FR3027019A1 - Lipopeptides de bacillus pour lutter contre les legionelles - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella, comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide produit par des bactéries du genre Bacillus. La présente demande fournit aussi des procédés de traitement des eaux.

Description

1 Introduction La présente invention a pour objet un nouveau procédé de traitement des légionelles de l'espèce Legionella pneumophila dans tous les milieux potentiellement contaminés par cette bactérie.

Les légionelles sont des bactéries aquatiques que l'on rencontre dans les eaux naturelles (lacs, rivières et marais) et qui se développent particulièrement dans les eaux tièdes (entre 25 et 45°C). Ces bactéries sont responsables chez l'homme d'infections respiratoires aigües, les légionelloses (maladie du légionnaire, fièvre de Pontiac) ainsi que d'anomalies biologiques extra-pulmonaires non spécifiques. La maladie du légionnaire est considérée comme une infection opportuniste. En France, les données issues de la déclaration obligatoire font état de 1527 cas de légionellose déclarés en 2005, représentant une incidence de 2 cas pour 100000 habitants contre une estimation de 8000 à 18000 cas de légionellose chaque année aux États-Unis. A ce jour, environ 50 espèces de Legionella ont été identifiées. L'espèce L. pneumophila est la plus répandue et la plus virulente pour l'homme. Parmi les 15 sérogroupes de L. pneumophila (représentant 90 à 95% des cas cliniques), le sérogroupe (SG) 1 est responsable de 84 % des infections humaines dans le monde. Les légionelles colonisent naturellement les réseaux d'eau d'alimentation. Elles sont présentes dans les eaux réchauffées des systèmes de conditionnement d'air, des tours aéroréfrigérantes (TAR), dans les réseaux d'eau chaude sanitaire (cumulus) où elles se multiplient de façon optimale entre 30° et 40°C. Elles peuvent contaminer des établissements comme les piscines, les équipements de stations thermales, les fontaines et, dans les hôpitaux, les humidificateurs, les respirateurs ou les nébulisateurs.

La lutte contre les légionelles, en particulier dans les réseaux d'eau, est difficile. En effet, la bactérie se trouve rarement sous forme planctonique, mais est généralement associée à deux types d'interactions, à savoir avec les biofilms (Declerck et al., 2007) et avec des protozoaires dont, notamment, des amibes (Rowbotham, 1980). Dans les biofilms, les microorganismes sont associés de façon irréversible avec une surface et englobés dans une matrice extracellulaire constituée de polymères complexes (Hall-Stoodley et al. 2004). Ce mode de vie confère aux bactéries une résistance accrue aux conditions environnementales délétères et aux 3027019 2 biocides (Borella et al. 2005; Kim et al. 2002). Les légionelles sont aussi associées à des protozoaires (amibes), qui, en les ingérant, permettent leur croissance intracellulaire et leur réplication. Cette multiplication intracellulaire procure aux légionelles un environnement protecteur contre les agressions du milieu. Biofilms 5 comme amibes infectées permettent donc aux légionelles d'échapper aux traitements. Les bactéries peuvent ensuite reprendre leur croissance et recoloniser les systèmes de traitement d'eau. En conséquence, à l'heure actuelle, bien que les traitements utilisés contre Legionella soient nombreux, ils ne sont pas pleinement efficaces. La résistance aux traitements conférée par les biofilms et les amibes 10 circulantes pose ainsi un grave problème de santé publique. Il est donc crucial d'identifier et d'isoler de nouveaux agents antibactériens actifs contre Legionella et ce, même dans les biofilms et les amibes. Description Les inventeurs ont maintenant identifié de nouveaux agents capables de lutter contre 15 les légionelles et ce, même quand ces bactéries participent à des biofilms ou sont incluses dans des amibes. Les présents inventeurs ont en effet montré que des lipopeptides produits par des bactéries du genre Bacillus sont capables d'inhiber la croissance des bactéries Legionella en milieu solide et en milieu liquide. Cette inhibition est due à une 20 activité bactéricide, ce qui est particulièrement avantageux dans le domaine du traitement des eaux. En outre les lipopeptides de l'invention peuvent tuer les légionelles même quand celles-ci sont sous forme de biofilm, ce qu'aucun agent antilégionelle de l'art antérieur n'est capable de faire. La présente invention a donc pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des 25 bactéries du genre Legionella comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide produit par des bactéries du genre Bacillus. Toutefois, les procédés d'inhibition de la croissance des légionelles selon l'invention ne comprennent pas les méthodes de traitement du corps humain ou animal Par - lipopeptide », on entend ici des peptides généralement cycliques produits par 30 des bactéries telles que les Bacillus et les Pseudomonas. Ils sont principalement constitués d'une partie peptidique hydrophile, contenant préférentiellement de 7 à 10 acides aminés, reliés à une partie lipidique hydrophobe, le plus souvent un acide 3027019 3 gras. Les lipopeptides sont bien connus de l'homme du métier, en raison de leurs propriétés biologiques. Par exemple, un grand nombre d'entre eux ont des propriétés de tensioactifs ou ont des activités antibactériennes ou antifongiques qui leur ont attiré l'intérêt des industriels. Toutefois, c'est ici la première fois qu'une activité de 5 ces molécules contre des légionelles est mise en évidence. Chez les bactéries du genre Bacillus, les lipopeptides produits peuvent être groupés en trois grandes familles, chacune d'entre elle regroupant des molécules structurellement apparentées : la famille des surfactines, celle des iturines et celles des fengycines (Ongena et Jacques, 2008). Ces peptides cycliques arnphiphiles sont 10 composés de 7 (surfactines et iturines) ou 10 (fengycines) résidus d'acides aminés, liés à une unique chaîne d'acide gras beta-aminé (iturines) ou beta-hydroxylé (surfactines et fengycines). Dans un mode de réalisation préféré, le lipopeptide selon l'invention est donc choisi parmi les lipopeptides appartenant à la famille des surfactines, les lipopeptides appartenant à la famille des iturines et les lipopeptides 15 appartenant à la famille des fengycines. La famille des surfactines en particulier comprend les esperines, les lychedisines, les pumilacidines et les surfactines (Ongena et Jacques, 2008). Le lipopeptide de l'invention est donc choisi préférentiellement parmi les esperines, les lychedisines, les pumilacidines et les surfactines. Selon un mode de réalisation plus préféré, il est choisi parmi les surfactines ou les 20 pumilacidines. Par - surfactine », on entend ici un groupe de composés produits par des bactéries du genre Bacillus, notamment B. subtilis (Shaligram Et Singhal, 2010). La surfactine est connue dans l'art antérieur pour son fort pouvoir tensioactif, ainsi que son activité antibiotique contre des bactéries résistantes aux médicaments. D'ailleurs, un 25 grand nombre d'applications thérapeutiques de la surfactine ont été étudiées (Seydlovà et al., 2011). Toutefois, c'est ici la première fois qu'il est montré que la surfactine a une activité contre les légionelles. Par « surfactine » au sens de l'invention, on entend un lipopeptide cyclique formé d'un peptide de 7 acides aminés, contenant deux résidus L-leucine, deux résidus D- 30 leucine, un acide L-glutamique, un acide L-aspartique et un résidu L-valine, lié à un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 13 à 15 atomes de carbone. Alternativement, la surfactine selon l'invention peut comprendre un résidu L-valine à la place d'un des deux résidus L-isoleucine.

3027019 4 De préférence, la surfactine de l'invention est un composé représenté par la formule (I) L-Asp - D Leu - X 0 HC - R L-Val CH2 D-Leu - L Leu - L-G lu - C=0 5 (I) où X est L-Leu ou L-Val et R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 13 à 15 atomes de carbone. Préférablement, la surfactine selon l'invention est choisie parmi les surfactines A, B, Cet D.

10 Plus préférablement, la surfactine A correspond au composé de formule (I) dans lequel : CH3 R = - CH2 -CH CH3 Plus préférablement, la surfactine B correspond au composé de formule (I) dans lequel : CH3 R = -(C -CH 15 CH3 Plus préférablement, la surfactine C correspond au composé de formule (I) dans lequel : 3027019 5 CH3 R = -(CH2)9-CH CH3 Plus préférablement, la surfactine D correspond au composé de formule (I) dans lequel : CH3 R = -(C 2),v-CH CH3 5 Par « pumilacidine », on entend une famille de composés produits par des bactéries du genre Bacillus, notamment Bacillus pumilus (Naruse et al., J Antibiot, 43(3) : 267-280, 1990). Les pumilacidines étaient connues dans l'art antérieur pour leurs propriétés antivirales, notamment contre HSV-1 (Naruse et al., J Antibiot, 43(3) : 267-280, 1990), mais aussi pour être liées à des cas d'intoxications alimentaires 10 sérieuses (From et al., Int J Food Microbiol, 115(3) : 319-24, 2007). Toutefois, les présents inventeurs sont les premiers à avoir montré que les pumilacidines sont capables de tuer les légionelles. Par « pumilacidine » au sens de l'invention, on entend un acylheptapeptide cyclique composé de deux résidus L-leucine, deux résidus D-leucine, un acide L-glutamique, 15 un acide L-aspartique et un résidu L-isoleucine d'un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 12 à 15 atomes de carbone. Alternativement, les pumilacidines selon l'invention peuvent comprendre un résidu L-valine à la place du résidu L-isoleucine. De préférence, la pumilacidine de l'invention est un composé représenté par la 20 formule (II) : R-CHCH2CO-L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Leu-L-Asp-D-Leu-X 0 3027019 6 où R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 12 à 15 atomes de carbone et X est Lite ou L-Val. Préférablement, la pumilacidine selon l'invention est choisie parmi les punnilacidines A, B, C, D, E, F et G.

5 Plus préférablement, la pumilacidine A correspond au composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)9- ou CH3C 2CH(CH CH3 CH3 X = Lite. Plus préférablement, la pumilacidine B correspond au composé de formule (II) dans 10 lequel : R = CH3CH(CH2)9- ou CH3CH2CH(CH2)8 CH3 CH3 X = L-Val. Plus préférablement, la pumilacidine C correspond au composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)11- ou CH3CH2CH(CH2)10 15 CH3 CH3 X = Lite. Plus préférablement, la pumilacidine D correspond au composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)11- ou CH3CH2CH(CH2)1© CH3 CH3 20 X = L-Val.

3027019 7 Plus préférablement, la pumilacidine E correspond au composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH CH3 X = Lite.

5 Plus préférablement, la pumilacidine F correspond au composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(C CH3 X = L-Val. Plus préférablement, la pumilacidine G correspond au composé de formule (II) dans 10 lequel : R = CH3CH C 2 2 CH X = L-Val. Par « légionelle », on entend une bactérie du genre Legionella. Ce genre regroupe une cinquantaine d'espèces, dont notamment les espèces Legionella pneumophila, L. 15 jordanis, L. oakridgensis, L. dumofii, L. bozemanii, L. drozanskii, L. fallonii, L. rowbothamii, L. feeleii, L. micdadei, L. lytica et L. longbeachae. En particulier, L. pneumophila est la bactérie la plus importante en pathologie humaine. On connaît à l'heure actuelle 15 sérogroupes pour cette bactérie. Elle est l'agent responsable d'environ 90% des cas de légionelloses diagnostiqués en France. Le sérogroupe 1 est 20 le plus fréquent (70 à 90% des cas) puis le sérogroupe 6. De préférence, une légionelle au sens de l'invention est une bactérie de l'espèce L. pneumophila. Encore plus préférablement, la légionelle au sens de l'invention est une bactérie de l'espèce L. pneumophila et du sérogroupe 1 ou 6.

3027019 8 Les légionelles selon l'invention peuvent se trouver sous forme planctonique, c'est-à-dire sous la forme libre et circulante de la cellule bactérienne. Cependant, il est aussi connu que des légionelles telles que L. pneumophila peuvent aussi se trouver sous forme de biofilm. Par - biofilm », on entend ici un type 5 d'organisation de microorganismes dans laquelle les cellules adhèrent à une surface. Le plus souvent, les biofilms sont caractérisés par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice d'exopolymères. Dans un biofilm, les microorganismes et, en particulier, les bactéries, dont notamment les légionelles, sont sous forme sessile », c'est-à-dire attachés à la surface et vivant en communauté.

10 De nombreux microorganismes, dont les légionelles, forment des biofilms. Il est d'ailleurs considéré qu'il s'agit là du mode de vie naturel des microorganismes et, en particulier, des légionelles. La structure et la physiologie du biofilm donneraient aux microorganismes qui le constituent des conditions d'organisation sociale proches de celles qu'établissent entre elles les cellules eucaryotes au sein des tissus. Ainsi, les 15 biofilms constituent des réservoirs pour plusieurs espèces de microorganismes dont les légionelles, et leur fournissent une protection vis-à-vis des agressions extérieures, telles que les agents désinfectants, les antibiotiques, les antiseptiques, via la matrice extracellulaire. Par exemple, les légionelles ainsi protégées peuvent survivre à l'action d'un désinfectant puis reformer un biofilm ou être décrochées de celui-ci 20 et se retrouver dans l'eau circulante ou sous forme d'aérosol. Un biofilm selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs espèces de microorganismes. Préférentiellement, le biofilm selon l'invention comprend des cellules d'au moins une espèce de légionelle. Plus préférentiellement, le biofilm selon l'invention ne comprend que des cellules de légionelle. Plus préférentiellement 25 encore, le biofilm selon l'invention est constitué des cellules d'une seule espèce de légionelle. En outre, ces bactéries sont capables de se multiplier à l'intérieur de cellules de protozoaires telles que les amibes libres. Par - amibe », on entend ici un organisme unicellulaire du groupe des Rhizopodes capable d'émettre des pseudopodes. Les 30 - amibes libres » selon l'invention sont des amibes qui mènent une existence autonome dans l'environnement et sont totalement indépendantes de l'homme. Ce sont pour la plupart des espèces vivant dans les eaux, les sols humides et les mousses. Les légionelles sont capables de pénétrer dans des amibes libres, comme 3027019 9 par exemple, Acanthamoeba sp., Didasculus sp., Echinamoeba sp., Hartmanella sp., Mayorella sp., Naegleria sp., Schizopyrenus sp., Vahlkampfia sp., et de se multiplier dans des vacuoles. Après 36 à 48 heures d'infection, la vacuole de phagocytose emplit la quasi-totalité de la cellule hôte et contient un nombre important de 5 bactéries. Celles-ci sont ensuite libérées dans l'environnement et vont ainsi pouvoir de nouveau coloniser des biofilms, infecter d'autres amibes ou contaminer des personnes. Les amibes constituent une protection pour les légionelles et leur permettent de survivre pendant de longues périodes lorsque les conditions sont défavorables. Il est 10 en particulier bien connu que les amibes permettent aux légionelles d'échapper aux traitements visant à les éradiquer. Or les lipopeptides de l'invention sont capables de lyser les cellules de légionelles quand celles-ci sont non seulement sous forme libre, mais aussi sous forme de biofilm ou incluses dans des amibes. Il s'agit là d'un avantage très important de l'invention, puisque ces deux dernières formes 15 constituent les voies habituellement empruntées par les légionelles pour échapper aux traitements. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention a donc pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont sous forme planctonique. Dans un autre mode 20 de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont sous forme de biofilm. Dans encore un autre mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella comme décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont 25 sous forme intracellulaire dans des protozoaires, notamment des amibes. Les légionelles colonisent les milieux aqueux naturels et artificiels. Dans ces derniers, elles peuvent aussi être transportées par aérosols. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, celui-ci comprend le traitement d'un flux gazeux ou liquide avec les lipopeptides de l'invention.

30 L'inhibition de la croissance de bactéries du genre Legionella est très importante afin d'éviter des infections par les légionelles telles que la légionellose et la fièvre de Pontiac, qui sont provoquées par l'inhalation d'aérosols contenant des bactéries du genre Legionella. Les lipopeptides de l'invention permettent d'empêcher la survie et 3027019 10 la prolifération des légionelles dans l'eau, et de limiter leur diffusion sous forme d'aérosols. Ils sont ainsi particulièrement utiles pour prévenir les infections par les légionelles par le traitement des milieux aqueux artificiels, tels que les réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, les circuits de refroidissements 5 et les tours aéro-réfrigérantes des installations industrielles, les réseaux de climatisations, etc... Les lipopeptides de l'invention peuvent être appliqués à un site où l'on s'attend à la croissance de bactéries du genre Legionella, sans aucune limitation particulière. Comme expliqué plus haut, les légionelles selon l'invention sont présentes dans les 10 réservoirs naturels ou artificiels d'eau douce tels que les réseaux de distribution d'eau chaude sanitaire (ballons de réserve d'eau, douches, robinets), les systèmes de climatisation les tours aéroréfrigérantes, les eaux thermales ou encore les fontaines décoratives où elles prolifèrent dans l'eau stagnante et lorsque la température de l'eau est comprise entre 25 et 43°C. Le procédé d'inhibition de la croissance des 15 légionelles selon l'invention trouve donc une application, en particulier, dans la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissement des installations industrielles, ou des réseaux de climatisation. Selon cet aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé de désinfection des 20 milieux aqueux artificiels, comprenant l'utilisation des lipopeptides décrits ci-dessus. Préférentiellement, ces milieux aqueux artificiels sont des réseaux de distribution d'eaux sanitaires (notamment en milieu hospitalier) ou d'eaux industrielles, des réseaux de distribution d'eau domestique, des stations d'épuration, des circuits de refroidissement et des tours aéro-réfrigérantes des installations industrielles, des 25 circuits de géothermie, notamment des pompes à chaleurs, ou des réseaux de climatisation. Le procédé de désinfection de l'invention est particulièrement avantageux car il permet de lutter contre les légionelles sous toutes les formes. En particulier, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est mis en oeuvre pour lutter contre la prolifération de légionelles au sein 30 des biofilms dans les canalisations d'eaux. Le plus souvent, un flux gazeux ou liquide est traité avec les lipopeptides de l'invention. Les lipopeptides de l'invention peuvent ainsi être directement ajoutés aux eaux ou aux liquides circulant dans les canalisations ou dans les réseaux à 3027019 11 traiter. Il est également possible de les pulvériser, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse en aérosol, dans les réseaux, les cheminées, les installations et les surfaces industrielles à désinfecter. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un agent désinfectant contenant au 5 moins un des lipopeptides de l'invention. Préférablement, l'agent désinfectant de l'invention comprend la surfactine et/ou au moins une des pumilacidines. De façon avantageuse, l'agent désinfectant selon l'invention se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, par exemple dans de l'eau distillée. L'agent désinfectant peut aussi se présenter sous une forme pulvérisable, par exemple en 10 aérosol. L'activité inhibitrice de ces lipopeptides produits par les bactéries du genre Bacillus, et en particulier de la surfactine et des pumilacidines, vis-à-vis des légionelles a été mise en évidence par les inventeurs non seulement sur la forme planctonique de la bactérie, mais aussi sur la forme de biofilm et sur la forme à l'intérieur des amibes 15 libres. Etant donné le rôle essentiel joué par les amibes libres et les biofilms dans la prolifération et le maintien des légionelles dans le milieu extérieur, éléments qui conditionnent l'épidémiologie de la légionellose puisqu'il n'existe pas de transmission interhumaine, le procédé et l'agent désinfectant envisagé selon l'invention présentent de nombreux avantages, en termes de coût, d'efficacité et de respect de 20 l'environnement. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et Figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.

25 Légendes des figures Fig.

1 Test en goutte de la souche B. subtilis AM1 (colonie centrale) sur un tapis de L. pneumophila Lens. Fig.

2 Analyse par électrophorèse de l'amplification par PCR du gène sfp. Piste 1: Marqueurs de poids moléculaires; Piste 2: B. subtilis AM1 30 Fig.

3 Profil d'élution HPLC en phase inverse des biosurfactants produits par la souche B. subtilis AM1. L'élution a été suivie en mesurant l'absorbance à 205 nm 3027019 12 (ligne grise) et 214 nm (ligne noire). Les fractions active contre L. pneumophila sont indiquées par des flèches (->). Le gradient d'élution, exprimé en % acétonitrile, est représenté par les pointillés. Fig.

4 Analyse ESI-MS des biosurfactants purifiés de B. subtilis AM1. (a) Spectre de 5 masse de la fraction 11.2 min, (b) Spectre de masse de la fraction 15.3 min. Les temps d'élution renvoient à la figure 3. Fig.

5 Structures déterminées pour (a) la surfactine purifiée (1007 Da) et (b) la surfactine commerciale, sur la base des analyses en spectrométrie de masse. n = 710.

10 Fig.

6 Profil d'élution HPLC en phase inverse du mélange de surfactine commerciale. L'élution a été suivie en mesurant l'absorbance à 205 nm (ligne grise) et 214 nm (ligne noire). Les fractions active contre L. pneumophila sont indiquées par des flèches (->). Le gradient d'élution, exprimé en % acétonitrile, est représenté par les pointillés.

15 Fig.

7 Perméabilisation de Acanthamoeba castellanii en présence de surfactine. Les amibes ont été traitées avec des concentrations de surfactine allant de 0 à 66 ug/nnl. Les barres d'erreur représentent l'écart type calculé à partir de deux expériences indépendantes; la significativité statistique en comparaison du témoin est comme suit : *** p < 0.0001.

20 Fig.

8 Cellules de L. pneumophila restant attachées à la surface des cônes de polystyrène en présence de surfactine. Les biofilms ont été traités 2 heures avec des concentrations de surfactine allant de 0 à 66 ug/nnl. Les expériences ont été réalisées en triplicat. Les barres d'erreur représentent l'écart type calculé à partir de trois expériences indépendantes; la significativité statistique en comparaison du 25 témoin est comme suit : **p < 0.01; *** p < 0.0001. Fig.

9 Imagerie ApoTtome de biofilms âgés de 6 jours formés par des L. pneumophila marqués au DsRed. Les biofilms ont été traités 2 heures soit avec (a) de l'éthanol comme témoin ou (b) de la surfactine à 66 ug/nnl. Chaque image est représentative des resultats obtenus dans au moins deux expériences indépendantes.

30 Figure 10. Test en goutte des souches Bacillus sp. MS1 et MS2 (colonie centrale) sur un tapis de L. pneumophila Lens. A, Bacillus MS1 ; B, Bacillus MS2.

3027019 13 Figure 11. Caractère hémolytique des souches Bacillus sp. MS1 (A) et MS2 (B). Les deux souches présentent un halo autour des colonies indiquant une hémolyse du sang de mouton contenu dans la gélose. Figure 12. Test en puit de l'activité des extraits bruts de biosurfactants produits par 5 les souches Bacillus sp. MS1 (C2) et et MS2 (C3). Figure 13. Test bactéricide. Survie en % par rapport au témoin (diluant de l'extrait) d'une population de légionelles à 1 x 106 UFC/ml après 1 heure de contact avec les extraits bruts de MS1 (C2) et MS2 (C3) dilués au 1/20. Figure 14. Quantité de biofilm de Legionella restant à la surface des cônes après 2 10 heures de contact avec les extraits lipopeptides. Les barres d'erreur représentent l'écart type calculé à partir de trois expériences indépendantes. Figure 15. Profil d'élution HPLC en phase inverse des biosurfactants produits par les souches Bacillus sp. MS1 et MS2. L'élution a été suivie en mesurant l'absorbance à 205 nm (ligne grise) et 214 nm (ligne noire). Les fractions actives contre L. 15 pneumophila sont indiquées par des flèches ( ). Le gradient d'élution, exprimé en % acétonitrile, est représenté par les pointillés. A, Bacillus MS1 ; B, Bacillus MS2. Figure 16. Profil d'élution LC-MS des biosurfactants produits par les souches Bacillus sp. MS1 et MS2. Quatre ions ont été détectés de masses m/z = 1036,5, 1050,5, 1064,5 et 1078,5 Da, correspondant aux fractions 1 à 6 obtenues en HPLC. A, Bacillus MS1 ; 20 B, Bacillus MS2. Exemples Exemple 1 : Matériel et méthodes Souches, conditions de culture et réactifs 25 Les souches bactériennes utilisées dans cette étude sont listées dans les tableaux 1 et 2. Les souches de Legionella ont été cultivées à 37°C soit sur milieu BCYE (buffered charcoal yeast extract) gélose pendant 96 h ou en milieu BYE (buffered yeast extract) liquide sous agitation (150 rpm) pendant 30 h. La souche L. pneumophila Lens (CIP 108286) (Cazalet et al. 2008) a été utilisée comme modèle 30 pour la formation de biofilm. Cette souche a été cultivée en milieu liquide SBB 3027019 14 (supplemented biofilm broth), comme décrit par Pecastaings et al. (Pecastaings et al. 2010). Les bactéries qui n'étaient pas des Legionella ont été cultivées pendant 24 à 48h en milieu BHI (Brain Heart Infusion) liquide ou gélose, à 30°C ou 37°C selon la nature de la souche testée.

5 Tableau 1 : souches de Legionella utilisées Souches de Legionella CMI (pg/mi)a Legionella bozemanii ATCC 33217 1-2 Legionella dumofii ATCC 33279 1-2 Legionella longbeachae ATCC 33484 1-2 Legionella oakridgensis ATCC 33761 2-4 Legionella feeleii ATCC 35072 1 Legionella micdadei ATCC 33218 2-4 Legionella pneumophila Corby (Sg 1)b 2 Legionella pneumophila ATCC 33215 (Sg 6)b 2-4 Legionella pneumophila ATCC 33155 (Sg 3)b 4 Legionella pneumophila Lens CIP 108286 (Sg 1)b 4 Legionella pneumophila ATCC BAA-74 130b (Sg 1)b 2-4 Legionella pneumophila ATCC 33216 (Sg 5)b 2-4 a Les concentrations de surfactine sont exprimées en ug/nnl parce que la solution standard est composée d'un mélange d'isoformes avec des poids moléculaires differents. 10 bSg: Sérogroupe Les souches Legionella de référence ont été obtenues auprès de plusieurs collections: ATCC (American Type Culture collection) ou CIP (Collection Institut Pasteur). La 3027019 15 souche Corby provient du Centre National de Référence des Legionelles (Lyon, France). Tableau 2 : souches bactériennes utilisées dans cette étude Souches bactériennes CMI (pg/mi)a Enterococcus faecalis V583 > 256 Listeria monocytogenes EGDe ATCC BAA-679 > 256 Staphylococcus aureus ATCC 29213 > 256 Listeria ivanovii Li4pVS2 > 256 Bacillus subtilis AM1 LMG28342 > 256 Klebsiella pneumoniae 0502083 > 256 Proteus mirabilis ATCC 35659 > 256 Enterobacter cloacae D03 > 256 Pseudomonas aeruginosa PA14 > 256 Pseudomonas aeruginosa LMG 1242 > 256 Aeromonas hydrophila LMG 2844 > 256 Salmonella enterica J18 > 256 Flavobacterium breve LMG 4011 > 256 Escherichia coli LMG 2092 > 256 Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 > 256 5 a Les concentrations de surfactine sont exprimées en ug/nnl parce que la solution standard est composée d'un mélange d'isoformes avec des poids moléculaires differents. Gram-negative Gram-positive 3027019 16 Les souches bactériennes de référence ont été obtenues auprès de plusieurs collections : LMG (Library of Microbiology Universiteit Gent, Belgique), ATCC (American Type Culture collection), CIP (Collection Institut Pasteur). Les autres souches bactériennes proviennent de la collection de souches du laboratoire.

5 La production de biosurfactants a été obtenue en cultivant la souche AM1 de Baciilus subtilis en milieu MSM (minera( sait medium) additionné de glucose comme seule source de carbone (Janek et al. 2010). Un volume de 200 ml de milieu a été inoculé à D0600 = 0,01 à partir d'une préculture ayant poussé sur la nuit, avant d'être incubé pendant 96°C à 17°C sous agitation. La croissance de la souche AM1 a été suivie par 10 mesure de l'absorbance de la culture à 600 nm. La souche Acanthamoeba castellanii ATCC 30234 a été obtenue de l'ATCC (American Type Culture Collection). Les cultures axéniques de Acanthamoebae ont été cultivées en milieu PYG (peptone yeast glucose) (Schuster 2002) et incubées à 30°C. La surfactine a été obtenue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le mélange de 15 lipopeptides a été dissous dans l'éthanol à une concentration finale 10 mg/ml. La solution stock a été conservée à 4°C et diluée extemporanément dans de l'eau distillée stérile avant chaque expérience. Tous les autres réactifs ont été obtenus chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA) sauf mention contraire. Identification de la souche bactérienne 20 La souche AM1 a été identifiée par le séquençage du gène de son ADNr 16S. L'ADN génomique a été isolé à partir d'une culture liquide de la souche d'un jour en utilisant le kit Wizard SV Genomic DNA purification (Promega, Madison, WI, USA) selon les instructions du fabricant, et a servi de matrice dans une réaction d'amplification par PCR (polymerase chain reaction) avec les amorces 515F (SEQ ID 25 NO. 1 : 5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') et 1492R (SEQ ID NO. 2 : 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). L'amplification a été réalisée comme suit: dénaturation à 94°C pendant 30 s, annealing à 50°C pendant 30 s et extension à 72°C pendant 1 min, for a total of 30 cycles, avant une élongation finale de 5 min à 72 °C.

30 Les produits de la réaction de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% et purifiés avec un kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey- 3027019 17 Nagel, Bethlehem, PA, USA). Le séquençage de l'ADN a été réalisé avec le kit de séquençage ABI Prisnn BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) puis analysés à l'aide d'un séquenceur automatique, ABI Prisnn 3730 genetic analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Les données obtenues ont été 5 traitées par le programme Sequencing Analysis 5.1.1. La séquence de 830 pb obtenues avec l'amorce 1492R primer a été comparée avec les séquences de rADN présentes dans GenBank. La séquence nucléotidique partielle du gène ADNr 16S de la souche B. subtilis AM1 a été déposée dans GenBank (numéro d'accession : KJ778029). Détection du gène sfp par PCR 10 Un fragment de 675 bp (Nakano et al. 1992), correspondant aux positions 167-841 du gène sfp de B. subtilis (numéro d'accession GenBank : X63158.1), a été amplifié par PCR avec les deux amorces sfp-f (SEQ ID NO. 3 : 5'-ATG AAG AU TAC GGA AU TA-3') et sfp-r (SEQ ID NO. 4 : 5'-TTA TAA AAG CTC TTC GTA CG-3') comme décrit précédemment (Hsieh et al. 2004).

15 Les produits de PCR ont ensuite été séparés sur gel d'agarose 1%, purifiés et sequencés comme décrit ci-dessus. La séquence partielle du gène sfp de B. subtilis a été déposée dans GenBank (numéro d'accession : KJ778030). Extraction et purification des biosurfactants La souche AM1 de B. subtilis a été cultivée en milieu MSM pendant 96 h à 17°C. les 20 bactéries ont été éliminées par centrifugation (10,000 x g, 30 min, 4°C) et le surnageant stérilisé par filtration à travers un filtre de seringue de 0.22 [Inn (Millipore, Germany). Le surnageant acellulaire a ensuite été extrait successivement trois fois avec de l'acétate d'éthyle (1:1, v/v) avant l'évaporation du solvant sous vide. Les extraits ont été repris dans 5 ml d'un mélange H20/Acétonitrile (ACN) (3:2, 25 v/v). Ces extraits étant susceptibles de contenir plusieurs molécules, leur séparation a été entreprise par chromatographie liquide à haute performance. Les molécules ont été séparées sur une colonne Chromolith SpeedROD RP-18e HPLC en phase inverse (4,6 x 50 mm) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) avec une pompe HPLC Dionex P680, 30 équipé d'un détecteur Dionex Ultime 3000. L'élution a été suivie à 205 nm et 214 nm. La séparation a été réalisée dans un système de solvant 0.2% H20 /ACN/ acide formique (v/v). Après un lavage initial de 2 min en ACN 60%, l'élution a été obtenue 3027019 18 en 23 min à un débit de 0,8 ml / min avec un gradient linéaire de 6% à 100% ACN, suivi d'un lavage de 5 min en ACN 100%. Toutes les fractions collectées ont été lyophilisées et conservées à -20°C en vue des analyses ultérieures.

5 Analyses en spectrométrie de masse Les masses moléculaires des biosurfactants ont été déterminées par spectrométrie de masse en électrospray (ESI-MS) à l'aide d'un spectromètre de masse de type Xevo QTOF (Waters, Milford, MA, USA). Les échantillons ont été suspendus dans 50% ACN/0,2% acide formique (v/v) et analysés, en mode positif, par infusion à un débit 10 de 0,5 ml/min. La tension d'ionisation a été réglée à 3,0 kV, la température de la source à 120 °C et la température de désolvatation à 250° C. Les spectres LC MS/MS ont été obtenus en mode MSE (Waters, Milford, MA, USA). En bref, en mode MSE, les balayages en masse alternent pendant toute l'expérience entre des énergies de fragmentation faibles (10 V) et fortes (montant de 30 à 60V), ce qui génère pour la 15 même séparation LC (quelque soit le gradient) deux chromatogrammes correspondant aux analyses MS and MS/MS respectivement. Les spectres ont été mesurés entre 150 et 1500 Da. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du programme MassLynx comprenant l'outil BioLynx (Waters). Tests antibactériens in vitro 20 Tests en goutte La souche indicatrice, L. pneumophila Lens, a été étalée (100 pl d'une suspension à 108 CFU/ml) sur milieu BCYE gélosé. On a ensuite déposé une goutte de 10 pl d'une culture ayant poussé sur la nuit de la souche AM1 sur la surface de ce milieu gélosé avant de l'incuber pendant 96 h à 37°C.

25 Détermination de la concentration minimale inhibitrice de surfactine La concentration minimale inhibitrice (CMI) de surfactine a été déterminée selon la méthode de Verdon et al. (Verdon et al. 2008), à laquelle n'ont été apportées que quelques modifications mineures. Après solubilisation de la surfactine dans l'éthanol, des dilutions séquentielles de facteur deux ont été ajoutées à des suspensions 30 bactériennes (106 CFU/ml) en démarrant à la concentration de 265 pg/ml. Les microplaques contenant ces cultures bactériennes ont été incubées pendant 24 à 96 3027019 19 h à 30°C ou 37°C, selon la souche testée. La CMI a été définie comme la plus petite concentration de surfactine qui inhibe totalement la croissance visible d'une souche donnée après qu'elle a été incubée durant la période déterminée. Détermination de l'effet bactéricide 5 L'effet bactéricide de la surfactine sur des cultures L. pneumophila Lens en phase exponentielle a été déterminé comme décrit ci-après. Les cellules de L. pneumophila ont été cultivées jusqu'à ce que la D0600 atteigne une valeur comprise entre 0,4 et 0,8. Les bactéries ont été diluées à 106 CFU/ml environ en BYE, puis ont été incubées pendant 1 h à 37°C en présence de plusieurs concentrations de surfactine, la plus 10 basse étant de 8 pg/ml. Les bactéries ont ensuite été lavées par centrifugation (10000 x g, 5 min). Le nombre d'UFC a été déterminé en étalant des dilutions séquentielles de facteur dix des suspensions bactériennes sur des boites BCYE. Les boites ont été incubées pendant 72 h à 37 °C avant de compter les colonies. Viabilité des amibes en présence de surfactine 15 Les effets de la surfactine sur l'intégrité membranaire des trophozoïtes a été estimée en mesurant la fluorescence d'un agent intercalant dans l'ADN, le SYTOX Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dans les cellules traitées. A. castellanii ATCC 30234, a été cultivé de manière axénique en microplaque 96 puits dans du milieu PYG (peptone yeast glucose), puis dilué de façon à obtenir un 20 titre de 2 x 104 trophozoïtes par puit. Des concentrations sérielles de surfactine ont été réalisées en tampon PAS (Page's modified Neff's amoeba saline) à pH = 6,5 contenant 2 pM de Sytox green. L'éthanol a été utilisé comme témoin négatif. A. castellanii ATCC 30234 a été traité dans un volume total de 100 pL. Un témoin de la lyse spontanée des amibes a été réalisé en incubant les amibes avec du tampon ne 25 contenant pas de Sytox green (valeur 0 %), tandis qu'un témoin de la perméabilisation totale des cellules a été réalisé en ajoutant du Triton à 0,1 % (valeur 100 %). Après 2 heures d'incubation à 30° C, la fluorescence des échantillons a été mesurée à 535 nm après excitation à 488 nm avec l'appareil TriStar2 LB 942 Multidetection Microplate Reader et le logiciel ICE (Berthold technologies, France).

30 L'activité de perméabilisation des membranes par la surfactine a été exprimée en pourcentage des amibes perméabilisées. La manipulation a été réalisée en duplicats internes et externes et les données sont exprimées comme la moyenne ± l'écart- 3027019 20 type. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode d'analyse de la variance (ANOVA) et un test de Bonferroni en utilisant la version 5.04 de GraphPad Prism pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Production de biofilm 5 Un biofilm monoespèce de L. pneumophila Lens a été cultivé sur des microplaques Calgary (Calgary Biofilm Device, CBD; MBEC AssayTM PEtG, Innovotech, Edmonton, AB, Canada). La microplaque est pourvue d'un couvercle couvert de cônes en polystyrène sur lesquels, lorsqu'ils sont mis en contact d'un milieu inoculé sous agitation douce, un biofilm se forme.

10 Les cônes sont préalablement recouverts une nuit avec 200 pl / puits de milieu SBB (étape de - coating »), avant d'être inoculés avec 150 pl/puits d'une suspension bactérienne de L. pneumophila Lens à 106 UFC/ml. Les microplaques ont été scellées avec du parafilm afin d'éviter l'évaporation et incubées 6 jours à 37°C sous agitation douce (110 rpm). Le milieu a été renouvelé au bout de 3 jours. Les expériences ont 15 été réalisées en triplicats externe (duplicat ou triplicat internes). Effet de la surfactine sur les biofilms préformés Un biofilm préformé de 6 jours de L. pneumophila a été mis en présence de concentrations croissantes de surfactine. Après avoir été rincés pendant 1 minute en tampon salin, les couvercles de la microplaque de 96 puits, avec les biofilms attachés 20 aux cônes, ont été déposés sur une microplaque de 96 puits contenant 200 pl par puit de milieu SBB additionné de diverses concentrations de surfactine. Cette microplaque a été incubée pendant 2 h à 37°C sous agitation (110 rpm). Ensuite, le couvercle a été déposé sur une microplaque de 96 puits contenant 200 pl par puits de milieu BYE. La plaque a été soumise à une sonication durant 5 min dans un bain de 25 sonication à une puissance des ultrasons de 100 %(Bioblock Scientific 86480, Fisher, Illkirch, France). Les cellules ont été quantifiées en comptant les UFC sur des boites de BCYE. Les expériences ont été réalisées au moins en duplicats internes et en triplicats externes. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode d'analyse de la variance (ANOVA) et un test de Bonferroni en utilisant la version 5.04 de GraphPad 30 Prisnn pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Effet de la surfactine sur l'adhésion des Legionella 3027019 21 Afin d'évaluer l'effet de la surfactine sur l'adhésion des Legionella, une concentration de surfactine inférieure à la CMI a été ajoutée à un milieu liquide à une concentration finale de 2 pM durant l'étape de - coating ». Après 6 jours de contact, l'effet de la surfactine sur l'adhésion des cellules a été analysé par 5 comptage des UFC, comme décrit ci-dessus. Observation des biofilms de L. pneumophila au microscope Pour les analyses au microscope, des biofilms de L. pneumophila Lens marqués au DsRed (Bigot et al. 2013) ont été cultivés dans dans des microplaques de 24 puits en verre. La surface a été recouverte sur la nuit avec du milieu SBB avant que les puits 10 ne soient inoculés avec 2.106 UFC/ml d'une culture fraiche. Les biofilms ont été cultivés sans agitation à 37°C en changeant le milieu après 3 jours d'incubation. Ensuite, des biofilms âgés de 6 jours ont été traités pendant 2 h avec 66 pg/ml de surfactine. Le surnageant a ensuite été remplacé par du milieu SBB frais sans rinçage avant observation, des cellules planctoniques motiles étant clairement distinctes des 15 cellules fixes du biofilm (Pecastaings et al. 2010). Les biofilms ont été observés à l'aide d'un microscope inversé à épifluorescence (Axio Observer A1, Zeiss) avec un module ApoTome (acquisition pseudo-confocale) équipé avec un objectif 63X/1,25 (objectif à immersion). Les images ont été prises à l'aide du programme AxioVision 4.8.1 et traitées avec le 20 programme Imasis 7.4.1 et Zen (Zeiss). Chaque image représente les résultats d'au moins deux experiences indépendantes. Résultats Identification de la souche AM1 de Bacillus subtilis Il a été observé qu'une souche contaminante possède une activité anti-Legionella, 25 comme le montre un test en goutte sur boite de Petri (Fig. 1). En outre, l'inoculation de cette souche sur milieu gélose contenant du sang de mouton entraine la formation de cercles d'érythrocytes lysés autour des colonies bactériennes, ce qui indique une activité hémolytique. La comparaison de la séquence nucléotidique d'un fragment de 830 bp du 16S rDNA 30 de ladite souche avec les séquences présentes dans GenBank ont révélé une identité de 99% avec les séquences correspondantes des souches RC22 de Bacillus subtilis, F3- 3027019 22 2 de B. subtilis et M2-3 de B. licheniformis. Afin de confirmer cette identification, le gène sfp a été séquencé. Le gène sfp, qui code une enzyme de la superfamille des 4'- phosphopantetheinyl transférases, est requis pour la production de la surfactine (Hsieh et al. 2004), un lipopeptide hémolytique produit par un grand nombre de 5 membres du genre Bacillus et en particulier B. subtilis (Peypoux et al. 1999). L'amplification d'un fragment ayant la taille attendue de 675 pb a été obtenue avec deux amorces (sfp-f et sfp-r) spécifiques pour le gène sfp , ce qui indique que la souche contaminante a la capacité de produire la surfactine (Fig. 2). Le séquençage dudit fragment de 675 pb a révélé une identité de 99% avec le gène sfp de la souche 10 A21 de B. subtilis (numéro d'accession GenBank : JN005771). Pris dans leur ensemble, ces résultats indiquent que la souche contaminante est une souche de B. subtilis ; en conséquence, elle a été désignée B. subtilis AMI . La souche Bacillus AM1 a été déposée auprés de la Library of Microbiology Universiteit Gent, Belgium (LMG) et est référencée sous le numéro LMG28342.

15 Purification et caractérisation des biosurfactants anti-Legionella Les biosurfactants produits par B. subtilis AM1 ont été isolés en suivant une méthode en deux étapes. Tout d'abord, les biosurfactants ont été partiellement purifiés du surnageant de culture par extraction à l'acétate d'éthyle et ont été passés en HPLC en phase inverse sur une colonne C18. Les extraits bruts obtenus par l'extraction ont 20 été séparés en sept fractions comme il est montré dans la Fig. 3. L'activité anti- Legionella de chaque fraction a été testée, ce qui a permis d'identifier deux fractions, correspondant aux pics d'élution à 11,2 et 15,3 minutes, actives contre L. pneumophila Lens. Par la suite, ces deux fractions actives ont été caractérisées par ESI-MS. En ce qui concerne la première fraction, des ions moléculaires ont été 25 détectés à m/z 1008,62, 1030,64 et 1046,57 Da (Fig. 4a) qui ont été affectés respectivement à l'ion moléculaire protoné, l'adduit sodium (22 Da en plus) et l'adduit potassium (38 Da en plus). Pour la seconde fraction, des ions moléculaires ont été détectés à m/z 1036,63, 1058,62 et 1074,59 Da (Fig. 4b) qui ont de même été respectivement affectés à l'ion moléculaire protoné, l'adduit sodium et l'adduit 30 potassium. Les deux ions pseudomoléculaires intenses [M+H]' à m/z 1008 et 1036 Da indiquaient la présence de surfactine (Kowall et al. 1998). Les ions fils principaux obtenus sont listés dans le Tableau 3. Les fractions actives ont été analysées en LCMS/MS. Le spectre de fragmentation pour la première fraction était dominé par un pic à m/z 685 Da qui a été assigné à l'ion fils [NH2-AA2-AA7-COOH + H]' (Fig. 5a). En 3027019 23 outre, le pic à miz 895 Da indique la perte de 113 Da, provenant du double clivage d'une liaison ester dans le cycle et d'une liaison peptidique entre les deux derniers résidus d'acides aminés C-terminaux. La présence de cet ion a donc permis d'identifier le résidu leucine ou isoleucine à la position 7 (113 Da) (Fig 5a). Le 5 spectre MS/MS de l'ion parent 1036 a donné des résultats similaires et a permis d'identifier une chaine d'acide gras longue de 15 carbones pour la sous-unité lipidique (Tableau 3). Les deux biosurfactants ayant une activité anti-Legionella et produits par B. subtilis AM1 ont été assignés à des isoformes de la surfactine contenant tous deux un résidu leucine ou isoleucine à la position 7. Néanmoins, afin 10 de confirmer cette hypothèse, nous avons identifié tous les isoformes présents dans une solution de surfactine commerciale et vérifié l'activité anti-légionelle de ceux-ci. Le même protocole que celui décrit ci-dessus a été suivi pour l'analyse de la surfactine commerciale. L'extrait brut a été séparé en 12 fractions (Fig. 6), parmi lesquelles 5, correspondant aux pics ayant des temps de rétention de 10,1, 11,8, 15 14,2, 15,3 et 17,4 minutes, sont actives. Tableau 3 Principaux Ions pseudo- moleculaires (m/z) ions produits Isoformes surfactine (m/z) Temps Longueur de Espèce de rétention [M+H]' MS-MS surfactine chaîne d'acide (min) grasa 11.2 1008 990, 895, 685 [Leu or Ile 7] Ci3 15.3 1036 1018, 923, [Leu or Ile 7] Ci5 685 aLes longueurs de chaînes d'acides gras ont été déduites des différences de masse entre l'ion précurseur (colonne 2) et son cycle peptidique (colonne 4).

20 Toutes les fractions actives ont été caractérisées plus avant par ESI-MS et LC-MS/MS. Les ions pseudomoléculaires et les ions filles principaux observés dans les spectres de 3027019 24 masse des isomères de surfactine sont récapitulés dans le Tableau 4. Dix isoformes de surfactine, y compris les deux formes produites par B. subtilis AMI, ont été ainsi caractérisés. Ils diffèrent par la longueur de leur chaine d'acide gras et par la nature du résidu d'acide aminé à la septième position, ce qui est en accord avec l'art 5 antérieur (Kowall et al., 1998). Il est à noter que l'isoforme ayant une leucine en position 7 a été principalement détecté dans ces expériences. Dans les fractions testées, les isoformes avec un résidu valine en position 7 représentent seulement entre 5 et 16% des lipopeptides d'après la comparaison de la surface des pics. Comme toutes les fractions isolées testées étaient actives contre L. pneumophila 10 Lens, et comme de grandes quantités de composés actifs étaient requises pour les analyses suivantes, nous avons décidé de réaliser les tests biologiques avec la solution de surfactine commerciale. Tableau 4 Ions pseudo- Principaux Isoformes surfactine moleculaires (m/z) ions produits (m/z) Temps Longueur de Espèce de rétention [M+H]' MS-MS surfactine chaîne d'acide (min) grasa 10.1 994 976, 881, 685 [Leu7] C12 11.8 1008 990, 895, 685 [Leu7] Ci3 13.4 1022 1004, 909, [Leu7] C14 685 14.2 1022 1004, 909, [Leu7] C14 685 15.3 1036 1018, 923, [Leu7] Ci5 685 3027019 25 1032, 937, 17.4 1050 685 [Leu7] Ci5 'Les longueurs de chaînes d'acides gras ont été déduites des différences de masse entre l'ion précurseur (colonne 2) et son cycle peptidique (colonne 4). Spectre antibactérien de la surfactine 5 Afin de déterminer la sensibilité potentielle de différentes souches bactériennes, dont plusieurs souches de Legionella, à la surfactine, un test d'activité antibactérienne a été réalisé et la concentration minimale inhibitrice (CMI) déterminée pour chacune des souches testées. Les résultats sont donnés dans le Tableau 1 pour les souches de Legionella et dans le Tableau 2 pour les autres 10 souches. Il a ainsi été trouvé que la surfactine est active contre toutes les souches de Legionella testées, y compris des souches qui ne sont pas L. pneumophila, les souches de L. pneumophila qui sont du sérogroupe 1 et les souches de L. pneumophila qui ne sont pas du sérogroupe 1 (Tableau 1). De plus, les lipopeptides 15 inhibaient la croissance de toutes les souches de L. pneumophila à des concentrations faibles (2-4 ug/nnl). Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres espèces de Legionella, telles que L. bozemanii, L. dumofii, L. longbeachae, L. oakridgensis, L. feeleii and L. micdadei, avec des CMI comprises entre 1 et 4 pg/ml (Tableau 1). En revanche, toutes les autres souches bactériennes testées 20 étaient résistantes à la surfactine, même à la concentration testée la plus haute (265 pg/ml) (Tableau 2). La surfactine a aussi un effet bactéricide contre L. pneumophila en phase exponentielle. En effet, la population bactérienne est réduite de 2 log après avoir été traitée pendant 1 heure par 8 ug/nnl de surfactine. Pris dans leur ensemble, ces 25 résultats indiquent que la surfactine est active, in vitro, à des concentrations très basses contre Legionella sp., possède un spectre antibactérien presque limité à ce genre et a une activité bactéricide. Effet de la surfactine sur la viabilité des amibes 3027019 26 La sensibilité de Acanthamoeba castellanii a été évaluée en présence de plusieurs concentrations de surfactine. Un colorant à haute affinité de l'ADN qui pénètre facilement les cellules dont l'intégrité membranaire est altérée, le SYTOX Green, a été utilisé pour déterminer la perméabilité de A. castellanii (Fig. 7). Les résultats 5 montrent que le SYTOX Green a pénétré les cellules traitées à la surfactine, suggérant une perméabilisation de la membrane (Fig. 7). En outre, le nombre de cellules perméabilisées augmente avec la concentration de surfactine. La plus grande concentration de surfactine utilisée (66 ug/nnl) a ainsi induit presque 30% de perméabilisation. Les résultats indiquent donc que la surfactine est capable de 10 perméabiliser les trophozoïtes de A. castellanii à des concentrations élevées. Effet de la surfactine sur l'adhésion de Legionella et la stabilité du biofilm Des biofilms ont été cultivés pendant 6 jours sur des microplaques (MBECTM355 - PEtG). La dislocation d'un biofilm déjà formé après une incubation de 2 h avec la surfactine est montrée dans la Fig. 8. En comparaison avec le témoin non traité, 15 aucun détachement du biofilm n'a été observé avec des concentrations de surfactine entre 1 et 16.5 pg/ml. A des concentrations de 33 ug/nnl et de 66 ug/nnl, la surfactine entraine une réduction significative de la quantité de biofilm attaché sur les cônes de l'ordre de 70% (p<0.01) et 90% (p<0.001), respectivement (Fig. 8). Cependant, un préconditionnement de la surface suivi par un traitement continu 20 avec 2 ug/nnl de surfactine pendant 6 jours d'incubation n'était pas suffisant pour prévenir l'attachement initial des cellules de L. pneumophila planctoniques et la maturation du biofilm, aucune différence n'étant observée avec le témoin. Observation microscopique de l'activité anti-biofilm de la surfactine Afin de visualiser les effets de la surfactine sur un biofilm déja formé de L. 25 pneumophila, des biofilms de cellules de L. pneumophila Lens marquées à la dsRed ont été cultivés 6 jours sur des microplaques de 24 puits en verre sans agitation. L'expression de la dsRed permet de visualiser les bactéries par microscopie à fluorescence sans étape de marquage supplémentaire. La dislocation du biofilm formé après 2 heures de mise en contact avec 66 ug/nnl de surfactine a été analysée 30 à l'aide d'un microscope inversé à épifluorescence équipé avec le module ApoTome pour une acquisition pseudo-confocale. L'expérience a été répétée en mettant en contact les biofilms avec le diluant seul, comme témoin négatif. Le biofilm non traité est épais (30 [Inn) and présente un ensemble bactérien compact (Fig. 9a), alors que le 3027019 27 biofilm traité pendant 2 heures est plus fin (entre 6 et 14 pm) avec les quelques cellules attachées apparaissant dispersées sur la surface de verre (Fig. 9b). À faible grossissement (20X), on peut discerner des agrégats grands et nombreux dans le biofilm de L. pneumophila biofilm sur la surface de verre dans le témoin, alors que 5 très peu sont visibles dans l'échantillon traité. En conclusion, un traitement de 2 heures avec 66 pg/ml de surfactine permet de disloquer efficacement la plus grande partie d'un biofilm de L. pneumophila de 6 jours, ce qui est en accord avec les résultats de la numération des UFC dans le test d'adhésion bactérienne. Exemple 2 : 10 Identification des souches Bacillus sp. MS1 et Bacillus sp. MS2. Deux nouvelles souches du genre Bacillus ont été isolées au laboratoire. Celles-ci présentent une forte activité anti-légionelle, comme le montre un test d'inhibition sur boite (Figure 10). L'identification de ces souches par des techniques de séquençage (16S et gènes domestiques gyr et pyrE) indique que ce sont deux 15 nouvelles espèces bactériennes proches de Bacillus pumilus mais distinctes de celle- ci et des espèces qui lui sont associées (B. safensis, B. altitudinis, B. stratosphericus, B. aerophilus). Ces deux souches sont provisoirement nommées Bacillus sp. MS1 et Bacillus sp. MS2. Extraction et caractérisation fonctionnelle des biosurfactants produits par MS1 et 20 MS2 Les souches MS1 et MS2 présentent un caractère hémolytique sur gélose au sang (Figure 11) et le surnageant de culture en milieu LB de ces souches entraîne une diminution de la tension de surface. Ces caractères sont caractéristiques d'une souche produisant des biosurfactants.

25 Les biosurfactants produits par ces souches ont été extraits à l'acétate d'éthyle (ratio 1:1) du surnageant d'une culture de 100 ml en milieu LB sur la nuit. Après que cette extraction a été répétée deux fois supplémentaires, le solvant a été évaporé et le résidu repris dans 5 ml d'eau/acétonitrile (3:2). Les deux extraits de biosurfactants ont montré une activité inhibitrice sur L. 30 pneumophila lens (Figure 12). La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été évaluée par la méthode utilisée dans l'exemple 1 : une suspension bactérienne de 3027019 28 1x106 bactéries /ml a été incubée en milieu BYE supplémenté en Fer et cystéine en présence d'une gamme de dilution des extraits bruts de biosurfactants. La CMI correspond à la dilution la plus grande permettant d'inhiber la croissance des bactéries. Le test a permis de révéler qu'elle correspond pour MS1 comme pour MS2 à 5 une dilution de 1/80 de l'extrait brut. Un test pour déterminer l'effet bactéricide des deux extraits a été effectué selon le protocole de l'exemple 1. Les extraits bruts MS1 et MS2 à une dilution finale de 1/20 présentent une activité bactéricide sur Legionella comme l'illustre la Figure 13. Activité des extraits bruts de Bacillus MS1 et MS2 sur un biofilm préformé de 10 L. pneumophila Lens Des biofilms de L. pneumophila Lens ont été cultivés sur des microplaques Calgary (Calgary Biofilm Device, CBD; MBEC AssayTM PEtG, Innovotech, Edmonton, AB, Canada) comme indiqué dans l'exemple 1. Quand ils ont atteint l'âge de 6 jours, ils ont été traités 2 heures avec les extraits lipopeptides de MS1 et MS2 à des dilutions 15 finales de 1/20 et 1/80. Le biofilm restant après traitement a été décroché par sonication puis quantifié par numération des colonies sur gélose BCYE. Les expériences ont été réalisées en triplicats externe (duplicat ou triplicat internes). Les résultats pour les extraits bruts des souches de Bacillus (MS1 et MS2) sont présentés en Figure 14. Les deux extraits présentent une diminution de la quantité 20 de biofilm par rapport au contrôle (diluant du résidu, eau/acétonitrile). En effet, une dilution de 1/20 de l'extrait brut entraine une diminution de -90% par rapport au contrôle. Observation microscopique de l'activité anti-biofilm des extraits bruts de Bacillus MS1 et MS2 25 Des biofilms de Legionella pneumophila Lens exprimant la dsRed ont été cultivés sur des microplaques 24 puits à fond en verre en suivant le protocole de l'exemple 1. Des biofilms âgés de 6 jours ont été traités 2 heures avec les différents extraits à la dilution finale de 1/40. L'activité des extraits sur le biofilm a été évaluée par microscopie confocale.

3027019 29 Les extraits entraînent un décrochement du biofilm de Legionella pneumophila de manière très importante. Ceci est cohérent avec les résultats obtenus par comptage dans l'expérience précédente. Effet des extraits bruts de Bacillus MS1 et MS2 sur la viabilité des amibes 5 Acanthamoeba castellanii a. Test quantitatif au Sytox green Les activités des extraits bruts MS1 et MS2 non dilués ont été évaluées sur des trophozoïtes adhérés d'A. castellanii par la méthode quantitative du Sytox green, selon la méthode utilisée dans l'exemple 1.

10 Chacun de ces deux extraits a un effet cytotoxique significatif sur les trophozoïtes d'A. castellanii. Plus spécifiquement, les extraits de MS1 et MS2 entrainent une perméabilisation d'environ 17 % et 22 % des amibes, respectivement. b. Test qualitatif par microscopie confocale Afin de confirmer de manière qualitative les résultats obtenus par le test au Sytox 15 green, des trophozoïtes adhérés traités avec les extraits bruts MS1 et MS2 non dilués ont été observés en microscopie confocale. Les cellules ont été mises à adhérer la veille à 30°C sur des lames labtek 8 puits en milieu PYG. Le lendemain, les cellules ont été traitées durant 2 heures avec les extraits MS1 ou MS2 ou du tampon amibe (contrôle) préchauffé à 30°C. Le test a été 20 réalisé en duplicat interne. La lame a ensuite été observée à l'aide d'un microscope confocal (Olympus FV1000) et d'un objectif à immersion d'eau x60. L'observation des amibes au microscope confirme les résultats du test de cytotoxicité au Sytox green pour l'extrait MS1. En effet, il est possible de distinguer des cellules lysées par rapport au contrôle. Concernant l'extrait MS2, bien que le test 25 au Sytox green indique une perméabilisation significative des trophozoïtes, la microscopie confocale n'a pas permis de mettre en évidence cette activité. Purification et identification des molécules présentes dans les extraits bruts de Bacillus MS1 et MS2 Les extraits bruts de Bacillus MS1 et MS2 étant susceptibles contenir plusieurs 30 molécules, leur séparation a été réalisée par chromatographie liquide à haute 3027019 30 performance. Les molécules ont été séparées sur une colonne Chromolith SpeedROD RP-18e HPLC en phase inverse (4,6 x 50 mm) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) avec une pompe HPLC Dionex P680, équipé d'un détecteur Dionex Ultime 3000. L'élution a été réalisée en 28 min à un débit de 0,8 ml / min avec un gradient 5 linéaire de 60% à 100% d'acétonitrile. Les chromatogrammes obtenus par HPLC suite à l'injection de 1 ml d'extrait dilué au 1/2 sont présentés dans la Fig. 15. Pour chacun des extraits, six fractions ont été collectées (1 à 6) et lyophilisées en vue de déterminer leur activité sur Legionella pneumophila Lens. L'activité inhibitrice des différentes fractions a été testée en 10 milieu liquide comme expliqué dans l'exemple 1, ce qui a permis de vérifier que l'ensemble des fractions était actif. Les molécules présentes dans les extraits MS1 et MS2 ont été identifiées par spectrométrie de masse en electrospray (ESI-MS), selon la méthode détaillée dans l'exemple 1 (Fig. 16) : 15 - pour MS1, après LC-MS, 4 masses ont été détectées (1036,5, 1050,5, 1064,5 et 1078,5 Da), correspondant aux fractions 1 à 6 obtenues en HPLC. - pour MS2, après LC-MS, 4 masses ont été détectées (1036,5, 1050,5, 1064,5 et 1078,5), correspondant aux fractions 1 à 6 obtenues en HPLC. Dans la littérature ces masses correspondent à des lipopeptides, les pumilacidines A 20 à G (Kalinovskaya et al., 2002). La structure de ces lipopeptides est très proche de celle de la surfactine. Afin de déterminer plus précisément les isoformes de pumilacidine présents dans nos extraits, de la fragmentation MS/MS a été réalisée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3. Les molécules actives contre Legionella sous forme sessile et planctonique des 25 extraits MS1 et MS2 correspondent donc à différents isoformes de la pumilacidine. Cette étude montre pour la première fois l'activité de la pumilacidine sur Legionella. De plus, une nouvelle forme de pumilacidine (pumilacidine H) a été identifiée. Références Abdel-Mawgoud AM, Aboulwafa MM, Hassouna NA (2008) Characterization of surfactin 30 produced by Bacillus subtilis isolate BS5. Applied biochemistry and biotechnology 150(3):289-303 doi:10.1007/s12010-008-8153-z 3027019 31 Arima K, Kakinuma A, Tannura G (1968) Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin dot formation. 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Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Procédé d'inhibition de la croissance des bactéries du genre Legionella, comprenant l'utilisation d'au moins un lipopeptide produit par des bactéries du genre Bacillus.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit lipopeptide est choisi parmi les lipopeptides appartenant à la famille des surfactines, les lipopeptides appartenant à la famille des iturines et les lipopeptides appartenant à la famille des fengycines.
3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit lipopeptide est choisi entre : - le composé de formule (I) : L-Asp - D-Leu X - 0 HC - R L-Val CH2 D-Leu - L-Leu - L-G u - C=0 (I) où X est L-Leu ou L-Val, et R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 13 à 15 atomes de carbone, et - le composé de formule (II) : R-CHCH2CO-L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Leu-L-Asp-D-Leu-X 0 où R est un acide gras beta-hydroxylé linéaire ou ramifié contenant de 12 à 15 atomes de carbone et X est Lite ou L-Val.
4. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est un composé de formule (I) dans lequel : 3027019 40 CH3 CH3 CH3 CH3 I I R = - C 2)7-CH- ou R = '<C| z CH- ou R = - C 2 -CH- ou R = - 0-CH- 1 1 CH3 CH3 CH3 CH3
5. 5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit lipopeptide est choisi parmi : - un composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)9- ou CH3CH2CH(CH2)8 5 CH3 CH3 X = Lite ; - un composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)9- ou CH3CH2CH(CH2)8 CH3 CH3 X = L-Val ; 10 - un formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)ii- ou CH3CH2CH(CH2)10 CH3 CH3 X = Lite. - un composé de formule (II) dans lequel : R = CH3CH(CH2)ii- ou CH3CH2CH(CH2)10 CH3 CH3 15 X = L-Val ; - un composé de formule (II) dans lequel : 3027019 R = 0-130-1(C CH3 X = Lite ; - un composé de formule (II) dans lequel : R = C CH(CH2)io CH3 5 X = L-Val ; et - un composé de formule (II) dans lequel : R = C1-13C1-1(C 2)12 CH3 41
6. 6. 10
7. 7. 158. 9. 20 10. X = L-Val. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les bactéries du genre Legionella sont des bactéries de l'espèce Legionella pneumophila. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que lesdites bactéries appartiennent au sérogroupe 1 ou au sérogroupe 6 de l'espèce L. pneumophila. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les bactéries du genre Legionella sont sous forme planctonique, sous forme de biofilm ou sous forme intracellulaire dans des amibes. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'un flux liquide ou gazeux avec ledit lipopeptide. Procédé de désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires, notamment en milieu hospitalier, ou d'eaux industrielles, des réseaux de distribution d'eau domestique, des stations d'épuration, des circuits de refroidissements et des tours aéro-réfrigérantes des installations industrielles, des circuits de géothermie, notamment des pompes à chaleurs, ou des 3027019 42 réseaux de climatisations, comprenant l'utilisation des lipopeptides des revendications 1 à 5. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour lutter contre la prolifération de Legionella pneumophila au sein des 5 biofilms dans les canalisations d'eaux.