CN102576390A - 用于量化pcr产物的方法、仪器和计算机程序产品 - Google Patents

Abstract

本文件涉及核酸的解链曲线分析。根据本发明的第一方面的方法包括分析由样品测量的核酸解链曲线，所述解链曲线包含至少两种核酸解链信号和背景信号的总和信号作为温度的函数。所述方法还包括在温度-依赖性指数校正函数中优化至少一个常数，以便使在其中样品中的靶向核酸保持实质上双链的温度区域核酸解链曲线的变化最小化，并通过将所述指数校正函数应用于其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域，产生代表核酸解链信号的校正的核酸解链曲线。根据其他方面，本发明涉及用于精确估计解链峰面积的曲线拟合算法，和用于使校准曲线数据线性化以增加竞争性PCR测定的线性测量范围的数学转化。本发明提供了一种强有力的工具来分析含有两种或更多种具有类似但可区别的解链温度的不同核酸的PCR-扩增的样品。

Description

用于量化PCR产物的方法、仪器和计算机程序产品

发明领域

本发明涉及核酸解链曲线分析。更具体地，本发明的实施方案涉及用于在双链核酸的解链曲线图中除去背景信号和提取特定的信号的方法和系统。

解链曲线分析通常与聚合酶链反应(PCR)结合进行，用于分析扩增产物。因此，本发明还涉及用于解链曲线分析以及实时和竞争性PCR技术的仪器和软件。

发明背景

解链曲线分析基于双链核酸(通常为DNA)在溶液中的温度-依赖性解离的测量。双链之间的氢键的解离所需的能量依赖于双链DNA分子的长度和碱基组成，并依赖于相反链的互补性。可使用当与核酸结合时改变其荧光性质的探针，或者当与双链DNA结合时发荧光但是当DNA解离成为单链分子时停止发荧光的荧光染料，来监测链的解离。因此，通过在光学监测荧光的量同时提高样品的温度，可测量存在于样品中的双链DNA的量。

如果样品含有多组具有不同长度或具有不同核苷酸组成的双链DNA分子，测量的结果将包括对于每个分析的DNA分子组具有特异性的温度-依赖性荧光信号的总和。因此，当两种或多种模板PCR扩增之后测量样品中的PCR扩增子时，对于存在于样品中的每个特定的PCR扩增子，可得到特定的温度-依赖性荧光信号。

此外，随着温度升高，荧光信号通常降低，这与双链DNA分子的温度-特异性解离无关地发生。这种荧光信号的降低通常可在整个温度范围观察到，尤其是在其中样品中的DNA分子保持实质上双链的温度下。该背景信号依赖于存在于样品中的双链DNA的量，并且当样品的温度升高时，其以指数方式下降。因此，测量的信号包括由样品中的双链DNA的解离得到的荧光信号的特定降低和温度依赖性的以指数方式下降的背景信号。

实时PCR涉及cDNA或DNA模板的扩增和定量测量扩增的DNA扩增子的量。在该技术中，在PCR扩增的每个循环期间，监测反应中的PCR产物的累积。通过将在样品中的反应产物的累积与在已知的标准物中的反应产物的累积进行比较，可确定存在于样品中的模板DNA的量。此外，基于累积动力学可确定反应效率，但是这种计算的精确度通常被有限的数据点折衷。竞争性PCR提供了一种供选的方法来控制单独的反应管瓶之间的扩增效率的变化。在该技术中，将长度或核苷酸组成与野生型cDNA或DNA模板不同的已知量的参比DNA模板包含在反应中，并且在相同的反应管瓶中与野生型模板共扩增。在扩增之后确定野生型和参比PCR扩增子的相对量。由于，扩增反应效率同等影响野生型和参比模板二者，由野生型和参比PCR扩增子的相对量可确定起初存在于样品中的野生型模板的量。在实时PCR中，在扩增期间进行定量测量，而在竞争性PCR中，通常在完成扩增反应之后进行定量测量。

基于RNA-表达分析的诊断测试面临若干技术挑战。一个具体的挑战为福尔马林-固定、石蜡-包埋的(FFPE)组织样品的分析，其中RNA分子已被降解成为较短的片段。提取和扩增这些短RNA片段是技术上要求高的，并且得到的信号通常低。基因组-受控的RT-PCR已成功地用于该目的(Stenman等人，Clinical Chemistry 52：111988-1996(2006))。该技术基于竞争性PCR并且能扩增和定量测量短cDNA片段，使其适用于分析在FFPE样品中的mRNA表达。在竞争性PCR扩增之后，使用解链曲线分析测量源自野生型cDNA和参比DNA模板的PCR扩增子的相对量。在该技术中，由野生型cDNA和参比DNA模板产生的PCR扩增子的核苷酸组成不同，并且示差检测基于解链温度的轻微差别。该技术存在若干特定的益处。由于在表达的序列和基因组序列之间的分化不依赖于内含子序列，使用基因组-受控的RT-PCR可格外地扩增由实际上任何基因的mRNA产生的短cDNA片段。当分析FFPE样品时，这是必要的。无论存在的野生型cDNA模板的量如何，在每一个反应中参比DNA模板的共扩增提高测定的再现性。通过改变参比模板的量可控制测定的检测限度和不精确性，这对于诊断应用是必要的。另外，来自RNA提取步骤的基因组DNA的遗留不会引起扩增之后的假阳性结果。由于具有接近相等的解链温度的PCR产物的相对水平在跨数个十进制的测量范围内精确地量化，在这种类型的测定中对解链曲线分析的定量性质的要求格外地高。

基于解链温度的用于快速PCR扩增和检测PCR产物的仪器描述于WO 1997/046712。基于荧光测量的解链曲线分析的原理详尽地描述于公布WO 2000/066777、WO 2004/038038和WO 2006/121423。由解链曲线谱图提取定性和定量数据通常涉及测量荧光信号，作为温度的函数，以产生原始解链曲线。通过计算信号的变化率，作为温度的函数，可产生第一导数曲线，其显示特定的双链DNA的解离作为特定的“解链峰”。然而，这种类型的分析的问题在于，背景信号影响谱图中的单独的解链峰的大小和基线，并且使定量分析变复杂，尤其是当在相同的谱图中存在多个峰时。在WO公布2007/035806中，描述了对分析程序的改进，其中将背景信号从核酸样品信号中减去。在该技术中，由取自核酸解链转化之前和/或之后的点的两个单独的斜率值，通过内插法而衍生指数算法。随后，通过将背景从原始解链曲线数据或从第一导数解链曲线谱图中减去，用该算法产生校正的解链曲线。该技术已主要用于基因分型应用，其中检测基因的一个或两个等位基因中的变异。在这些应用中，解链曲线分析已用于检测来自扩增的DNA的靶向-特异性未标记的探针的解离。或者，已进行整个扩增子解链曲线分析。在这些类型的应用中，必要的是测定的分辨率足以在相同的谱图中单独检测解链峰。

用于校正测量的解链曲线和用于分析解链峰面积的现有技术(包括上述公布中所描述的那些)不能令人满意地在位置彼此非常接近的解链峰之间进行区别。特别是，需要对用于精确量化样品中的核酸的相对量(特别是在RNA-表达分析中)的技术的改进。

发明概述

本发明的目标是提供用于精确分析解链曲线谱图的新的技术。特别是，本发明的目标是提供一种用于相对量化在由扩增的DNA得到的解链曲线谱图中存在的两种或更多种特定的解链峰的改进的方法。

本发明的其他目标是改进用于扩增和定量测量核酸的仪器和软件分析。

本发明特别关注实现用于精确量化双链DNA分子的技术，该双链DNA分子的长度从1000到30个核苷酸变化，特别是从500到30个核苷酸变化。在涉及长度为100个核苷酸或更小，特别是70-30个核苷酸的分子的研究中，得到特定的优点。

本发明的第一方面为包括背景信号和核酸解链信号的总和的原始解链曲线数据的信号-依赖性转化方法，以便使得数据为用于最终分析的最优形式。如下实现这一点：

-在温度-依赖性指数校正函数中优化一个或多个常数，使得在其中样品中的靶向核酸保持实质上双链的原始解链曲线的温度区域，总和信号强度的降低接近零，以及

-使用所述校正函数，特别是将整个原始解链曲线或其导数或关注的特定面积乘以所述校正函数，产生代表核酸解链信号的校正的核酸解链曲线。因此，校正的绝对量依赖于在每个给定的温度点的荧光信号值。

根据一个优选的实施方案，通过将测量的解链曲线乘以校正函数直接得到校正的解链曲线，该校正函数以指数方式依赖于温度。也就是，校正函数包括至少一个相对于温度具有指数行为的项。因此，不需要或进行单独的计算或从测量的信号减去背景信号。校正的原始解链曲线包括与样品中的靶向核酸的特定的解离相关的荧光信号。

根据一个实施方案，校正函数C(T)包括与K^BT成比例的校正项，其中K为指数基数，T为温度，B为定标因子。特别是，校正函数可为在以下详细描述中给出的数学形式。作为乘积C(T)F_meas(T)得到校正的解链曲线F_corr(T)，其中F_meas为测量的解链曲线。

根据一个实施方案，在应用校正函数之前将测量的解链曲线预先处理，以便校正曲线的总体水平中可能的偏差，或者校正函数本身包括一个或多个校正这种偏差的因子(因此，为了简化，术语“解链曲线”和F_meas可指原始的或经过偏差-校正的曲线的任一)。该偏差校正使得在解链转化之后的解链曲线的面积为零或接近零。偏差校正补偿可能存在的任何系统测量误差和/或系统(恒量)荧光背景。

可通过在靶向核酸不发生解离的区域使解链曲线归一化进行基数K的确定。实际上可通过优化校正因子(K)来实现这一点，使得在非解离区域内背景信号的变化接近零。例如，最小总和或最小二乘方法可用于优化K。之后，将依赖于每个点温度(或与预先规定的起始点的温度差异)的基于K的校正函数应用于解链曲线或其特定部分的所有的点。

为了得到解链峰曲线，计算校正的解链曲线的导数(通常为负导数)。本领域技术人员将理解，上述校正方法的等价物为其中对已求导的曲线进行相应的校正的方法。可应用乘法定则的导数，得到适用于这种情况的校正函数。也就是说，步骤的顺序不是关键的。

上述方法比起现有技术提供了显著的优点。作为测量的解链曲线的乘数的指数校正函数产生具有陡峭的解链区域的经背景-校正的解链曲线，其求导进一步产生其中位置接近的峰窄并且可良好区别的解链峰曲线。此外，校正考虑了在较高温度下每个分子的测量的信号水平比在较低温度下低。由详细说明中可见，本发明的方法补偿了该现象并引起较高温度峰朝上校正多于较低温度峰，因此产生用于进一步分析的精确数据。

在特定的分析应用中得到本发明的特殊的优点。例如，在使用高分辨率解链方案来检测单一核苷酸多态性的基因分型应用中，在已分析的核酸之间的序列差别最小化，并且解链温度的差别通常小于2℃。在这种类型的应用中，解链峰之间的距离部分取决于靶向模板的天然核苷酸序列。这导致在随后的解链曲线谱图中峰的部分重叠。当使用竞争性PCR技术(比如基因组-受控的RT-PCR)分析样品中的mRNA表达时，优选野生型和参比PCR扩增子的核苷酸序列的差别最小化，以确保共扩增的模板的扩增效率接近相等。通常，在这种类型的测定中，长度小于100个核苷酸的竞争性扩增的模板被量化，通常其核苷酸组成有3-7个碱基不同，导致在相应的PCR扩增子的解链温度中2-5℃的差别。在这种类型的应用中，可将特定的解链峰之间的距离调节至某一程度。然而，根据样品中的野生型和参比模板的初始量，峰的大小显著变化。峰大小的显著的变化可引起峰重叠，即使当在解链曲线谱图中相邻峰之间的距离大于3℃时。无论相邻峰的重叠是否由解链温度的小的差别或由峰大小的显著变化而引起，可使用本发明的各方面，有效和方便地分析这种峰。

本发明的第二方面为通过曲线拟合算法用于计算谱图中单独的解链峰的面积的方法，以得到在谱图中独立的、部分重叠的解链峰的面积的精确的数学估计。使用基于曲线拟合的峰面积代替实际的峰面积来计算在扩增反应之后存在于样品中的PCR扩增子的相对量。

通过曲线拟合而不是实际的峰来序贯估计峰面积的益处在于，可精确地估计谱图中的部分重叠峰的面积。在其中由于相邻峰的面积可观的差别而存在相邻峰重叠的情况和/或当单独的扩增子之间的解链温度的差别小时，这尤其是有益的。这导致精确定量测量相对峰面积，这对于使用竞争性扩增技术定量测量基因表达来说是基本的。通常，在这种类型的测定中，样品中的特定的PCR扩增子的解链温度为已知的。这允许预先确定解链范围(window)，其中对于独立的特定的解链峰，限定了温度上和下界限。通过自动化检测和曲线拟合存在于相同的谱图中的多个特定的解链峰，可使得测定分析自动化。

在竞争性PCR技术中，野生型模板与一种或多种参比模板在相同的反应中共扩增，具有相同的PCR引物对。这些模板的扩增同样受到单独的反应管瓶之间的扩增效率的变化的影响。因此，由在扩增后存在的野生型与参比PCR扩增子的比率，可确定在扩增之前起初存在于样品中的野生型模板的量。我们已观察到，由使用这种类型的测定产生的具有线性提高量的野生型模板和恒定量的参比模板的系列样品组成的校准曲线具有S形。为了使测定的动态范围最大化，有益的是进行定量数据的数学转化，使得校准曲线为线性。

本发明的第三方面为用于计算在扩增之前存在于样品中的核酸模板分子的绝对量的方法。通过具有线性增加量的野生型模板和恒定量的参比模板或反之亦然的样品进行竞争性扩增，对于每个分析的基因产生校准曲线。可如上所述进行原始解链曲线的数学校正和使用曲线拟合算法估计相对峰面积。得到的数据进行Logit-Log(分对数-对数)转化并产生校准曲线。在相对峰面积估计值的Logit(p)值(Log(p/(1-p))与野生型和参比模板R的相对量的对数Log R之间存在线性从属性。Logit-Log转化使校准曲线线性化，并因此显著增大测定的动态范围。在转化后，对于每个基因单独地计算必要的参数(也就是，线性回归斜率和y-截距值)，并储存于数据库。当参比模板的绝对量已知时，在PCR扩增之前存在于样品中的野生型模板分子的未知量可使用基因-特异性斜率和y-截距值，由野生型和参比扩增子的相对解链峰面积计算。

Logit-Log转化在免疫学测定中已广泛用于类似目的。其中的一个实例呈现于WO公布2002/076343。我们已观察到，这种类型的数学转化适用于基于PCR(特别是竞争性PCR)的测定，尽管PCR扩增具有指数性质。在这种测定中，恒定量的参比DNA模板与野生型模板竞争DNA聚合酶结合位点。这种情况已证实与免疫学测定类似，在免疫学测定中，恒定量的标记的抗原与样品中的抗原竞争抗体结合位点。应注意到，在竞争性PCR中使用Logit-Log转化的本观点可延伸至其他非免疫学的采用PCR的应用，用于计算模板分子的量，特别是在其中两种或更多种分析物竞争结合位点的情况下。这是在竞争性PCR中具有聚合酶和两种模板的情况。

以上讨论的本发明的三个主要方面的每一个对于使用解链曲线分析的核酸相对定量是独立有益的。本发明的这三个方面可独立使用，或者2-3个成组一起使用增加定量分析的最大精度。本发明的所有的三个方面可用于任何使用荧光或发光检测的解链曲线测定，其中样品包含具有单独的特定的解链温度的两种或更多种核酸分子。这种技术的实例为定量和/或竞争性PCR技术，比如描述于以下出版物的那些：Wang，A.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.86，9717-9721(1989)，Becker-André，M.&Hahlbrock，K.Nucl.Acids Res.17，9437-9446(1989)，Gilliland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87，2725-2729(1990)和Stenman，J.等人，Clin.Chem.52：111988-1996(2006)。另外的实例为各种基因分型应用，其实例在WO 2007/035806中给出；基于单一核苷酸多态性用于定量分析差异表达的等位基因的技术，如Kuokkanen M.等人，Gut 52，647-652(2003)所描述的；和用于定量分析差异表达的高度同源的基因的技术，如Stenman，J等人，Nat.Biotechnol.17，720-722(1999)所描述的。第一和第二方面或其部分也可用于仅含有单一核酸的样品。

本发明可例如用于确定在细胞或组织样品中mRNA转录物的相对量。当使用基因组-受控的RT-PCR技术用于该目的时，使用相同的PCR引物，序列-改变的cDNA模板与一种或若干参比DNA模板竞争性共扩增。在该技术中，可使用基因组DNA(gDNA)、合成的或克隆的DNA低聚物或聚合物作为参比DNA模板，使得在单独的反应管瓶之间的扩增反应效率的差别归一化。

通过使用解链曲线分析来测量在PCR循环期间或在扩增之后序列-改变的cDNA和参比DNA扩增子的相对量，可确定起初存在于样品中的mRNA转录物的相对量。由于在相同的反应管瓶中使用相同的引物扩增cDNA和参比DNA模板，相应的扩增子的相对量保持不变，即使当扩增反应进行至平台相时。通过使反应进行至平台相，使得信号进入测定的测量范围，而无论存在于样品中的起始模板的量，可利用这一点。这种类型的技术充分呈现于WO公布2005/116248，其基本内容通过引用结合到本文中。

类似地，通过mRNA模板的反转录和cDNA和/或DNA模板的竞争性共扩增和通过解链曲线分析的定量检测，本发明可用于用来确定天然存在于样品中的高度同源的mRNA或DNA模板的相对量的测定中。

下面，借助附图来描述本发明的实施方案和优点。

附图简述

图1a-1d说明对于根据本发明的一个实施方案的解链曲线校正函数，校正因子的确定。

图2说明通过计算测量的解链曲线-dF_meas/dT校正的解链曲线-dF_corr/dT的负导数产生的示例性解链峰。

图3a-3f举例说明对存在于样品中的两种扩增子的校正的解链峰的高斯函数拟合。

图4a和4b分别举例说明标准曲线的Log-Log图和使标准曲线的整个范围线性化的Logit-Log图(基因：dd3)。

具体实施方式

如上所讨论的，根据本发明的第一方面的方法包括分析由样品测量的核酸解链曲线，所述解链曲线包含作为温度的函数的至少两种核酸解链信号和背景信号的总和信号。所述方法还包括在温度-依赖性指数校正函数中优化至少一个常数，以便使在其中样品中的靶向核酸保持实质上双链的温度区域核酸解链曲线的变化最小化，并通过将所述指数校正函数应用于其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域，产生代表核酸解链信号的校正的核酸解链曲线。根据其他方面，本发明涉及用于精确估计解链峰面积的曲线拟合算法，和用于使校准曲线数据线性化以增加竞争性PCR测定的线性测量范围的数学转化。概括地说，本发明提供了强有力的工具，用于分析含有两种或更多种具有类似但可区别的解链温度的不同核酸的PCR-扩增的样品。

定义

术语“PCR扩增子”是指任何PCR-可扩增的模板分子的PCR产物。在竞争性PCR的上下文中，该术语通常是指通过特定的cDNA或DNA模板的扩增产生的PCR产物。在基于竞争性PCR的技术中，由使用相同的引物在相同的反应中共扩增的野生型和参比模板得到各自的扩增子。

术语“野生型模板”是指待分析的核酸模板。野生型cDNA模板在存在于初始样品中的mRNA物类的反转录期间产生，而野生型DNA模板天然出现在初始样品中。在分析之前，野生型模板的量通常是未知的。

术语“参比模板”是指包括在每一个扩增反应中并用于使扩增效率在管与管之间的变化归一化的核酸模板。在基因组-受控的RT-PCR的上下文中，参比DNA模板包括包含在样品中或加入到样品中的基因组DNA，或基因-特异性模板库(pool)，比如克隆的或合成的DNA低聚核苷酸或多聚核苷酸，用于每种分析的基因。在单个扩增反应中的野生型和参比模板使用相同的引物采用竞争性方式共扩增。基因-特异性合成的或克隆的参比模板通过连接或其他方式多联，以形成单个多聚核苷酸，用作若干基因的通用参比模板。

术语“共扩增”是指同时扩增两种或更多种模板。例如在竞争性PCR中，共扩增的模板可为在产生的扩增子内具有不同核苷酸序列的cDNA和/或DNA模板。作为术语在本专利申请中使用的共扩增的先决条件是，在用于扩增反应的引物-结合位点模板具有相同的核苷酸序列，并且在相同的反应管瓶中，采用相同的引物和其他试剂以竞争性方式进行所述模板的扩增。

测量的解链曲线的校正

如以上简略说明的，在本发明的第一方面，由特定的核酸解链转化之前的原始解链曲线的初始部分估计背景荧光，其中扩增的核酸保持实质上的双链。基于解链曲线的初始部分计算指数校正因子。随后将整个测量的荧光曲线乘以其中结合所述指数校正因子的温度函数。该转化使得背景信号的平均导数接近零。如果解链实验包括若干样品(这是通常的情况)，考虑存在于每个单个样品中的信号的量，对于每个独立的样品，单独进行转化。

因此，概括地，根据一个实施方案的方法包括以下步骤：

-优化校正因子K(其为指数校正函数的基数)，以使得在特定的核酸解链转化之前的范围内背景信号强度的变化接近零。

-将校正函数应用于解链曲线中的每一个温度点，以产生校正的解链曲线。

在特定的核酸解链转化之前的温度范围，使用测量的解链曲线的数据进行校正因子K的优化。所需的最小范围宽度取决于得到的温度数据点的频率，其为所用的特定的仪器的功能特征。基本上，使用两个数据点可形成斜率，但是优选3-5个数据点用于得到更可靠的结果。该范围通常宽度为至少1℃，特别是至少3℃，并优选至少6℃，在这种方式中，用于估计背景荧光的荧光信号不受样品中的特定的核酸的解链的影响。这确保样品中的背景荧光的比例被正确地估计。

本发明的方法使得背景荧光接近零并增加特定的核酸解链转化的动态范围。我们已观察到，这种类型的校正精确地估计由样品中的PCR扩增子的DNA链的温度-特异性解离而得到的由样品衍生的信号。当对于具有表面上等同面积的两个相邻的解链峰进行校正时，校正使在较高解链温度下得到的峰的面积大于在较低解链温度下得到的峰的面积。这是由于每个DNA分子的荧光信号为温度-依赖性的事实。

根据一个优选的实施方案，校正服从下式

$F_{\mathrm{corr}}\left(T\right)=\frac{1+K^{\mathrm{dT}}}{2}{F}_{\mathrm{meas}}---\left(1\right)$

也可以写成以下形式：

$F_{\mathrm{corr}}\left(T\right)=\left(\frac{1+{\mathrm{Ae}}^{\mathrm{BT}}}{2}\right)F_{\mathrm{mcas}}\left(T\right)---\left(2\right)$

其中F_meas(T)为测量的解链曲线，dT＝T-T₀，且常数A和B如下定义：B＝ln K，并且A＝e^-BT0。

还更通常，校正可写成下式

$F_{\mathrm{corr}}\left(T\right)=(C_1+C_2{e}^{C_{3}T})F_{\mathrm{meas}}\left(T\right)---\left(3\right)$

其中C₁、C₂和C₃为常数。可在固定C₁和C₂之后，根据对于C₃的上述优化原理，计算校正函数。

如本领域技术人员所理解的，指数校正项可采用多种方式写成数学公式。

参数T₀可从解链转化之前的范围相对自由地选择，由于其仅限定校正的起始点，因此设计校正方程式以得到F_corr(T₀)＝F_meas(T₀)。

通过计算经校正的原始解链曲线的负导数-dF/dT，产生典型的解链曲线谱图。与早期技术相比，本发明的益处在于，对整个解链曲线进行背景荧光影响的校正，这使得在解链曲线的整个范围内可以精确测量多个特定的解链峰。

实际上，在不关联的步骤中进行荧光测量，并且测量结果以某一阵列储存。因此可通过为该目的设计的计算机程序产品或在电子数据表程序中通过离散数学方法进行校正因子的计算。

以下将详细描述使用上述公式对经校正的解链曲线的计算。

图1a-1d举例说明使用上式(1)对校正因子K的优化。将该因子逐步增大以找到最优值，这使在曲线初始部分的经校正的曲线归一化。图1a说明其中不进行校正(K＝1)的情况。图1d说明最优校正(K＝1.077)，其使得解链曲线的非解离区域归一化。选择K-值的值，用来使用相同的公式校正整个曲线。可使用一阶总和或例如最小二乘方法，可实现曲线与标准水平(normal level)的偏差的总和最小化。

还应理解的是，可使用用于找到最优K-值的其他方法。这些可包括例如迭代或其他计算方法。

图2说明未校正的和校正的解链曲线的第一负导数。由数据可见，校正引起不同的扩增子的峰的相对高度改变。在未校正的数据中，峰高度的比率为184.5/365.5＝0.50，而在经校正的数据中，该比率为438.7/691.6＝0.63。由于温度的升高引起测量的信号变弱，可发现校正矫正了该方面的数据。因此，样品中扩增子的比例的以下计算更精确。

优选利用在计算机的中央处理单元中运行的计算机程序进行分析。在分析之前可进行以下准备步骤：

-从计算机的存储单元检索或直接从进行样品解链和信号获得的仪器得到温度和荧光数据，

-从数据库检索或从使用者接受野生型和参比扩增子的解链温度范围和优选的分析的标识数目或名称，和

-如果包括过多的数据点，从温度和荧光数据确定合适的开始和结束的点。

计算扩增子的比例

使用代表扩增子的量的曲线拟合，而不是直接使用测量的第一导数解链曲线峰，可由校正的解链曲线计算样品中的扩增子的相对量。

在该方法中，对于在经校正的第一导数解链曲线谱图中的第一峰进行曲线拟合，以便得到第一解链峰的面积的数学估计。随后计算经校正的第一导数解链曲线和所述曲线拟合的差，以得到残差的(residual)校正的解链曲线。对于在残差解链曲线中的第二峰进行第二曲线拟合，以得到第二解链峰的面积的数学估计。重复该程序所需的次数，以估计谱图中的每个特定的解链峰的面积。对于单独的解链峰，曲线拟合的面积用于确定存在于样品中的PCR扩增子的相对浓度。在竞争性PCR(比如基因组-受控的RT-PCR技术)中，野生型和参比DNA扩增子的相对浓度反映在扩增之前起初存在于样品中的野生型cDNA和参比DNA的量。在该技术的变体中，以不同的已知的浓度向样品中加入的两种或多种单独的参比DNA模板可与野生型cDNA模板一起共扩增。采用这种方式，由每个单个扩增反应可得到样品-特异性校准曲线，这样进一步提高分析的定量精度。

在基因组-受控的RT-PCR技术中，PCR扩增子的长度通常在30-70个核苷酸范围内。通常通过核苷酸置换来改变参比DNA模板的解链温度，而不会改变随后的PCR扩增子的长度。这导致野生型和参比DNA PCR扩增子的解链温度的差别小于5℃。当使用竞争性PCR和解链曲线分析进行基因分型应用或用于量化基于单一核苷酸多态性的差异表达的等位基因的表达水平时，扩增子之间的解链温度的差别通常小于3℃。此外，目前用于核酸解链的许多仪器，跨热部件(block)有一定程度的固有的温度变化。结果是，根据样品在部件中所处的位置，在解链曲线谱图中特定的核酸的解链峰将出现在稍微不同的温度。

重叠的相邻的解链峰引起显著的偏斜(skewing)。特别是，与显著较大的峰相邻的峰通常看起来仅是较大峰上的肩。在这种情况下，对实际的峰面积的估计困难并且不精确。本发明的曲线-拟合程序使得能精确估计存在于样品中的扩增子的相对量，特别是当相邻峰存在部分重叠和/或当峰面积的差别大的时候。

本发明的方法可在通常形成定量PCR系统的一部分的单独的计算机中或在PCR循环的中央处理单元中或在解链曲线仪器本身中进行。

实施例

通过描述解链曲线分析的主要步骤，本实施例举例说明本发明的各方面，其中样品含有具有不同的解链温度的两种核酸。

a)解链曲线的校正

以下呈现使用以上公开的原理，由解链曲线上的两个单独的温度点的校正进行计算的实例。其中特定的核酸不发生解离的预先规定的温度范围的值用于产生对整个解链曲线的最优校正。此处，T₀＝59.3(℃)，相应于用于记录测量中数据的起始温度。

表1.测量的解链曲线的校正的实例(在非解离区域)

点	温度	Fmeas	dT	(1+K^dT)/2	Fcorr
						1	59.3	0.1536			0.1536
12	62.2	0.1372
						13	62.5	0.1355	3.2	1.1328	0.1535
24	65.8	0.1175
						25	66.1	0.1155	6.8	1.3249	0.1530

表1证明，在校正函数(1+K^dT)/2中使用优化的校正因子K，使得在低于样品中的靶向核酸解链转化的温度下，经校正的荧光值接近相等。在校正后，原始(非求导的)解链曲线将为水平的，即，在非解离区域归一化。在解离区域和解离区域之后的经校正的曲线的行为示于附图。

b)解链峰面积的测定

可如下进行测量特定的解链峰的面积

-确定在校正的信号强度中变化率最大的位置，例如通过找到在解链曲线中出现的第一核酸的导数的最大值(出于该目的，可利用对各自的扩增子的预先确定的解链温度范围)，

-对于第一解链峰进行曲线拟合，例如通过优化所选的曲线形式(即，高斯)的宽度来拟合峰，即，直至发现曲线和第一解链峰的差别(即，残差曲线)最小(在图3a和3b(显示非最优的拟合)和图3c(显示最优的拟合)中举例说明)，

-当已确定曲线的宽度来拟合第一核酸解链峰时，计算在整个导数解链曲线的每个数据点的测量值-所述曲线值的差，以产生残差解链曲线(图3c)，

-通过找到信号的最大变化率，由残差解链曲线确定第二核酸的峰，例如通过找到在解链曲线中出现的第二核酸的导数的最大值(出于该目的，可利用对各自的PCR扩增子的预先确定的解链温度范围)，

-通过使用所述最大值作为曲线的最大值(图3e(非最优的拟合)和3f(最优的拟合))，通过优化曲线(即，高斯)的宽度进行曲线拟合，来拟合第一导数解链曲线中的第二核酸的峰，

-如果存在多于两种核酸，重复这些步骤，直至对于样品中的每个特定的核酸解链峰已进行曲线拟合，

-任选，用图表显示第一导数解链曲线和/或曲线拟合优度和/或计算的残差解链曲线，

-计算每个拟合的曲线的面积并使用这些面积来估计存在于样品中的各自的扩增子的相对量。

使用以上算法通常可进行曲线拟合自动化。然而，如果需要，还可完全或部分手动进行拟合。

c)计算样品中的核酸的绝对量

在本发明的一个实施方案中，产生校准曲线，以便量化在扩增之前存在于样品中的野生型模板分子的未知的绝对量。通过以恒定的增量，对具有已知的野生型/参比模板比率的样品进行扩增，产生该校准曲线。进行Logit-Log转化，其中通过公式Logit(p)＝log(p)-log(1-p)给出在0-1之间的数p的Logit，将S形校准曲线线性化。计算经线性化的校准曲线的线性回归斜率和y-截距值并储存于数据库。这些值用于自样品中的野生型和参比扩增子-求导的解链曲线面积的经Logit-Log转化的比率，计算在扩增之前存在于样品中的野生型模板的未知的绝对量。如下实现该计算：

-将系列样品中恒定量的参比模板与线性递增量的野生型模板共扩增。出于该目的，可使用具有与野生型和参比模板相同的核苷酸组成的合成的或克隆的DNA低聚-或多聚核苷酸，

-进行扩增子的解链曲线分析，由系列样品中的每一个得到cDNA和参比DNA-求导的解链曲线面积的比率，以产生校准曲线(优选，但不必需，使用根据本发明其他方面的解链曲线校正和/或解链峰面积计算)，

-进行相对曲线面积的Logit-Log转化，以便使得校准曲线线性化(图4a说明S形校准曲线(基因：dd3)的Log-Log图，图4b说明在Logit-Log转化之后的校准曲线)，

-对于包括在随后的分析中的每个基因，单独地由校准曲线计算线性回归斜率和y-截距值并储存于数据库，

-使用基因-特异性斜率和y-截距值，由野生型和参比扩增子-求导的解链曲线面积的样品-特异性比率，来计算起初存在于样品中的野生型模板分子的未知的绝对量，

由图4a可见，标准曲线的Log-Log图通常为S形的，但是示于图4b的Logit-Log函数在标准曲线的整个范围线性化(基因：dd3)。因此，增加了分析的线性动态范围。

然而，在放射免疫学测定的上下文中，Logit-Log转化的基本数学原理出现在Rodbard D.等人，Mathematical analysis of kinetics ofradioligand assays：improved sensitivity obtained by delayed addition oflabeled ligand(放射性配体测定的动力学的数学分析：通过延迟加入标记的配体得到的改进的灵敏度)，J Clin Endocrinol Metab.，1971年8月；33(2)：343-55。

以上描述的和在附图中显示的实施方案用于举例说明的目的而给出，不意在限制所附权利要求限定的本发明的范围。

Claims (23)

1.使用由样品测量的核酸解链曲线来分析含有至少一种核酸的样品的方法，所述解链曲线包含核酸解链信号和背景信号的总和信号作为温度的函数，所述方法包括

-在温度-依赖性指数校正函数中优化至少-个常数，以使在其中样品中的核酸保持实质上双链的温度区域核酸解链曲线的变化最小化，和

-通过将所述指数校正函数应用于其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域或其导数，产生代表核酸解链信号的校正的核酸解链曲线。

2.权利要求1的方法，其中将所述测量的解链曲线乘以指数校正函数，以得到所述校正的解链曲线。

3.权利要求1或2的方法，其中通过将在其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域的测量的核酸解链曲线乘以包括项K^T的指数函数或其数学等价物，产生所述校正的核酸解链曲线，其中K为常数校正因子，所述K使用来自靶向核酸不发生解离的解链曲线的区域的数据来优化。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述校正服从下式

$F_{\mathrm{corr}}\left(T\right)=\frac{1+K^{\mathrm{dT}}}{2}{F}_{\mathrm{meas}}\left(T\right),$

其中F_corr(T)为校正的解链曲线，F_meas(T)为测量的解链曲线，dT＝T-T₀，其中T₀为预先规定的起始温度，K为使用在其中样品中的靶向核酸保持实质上双链的温度区域测量的解链曲线优化的常数。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中在宽度为至少1℃，特别是至少3℃，优选至少6℃的温度范围内进行校正函数中常数的优化。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中计算校正的解链曲线的导数，以便得到解链峰曲线。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸解链曲线由通过PCR扩增，特别是竞争性PCR扩增处理的样品测量。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品含有两种或更多种具有不同的解链温度的不同的核酸。

9.权利要求8的方法，其中所述核酸解链曲线由含有野生型cDNA和参比DNA核酸的基因组-受控的RT-PCR样品测量。

10.权利要求8或9的方法，其中所述至少两种不同的核酸的解链温度的差别小于10℃，特别是小于5℃，优选0.5-5℃。

11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述至少两种核酸中每一种的长度小于500个核苷酸，有利地小于100个核苷酸，特别是30-70个核苷酸。

12.权利要求8-11中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤

-计算校正的解链曲线的第一导数以形成解链峰曲线，

-确定解链峰曲线的至少两个解链峰的面积，

-使用所述面积计算样品中的核酸的比例。

13.用于分析核酸的解链性质的系统，所述系统包含

-用于测量核酸解链曲线作为温度的函数的装置，所述解链曲线包含核酸解链信号和背景信号的总和信号，

-用于分析测量的解链曲线的计算单元，和

-用于将测量的解链曲线传递至所述计算单元的装置，

其中所述计算单元包含

-用于在温度-依赖性指数校正函数中优化至少一个常数，以便使在其中样品中的核酸保持实质上双链的温度区域总和信号强度的变化最小化的装置，和

-通过将所述指数校正函数应用于其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域或其导数，用于产生代表核酸解链信号的校正的核酸解链曲线的装置。

14.权利要求13的系统，其中所述计算单元适用于进行权利要求1-12中任一项的方法。

15.储存于计算机-可读的介质上用于分析核酸解链曲线的计算机程序产品，所述产品被设置成

-由数据文件读取测量的解链曲线数据，包括温度值和相应的信号值，

-基于所述数据，在温度-依赖性指数校正函数中优化至少一个常数，使在其中样品中的核酸保持实质上双链的温度区域总和信号强度的变化最小化，

-对其中核酸的链解离的测量的解链曲线的区域或其导数，使用所述指数校正函数计算校正的核酸解链曲线。

16.权利要求15的计算机程序产品，所述产品被设置成进行权利要求1-12中任一项的方法。

17.用于由含有至少两种核酸的样品测量的解链曲线确定核酸的比例的方法，所述方法包括

-通过除去背景信号的影响来校正测量的解链曲线，以形成反映样品中的靶向核酸的解链的校正的解链曲线，

-计算校正的解链曲线的第一导数以形成解链峰曲线，

-将数学函数例如高斯函数拟合至包含在解链峰曲线中的解链峰，

-使用所述拟合的数学函数估计解链峰的面积，和

-使用所述面积确定样品中的核酸的比例。

18.权利要求17的方法，其中所述拟合如下进行

-将第一数学函数拟合至在解链峰曲线上发现的第一峰，用于估计第一解链峰，

-通过从解链峰曲线中减去所述第一数学函数，计算残差曲线，

-将第二数学函数等拟合至残差曲线，用于估计第二解链峰，和

-任选地，重复前面的步骤，用于估计可能存在的其他解链峰。

19.权利要求18的方法，其中所述校正测量的解链曲线的步骤根据权利要求1-12中任一项进行。

20.用于由含有至少两种核酸的样品测量的解链曲线确定核酸的比例的方法，所述方法包括

-通过除去背景信号的影响来校正测量的解链曲线，以形成反映样品的真实解链的校正的解链曲线，

-计算校正的解链曲线的第一导数以形成解链峰曲线，

-估计解链峰的面积，和

-使用所述面积通过Logit-Log转化确定样品中的核酸的比例。

21.权利要求20的方法，所述方法包括

-提供用于量化核酸的量的校准曲线，所述校准曲线在至少两种已知的浓度下，由具有已知的核酸比率的样品得到，

-使用Logit-Log转化使校准曲线线性化，

-计算必要的参数来描述经线性化的校准曲线，和

-使用所述参数和所述解链峰的估计面积来计算在扩增之前样品中的核酸中的至少一种的绝对量。

22.权利要求20或21的方法，其中所述校正测量的解链曲线的步骤根据权利要求1-12中任一项进行。

23.权利要求20-22中任一项的方法，其中核酸的比例根据权利要求16-19中任一项来估计。

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