブ (LATE−PCRのみ)
10×希釈 SYBR Green色素(FMC Bioproducts社、米国、メイン、ロックランド)
1.25ユニット プラチナTaq DNA ポリメラーゼ (Invitrogen社)
ヒト血液リンパ球ゲノムDNA(100mtDNAゲノム相当)
プライマー:LATE-PCR用、50 nM 制限プライマー、及び1000 nM 過剰プライマー
<オリゴヌクレオチド配列>
プローブ:5’ Cy5 - TGCTAATGGTGGAG -Phosphate 3’(配列番号20)
HV1-H
制限プライマー:5’ GCCCGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTTG 3’(配列番号21)
過剰プライマー:5’ CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAA 3’(配列番号22)
HV2-H
制限プライマー:5’ GTATGGGAGTGGGAGGGGAAAATAATGTGTTAG 3’(配列番号23)
過剰プライマー:5’ AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCA3’(配列番号24)
HV1-L
制限プライマー:5’ CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAAAACC 3’(配列番号25)
過剰プライマー:5’ CGAGGAGAGTAGCACTCTT3’(配列番号26)
HV2-L
制限プライマー:5’ AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGG 3’(配列番号27)
過剰プライマー:5’ GGAGGGGAAAATAATGTGTTAGT 3’(配列番号28)
<サイクルシークエンス反応混合物>
容量:25 μl
100 fmol シークエンス用産物
5pmol シークエンスプライマー(制限プライマーまたは過剰プライマーのいずれか)
1×DTC5 Quick Start Master Mix(Beckman Coulter, Inc.社、米国、カリフォルニア、フラトン)
(dNTP、ddNTP、バッファ、MgC12を含む)
<ジデオキシシークエンス法>
シークエンス反応混合物をサイクルシークエンスにかけた後、使用説明書に従ってCEQ 2000 Dye Termination Cycle Sequencing Kit(Beckman Coulter, Inc社)を用いてCEQ 2000XL DNA Sequence(Beckman Coulter, Inc社)でキャピラリー電気泳動にかけた。
LATE-PCR増幅反応混合物を以下のサーマルサイクルにかけた。すなわち、95℃3分;95℃15秒、64℃10秒、そして72℃45秒を15サイクル、続いて95℃15秒、64℃10秒、72℃45秒、55℃20秒、そしてHV1-Hのみ50℃20秒を50サイクルである。二本鎖アンプリコンの合成については、SYBR Green色素を励起することによりモニターし、72℃のプライマー伸長中にその蛍光を読み取った。制限プライマーの枯渇に続く一本鎖産物の合成については、SYBR色素を励起することによりモニターし、HV1-H領域のみの50℃の低温検出ステップ中に低TmプローブのCy5フルオロフォアからの蛍光を読み取った。
4つの可能な組合せ、すなわち1) HV1-HとHV2-H、2) HV1-LとHV2-L、3) HV 1-HとHV2-L、4) HV 1-LとHV2-Hがある。図18は、4%アガロースゲルの電気泳動結果を示している。左3レーンは鋳型なしのコントロール(NTC)、次の3レーンはゲノムDNA100コピーで始めた反応由来のアンプリコン、そして一番右のレーンは100塩基対のラダーを示す。図18は、反応開始時にゲノムDNA100コピーを用いたときの549塩基対及び464塩基対のHV1-H dsDNAアンプリコン及びHV2-H dsDNAアンプリコンの形成を示している。鋳型なしのコントロールNTCでは、増幅は見られなかった。当業者にはお分かりのように、同一反応で一つの鋳型から二つの一本鎖アンプリコンを増幅する際に、同一のDNA鎖から、又は相補的なDNA鎖から二つの過剰プライマー鎖を生成できる。本発明者らは、両方法をうまく使用した。HV2-HとHV1-H、及びHV2-LとHV1-Lの組合せでは、両アンプリコンは同一のDNA鋳型鎖から生成される。HV1-HとHV2-L、及びHV1-LとHV2-Hの組合せでは、二つのアンプリコンは相補するDNA鋳型鎖から生成される。図19Aは、16209〜16169番目の塩基領域における二重のHV1-HとHV2-H中でのアンプリコンHV1-Hについての配列情報を表す。図19Bは、289〜326番目の塩基領域における二重のHV1-HとHV2-H中でのアンプリコンHV2-Hについての配列情報を表す。図19Cは、16209〜16169番目の塩基領域における二重のHV1-HとHV2-L中でのアンプリコンHV2-Hについての配列情報を表す。図19Dは、289〜326番目の塩基領域における二重のHV1-HとHV2-L中でのアンプリコンHV2-Lについての配列情報を表す。LATE-PCRは、GenBank配列情報に一致する配列を生成した。
LATE-PCR増幅で生成された一本鎖DNA量と二本鎖DNA量を使用して、「希釈して開始する」ジデオキシシークエンスに必要なssDNA量を測定することができる。PCR増幅は、ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア、 フォスターシティー)を用いて行い、ヒトミトコンドリアDNAのd-ループ領域中のHV1-Hとして設計された549塩基のアンプリコンを増幅した。MtDNAについては、ヒト毛幹から(100μ1の溶解反応混合物中に4μ1のDTTを含んだ状態で、Peirceらの(2002) Biotechniques 32(5); 1106-1111に記載されているような)溶解条件下で抽出した。増幅は全てLATE-PCR増幅であり、また前記産物を直接ジデオキシシークエンスにかけた。
容量:25μl
1×PCRバッファ(Invitrogen社、米国、カリフォルニア、カールスバッド)
3 mM MgC12
250 μM dNTPs(Promega社)
1.0 μM プローブ (LATE−PCRのみ)
10×希釈 SYBR Green色素(FMC Bioproducts社、米国、メイン、ロックランド)
1.25ユニット プラチナTaq DNA ポリメラーゼ (Invitrogen社)
1μl DNA溶解溶液(ほぼ10mtDNAゲノム相当)
プライマー:LATE-PCR用、50 nM 制限プライマー、及び1000 nM 過剰プライマー
<オリゴヌクレオチド配列>
HV1H:制限プライマー、過剰プライマー、及びプローブ、いずれも実施例11に同じ。
実施例11に同じ。
実施例11に同じ。
LATE-PCR増幅から得た生の蛍光データを図20のパネルA及びBに示す。図20Aの例えば線201は、ssDNA/dsDNA(色素シグナルに対するプローブシグナル)比として増幅サイクル数に対して描かれた全毛幹データを示している。本解析方法は、指数関数的増幅が始まる際、又はそのレベルがプラトーに達したときにより生じる変動を最小にし、また非常に遅れて始まるものを除けばssDNAの増幅効率は全サンプルで実質的に同じであることを立証している。
LATE-PCRと「希釈して開始する」シークエンス法の感度は、10%の分離レベルに複数のSNPをもつアンプリコンの混合物を区別できる。PCR増幅は、2mmのヒト毛幹、又はスライドグラスに付着したヒト親指の指紋一つから始めた。全ての増幅をLATE-PCR法で行い、その産物を直接ジデオキシシークエンスにかけた。最終増幅反応混合物、オリゴヌクレオチドシークエンス(HV1-H)、サイクルシークエンス反応混合物、ジデオキシシークエンス、LATE-PCR増幅及びシークエンス調製については、全て実施例11と同様に行った。
一塩基変異について90%異型接合性DNAと10%同型接合性ゲノムDNAからなるサンプルと100%異型接合性ゲノムDNA からなるサンプルを区別するために、本発明者らは、まずヒト17番染色体に位置するSNP部位rs858521の異型接合性DNA(G/Cアレル)90%に同SNP部位の同型接合性DNA(C/Cアレル)10%を加えてなるDNA混合物を作った。該SNP部位は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=SNPからアクセスできるNCBI dbSNPデータベースに記載されている。このDNA混合物は、シアトルのワシントン大学におけるReid研究室により提供された対応の異型接合性及び同型接合性DNAの濃度に合わせて混合することにより調製された。混合目的の各ゲノムDNAのDNA濃度については、以下で説明するものと同様にLATE-PCRサンプルのリアルタイム解析から得られたSYBR蛍光のCt値に基づいて見積った。一旦、DNA混合物が調製されれば、本発明者らは100%異型接合性DNAか、90%異型接合性DNA+10%同型接合性DNAのいずれかを含む反復LATE-PCR反応をセットアップした。それぞれのLATE-PCRサンプルは、最終容量25μlで、1×プラチナTaqバッファ(Invitrogen社、カリフォルニア、カールスバッド)、3mM MgC12、250μM dNTP混合液、0.24×SYBR Gold I (Invitrogen社、カリフォルニア、カールスバッド)、本発明者らがElixir化合物9-3iDDと呼んでいる200nMミスプライミング防止試薬、1.25ユニット プラチナTaqポリメラーゼ(Invitrogen社、カリフォルニア、カールスバッド)、1μM rs858521過剰プライマー、50 nM rs858521制限プライマー、2.4 μMのrs858521 SNPのGアレルに対するResonSenceプローブ、及び適当なゲノムDNAの1800ゲノム当量で構成される。前記rs858521過剰プライマーの配列は、5’ CAATCCCTTGACCTGTTGTGGAGAGAA 3’(配列番号29)であり、前記rs858521制限プライマーの配列は、5’ TCCCCAGAGCCCAGCCGGTGTCATTTTC 3’(配列番号30)である。rs858521 SNPのGアレルに対するResonSenceプローブの配列は、5’ [Cy5] CTTCAGCTCAAACAATA [Phos](配列番号31)である。
PCR増幅をABI 7700を利用して行い、ヒトミトコンドリアDNAのdループ領域内のHV1-Hとして設計した549塩基のアンプリコンを増幅した。ヒトゲノムDNAの反応混合物、オリゴヌクレオチドシークエンス(HV1-H)、及びLATE-PCR増幅は、プラチナTaqDNAポリメラーゼのユニットをサンプル間で0.215、0.250、0.375、0.50、0.625、及び1.25ユニットと変化させたことを除いては、実施例11の記載と同様とした。
本発明者らは、マウスOct4及びXist遺伝子(GenBankアクセッション番号:それぞれNM013633とL04961)のエクソン内配列の同時増幅用の二重リアルタイムLATE-PCRアッセイを設計した。それぞれの反応は、最終容量50μlで行われ、以下の試薬を含んでいる。すなわち、20 mM Tris-HC1(pH 8.4)と50 mM KC1を含む1×PCRバッファ(Invitrogen社、カリフォルニア、カールスバッド)、3mM MgCI2、0.4 mMの各dNTP、配列5’ TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3’(配列番号33)を有する50nM Oct4制限プライマー、配列5’ CAACTTGGGGGACTAGGC 3’(配列番号34)を有する2μM Oct4過剰プライマー、配列5’ GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3’(配列番号35)を有する100nM Xist制限プライマー、5’ TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3’(配列番号36)を有する2μM Xist過剰プライマー、配列5’ TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGA AGG CGG-Dabcyl 3’(配列番号37)を有する1 μM 低融点Oct4モレキュラービーコンプローブ、及び配列5’DabcylCGTTATAATGAAATTATAACG-Dabcyl 3’(配列番号38)を有する300nM ミスプライミング防止試薬(本発明者らが化合物9-3bDDと呼ぶもの)である。抗体複合プラチナ(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社、カリフォルニア、カールスバッド)も1アッセイあたり1、2、又は3ユニットの濃度でPCR混合物に加えた。Xistアンプリコン検出用のモレキュラービーコンプローブは、本実施例では加えられていない。
Claims (14)
- DNAポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって二本鎖及び一本鎖アンプリコンの双方を生成し、ならびに、少なくとも一つのプライマーアニーリング温度を含む非対称性核酸増幅工程の少なくとも一つの一本鎖増幅産物を解析するための方法であって、
蛍光検出により二本鎖アンプリコンを検出すること、
前記少なくとも一つのプライマーアニーリング温度より低い温度で配列特異的な蛍光検出により前記少なくとも一つの一本鎖アンプリコン産物を検出すること、そして
前記二本鎖アンプリコンの蛍光に対する前記一本鎖産物の蛍光比率を計算すること
を含む、
前記方法。 - 検出試薬を核酸増幅工程の開始時に添加する、請求項1に記載の方法。
- 二本鎖アンプリコンの検出は蛍光性DNA色素によるものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記少なくとも一つの一本鎖産物の検出は前記少なくとも一つのプライマーアニーリング温度より低い少なくとも一つの温度における検出ステップの間に前記一本鎖産物に結合するが、前記少なくとも一つのプライマーアニーリング温度では結合しないフルオロフォア標識されたハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも一つの一本鎖増幅産物に対するハイブリダイゼーションプローブはアレル識別型消光性二本鎖プローブである、請求項4に記載の方法。
- 同一のフルオロフォアで標識されているがターゲットに関しては異なる融解温度を有する、異なる一本鎖増幅産物に対する少なくとも二つのプローブを包含し、前記低温検出ステップは、一つのプローブのみがそのターゲットに結合する温度、及び少なくとも二つのプローブがそれぞれのターゲットに結合する温度において前記フルオロフォアからの放出を検出することを包含する、請求項5に記載の方法。
- 伸長により一本鎖アンプリコンを生じるプライマーが前記色素によって間接的に刺激されるフルオロフォアで標識され、ならびに、前記少なくとも一つの一本鎖産物の検出が色素を刺激すること及び前記プライマーにより放出された蛍光を検出することを含む、請求項3に記載の方法。
- 可能性のある少なくとも二つの一本鎖増幅産物に結合して前記増幅でプライマーをアニールするために利用される温度より低い異なる融解温度を有するハイブリッドを形成し、ならびに、前記色素によって間接的に刺激されるフルオロフォアで標識された、少なくとも一つのミスマッチ寛容性ハイブリダイゼーションプローブを含む方法であって、一本鎖産物の検出が、前記異なる融解温度によって決定される複数の温度における低温検出を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ミスマッチ寛容性ハイブリダイゼーションプローブはクエンチャーを含み、前記低温検出期間に該クエンチャーをフルオロフォアに近接するように導く二次構造を形成する直鎖状ハイブリダイゼーションプローブであり、前記二次構造に起因する蛍光は内部で消光される、請求項8に記載の方法。
- 前記ミスマッチ寛容性ハイブリダイゼーションプローブはモレキュラービーコンプローブである、請求項8に記載の方法。
- それぞれが、いずれのターゲットに対してもプライマーアニーリング温度より低い融解温度を有し、ならびに、共同して可能性のある複数のターゲット配列にハイブリダイズする複数の異なる蛍光標識された低温ハイブリダイゼーションプローブと、異なる温度で可能性のある複数のターゲットにハイブリダイズし、かつ、前記色素により励起されるフルオロフォアを有するミスマッチ寛容性プローブである少なくとも二つのプローブを含み、
一本鎖アンプリコンの検出が前記プライマーアニーリング温度より低い一以上の温度において、色素を励起するが前記ミスマッチ寛容性プローブのフルオロフォアを励起しない光で前記反応混合物を刺激すること、及びプローブからの放出を検出することを含む、請求項8に記載の方法。 - 前記一以上の温度が二つ又は三つの温度である、請求項11に記載の方法。
- 増幅工程は指数関数後比例PCR(LATE-PCR)増幅工程である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出は増幅工程の完了に続くエンドポイント検出である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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