WO2007061274A1 - Kit universel pour la lyse cellulaire - Google Patents

Kit universel pour la lyse cellulaire Download PDF

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WO2007061274A1
WO2007061274A1 PCT/MA2006/000004 MA2006000004W WO2007061274A1 WO 2007061274 A1 WO2007061274 A1 WO 2007061274A1 MA 2006000004 W MA2006000004 W MA 2006000004W WO 2007061274 A1 WO2007061274 A1 WO 2007061274A1
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WO
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lysis
lysing
cell lysis
substance
solution
Prior art date
Application number
PCT/MA2006/000004
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English (en)
Inventor
Adnane Remmal
Bouchra Louaste
Original Assignee
Adnane Remmal
Bouchra Louaste
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Publication date
Application filed by Adnane Remmal, Bouchra Louaste filed Critical Adnane Remmal
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols

Definitions

  • the invention relates to the development of a composition of chemical substances, a cell lysis kit and an asceptant solution comprising at least two active substances.
  • the invention is concerned with cell lysis, which is the key step in all DNA preparations whether plasmidic, genomic or mitochondrial and in all extractions of all cellular proteins.
  • the invention is also concerned with the sanitization of hands, tools or surfaces on a hospital, industrial or domestic scale.
  • Detergents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), polyoxyethylene glycol (PEG), dodecylmaltoside (DM), Triton X-100 (TX-
  • Enzymes such as proteinase k, lysozyme, zymolyase, lyticase
  • NaOH Used in combination with SDS or with an enzyme like lysozyme For the alkaline lysis of some gram negative bacteria like
  • Detergents especially SDS which is the most used
  • SDS styrene-maleic anhydride
  • fungi and plant cells that have solid walls, detergents alone can not cause lysis.
  • Enzymes several enzymes are used in lysis solutions, their essential role being to degrade certain bacterial, fungal and plant cell wall connections to facilitate cell lysis.
  • the disadvantage of enzymes lies in four important points: firstly in their high cost.
  • NaOH has the function of making the medium very basic, which denatures certain proteins of the wall or of the membrane and facilitates cell lysis, but this effect is insufficient on its own and must necessarily be associated with the effect of other lysing agents.
  • a high concentration of NaOH can cause a strong denaturation of the proteins and compromise their use after extraction.
  • the object of the invention is to provide realistic solutions to the problems posed by combining at least two substances which have a lysing power, one of which has a synergistic effect with the other.
  • the invention is directed to the development of a chemical composition and a universal lysis kit and a sanitizing solution which are effective for treating Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungi, animal and plant cells and viruses in one step at a single temperature.
  • Universal kit for cell lysis means Kit allowing the manipulator to lyse different types of cells.
  • the first substance can be obtained by chemical synthesis or extracted from a natural product, for example the extracts by solvent or by distillation of certain aromatic plants. like thyme, oregano or clove.
  • the second substance may be preferably NaOH or SDS or a mixture thereof.
  • said first substance is carvacrol or thymol or eugenol or a mixture thereof at a concentration ranging from 0.1mM to 6.5mM and said second substance at a concentration of 0. 1N to 10N for NaOH and ranging from 0.1% to 5% for SDS.
  • Said at least first substance is dispersed in an aqueous solution of agar at a concentration of between 0.5 and 3% and said second substance is dissolved in distilled water.
  • the 0.2% concentration of agar is preferred for the dispersion of said first lysing substance.
  • the invention also proposes a universal lysis kit characterized in that contains: - at least one first container containing one of said first lysing substance, and
  • At least one second container containing one of said second substance which is a base or a detergent
  • At least one first container containing a first lysis substance selected from carvacrol, thymol, eugenol and the isomers and derivatives and mixtures thereof; and at least one second container containing a second substance capable of facilitating lysis cell selected from NaOH or SDS or a mixture thereof.
  • Said first container contains said first substance at a concentration ranging from 0.1 mM to 6.5 mM.
  • Said second container contains said second substance at a concentration ranging from 0.1 N to 10 N for NaOH and ranging from 0.1% to 5% for the
  • This kit will allow the manipulator to prepare extemporaneously a mixture, at the appropriate concentrations of the first lysante substance and the base
  • compositions for lysis are generally sterile solutions which can be prepared extemporaneously at the time of use.
  • an aqueous 0.2% agar-agar solution is used to obtain a stable dispersion of carvacrol, thymol or eugenol or their derivatives.
  • NaOH and SDS are placed in sterile aqueous solutions at concentrations of, for example, 0.1 N to 10 N for NaOH, and 0.1% to 5% for SDS.
  • composition of the invention makes it possible to lyse all types of cells and to release their cytoplasmic content more rapidly than with conventional lysis methods and at a single temperature (37 ° C.). This has the consequence of offering a kit that has the following advantages:
  • compositions of the invention are a simple, fast and effective means of facilitating the preparation of I 1 DNA and proteins from different cell types without changing products or protocols or using enzymes.
  • the advantages of the invention can be exploited in different fields of activity; examples include: research, diagnostics, industry (biotechnology).
  • the composition of the asceptant solution is: carvacrol, thymol, eugenol and the isomers and derivative and mixtures thereof at a concentration between 0.1 mM and 6.5 mM mixed with NaOH at a concentration ranging from 0.1 N to 1ON and / or SDS at a concentration ranging from 0.1% to 5%
  • composition of the invention has a potent lysing power and efficacy on the different types of treated cells compared to conventional lysis methods.
  • PCR amplification was performed on 1 I DNA E. chrysanthemi, S. cerevisiae and C. aibicans.
  • the DNA obtained after lysis with the kit according to the invention also gave satisfactory results in the bacterial transformation.
  • the emulsion of carvacrol (or thymol, or eugenol) is prepared by dispersion in an aqueous solution of sterile 0.2% agar at a final carvacrol concentration of 10% (v / v), the whole is vigorously vortexed (Remmal et al., 1993) Inhibition of antibacterial activity of essential oils by tweendO and ethanol in liquid medium Journal of Pharmacy of Belgium 48, 352-6).
  • the lysing agent is carvacrol.
  • the lysis kit according to the invention was manufactured by mixing the emulsion of carvacrol (or thymol) 1/10 th diluted 200, 100 and 50 times, ie at concentrations of 1/2000, 1 / 1000, 1/500, ie 0.325 mM, 0.65 mM and 1.3 mM with NaOH (0.2 N).
  • the lysing power was tested with either the SDS-NaOH or with the composition of the invention.
  • the temperature suitable for the composition of the invention is
  • Figure 1 shows the result of lysis ⁇ 'Escherichia coli and extracting plasmid DNA pUC18 I 1 and pUC18K3.
  • composition of the invention has a remarkable lysing power on E. coli compared to SDS-NaOH alone.
  • Figure 1 shows the same electrophoretic profile obtained with the lysis kit according to the invention than that obtained by alkaline lysis.
  • the integrity of the DNA obtained was subsequently verified using several manipulations: UV spectrophotometer determination at two wavelengths 260 nm and 280 nm and the ratio between these two absorbances was determined.
  • the experiment was conducted with two strains of Gram-negative bacteria (Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi). The same number of bacterial cells was treated with the following preparations:
  • the first sample is treated with 300 ⁇ l of the lysis kit according to the invention which is manufactured by mixing the emulsion 1/10 th of carvacrol (or thymol) diluted 300 times, that is to say at a concentration of 1/3000. or 0.21 mM, with SDS at a concentration of 1%.
  • the incubation time is 5 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the second sample is treated with 300 .mu.l of the lysis salt according to the invention which is manufactured by mixing the 1/10 emulsion lemé carvacrol (or thymol) diluted 200 times, that is to say at a concentration of 1 / 2000, ie 0.325 mM, with SDS at a concentration of 1%.
  • the incubation time is 5 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the third sample is treated with 300 ⁇ l of the lysis kit according to the invention which is manufactured by mixing the 1/10 th emulsion of carvacrol (or thymol) diluted 100 times, that is to say at a concentration of 1 / 1000, ie 0.65 mM, with SDS at a concentration of 1%.
  • the incubation time is 5 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the fourth sample is treated with 300 ⁇ l of the lysis kit according to the invention which is manufactured by mixing the 1/10 th emulsion of carvacrol (or thymol) diluted 50 times, that is to say at a concentration of 1 / 500, ie 1.3 mM, with SDS at a concentration of 1%.
  • the incubation time is 5 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the fifth sample (conventional method) is treated with 10 .mu.l of lysozyme 10 mg / ml and then incubated at 37 ° C for 20 to 30 minutes, supplemented with 20 .mu.l of SDS 25% the mixture is incubated 10 minutes at 60 0 C. Finally, the proteinase K is added at 200 ⁇ g / ml, the mixture is homogenized and then incubated for 1 hour at 42 ° C.
  • the product of each preparation is migrated agarose gel.
  • Figures 2 and 3 give the results of the lysis of E coli and E. chrysanthemi and the extraction of their chromosomal DNA.
  • composition of the invention has a high lysing power on E. coli and E chrysanthemi even at low concentrations compared to the conventional method which uses two enzymes.
  • the same number of bacterial cells was treated with the following preparations: Several samples were treated with 400 ⁇ l of the lysis kit according to the invention, which is manufactured by mixing the 1/10 th emulsion of the diluted carvacrol (or thymol). 50 times, ie at a concentration of 1/500, ie 1.3 mM, with SDS at a concentration of 1%. The incubation time is 15, 30 and 45 minutes at a temperature of 37 ° C. The fourth sample is treated with 1 ml of a solution containing 100 ⁇ g of lysozyme incubated for 30 minutes at 37 ° C. The preparation is treated with 100 ⁇ g / ml of proteinase K for 60 minutes at 37 ° C.
  • Figure 4 gives the results of the lysis of S. ausreus and the extraction of its chromosomal DNA.
  • the results of FIG. 4 show the effectiveness of the kit according to the invention against S. aureus which made it possible to lyse its wall and its envelope and to extract its genomic DNA.
  • the DNA preparations obtained after treatment with the kit according to the invention are in the form of bands of a good profile even during an incubation time of 15 minutes. In addition, these bands are similar to those of the DNA prepared by the conventional method that uses two enzymes (lysozyme and proteinase K).
  • the fourth sample is treated with 200 ⁇ l of the protoplast preparation buffer consisting of: 10 ⁇ l / ml 2-mercaptoethanol + 100 mM Tris-HCl (pH
  • FIG. 5 and 6 show the results of the lysis of S. cerevisiae and C. albicans and the extraction of their chromosomal DNAs.
  • the I-1 DNA profile obtained after lysis with the composition of the invention is similar to that obtained by the conventional method especially when the incubation is 45 and 60 minutes. This shows the effectiveness of lysis of the kit according to the invention even for cells known by the rigidity of their wall, such as yeasts.
  • Lysis of leukocytes and extraction of chromosomal DNA The experiment was conducted with leukocytes. The same number of cells was treated with the following preparations: Several samples were treated with 2 ml of the lysis kit according to the invention which is manufactured by mixing the 1/10 th emulsion of the diluted carvacrol (or thymol). 50 times, that is to say at a concentration of 1/500, ie 1.3 mM, with SDS at a concentration of 1%. The incubation time is 30, 60, 90 and 120 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the fifth sample (conventional method) is treated with 2 volumes of the solution containing Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M, EDTA (pH 8.0); 0.5% SDS and RNase (20 ⁇ g / ml); the incubation is carried out at 37 ° C. for 60 minutes. Proteinase K is added at a final concentration of 100 ⁇ g / ml and then incubated for 3 hours at 50 ° C. After precipitation of 1 I DNA, we have migrated the product. of each agarose gel preparation.
  • Figure 7 gives the results of leukocyte lysis and extraction of their chromosomal DNA.
  • composition of the invention allowed to lyse leukocytes for a minimum of 30 minutes and extracted later I 1 of chromosomal DNA with good electrophoretic profile compared to conventional lysis.
  • the experiment was conducted with plant cells (olive leaves, onion bulb and tomato skin). Each plant organ was milled separately and the same weight of each mash was treated with the following preparations:
  • the first sample is suspended in 15 ml of buffer (100 mM Tris-HCl pH 8 + 50 mM EDTA + 0.5 M NaCl ) and treated with 0.6 ml of the lysis kit according to the invention which is manufactured by mixing the emulsion 1/10 th of carvacrol (or thymol) diluted 50 times, that is to say at a concentration of 1 / 500, ie 1.3 mM, with SDS at a concentration of 1%.
  • the incubation time is 15 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • the second sample is treated with 15 ml of buffer (100 mM Tris-HCl pH 8 + 50 mM EDTA + 0.5 M NaCl + 10 mM 2-mercaptoethanol), supplemented with 1 ml of 20% SDS. Incubation is at 65 ° C for 15 minutes. After precipitation of the DNA, we migrated the product of each agarose gel preparation.
  • buffer 100 mM Tris-HCl pH 8 + 50 mM EDTA + 0.5 M NaCl + 10 mM 2-mercaptoethanol
  • Figures 8, 9 and 10 give the results of the lysis of tomato skin cells, olive leaves and onion bulbs and the extraction of their chromosomal DNA.
  • Microorganisms Five multidrug-resistant bacterial strains (numbered from 1 to 5) from the hospital environment were identified based on the different biochemical characteristics of the Api Bioméreux gallery.
  • the susceptibility test (Antibiogram) for the different strains shows that 1 - Staphylococcus aureus is resistant to AP, AX, CFI, GN, BA, PP 1 CO; 2-Enterobacter cloacae is resistant to AP, AX, AG, CF, CFZ, CFX, CFI, TB, NT, GN, CO, BA, RF, TC, PP; 3- AP-resistant Escherichia coli, AX 1 AG, CF 1 CF 1 CFI, TB 1 NT 1 RF 1 TC 1 PP; 4- Pseudomonas aeruginosa resistant to AP, AX, AG, CF 1 CFT 1 CFX, CFI, CFO, CO, BA 1 RF 1 CO 1 NA 1 OF; 5- Kle
  • washed bacterial cells A preculture of 18h is prepared for each of the strains studied in a volume of 5 ml of the liquid Muller Hinton nutrient medium (Difco) supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) at 37 ° C. with shaking. Then, one ml of the preculture is recovered and then centrifuged at 2700 g for 10 minutes.
  • Difco liquid Muller Hinton nutrient medium
  • the bacterial pellet obtained is resuspended in 1 ml of PBS (Phosphate Buffer Saline) [composition: 8 g / l NaCl; 0.2 g / l KCl; 1.13g / l Na 2 HPO 4 , 2H 2 O and 0.2g / l KH 2 PO 4 ].
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • This operation is repeated three times to obtain washed cells.
  • the effectiveness of the asceptant solution according to the invention was tested at decreasing concentrations of Thymol or Cravacrol (0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.03% and 0.025%) in combination with NaOH.
  • a high number of viable cells located between 10 9 and 10 11 CFU / ml of each strain of bacteria are brought into direct contact with the asceptant solution at different concentrations in a final volume of one ml of PBS.
  • the tubes (in duplicate) are incubated at 37 ° C for twenty four hours. After incubation, and for each tube, a calibrated drop of 25 .mu.l is diluted and then deposited on Muller Hinton agar medium. After 24h incubation at 37 0 C there are colonies on the first dilution to observe between 7 and 30 distinctly separate colonies.
  • CFU Colony Forming Units

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Abstract

La présente invention se rapporte à une composition de lyse cellulaire, un Kit universel de lyse cellulaire et une solution asceptisante comprenant comme première substance lysante le carvacrol, le thymol et leurs isomères et dérivés et mélanges comprenant également comme autre substance utiles pour la lyse ; du NaOH et du SDS. La composition et le Kit universel de lyse cellulaire peut être utilisé pour tous les types cellulaires (bactériennes, fongiques, animales et végétales) et pour les virus. La solution asceptisante est utilisable pour les mains et pour toutes les surfaces qui ont besoin d'être aseptisées.

Description

Uinvention concerne la mise au point d'une composition de substances chimiques, d'un kit de lyse cellulaire et d'une solution asceptisante comprenant au moins deux substances actives.
L'invention s'intéresse à la lyse cellulaire, qui constitue l'étape clé dans toutes les préparations d'ADN qu'elle soit plasmidique, génomique ou mitochondriale et dans toutes les extractions de toutes protéines cellulaires.
L'invention s'intéresse aussi à l'aseptisation des mains, des outils ou des surfaces à l'échelle hospitalière, industrielle ou domestique.
Discussion de l'art antérieur On connaît une multitude de protocoles et de techniques pour extraire I1ADN et les protéines. La principale différence entre ces protocoles réside dans l'étape de lyse cellulaire. Cette dernière varie selon qu'il s'agisse de bactéries à Gram négatif, de bactéries à Gram positif, de levures, de cellules animales ou végétales ou de virus. Plusieurs produits sont utilisés dans cette étape, on cite :
Les détergents tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), le polyoxyéthyleneglycol (PEG), le dodécylmaltoside (DM), le Triton X-100 (TX-
100), ou le N,N-diméthyldodécylamine N-oxide (DDAO) (Kragh-Hansen et coll.
1998), le perchlorate de sodium (Sambrooket al., Molecular cloning : a laboratoty manual, second édition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989), la mutanolysine
(Cote et coll 2000) et le Cetyl-Triméthyl-Ammonium-Bromides (CTAB),
Les enzymes tels que la protéinase k, le lysozyme, la zymolyase, la lyticase
(Wach et coll.1994) et la lysostaphine (Lyon et coll., 1983, Martineau et coll.,
1998). NaOH : Utilisée en association avec SDS ou avec un enzyme comme le lysozyme Pour la lyse alcaline de quelques bactéries à gram négatif comme
Escherichia coli. (Bron, 1990)
Certaines publications ont montré que certaines Huiles essentielles contenant comme composés majoritaires des substances phénoliques telles que le Thymol ou l'Eugénol et que des composés phénoliques purs tels que le thymol, l'eugénol ou l'Eugénol et que des composés phénoliques purs tels que le thymol, l'eugénol exercent leur activité antibactérienne ou antifongique par un mécanisme impliquant une altération des membranes et des parois bactérienne ou fongique. (Bennis et al., " surface altération of Saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol" Letters in Applied Microbiology. 2004, Vol. 38, Pages 454- 458)
(Rhayour et al., "the mechanism of bactericidal action of oregano and clove essential oils and their phenolic major components on Escheήchia coli and Bacillus subtilis" Journal of essential oil research. 2003, Vol.15, pp356-362. Cependant, ces publications ne montrent pas que les altérations induite par les huiles essentielles ou par leurs composés majoritaires phénoliques est un fait utilisable pour une bonne extraction de l'ADN ou des protéines cellulaires. La plupart des méthodes classiquement utilisées pour la lyse cellulaire en vue d'une extraction de l'ADN ou des protéines associent des enzymes, des détergents et du NaOH.
Ces méthodes classiques de lyse ont plusieurs inconvénients :
1) Les détergents (surtout le SDS qui est le plus utilisé) sont capables de provoquer des altérations des membranes cellulaires, ce qui en fait un agent de lyse pour les cellules sans paroi comme les cellules animales ou à paroi fragile comme certaines bactéries à Gram négatif. Pour les bactéries à gram positif, les champignons et les cellules végétales qui possèdent des parois solides, les détergents seuls ne peuvent pas provoquer la lyse.
2) Les enzymes : plusieurs enzymes sont utilisés dans les solutions de lyse, leur rôle essentiel étant de dégrader certaines liaisons au niveau de la paroi des cellules bactériennes, fongiques et végétales pour faciliter la lyse cellulaire. L'inconvénient des enzymes réside dans quatre points importants : premièrement dans leur coût trop élevé.
Deuxièmement, dans leur fragilité qui se manifeste par une perte d'activité pendant le stockage. - Troisièmement, dans le fait que pour chaque type de bactérie ou de champignon les enzymes sont différents, ce qui oblige un laboratoire ou une industrie qui doit lyser plusieurs types de cellules à disposer de plusieurs enzymes ou plusieurs kits de lyse différents.
Quatrièmement, dans le fait que la lyse enzymatique nécessite une longue durée d'incubation, ce qui n'est pas pratique pour le manipulateur qui doit effectuer d'autres étapes après la lyse.
3) NaOH : a pour fonction de rendre le milieu très basique, ce qui dénature certaines protéines de la paroi ou de la membrane et facilite la lyse cellulaire, mais cet effet est insuffisant à lui seul et doit obligatoirement être associé à l'effet d'autres agents de lyse. De plus, une forte concentration de NaOH peut provoquer une forte dénaturation des protéines et compromettre leur utilisation après extraction.
Par conséquent, II apparaît que les solutions et les kits de lyse classiquement utilisés dans l'art comportent des problèmes de coût, de perte de temps et de changement de préparations de lyse et de kits en fonction du type de cellule à lyser. Ce qui complique la pratique de la lyse quelque soit le niveau d'application (recherche, diagnostique, industrie).
Par ailleurs, on connaît une multitude de solutions aseptisantes utilisées en milieu hospitalier ou industriel pour l'aseptisation des mains ou des outils (matériel chirurgical, endoscopes) ou des surfaces de travail (sols, murs, paillasses). Ces solutions contiennent souvent des détergents divers, des solvants tels que l'éthanol, des agents fixateurs tels que le formaldéhyde et glutaraldéhyde, et substances chlorées telles que l'eau de Javel. Ces solutions aseptisantes présentent plusieurs inconvénients : Premièrement : elles sont corrosives et ou allergéniques pour les mains, les yeux et pour les outils.
Deuxièmement : Elles ne sont pas efficaces contre tous les germes, et conduisent rapidement à la sélection de germes résistants. Troisièmement : leurs prix sont souvent trop élevés. Quatrièmement : Ils ont souvent une odeur désagréable L'invention a pour but d'apporter des solutions réalistes aux problèmes posés en associant au moins deux substances qui ont un pouvoir lysant, dont Tune a un effet synergique avec l'autre.
L'invention s'intéresse à la mise au point d'une composition de substances chimiques et d'un kit universel de lyse et d'une solution aseptisante qui sont efficaces pour traiter les bactéries à Gram négatif, les bactéries à Gram positif, les champignons, les cellules animales et végétales et les virus et ceci en une seule étape à une seule température. Par Kit universel de lyse cellulaire, on entend : Kit permettant au manipulateur de lyser différents types de cellules.
L'invention propose une composition de lyse cellulaire et un kit de lyse universel caractérisés en ce qu'ils contiennent :
- au moins une première substance a pouvoir lysant choisie parmi le carvacrol, le thymol, l'eugénol et les isomères, dérivés ou mélange de ceux ci. - au moins une seconde substance qui facilite la solubilisation des protéines membranaires choisie parmi SDS, NaOH ou leur mélange La première substance peut être obtenue par synthèse chimique ou extraite d'un produit naturel par exemple les extraits par solvant ou par distillation de certaines plantes aromatiques comme le thym, l'origan ou le girofle. La deuxième substance peut être préférablement, le NaOH ou le SDS ou leur mélange.
Dans un mode de réalisation préféré, la dite première substance est le carvacrol ou le thymol ou l'eugénol ou un mélange de ceux-ci à une concentration allant de 0,1mM à 6,5mM et la dite deuxième substance à une concentration de 0,1 N à 10N pour le NaOH et allant de 0, 1 % à 5% pour le SDS.
La dite au moins première substance est dispersée dans une solution aqueuse d'agar a une concentration comprise entre 0,5 et 3% et la dite deuxième substance est mise en solution dans de l'eau distillée. Avantageusement, selon l'invention, la concentration 0,2% d'agar est préférée pour la dispersion de la dite première substance lysante.
L'invention propose également un kit universel de lyse caractérisé en ce qu'il contient : - au moins un premier récipient contenant une desdites première substance a pouvoir lysant, et
- au moins un second récipient contenant une desdites seconde substance, qui est une base ou un détergent
Ce Kit de lyse universel est caractérisé en ce qu'il contient :
- Au moins un premier récipient contenant une première substance de lyse choisie parmi Ie carvacrol, le thymol, l'eugénol et les isomères et dérivés et mélanges de ceux-ci et - Au moins un second récipient contenant une seconde substance capable de faciliter la lyse cellulaire choisie parmi le NaOH ou le SDS ou leur mélange.
Le dit premier récipient contient la dite première substance à une concentration allant de 0,1 mM à 6,5 mM.
Le dit deuxième récipient contient la dite deuxième substance à une concentration allant de 0,1 N à 10 N pour le NaOH et allant de 0,1% à 5% pour le
SDS.
Ce kit permettra au manipulateur de préparer extemporanément un mélange, aux concentrations appropriées de la première substance lysante et de la base
(NaOH) pour la lyse des bactéries en vue d'extraire l'ADN plasmidique, ou du détergent (SDS) pour la lyse des bactéries, des levures, des cellules animales et végétales ou des virus en vue d'extraire I1ADN chromosomique. Les compositions pour la lyse sont généralement des solutions stériles qui peuvent être préparées extemporanément au moment de l'emploi.
Pour la préparation de la composition, on utilise une solution aqueuse d'agar- agar à 0,2 % pour obtenir une dispersion stable du carvacrol, du thymol ou de l'eugénol ou de leurs dérivés. Le NaOH et le SDS sont mis en solutions stériles aqueuses à des concentrations par exemple de 0,1 N à 10 N pour le NaOH, et de 0,1% à 5% pour le SDS.
La composition de l'invention permet de lyser tous les types de cellules et de libérer leur contenu cytoplasmique plus rapidement qu'avec les méthodes de lyse classiques et à une seule température (37° C). Ceci a pour conséquence d'offrir un kit qui présente les avantages suivants :
- efficacité de lyse contre les bactéries à Gram négatif pendant seulement 5 minutes.
- efficacité de lyse contre les bactéries à Gram positif pendant un temps maximal de 45 minutes.
- efficacité de lyse contre les levures qui ont une paroi rigide pendant un temps maximal de 60 minutes.
- efficacité de lyse contre les leucocytes pendant un temps maximal de 120 minutes. - efficacité de lyse contre les cellules végétales pendant un temps maximal de 15 minutes.
- Efficacité de désintégration des capsides virales et libération du matériel génétique viral et de ses protéines.
De plus, il en résulte une diminution du coût de production du réactif étant donné les faibles concentrations de principes actifs utilisés.
Les compostions de l'invention représentent un moyen simple, rapide et efficace pour faciliter la préparation de I1ADN et des protéines de différents types de cellules sans changer de produits ou de protocoles ou utiliser des enzymes. Les avantages de l'invention peuvent être exploités dans différents domaines d'activités ; à titre d'exemple on peut citer : recherche, diagnostique, industrie (biotechnologie).
Etant donnée cette action surprenante de la composition de lyse cellulaire contre les différents types de cellules, il est judicieux de l'exploiter dans la mise au point d'une solution asceptisante pour lutter contre les cellules responsables de contaminations. En effet, aussi bien en milieu industriel qu'en milieu hospitalier, les gens sont confronté au problème de la contamination par des microorganismes (bactéries, champignons, parasites) et par des virus. Puisque les constituants de la solution asceptisante selon l'invention ne présentent aucun risque de toxicité aiguë ou chronique pour le manipulateur, son usage pour aseptiser les mains, les outils et les surfaces peut être d'une grande utilité pour lutter avantageusement contre la contamination. De plus, les constituants de la solution asceptisante ont une odeur agréable et sont par conséquent bien tolérés et même appréciés. Préférablement, la composition de la solution asceptisante est : le carvacrol, le thymol, l'eugénol et les isomères et dérivée et mélanges de ceux- ci à une concentration comprise entre 0,1 mM et 6,5mM mélangés avec du NaOH à une concentration allant de 0,1 N à 1ON et/ou du SDS à une concentration allant de 0,1% à 5%
Pour mieux comprendre l'objet de l'invention, nous allons décrire à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs quelques modes de mise en œuvre
II apparaît clairement des résultats qui suivent que la composition de l'invention a un puissant pouvoir lysant et une efficacité sur les différents types de cellules traitées comparées aux méthodes de lyse classiques. L'ADN extrait de ces différents types cellulaires a été quantifié et qualifié par mesure de l'absorbance à 260 nm et à 280 nm et en mesurant le rapport R = A260/A280 et par la digestion enzymatique. L'amplification par PCR a été réalisée sur I1ADN d'E. chrysanthemi, de S. cerevisiae et de C. aibicans. L'ADN obtenu après lyse par le kit selon l'invention a aussi donné des résultats satisfaisant dans la transformation bactérienne. Les résultats obtenus permettent de dire que l'ADN obtenu suite à la lyse par le Kit selon l'invention possède la qualité nécessaire pour être utilisé dans différentes manipulations de biologie moléculaire, ou pour le diagnostique et pour l'extraction de l'ADN ou des protéines à l'échelle industrielle. Exemple 1 Lyse des bactéries à Gram négatif et extraction de J'ADN plasmidique Préparation de l'émulsion du carvacrol
L'émulsion du carvacrol (ou du thymol, ou de l'eugénol) est préparée par dispersion dans une solution aqueuse d'agar 0,2% stérile à une concentration finale en carvacrol de 10% (v/v), le tout est vigoureusement agité au vortex (Remmal et al. (1993). Inhibition of antibacterial activity of essential oils by tweenδO and ethanol in liquid médium. Journal de Pharmacie de Belgique 48, 352-6).
L'expérience a été menée avec plusieurs souches de bactéries à Gram négatif.
L'agent lysant est le carvacrol. Le kit de lyse selon l'invention a été fabriqué en mélangeant l'émulsion de carvacrol (ou du thymol) au 1/10ême dilué 200, 100 et 50 fois, c'est à dire à des concentrations de 1/2000, 1/1000, 1/500 soit 0,325 mM, 0,65 mM et 1,3 mM avec le NaOH (0,2 N).
Le pouvoir lysant a été testé soit avec le SDS-NaOH soit avec la composition de l'invention. La température convenable pour la composition de l'invention est
37°C. Après précipitation de l'ADN, on fait migrer le produit de chaque préparation sur un gel d'agarose.
La figure 1 donne le résultat de la lyse ύ'Escherichia coli et l'extraction de I1ADN plasmidique pUC18 et pUC18K3.
Il apparaît clairement de la figure 1 que la composition de l'invention a un pouvoir lysant remarquable sur E. coli comparé au SDS-NaOH seuls.
En effet, la figure 1 montre le même profil éléctrophorétique obtenu avec le kit de lyse selon l'invention que celui obtenu par la lyse alcaline.
L'intégrité de l'ADN obtenu a été vérifiée par la suite en utilisant plusieurs manipulations: - Dosage au spectrophotomètre à UV à deux longueurs d'onde 260nm et 280nm et le rapport entre ces deux absorbances a été déterminé.
- Digestion enzymatique par des enzymes de restriction : EcoRI, Pstl et SaII.
- Transformation bactérienne avec les plasmides extraits.
Les résultats obtenus ont montré que le kit selon l'invention permet de préparer une bonne quantité d'ADN plasmidique avec un rapport de pureté R= A26o/A28o compris entre 1 ,8 et 1 ,9. La digestion enzymatique et la transformation bactérienne ont été réalisées avec succès et ce, en comparaison avec la méthode de lyse alcaline. Ceci montre que le Kit selon l'invention, permet d'obtenir du matériel génétique (ADN et Protéines associées) ayant gardé toute ses qualités pour être reconnu par les enzymes de restriction et traduit normalement dans les bactéries transformées. Exemple 2
Lyse des bactéries à Gram négatif et extraction de l'ADN chromosomique
L'expérience a été menée avec deux souches de bactéries à Gram négatif (Escherichia coli et Erwinia chrysanthemi). Le même nombre de cellules bactériennes a été traité avec les préparations suivantes :
Le premier échantillon est traité avec 300 μl du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant Pémulsion au 1/10eme du carvacrol (ou du thymol) dilué 300 fois, c'est à dire à une concentration de 1/3000, soit 0,21 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est de 5 minutes à une température de 37° C.
Le deuxième échantillon est traité avec 300 μl du h it de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant l'émulsion au 1/10 lemé du carvacrol (ou du thymol) dilué 200 fois, c'est à dire à une concentration de1/2000, soit 0,325 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est de 5 minutes à une température de 37° C.
Le troisième échantillon est traité avec 300 μl du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant l'émulsion au 1/10ème du carvacrol (ou du thymol) dilué 100 fois, c'est à dire à une concentration de1/1000, soit 0,65 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est de 5 minutes à une température de 37° C.
Le quatrième échantillon est traité avec 300 μl du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant l'émulsion au 1/10ème du carvacrol (ou du thymol) dilué 50 fois, c'est à dire à une concentration de1/500, soit 1,3 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est de 5 minutes à une température de 37°C.
Le cinquième échantillon (méthode classique) est traité avec 10 μl du lysozyme à 10 mg/ml puis incubé à 37°C pendant 20 à 30 minutes, additionné de 20 μl de SDS à 25% le mélange est incubé 10 minutes à 600C. Enfin, la protéinase K est ajouté à 200 μg/ml, l'ensemble est homogénéisé puis incubé 1h à 42°C.
Après précipitation de l'ADN, on fait migrer le produit de chaque préparation sur gel d'agarose.
Les figures 2 et 3 donnent les résultats de la lyse d'E coli et d'E. chrysanthemi et l'extraction de leurs ADN chromosomiques.
Il apparaît clairement des figures 2 et 3 que la composition de l'invention a un pouvoir lysant important sur E. coli et E chrysanthemi même à de faibles concentrations comparé à la méthode classique qui utilise deux enzymes
(lysozymes, protéinase K) mélangées au SDS.
L'analyse de ces figures montre Ia présence de bandes d'ADN chromosomique de taille supérieure à 12 kb. L1ADN obtenu par le kit de lyse selon l'invention ne présente pas de bandes d'ADN étalée sur le gel communément appelée "smear"
. On constate que l'intensité des bandes augmente progressivement en fonction de la concentration du carvacrol.
L'intégrité de l'ADN obtenu a été vérifiée par la suite en mesurant l'absorbance à
260 nm et à 280 nm et en mesurant le rapport R = A2eo/A28o et aussi par la digestion enzymatique et l'amplification par PCR. Les résultats obtenus montrent la fiabilité du kit de lyse selon l'invention, car l'ADN polymérase qui réalise l'amplification de l'ADN par PCR, a reconnu l'ADN obtenu après lyse par le kit selon l'invention et l'a répliqué normalement.
Exemple 3 Lyse des bactéries à Gram positif et extraction de l'ADN chromosomique
L'expérience a été menée avec deux souches de bactéries à Gram positif
(Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis). Le même nombre de cellules bactériennes a été traité avec les préparations suivantes : Plusieurs échantillons ont été traités avec 400 μl du kit de lyse selon l'invention, qui est fabriqué en mélangeant Pémulsion au 1/10èmedu carvacrol (ou du thymol) dilué 50 fois, c'est à dire à une concentration de1/500, soit 1,3 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est 15, 30 et 45 minutes à une température de 37°C. Le quatrième échantillon est traité avec 1 ml d'une solution contenant 100 μg de lysozyme incubé pendant 30 minutes à 370C. La préparation est traitée avec 100 μg/ml de protéinase K pendant 60 minutes à 37 0C.
Après précipitation de l'ADN, on fait migrer le produit de chaque préparation sur gel d'agarose.
La figure 4 donne les résultats de la lyse de S. aυreus et l'extraction de son ADN chromosomique.
Les résultats de la figure 4 montrent l'efficacité du kit selon l'invention contre S. aureus qui a permis de lyser sa paroi et son enveloppe et d'extraire son ADN génomique. Les préparations d'ADN obtenues après traitement avec le kit selon l'invention se présentent sous forme de bandes d'un bon profil même pendant un temps d'incubation de 15 minutes. De plus, ces bandes sont similaires à celles de l'ADN préparé par la méthode classique qui utilise deux enzymes (lysozyme et protéinase K). Les différentes préparations d'ADN ont subi des dosages à 260 nm et à 280 nm pour quantifier l'ADN et calculer le rapport R = A260/A280 et aussi des digestions enzymatiques. Ces expériences ont confirmé la bonne qualité et quantité de l'ADN extrait avec le kit de lyse selon l'invention.
Exemple 4 Lyse des levures et extraction de l'ADN chromosomique
L'expérience a été menée avec deux souches de levures (Saccharomycçs. cerevisiae et Candida. albicans). Le même nombre de cellules a été traité avec les préparations suivantes :
Plusieurs échantillons ont été traité avec 600 μl du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant Pémulsion au 1/10èmedu carvacrol (ou du thymol) dilué 50 fois, c'est à dire à une concentration de1/500, soit 1,3 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est 30, 45 et 60 minutes à une température de 37° C.
Le quatrième échantillon est traité avec 200 μl du tampon de préparation de protoplaste constitué de : 10 μl/ml 2-mercaptoéthanol + 100 mM Tris-HCI (pH
7,5) + 10 mM EDTA (pH 7,5) + 1 mg/ml de la zymolyase). L'incubation se fait à 37°C pendant 1 à 2h. La lyse est poursuivie avec l'addition de 200 μl de la solution (0,2 N NaOH, SDS 1%). Le mélange est incubé à 65°C pendant 20 minutes. Après précipitation de PADN, on fait migrer le produit de chaque préparation sur gel d'agarose. Les figures 5 et 6 donnent les résultats de la lyse de S. cerevisiae et de C. albicans et l'extraction de leurs ADN chromosomiques. Le profil de I1ADN obtenu après lyse avec la composition de l'invention est similaire à celui obtenu par la méthode classique surtout quand l'incubation est de 45 et 60 minutes. Cela montre l'efficacité de lyse du kit selon l'invention même pour des cellules connues par la rigidité de leur paroi comme les levures.
Les différentes préparations d'ADN ont subi des dosages à 260 nm et à 280 nm pour quantifier l'ADN et calculer le rapport R = A26o/A28o et aussi des digestions enzymatiques et des amplifications par PCR. Ces expériences ont confirmé l'intégrité de l'ADN extrait avec le kit de lyse selon l'invention. Exemple 5
Lyse des leucocytes et extraction de l'ADN chromosomique L'expérience a été menée avec les leucocytes. Le même nombre de cellules a été traité avec les préparations suivantes : Plusieurs échantillons ont été traités avec 2 ml du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant l'émulsion au 1/10ème du carvacrol (ou du thymol) dilué 50 fois, c'est-à-dire à une concentration de1/500, soit 1,3 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est 30, 60, 90 et 120 minutes à une température de 37° C. Le cinquième échantillon (méthode classique) est traité avec 2 volumes de la solution contenant le Tris-HCI (pH 8.0), 0,1 M, l'EDTA (pH 8.0) ; le SDS à 0,5% et la RNase (20 μg/ml); l'incubation se fait à 37°C pendant 60 minutes La protéinase K est ajoutée à une concentration finale de 100 μg/ml, puis incubée pendant 3 h à 500C. Après précipitation de I1ADN, nous avons fait migrer le produit de chaque préparation sur gel d'agarose. La figure 7 donne les résultats de la lyse des leucocytes et l'extraction de leur ADN chromosomique.
L'analyse de cette figure montre que la composition de l'invention a permis de lyser les leucocytes pendant un temps minimal de 30 minutes et d'extraire par la suite de I1ADN chromosomique avec un bon profil électrophorètique comparé à la lyse classique.
Les dosages à 260 nm et à 280 nm et le rapport R = A260/A280, ainsi que les digestions enzymatiques effectuées sur l'ADN extrait avec le kit de lyse selon l'invention ont montré son intégrité. Exemple 6
Lyse des cellules végétales et extraction de l'ADN chromosomique L'expérience a été menée avec des cellules végétales (feuilles d'olive, bulbe d'oignon et peau de tomate). Chaque organe végétal a été broyé séparément et le même poids de chaque broyât a été traité avec les préparations suivantes : Le premier échantillon est suspendu dans 15 ml de tampon (Tris-HC1 100 mM pH 8 + EDTA 50 mM + NaCI 0,5 M) et traité avec 0,6 ml du kit de lyse selon l'invention qui est fabriqué en mélangeant l'émulsion au 1/10eme du carvacrol (ou du thymol) dilué 50 fois, c'est à dire à une concentration de1/500, soit 1,3 mM, avec le SDS à une concentration de 1%. Le temps d'incubation est de 15 minutes à une température de 37°C.
Le deuxième échantillon est traité avec 15 ml de tampon (Tris-HCI 100 mM pH 8 + EDTA 50 mM + NaCI 0,5 M + 2-mercaptoéthanol 10 mM), additionné de1 ml de SDS 20 %. L'incubation se fait à 65°C pendant 15 minutes. Après précipitation de l'ADN, nous avons fait migrer le produit de chaque préparation sur gel d'agarose.
Les figures 8, 9 et 10 donnent les résultats de la lyse des cellules de la peau de tomate, des feuilles d'olive et des bulbes d'oignon et l'extraction de leur ADN chromosomique.
Après le traitement avec le kit selon l'invention pendant 15 minutes, nous avons pu obtenir des bandes d'ADN similaires à celles obtenues par le protocole classique. Les dosages à 260 nm et à 280 nm et le rapport R = A26o/A28o, ainsi que les digestions enzymatiques effectuées sur les différentes préparations d'ADN extrait avec le kit de lyse selon l'invention ont montré sa bonne qualité et quantité. Dans les six exemples précédents, Le SDS tout seul ou le NaOH tout seul utilisés comme agents de lyse ne donnent pas le résultat attendu. Le mélange SDS-NaOH ne donne pas de iyse correct non plus sauf dans l'exemple 1.
Exemple 7
Nous avons évalué l'effet antibactérien in vitro de la solution asceptisante sur des germes multirésistants aux antibiotiques. L'activité antibactérienne de la solution asceptisante a été vérifiée en milieu non nutritif pour vérifier son efficacité pour lutter contre les germes multirésistants aux doses les plus faibles possibles pour être utilisables comme agent antiseptique sur des surfaces inertes.
Microorganismes Cinq souches bactériennes multirésistantes (numérotées de 1 à 5) provenant du milieu hospitalier ont été identifiées en s'appuyant sur les différents caractères biochimiques de la galerie Api Bioméreux. Le test de sensibilité (Antibiogramme) pour les différentes souches montre que 1 - Staphylococcus aureus est résistant à l'AP, AX, CFI, GN, BA, PP1 CO ; 2-Enterobacter cloacae est résistante à l'AP, AX, AG, CF, CFZ, CFX, CFI, TB, NT, GN, CO, BA, RF, TC, PP ; 3- Esherichia coli résistante à l'AP, AX1 AG, CF1 CFZ1 CFI, TB1 NT1 RF1 TC1 PP ; 4- Pseudomonas aeruginosa résistante à l'AP, AX, AG, CF1 CFT1 CFX, CFI, CFO, CO, BA1 RF1 CO1 NA1 OF ; 5- Klebsiella pneumoniae résistante à l'AP, AX, AG, CF, CFT, CFZ, CFX, CFI, CFO, TB1 NT, GN1 CO1 BA, RF1 TC1 PP. [AP- Ampicillin ; AX- Amoxicillin ; AG- Augmentin ; CF- Cephalothin ; CFT- Ceftriaxone ; CFZ- Ceftazidime ; CFX- Cefoxitin ; CFI- Cefixime ; CFO- Cefotaxime ; TB- Tobramycin ; NT- Netilmycin ; GN- Gentamicin ; CO- Chloramphenicol ; BA- Bactrim ; RF- Rifampicin ; TC- Ticarcillin ; PP- Pîperacilline ; COL- Colistfn ; NA- Nafidixic Acid ; OF- Ofloxacin]. Préparation des cellules bactériennes lavées Une préculture de 18h est préparée pour chacune des souches étudiées dans un volume de 5 ml du milieu nutritif Muller Hinton liquide (Difco) supplémenté d'ampicilline (100μg/ml) à 37°C sous agitation. Ensuite, un ml de la préculture est récupéré puis centrifugé à 2700g pendant 10 minutes. Le culot bactérien obtenu est remis en suspension dans 1 ml de PBS (Phosphate Buffer Saline) [composition : 8g/l NaCI ; 0.2 g/l KCI ; 1.13g/l Na2HPO4, 2H2O et 0.2g/l KH2PO4]. Cette opération est répétée trois fois afin d'obtenir des cellules lavées. La taille d'inoculum est située entre 109 et 1011 UFC/ml (UFC = Unités Formant Colonie) pour les différentes souches étudiées. L'efficacité de la solution asceptisante selon l'invention a été testée à des concentrations décroissantes de Thymol ou de Cravacrol (0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.03% et 0.025%) en association avec du NaOH.
Un nombre élevé de cellules viables situé entre 109 et 1011 UFC/ml de chaque souche de bactérie est mis en contact direct avec la solution asceptisante à différentes concentrations dans un volume final d'un ml de PBS. Les tubes (en duplicate) sont incubés à 37° C pendant vingt quatre heures. Après incubation, et pour chaque tube, une goutte calibrée de 25 μl est diluée puis déposée sur milieu Muller Hinton gélose. Après 24h d'incubation à 370C on dénombre les colonies sur la première dilution permettant d'observer entre 7 et 30 colonies nettement séparées. Les témoins positifs non traités de chaque souche sont également dénombrés, le nombre d'UFC/ml (UFC = Unités Formant Colonie) trouvé est considéré comme inoculum initial de la souche concernée. Les résultats obtenus du nombre de cellules viables sont exprimés en Log de UFC/ml. Résultats
La souche S. aureus en PBS est beaucoup plus sensible vis-à-vis de la solution asceptisante selon l'invention car même à la concentration la plus faible (0.025% v/v) on trouve toujours qu'il y a absence totale de croissance (réduction 100%). Pour Pseudomonas aeruginosa, très réputée pour sa résistance aux agents antiseptiques la concentration 0.1% (v/v) est totalement bactéricide (réduction 100%). Pour les trois autres souches, les résultats montrent que le nombre de cellules viables exprimées en Log de UFC, après traitement par Ia solution asceptisante en milieu non nutritif (PBS), présente une réduction très significative du Log UFC/ml. Cette réduction est d'autant plus importante que la concentration de la solution asceptisante est élevée. Elle est fréquemment supérieure à 4 unités Log-io par rapport à la taille d'inoculum initiale ce qui correspond à une réduction du nombre de germes de l'ordre de 99,9%.

Claims

Revendications
1- Composition de lyse cellulaire caractérisée en ce qu'elle comprend :
- au moins une première substance lysante choisie parmi le carvacrol, le thymol, l'eugénol leurs isomères, dérivés et mélanges de ceux-ci.
- au moins une seconde substance capable de faciliter la lyse cellulaire choisie parmi le NaOH ou le SDS ou leur mélange.
2- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la première substance lysante est obtenue par synthèse chimique ou issue d'un composé naturel.
3- Composition selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la dite première substance lysante est le carvacrol ou le thymol ou un mélange de ceux- ci.
4- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la première substance lysante est dispersée dans une solution aqueuse d'agar comprise entre 0,1 et 0,3 %.
5- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la solution aqueuse d'agar est à 0,2 %.
6- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la dite première substance lysante est présente a une concentration comprise entre 0,ImM à 6,5mM et la dite deuxième substance capable de faciliter la lyse cellulaire est présente à une concentration comprise entre O,1N et ION pour le NaOH et comprise entre 0,1% et 5% pour le SDS.
7- Kit de lyse cellulaire universel caractérisé en ce qu'il contient :
- au moins un premier récipient comprenant au moins une première substance lysante choisie parmi le carvacrol, le thymol, l'eugénol, leurs isomères, dérivés et mélanges de ceux-ci et
- au moins un second récipient comprenant au moins une seconde substance capable de faciliter la lyse cellulaire qui est sélectionnée parmi le NaOH, le SDS ou le mélange de ceux -ci.
8- Kit de lyse cellulaire universel selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'on traite les cellules à lyser de manière simultanée ou séquentielle.
9- Kit de lyse cellulaire universel selon les revendications 7 à 8, caractérisé en ce que le dit premier récipient contient la dite première substance lysante à une concentration comprise entre 0,1 mM et 6,5 mM et, le dit deuxième récipient contient la dite deuxième substance capable de faciliter la lyse cellulaire à une concentration comprise entre 0,1 N à 10 N pour le NaOH et comprise entre 0,1% à 5% pour le SDS.
10- Utilisation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et /ou du kit de lyse cellulaire universel selon les revendications 7 à 9, pour l'extraction et/ou la purification de l'ADN et/ou des protéines cellulaires.
11- Solution asceptisante caractérisée en ce qu'elle contient la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 12- Solution asceptisante selon la revendication 11, caractérisée en ce que le carvacrol, le thymol, l'eugénol, leurs isomères, dérivés et mélanges de ceux-ci sont à une concentration comprise entre 0,ImM et 6,5mM mélangés avec du NaOH à une concentration allant de O,1N à ION et/ou du SDS à une concentration allant de 0,1% à 5%.
13- Solution asceptisante selon les revendications 11 à 12, caractérisée en ce que le carvacrol, le thymol, l'eugénol, leurs isomères, dérivés et mélanges de ceux- ci sont obtenus par synthèses chimiques ou issues d'un composé naturel.
14- Solution asceptisante selon les revendications 11 à 13, caractérisée en ce que cette solution est utilisée à l'état liquide ou à l'état de gel ou de crème dans l'aseptisation de mains.
15- Solution asceptisante selon l'une quelconque des revendications l i a 14, caractérisée en ce cette solution est transformée en gel ou en crème par addition d'excipients adéquats.
16- Utilisation de la solution asceptisante selon les revendications 11 à 15, dans l'aseptisation des mains, des outils et/ou des surfaces nécessitant une aseptisation.
17- Utilisation de la solution asceptisante selon la revendication 16, caractérisée en ce que les outils et/ou les surfaces nécessitant une aseptisation sont rincés, essuyés, aspergés ou immergés par ladite solution asceptisante.
18- Outil diagnostique comprenant la composition de lyse cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et /ou le kit de lyse cellulaire universel selon les revendications 7 à 9.
19- Outil de recherche comprenant la composition de lyse cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et /ou le kit de lyse cellulaire universel selon les revendications 7 à 9.
20- Outil de lyse pour l'exploitation à l'échelle industrielle comprenant la composition de lyse cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et /ou le kit de lyse cellulaire universel selon les revendications 7 à 9.
21- Procédé d'obtention de la composition de lyse cellulaire selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la première substance lysante est dispersée dans une solution aqueuse d'agar comprise entre 0,1 et 0,3 % et mélangée conjointement avec ladite deuxième substance capable de faciliter la lyse.
22- Procédé de lyse cellulaire, caractérisé en ce que les cellules à traiter sont incubées en présence de la composition de lyse cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou en présence du kit de lyse cellulaire universel selon l'une quelconque des revendications 7 à 8 à une température de 370C pendant une durée allant de lminute à 120 minutes sous agitation.
23- Procédé d'obtention de la solution asceptisante selon les revendications 11 à 15, caractérisé en ce que carvacrol, le thymol, l'eugénol, leurs isomères, dérivées et mélanges de ceux-ci sont dispersés dans une solution aqueuse d'agar comprise entre 0.1% et 0.3% puis mélangés avec du NaOH et/ou du SDS.
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