CN108624664B

CN108624664B - 一种急性肝损伤的早期诊断标志物的快速扩增方法

Info

Publication number: CN108624664B
Application number: CN201810041213.7A
Authority: CN
Inventors: 张辉
Original assignee: Wuhan Feisite Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongguancun Technology Leasing Co.,Ltd.
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: CN108624664A

Abstract

本发明公开了一种急性肝损伤的早期诊断指标的快速扩增方法，其中，扩增方法通过线性指数PCR扩增诊断标志物GSTA1，GSTA1的模板DNA序列包含在如序列表SEQ ID NO：1所示的片段中，扩增体系包括一个过量引物和一个限制性引物，扩增循环采用60℃循环，扩增引物上游序列如序列表SEQ ID NO：2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO：3所示。本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链DNA可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。

Description

一种急性肝损伤的早期诊断标志物的快速扩增方法

技术领域

本发明涉及一种急性肝损伤的早期诊断标志物的快速扩增方法，属于领生物域，尤其是生物检测领域。

背景技术

肝脏是人类内的重要器官，在保护机体的同时，又易被各种毒物、药物以及化合物的代谢产物损伤，导致肝损伤的原因主要有几种类型：(1)病原性肝损伤；(2) 酒精性肝损伤；(3)肝脏占位性疾病；(4)药物引起的中毒性肝损伤；(5)免疫性肝损伤。当肝脏发生病理性病变时，会对全身的代谢和循环分泌系统产生影响，从而影响到内源性小分子代谢物的转归。急性肝损伤时许多肝脏疾病的初始环节和共同途径，早期发现并确诊急性肝损伤对肝脏疾病来说是十分重要的。因此，筛选出敏感、准确的诊断标志物对于肝脏疾病有着重要的意义。

急性肝损伤在临床上主要的产生原因有病毒感染、服用药物不当、食物添加剂、乙醇摄入过量、误服有毒食物、放射线损伤等。肝损伤的标记物在临床上的获得主要以血清生化指标、病理学和影像学检查为主，包括血清生化指标，透明质酸和内皮素，脂质过氧化反应指标和能量代谢指标；其中血清转氨酶具有指标获得简单、指标灵敏、检测快速等特点，常作为诊断标志物使用，转氨酶一共有20余种，其中以血清谷丙转氨酶(ALT)和血清谷草转氨酶(AST)的活性最强，测定两种血清转氨酶活性是反应肝细胞变性坏死的常规检测指标。谷胱甘肽S转移酶(GST)是解毒家族中最重要的成员之一，GST活性以及表达量的变化与细胞保护作用、药物代谢、肿瘤耐药性密切相关。GSTA1编码的二聚体蛋白在正常肝脏和肾脏中高表达， GSTA1基因cDNA全长669bp，位于6号染色体P12的一个基因簇编码。与ALT和 AST相比，GSTA1的半衰期较短，且在肝损伤时，相对变化率高，且GSTA1在红细胞中不表达，样本溶血不影响GSTA1含量的检测，增加了GSTA1的准确度。因此GSTA1已经越来越多的作为急性肝损伤的早期诊断标志物在临床中使用。研究 GSTA1的变化和意义，对于肝损伤的早期诊断以及治疗有重要意义，并有可能为研究肝损伤机理和药物筛选提供更可靠的数据。

GSTA1基因包含7个外显子，具有单核苷酸多态性(SNP)位点，这些SNP位点对于GSTA1的蛋白表达量有影响，因此这些位点对于GSTA1的扩增检测具有一定的影响，有研究表明GSTA1基因的C-69T位点突变对GST活性影响较为明显、因此，需要针对这些SNP位点设计一种快速扩增的方式，并针对SNP位点的具体基因频率，综合得出GSTA1的检测结果。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种急性肝损伤的早期诊断标志物的快速扩增方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的急性肝损伤的早期诊断指标的快速扩增方法的技术方案如下：

所述扩增方法通过线性指数PCR扩增诊断标志物，扩增体系包括一个过量引物和一个限制性引物，扩增循环采用60℃循环。过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。

所述扩增方法通过线性指数PCR扩增诊断标志物GSTA1，GSTA1的模板DNA序列包含在如序列表SEQ ID NO：1所示的片段中，扩增体系包括一个过量引物和一个限制性引物，扩增循环采用60℃循环，扩增引物上游序列如序列表SEQ ID NO：2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

过量引物的数量是限制性引物的至少10倍。

本发明中过量引物与限制性引物的具体选择可以根据实际需要扩增的单链进行调换，也就是说，如序列表SEQ ID NO：2所示的引物为限制性引物，如序列表SEQ ID NO：3所示的引物为过量引物。引物的用量可以根据实际需要和本领域常识进行调整，用量多的一条引物为过量引物，用量少的一条引物为限制性引物，本发明的保护范围不应受到引物名称和使用量的限制。

设计引物时，由于线性指数PCR对于引物的要求较高，要求引物之间的Tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的Tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过LATE-PCR扩增出待测的目的产物，就可以采用。

优选的，扩增条件为95℃预变性5min，60℃扩增循环，72℃延伸10min，4℃保持，其中每87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个扩增循环。

60℃循环由87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个循环。

扩增体系为1×PCR buffer、3mmol/L MgCl2、100μmol/L dNTPs、1.5U TaqDNA聚合酶、0.1μmol/L限制性引物、1μmol/L过量引物，13％甘油和4％BSA 2mmol/L；1μL DNA 模板，加水补充至25μL。

优选的，PCR buffer为50mmol KCl和15mmol Tris-HCl的混合液，pH 8.0。

扩增产物为大量的单链DNA，便于采用焦磷酸测序，但也可以采用其他测序方式进行测序。焦磷酸测序时，扩增产物先进行室温退火，具体步骤如下：

取1～2μL LATE-PCR产物和1.2μL APS(1mmol/L)，加入30μL试剂A，混匀后放置10～15min，再加40μL试剂B混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到 0.3μmol/L)，室温退火10～15min。

其中，试剂A为不含Apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括DTT、APS、PVP、ATPsulfurylase、Klenow、荧光素和荧光素酶，试剂B为试剂A与Apyrase的混合液。试剂B 为试剂A与3.2U/mL Apyrase的混合液。

本发明采用本公司自行研发的焦磷酸测序仪进行测序，测序结果与现有的市售焦磷酸测序仪相比，不仅结果更加准确，且精度高样本用量小，检测出峰准确，无需重复验证试验。

与现有技术相比，本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链DNA可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。

本发明的第二个目的在于提供一种GSTA1的特异性引物在扩增试剂盒中的应用，该试剂盒采用线性指数PCR与焦磷酸测序结合的方式对GSTA1基因进行扩增，可用于急性肝损伤早期诊断标志物的快速扩增，扩增产物可以作为基因筛查、疾病易感性、用药指导等多方面的进一步检测依据，对于该基因的研究和临床发展具有重要的意义。

本发明中的快速扩增诊断试剂盒包括：引物扩增组和焦磷酸测序组，其中引物扩增组包括扩增引物、DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，焦磷酸测序组包括退火引物、DNA聚合酶(AmpliTaqGold聚合酶)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(Luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)和dNTP，以及配置反应液用的Klenow酶(KlenowFragment)。

试剂盒中配有完整的操作方法，如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品PCR的缓冲液，其中含有100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH 9.3～9.5。

本扩增方法是经过精密的设计和测试得出的，适用于各种样本的GSTA1的SNP位点检测，并且检测效率高，检测结果准确。直接使用本发明中的扩增检测扩增方法，对实验员的操作要求低，对检测环境的耐受力强，可以随时快速地进行扩增检测工作，方便快捷，检测成本低，结果准确且得出时间短，可以最大程度地减轻被检者的经济和精神负担，具有良好的市场潜在价值。检出结果不仅可以结合地区和人种数据综合对GSTA1的含量检测进行辅助评估，并且在如结肠癌、结核、肝细胞检测等多种临床检测中使用。

附图说明

图1是本发明提供的扩增产品的凝胶电泳图；

图2是本发明提供的焦磷酸测序的纯合基因测序图；

图3是本发明提供的处理后的焦磷酸测序的杂合基因测序图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的急性肝损伤的早期诊断指标的快速扩增方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本发明中采用的仪器和试剂如下：

PTC-255PCR扩增仪，美国MJ Research公司；

焦磷酸测序仪，武汉菲思特生物科技有限公司；

TaqDNA聚合酶、dNTPs(10mmol/L)、10×Buffer和MgCl₂(25mmol/L)(大连TaKaRa公司)；AmpliTaqGold聚合酶(AppliedBiosystems公司)；KlenowFragment(无外切酶活性)、乙烯基吡咯烷酮(PVP)和Luciferase(Promega公司)，牛血清白蛋白(BSA)、APS和Apyrase(Sigma公司)，α-硫化脱氧三磷酸腺苷(dATPαS)、dGTP、dTTP和dCTP(Amersham PharmaciaBiotech公司)；ATPsulfurylase由本公司实验室表达；其它试剂均为分析纯，所有试剂均用灭菌去离子水稀释。试剂盒中引物由上海Invitrogen公司合成，具体引物名称及序列请见序列表。

本发明中的快速扩增诊断试剂盒包括：引物扩增组和焦磷酸测序组，其中引物扩增组包括扩增引物、DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，焦磷酸测序组包括退火引物、DNA聚合酶(AmpliTaqGold聚合酶)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(Luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)和dNTP，以及配置反应液用的Klenow酶(KlenowFragment)。试剂盒中配有完整的操作方法，如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品PCR的缓冲液，其中含有100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH 9.3～9.5。

一、扩增引物设计

本发明中采用线性指数PCR对GSTA1的SNP片段进行扩增，根据NCBI中对GSTA1 的SNP位点的记载，GSTA1的rs号为3957356，序列长1101bp，SNP位点位于第501位，发生错配时可能发生T/C错配，具体序列如序列表SEQ ID NO:1所示，Y表示GSTA1的 SNP位点，SEQ IDNO:1序列具体如下，下划线处表示特异性引物的连接位置：

TTGTATTTTCACAGCCAATATAGAATTACAGTGTCACAATTTACAATTGTGTGTTGACTA CTTACACAGAGAAATAAATTTTTGCATACATTGCCACTTCTTCCAGCACTGATTATTCTC AGATTGTTTAAAATGCTACCATTTCTTTTTTCTCTTCATGTCATTGTTTCCCATACCATT AAATGCTGAAGCCCTGGTTTTCTAAATTCTTCATTTTTACAATTCTGTAAAGATGTATCC AACAGAAAAGAAATAAACAATTCTTGAACTGTCACCCAAGCACACCAAGACGGCACAATA TGAGTAAAAACAGACTTTTCCTTGTGCTAAGGACACATATTAGCATATTTTTCTAGGAGGCTAGAGA GGAGGGTGTGAGGCAATGTAGAGAAATTTATAAGATCAGTACTTACTTTGTTA AACGCTGTCACCGTCCTGGCTCGACAACTGAATTCCAGGTCCTAATGTATTTATAAGCTC TTTGTTCCTCTCAATAGTTC

Y

CTCCCACTGAAAGAAGAGTCAAGTTAGGGAAAAGCCACTCCCACACATTTCATGGCCAAGGGGCCACC TACTGGATTCTAAGACATGAGGCAAGTGATCTGCTTATCAGAAGACACTGGT TAATGTGTTCCTTTTCAAGGTTGGCAATCAAAGTTTACACAATACATTTCACCGAGATTT TGCTCTTTTTGCAAGTCAGCAGAAACTGGCTTTTTAAAGATGCTTTTTTTCATGAGTTGG GTGCAAAGACTAGGGCAACTGAAAAATCTCTATTGTGAGCATAGCTGGGAGAGGATGTCT GTGAAGGGCAAGCTGATGCCACCGTTTTCTTACTGGGTTGCCAAATAAAATATAGGACAT CCATGTAAATGTGAATTTCAGGCAAACAATCAACAATTTTTTAGTTATAGCTATGTTCCA AACACGGTATGAAACCAGATTATACTGAAATATTATTTATTGTTTATCTGAAATTCACAT TTAGGTGGGTATCCTGTATT

根据上述基因序列，采用Primer Primer 5软件设计扩增和退火引物，其中E为过量引物，过量引物序列如序列表SEQ ID NO：2所示，L为限制性引物，限制性引物序列如序列表 SEQ ID NO：3所示，A为扩增产物。T_m值的计算采用Oligo Analyzer 3.1软件计算。引物序列及参数如下表1所示：

表1

二、线性指数PCR扩增

1.取样

本次实施例中选取50例人血样本进行测试，样本来源于武汉市中心血站，样本进行预处理为DNA模板，避免血液中的免疫球蛋白G、血红蛋白和乳铁蛋白对PCR反应体系的干扰。

2.线性指数扩增

线性指数扩增的反应体系为25μL体系，体系中具体成分如下：

1×PCR buffer(50mmol KCl、15mmol Tris-HCl、pH 8.0)、3mmol/L MgCl2、100μmol/L dNTPs、1.5U TaqDNA聚合酶、0.1μmol/L限制性引物P_L、1μmol/L过量引物P_E，13％甘油和4％BSA 2mmol/L；1μL DNA模板，加水补充至25μL。

扩增条件为：95℃5min，60℃扩增循环(87℃10s，66℃10s，72℃20s)，72℃10min，4℃保持。

三、焦磷酸测序

3.1引物设计

根据扩增产物设计退火引物，退火引物序列如序列表SEQ ID NO：4所示： 5'-GCCAAGTGGAGCACCCAAGCGT-3'。

3.2反应液的配制

试剂A：0.1mol/L Tris-醋酸(pH 7.7)，2mmol/L EDTA，10mmol/L醋酸镁，0.1％BSA， 1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2μmol/L APS，0.4g/L PVP，200U/L ATPsulfurylase，18U/mL Klenow，0.8mmol/L D-荧光素，6mg/L荧光素酶；

试剂B：试剂A，3.2U/mL Apyrase。

3.3单链模板的制备

取1～2μL LATE-PCR产物和1.2μL APS(1mmol/L)，加入30μL试剂A，混匀后放置10～15 min，再加40μL试剂B混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到 0.3μmol/L)，室温退火10～15 min。

3.4焦磷酸测序

将3.3步骤中的反应溶液全部转入焦磷酸测序反应池中，按照设计好的引物顺序加入 dNTP，采用本公司生产报批的焦磷酸测序仪进行测序，dNTP加入顺序及检测结果如图2 所示，其中图2所示为TT型和CC型检测结果图，图3所示为处理后的TC型检测结果图。

3.5统计结果

根据对本实施例中50例样本的检测结果进行统计分析，GSTA1基因型频率分布情况如下表2所示：

表2 GSTA1基因型频率分布统计表

	CC型	TT型	CT型
				检出例	35	0	15
总数占比(％)	70	0	30

本实施例中的检测样本较小，加之GSTA1的基因多态性位点较多且具有地域、民族分布不均的特点，故本次检测结果不代表该基因型的整体分布情况，仅表示本次实施例检测的统计结果。

结果显示，常规血样中野生纯合子(CC)的分布频率较高，野生纯合子对GSTA1的含量检测无过多影响，因此该类基因携带者在本次检查中占比较大，因此GSTA1的检测结果可信度较高，突变型纯合子(TT)的基因分布频率极少或无，说明该类型基因携带者缺陷较为严重，该类型的携带者的GSTA1检测结果存疑。

本试剂盒中的检测结果不仅可以作为GSTA1的辅助判断指标，并且随着对该基因多态性位点研究的不断深入，以及基因数据库的逐渐建立，本试剂盒的检测结果可作为多种疾病的基因检测结果使用。

四、检测结果验证

4.1琼脂糖凝胶电泳

将经过线性指数扩增的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果图如图1所示，图中未标记条带为DNA Marker，1～5道为随机抽取的扩增产物，6道为阴性对照。图中目的条带位置显示扩增的目的片段大小正确。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 新开源汇诚（武汉）医疗科技有限公司

<120> 一种急性肝损伤的早期诊断标志物的快速扩增方法

<130> 2017

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1001)

<223> GSTA1基因序列

<400> 1

ttgtattttc acagccaata tagaattaca gtgtcacaat ttacaattgt gtgttgacta 60

cttacacaga gaaataaatt tttgcataca ttgccacttc ttccagcact gattattctc 120

agattgttta aaatgctacc atttcttttt tctcttcatg tcattgtttc ccataccatt 180

aaatgctgaa gccctggttt tctaaattct tcatttttac aattctgtaa agatgtatcc 240

aacagaaaag aaataaacaa ttcttgaact gtcacccaag cacaccaaga cggcacaata 300

tgagtaaaaa cagacttttc cttgtgctaa ggacacatat tagcatattt ttctaggagg 360

ctagagagga gggtgtgagg caatgtagag aaatttataa gatcagtact tactttgtta 420

aacgctgtca ccgtcctggc tcgacaactg aattccaggt cctaatgtat ttataagctc 480

tttgttcctc tcaatagttc yctcccactg aaagaagagt caagttaggg aaaagccact 540

cccacacatt tcatggccaa ggggccacct actggattct aagacatgag gcaagtgatc 600

tgcttatcag aagacactgg ttaatgtgtt ccttttcaag gttggcaatc aaagtttaca 660

caatacattt caccgagatt ttgctctttt tgcaagtcag cagaaactgg ctttttaaag 720

atgctttttt tcatgagttg ggtgcaaaga ctagggcaac tgaaaaatct ctattgtgag 780

catagctggg agaggatgtc tgtgaagggc aagctgatgc caccgttttc ttactgggtt 840

gccaaataaa atataggaca tccatgtaaa tgtgaatttc aggcaaacaa tcaacaattt 900

tttagttata gctatgttcc aaacacggta tgaaaccaga ttatactgaa atattattta 960

ttgtttatct gaaattcaca tttaggtggg tatcctgtat t 1001

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> GSTA1基因过量引物序列

<400> 2

aggaggctag agaggagggt gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> GSTA1基因限制性引物序列

<400> 3

atccagtagg tggccccttg gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> GSTA1基因退火引物序列

<400> 4

gccaagtgga gcacccaagc gt 22

Claims

1.一种检测GSTA1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒通过线性指数PCR扩增诊断标志物GSTA1，rs号为3957356，GSTA1的模板DNA序列包含在如序列表SEQ ID NO：1所示的片段中，扩增体系包括一个过量引物和一个限制性引物、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，扩增体系为：1×PCR buffer、3mmol/L MgCl₂、100μmol/L dNTPs、1.5UTaqDNA聚合酶、0.1μmol/L限制性引物、1μmol/L过量引物，13％甘油和4％BSA 2mmol/L；1μLDNA模板，加水补充至25μL；扩增循环采用60℃循环，扩增引物上游序列如序列表SEQ IDNO：2所示，该引物为过量引物；下游序列如序列表SEQ ID NO：3所示，该引物为限制性引物，所述过量引物的数量是限制性引物的至少10倍；所述扩增引物退火后经焦磷酸测序获得基因序列，焦磷酸测序的引物序列如序列表SEQ ID NO：4所示；其中焦磷酸测序的步骤如下：取1～2μL LATE-PCR产物和1.2μL APS，加入30μL试剂A，混匀后放置10～15min，再加40μL试剂B混匀放置3～5min，然后加入退火引物，终浓度达到0.3μmol/L，室温退火10～15min，所述60℃循环由87℃ 10s、66℃ 10s和72℃ 20s组成一个循环，试剂A为不含Apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括DTT、APS、PVP、ATP sulfurylase、Klenow、荧光素和荧光素酶，试剂B为试剂A与3.2U/mL Apyrase的混合液。

2.根据权利要求1所述的检测GSTA1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，其特征在于：PCR buffer为50mmol KCl和15mmol Tris-HCl的混合液，pH 8.0。