CN86106566A - 新的脂解酶及其在除垢组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有最适pH范围为8—10.5的新溶脂酶。在洗涤条件下，除垢剂在水溶液浓度为10克/升，温度为60℃或60℃以下，pH为7—11时该酶显示出有效的脂酶活性。这些脂酶在洗涤组合物、预混剂和酶促除垢添加剂中是有用的。它们可从类产碱假单胞菌、施氏假单胞菌和乙酸钙不动杆菌选出的菌株获得。最好的菌株是类产碱假单胞菌CBS467.85，CBS468.85，CBS473.85，和ATCC29625、施氏假单胞菌CBS461.85和乙酸钙不动杆菌CBS460.85，及其变种或突变型菌株。

Description

本发明是关于对脂肪物质可以酶促降解的酶，特别是涉及新的脂解酶。在洗涤的条件下，这类酶具有增强的脂解活性，特别适于作除垢添加剂。本发明还涉及制备这类新脂解酶的方法，作为洗涤组合物添加剂的应用，以及用这些洗涤组合物进行洗涤的方法。此外，本发明还涉及含有这类新脂除酶的除垢组合物。

本发明的酶至少包含多种脂解酶中的一种，它们是由某些微生物，特别是某些细菌产生的，并发现这些脂解酶的理化性质和酶学性质彼此是不相同的。

清洗衣物时的一个特殊问题，是除去油脂性的污斑。若要求低温洗涤，这个问题会更加严重。现今除去油污的方法是在洗涤过程中提高温度和碱性，使其乳化并除去。

现今为了节省能量，越加趋于用较低的洗涤温度，即大约40℃或以下。因此，需要这样的脂酶，这种脂酶在较低的洗涤温度下是有效的，在碱性较高的洗涤溶液中是稳定的，在固体和液体除垢组合物中在贮存状态下是稳定的。

除垢组合物中应用脂解酶虽然已经知道了许多年（例如英国专利说明书No1，442，418第1页第36-38行所提及的），但在实践中看来是相当不令人满意的，因为在洗涤条件下，它们只有很低的清洗效力，并且不能满足现今对稳定性的要求。综述性的文章可参考H.Andree等：应用生物化学杂志（J.Appl.Biochem），2卷，（1980）218-229页，“作为除垢成分的脂酶”

脂解性除垢添加剂也可见于，例如英国专利No.1，293，613及加拿大专利No.835，343.

美国专利No.3，950，277和英国专利No.1，442，418分别公布了与活化剂及钙离子和/或镁离子结合的脂酶，分别用来对脏污的纺织物预浸，并且除掉聚酯纺织物或聚酯-棉混纺物上的甘油三脂污斑和污垢。适用于此处的微生物来源的脂酶（除了动物和植物来源的脂酶）是由假单胞菌属、麦霉菌属、肺炎球菌、葡萄球菌和葡萄球菌毒素，结核杆菌，溶脂酵母和核盘菌属衍生物而来。

英国专利1，372，034公布了一种除垢组合物，该组合物中含有施氏假单胞菌株ATCC1954产生的细菌性脂酶。而且建议最好的脂解酶的较适宜的PH应在6与10之间，在这个范围内应是有活性的，最好PH是在7到9之间。约于1970年，所推定的施氏假单胞菌株重新分类为绿脓杆菌，如同出现在ATCC目录中的那样。

欧洲专利申请EP-A-0130064公布了一种酶促除垢添加剂，其中含有从镰刀菌子孢子体中分离的脂酶，并宣称其溶脂清洗效力比常规的脂酶为高。

由于进行了广泛的研究和实验，惊奇地发现脂酶制剂可由培养适当选择的微生物中获取，在现代洗涤的条件下，这些脂酶能显示有脂酶的活性，亦即在高浓度的除垢剂、高PH值和低洗涤温度的情况下，是稳定和有效的。

因此，本发明提供了新的脂酶制剂，这些脂酶是由属于类产碱假单胞菌，施氏假单胞菌和乙酸钙不动杆菌的一些菌株的培养而获得的。这些脂酶的最适PH大约在8到10.5之间。在洗涤的条件下，在含有除垢剂浓度高达约10g/l的水溶液中，温度在60℃或以下（最好在30-40℃）和PH大约在7到11之间（最好是在大约9到10.5之间），这些脂酶显示有效的脂酶活性。在测定真脂酶单位（TLU）的条件下，最适PH值是在PH恒定仪上测定的，这在本说明书第17页阐述。

按照本发明的最佳实施例，脂酶制剂是在通常的培养条件下，对新分离出的类产碱假单胞菌培养而获得，该菌是从一组内部编号为Sp9，IN    Ⅱ-5，Gr    Ⅵ-15和M-1的菌珠群中选择来的。这些株是1985年8月8日贮存在荷兰巴恩的氟尔-希麦尔培养中心（CBS），编号分别为CBS467.85（7181），CBS468.85（7182），CBS471.85（7185）和CBS473.85（7187）。这些分离菌是用表1所列的表型特征鉴定的。

根据本发明的另一最佳实施例，是在通常的培养条件下，对类产碱假单胞菌亚种Citrulli菌株培养而获得，该菌种储存在ATCC（American    Type    cuture    collection），储存号为ATCC29625。

熟悉这方面技术的人皆知，以DSM50188菌株（即ATCC17440株）和DSM50189菌株作为范例的类产碱假单胞菌种，并不产生脂酶。然而也已知道该菌种相当不纯，这已通过对新的植物病原菌的鉴定而得到证明。该植物病原菌是由N.W.Schaad等人发现的[国际系统微生物学杂志（Lnt.J.Syst.Microbiol），28卷，（1978），117-125页]，命名为类产碱假单胞菌Citrulli亚种，和由M.Goto发现[国际系统生物学杂志，33卷（1983），539-545页），命名为类产碱假单胞菌Konjaci亚种。

虽然Citrulli和Konjaci两个亚种的表型特征彼此有些差别，也与上述菌种的典型株有区别，但熟悉本领域的人认为，这些亚种都属于类产碱假单胞菌株（见N.J.Palleroni，《伯盖氏系统细菌学手册》（Bergey′s    Manual    of    Systematie    Bacterioloyy）第1卷，N.R.Krieg，Williams和Wilkimore/伦敦，1984年，第173-174页）。它们的存在表明了类产碱假单胞菌种的表型特征的自然变化。在其它的特征中间，表型特征的变异表现在类产碱假单胞菌种的新的亚种Citulli和Konjaci可产生脂酶。

熟悉这领域的人们也会意识到，这些新分出的菌种与迄今新发现的类产碱假单胞菌亚种所描述的特征各有不同，但仍然属于这一种。

由上述类产碱假单胞菌选育的四种菌株的每一种产生的脂酶，在洗涤的条件下都有令人惊奇好的稳定性和有效性。由上面指出的类产碱假单胞菌的亚种Citulli典型株新产生的脂酶也有同样效力，夏德等人的文献中决不会产生出脂酶的这种有用的性质。

按照本发明的另一个最好实施例，脂酶制剂可以在通常的培养条件下，培养施氏假单胞菌株来制取，该菌株的内部编号为Thai    Ⅳ17-1，它是于1985年8月8日贮存于CBS，编号为CBS461.85（7175）。该菌株的表型特征列于表2。该施氏假单胞菌株能够产生脂酶，该脂酶在每升洗涤溶液中含有高达10克除垢剂、于35℃、PH9.0时是稳定的。

如前提及，施氏假单胞菌ATCC    19154已知能够产生可用作除垢剂的稳定的脂酶（亦见美国专利No.3，511，753）。然而该菌株又重新归类为绿脓杆菌株，例如见ATCC《细菌，噬菌体和rDNA载体目录》，第16版，1985年，第134页，No.19154。熟悉这一领域的人肯定不会予期或指望真实的施氏假单胞菌株会产生如本发明已提及的稳定的脂酶，很久以来，已知施氏假单胞菌是相当不均一的菌株，它包括了数种菌株，它们产生脂酶的能力是不相同的。没有迹象表明在现代洗涤组合物中可能用这类脂酶，尤其是在上述的洗涤条件下，其稳定性未必有那样的好。

按照本发明的另一最好的实施例，由新分离出的乙酸钙不动杆菌（Acinetofacter    calcoaceticus）菌株用通常的培养条件进行培养，可产生脂酶制剂。该菌株的内部编号为Gr    V-39，于1985年8月8日贮存于CBS，编号为CBS460.85（7174）。该菌株的表型特征列于表2。由该菌株获得的脂酶制剂在洗涤溶液中含除垢剂浓度高达10克/升，于40-50℃和PH高达10.3的条件下，仍是稳定和有效的。

本发明的最佳脂酶制剂可以使大约至少10%的复盖的脂肪或最好是20%的脂肪水解，条件是在下文所述的实例9，粉状除垢剂的最低浓度是2克

表1（续）

表2.施施假单胞菌Thai    Ⅳ    17-1菌株及乙酸钙不动杆菌Gr    v-39

菌株的特征

表2（续）

本发明的另一点是提供了洗涤组合物，在组合物中含有本发明的脂酶和一种除垢剂，以及通常用于除垢组合物的其它任选的成分。本发明中除垢组合物中的成分，除了必不可少的脂酶外，还可包括如下的一个或多个成分：

1.通常用于酶促除垢组合物的表面活性剂。一般可以用天然的或合成的表面活性物质，例如水溶性肥皂，阳离子型、阴离子型、非离子型、两性电介质或两性离子的表面活性剂。常用的这一类表面活性剂的一个实例是苯磺酰十二碳醇酯。表面活性剂可单独应用或混合使用，通常在洗涤组合物中的含量大约是4-50%（重量/重量）。

2.水软化剂如复合磷酸盐，例如三聚磷酸碱金属盐，或焦磷酸碱金属盐，或沸石，含量最好是高达洗涤组合物重量的40%。还可以包括或选用化合物如氰基三醋酸碱金属盐或柠檬酸碱金属盐，使得洗涤组合物有复合的作用。

3.碱金属的硅酸盐或弱碱性化合物如碱金属的碳酸氢盐，通常可占到重量的20%。

4.填充剂，如碱金属的硫酸盐。

5.化合物如羧甲基纤维素，香料，光学增白剂，缓冲剂，聚烷撑二醇或乙醇。

6.其它类的酶，如蛋白酶和淀粉酶。

按照本发明所述的酶促洗涤组合物，其脂酶的活性范围最好是在组合物的1-20，000TLU/克，而蛋白水解酶的活性范围最好是在洗涤组合物中50-10，000德福特单位/克，一个TLU（真脂酶单位）规定为每分钟滴定的相当于1微摩尔NaOH量的脂肪酸量（见下文的第16页）。德福特单位的定义刊于美国油脂化学会杂志60卷，（1983），1672页。

参照组成本发明的洗涤组合物的另一组化合物是漂白剂如碱金属的过硼酸盐，特别是过硼酸钠，碱金属的过碳酸盐如过碳酸钠，过酸或其盐，以及这些漂白剂的活化剂如TAED当洗涤组合物中一方面含有过硼酸盐、过碳酸盐，活化剂和光学增白剂，另一方面又含有蛋白酶时，本发明的脂酶制剂在这些成分的存在下，出乎意料地仍有很高的稳定性。

制备本发明的洗涤组合物可以用通常的方法，例如将诸成分混合在一起，或者制成预初混合，最后再与其它成分混合而成。按照一种可以制备的途径，即一种或多种脂酶制剂与一种或多种其它的化合物混合，做成予先已测定过的酶活性的浓缩物，该浓缩物然后与其它所需要的成分混合。

按照特别优选的实施案，本发明的脂解酶是以酶促除垢添加剂的形式存在。该添加剂也可以含有一个或多个其它的酶，例如可用于新式洗涤组合物的蛋白酶和/或淀粉酶，也可以含有通常用于本技艺的一个或多个成分，例如非离子型稳定剂，盐类稳定剂和/或涂布剂。该酶促除垢添加剂中除含有本发明的脂，酶外最好还含有蛋白酶或任选的一种α-淀粉酶。已发现蛋白水解酶并不能破坏本发明的脂解酶。本发明的酶促除垢添加剂通常与一个或多个垢剂以及本技艺中已知的其它成分相混合，形成洗涤组合物。

按照一个特定的实施案，所用的酶促除垢添加剂是使脂酶的活性范围在添加剂中为10²-10⁶TLU/克。而任选的水解蛋白活性范围是在5×10⁴-10⁶德福特单位/克。

本发明的酶促除垢添加剂可以呈例如颗粒剂型或球粒剂型，是按照该特定领域中通常已知的方法制造的，例如见英国专利1，324，116和1，362，365及美国专利3，519，570，4106，991和4，242，219。

在本发明的特定实施案中，还提供具有酶稳定剂的液体剂型的酶促除垢添加剂。该酶的稳定剂例是丙二醇。这样的液体添加剂利用液体除垢组合物最好。

本发明的稳定和有效的脂酶制剂可以在适当的条件下，培养下文所述的微生物而方便地制备。为了获得高产量的酶，在培养基中必须含有容易吸收的碳源和能源，如同有机氮源酪蛋白那样。最好在培养基中加入脂肪或油，以及钙盐、镁盐和微量元素。

按照本发明的最好的实施案，培养过程在脱脂牛乳中进行，牛乳预先用水稀释，比例由1∶1到1∶25重量/体积。在发酵时必须有良好的通气。培养基的PH要适当地控制在6-10之间，最好是在6.5-9之间。

本发明还提供了一种用本发明的除垢组合物的洗涤过程。这一过程可以在约为60℃或以下的温度满意地进行，最好的温度是30-40℃，PH通常在7-11之间。洗涤时间一般是10-60分钟。洗涤过程中所用的洗涤溶液，最好含本发明的去垢组合物，其量的范围为每升0.5-15克，最好是1-10克/升。

洗涤过程中的脂酶性能

新式洗涤组合物含有的成分，要从在洗涤过程中具有最佳效力的成分中选择。显然，在新式洗涤过程中若使用脂酶，其作用应与现代除垢剂处方中的活性和有效的成分相一致。为此，选定了若干个测定标准，以便在洗涤的条件下，证明本发明的脂酶的活性和有效性。这些标准是：

1.在广泛应用的除垢成分如三聚磷酸钠（TPP）的存在下脂酶的活性。这个标准之所以重要，是因为大家都认为脂酶的活性和稳定性取决于碱金属离子如钙离子。因此，这种依赖于钙的脂酶不适宜用于新式洗涤过程。

2.在新式除垢溶液中脂酶的活性。有许多新式除垢组合物可用来试验碱性脂酶的活性和有效性。其中我们选用了一种粉状除垢组合物和一种液体配方，作为广泛应用的新式除垢配方的典型范例。这些有代表性的新式除垢组合物是

-ALL

（粉剂），是荷兰Unilever的产品，在试验中，我们用了ALL-碱（得自荷兰弗拉定根的Unilever研究所），它与ALL的配方相同，只是没有过氯酸盐，漂白活化剂（TAED），及酶。ALL是注册商标。

-TIDE

（液体），是Procter及Gamble的产品，在美国有售。我们试验时，该配方中的酶因热处理而失活。TIDE是个注册商标。

3.含有蛋白酶的ALL中脂酶的活性。由于蛋白酶是新式除垢组合物的重要成分，应当证明在该除垢成分（以及表面活性剂基质）的存在下脂酶的活性与有效性。

4.在典型的漂白剂（如过硼酸盐）和漂白活化剂（如TAED）存在下的脂酶活性。漂白剂（以及在较低洗涤温度时的漂白活化剂）是一些新式除垢组合物的重要成分。在它们的存在下，脂酶的活性和有效性被认为是重要的标准。

为了评价本发明的脂酶对除去纺织物上油脂的能力，必须有一个适当的试验系统，以便准确无误地测定洗涤溶液中本发明的脂酶的活性。

通常用的试验纺织物，如EMPA101和EMPA102（可在瑞士圣加伦的材料试验联合研究所买到）的缺点是用除去色素来测量去垢能力。除掉EMPA101及102纺织物上的色素，是否与除掉脂肪酸直接相关连，这是个悠关重要的问题，因此，只用这些纺织物评价脂酶的性质是不恰当的。

另一个试验系统，例如在EPA-0130064所阐述的系统，也是基于清除掉人为弄脏的脂肪物上的染料。用于EMPA101和EMPA102试验纺织物的同样缺点确实也在此适用。而且在上述专利申请的试验系统中，用乳化的脂肪作为碱性脂酶的底物。这种脂肪并不相当于新式洗涤溶液所要处理的大多数脂肪斑迹，这样的斑迹不呈乳化形式，并且非乳化脂肪与该纺织物相接触。

安得烈等人在应用生化杂志2卷，（1980）218-229页所叙述的试验系统是用沉积在纺织物上放射性标记的脂肪。洗涤后，测定小块纺织物上的放射性，该放射性与溶脂性相关。然而，这个系统不可能区分是脂肪的放射性还是脂肪酸的放射性。因此，这个试验系统对于测定洗涤过程中碱性脂酶的性能并不可靠。

为了本发明的目的，开发了一种新的试验方法，在下文中称为SLM-试验法，用来评价在洗涤过程中的碱性脂酶及其活性和有效性。SLM-试验法用的原理与T.Hashimoto等在油脂化学（Yu    Kagaku）34卷，（1985），606-612页发明的方法相同，但分析用的时间大大缩短了。该方法包括：用纺织物上固着的非乳化的脂肪或油作为试验污斑，洗涤后从小块纺织物上提取，分析提取液中的脂肪和脂肪酸。由于脂酶的活性而生成的脂肪酸，以及残留的甘油三酯，在洗涤过程中可能留在纺织物上，这取决于所用的条件。因此，留在小块纺织物上这些油脂产物的量，是洗涤过程中脂酶性能的很好的量度。在下文的一般分析方法项下，将详细公布该SLM试验法。

本发明用下面的实例作进一步说明。在实例中所用的一般分析法如下。

脂酶活性的测定法

A.橄榄油水解作用（TLU法）

本发明的脂酶制剂的活性测定，或基于橄榄油的水解，或基于月桂酸对-硝基苯酯的水解。前一方法主要根据耐尔（G.耐尔：1974年于“酶分析方法”，第Ⅱ卷814-818页，H.U.伯格迈尔编，科学出版社，纽约，伦敦）的方法，只是游离出的脂肪酸是在25℃，PH8.0于PH-恒定仪上测定。一个真脂酶单位（TLU）规定为每分钟滴定的相当于1微摩尔NaOH的脂肪酸。

B.月桂酸对-硝基苯酯的水解（NPL法）

本法基于月桂酸对-硝基苯酯水解成对-硝基酚和月桂酸，主要方法如下：适当量的脂酶于PH8在0.05M    MOPS（3-N-吗啉丙烷磺酸）-NaOH中稀释成大约0.003-0.008NPL单位/毫升。一个NPL单位规定为释放出1微摩尔的对-硝基酚所需的脂酶量。4毫升脂酶溶液与1毫升月桂酸对-硝基苯酯溶液（25mg月桂酸对-硝基苯酯溶于25ml乙醇，加两滴1N盐酸）混合，在30℃温育10分钟。加入5ml醇性Tris溶液（2.5克三-（羟甲基-氨基甲烷）溶于1升乙醇中）以中止该反应，并冷却至室温。测定400nm的吸光度并用无脂酶的保温液的吸光度校正。释放出的对硝基酚的微摩尔量在校准曲线上计算出，该曲线的绘制是对-硝基酚于乙醇中的适当的溶液在400nm下的吸光值。该溶液1毫升加到4ml    0.05MMOPS-NaOH缓冲液中，PH8，和5ml醇性Tris溶液。

脂酶的稳定性测定是用上述方法之一，于0分钟、15分钟、30分钟（有时到90分钟）测定酶的活性。

洗涤溶液中脂酶稳定性的测定

为了估价本发明的若干个脂酶在洗涤溶液中的稳定性，建立了如下的实验：

按实例1所述得到的脂酶制剂适量，制成如下的溶液：a）合成自来水（STW）每升蒸馏水中含有0.433g    CaCl·6H    O，0.140gMgCl·6H    O，和0.210gNa    HCO.b）所用的除垢剂选自：

-ALL-碱（＝没有过硼酸盐，TAED和酶的ALL）

-TIDE加（＝含有三聚磷酸钠的TIDE）

-TIDE减（＝无磷酸盐，含有其它成分）

ALL-碱得自荷兰的Unilever研究所。TIDE加和TIDE减在美国的波洛克脱和盖伯尔公司有出售。ALL和TIDE是注册商标。

试验是在PH    9.0或10.3，于35，40或50℃下进行。自混合物中取样的时间是在0，15及30分钟（有时到90分钟），残留的脂酶活性用所述的两种方法中的一种进行测定。所用的脂酶是类产碱假单胞菌菌株Sp    9（CBS467.85），IN    Ⅱ-5（CBS468.85），Gr    Ⅵ-15（CBS471.85）及M-1（CBS473.85），施氏假单胞菌菌株Thai    Ⅳ    17-1（CBS461.85）及乙酸钙不动杆菌菌株Cr    Ⅴ-39（CBS460.85）。

结果列于实例4-8中。

在洗涤条件下脂酶性能的测定方法（SLM试验）

下面是如何更好地进行SLM试验的典型实例。

EMPA    211棉布片作为纤维材料，三油酸甘油酯或精制的橄榄油（两者均是美国西格玛公司产品）作为底物。在抽提纺织物后，可以用层析法对其进行水解。

用于SLM试验最好的洗涤方法如下：

5毫克橄榄油溶于20微升丙酮（25%）中，涂在棉布片（3×3厘米）上。棉布片在室温下空气中晾干。将含有10ml STW（标准自来水：每升滞留水含0.433g CaCl₂，0.140g MgCl₂·6H₂O和0.210gNa HCO₃）或溶于STW中的去垢剂的洗液放到一有磨口玻璃塞的锥形瓶（25ml）中，瓶放入振荡的40℃水浴中。洗涤步骤从向瓶内加入脂酶（20TLU见下文）开始随之即加入脏污布片，并于40℃下振摇40分钟，空白实验不加脂酶。

洗涤完毕，用STW冲洗布片，然后于室温下干燥。干布片放入含有5毫升溶剂的玻璃管中旋转进行提取，该溶剂与用于层析分离底物和产物的洗脱液的成分相同。

提取液中残留的甘油三酯及所形成的游离脂肪酸用高效液相层析测定（HPLC）。

设备与条件

泵：2150型（LKB）。

检测器：析光率监测器（Jobin    Jvon）。

注入系统：Wisp（微孔）：10微升。

积分仪：SP4270（光谱物理学）

柱：CP微球体-硅（CHROMPACK），100×4.6毫米

洗脱液：正己烷/异丙醇/甲酸：975∶25∶25（体积/体积），1毫升/分钟

温度：环境温度

在这些条件下，三油酸甘油酯和油酸的保留时间分别是1.2和1.6分钟。测量峰面积或峰高度。它们是从布片上提取后，甘油三酯和脂肪酸回收率的一种测定。以从未经洗涤的布片上提取后甘油三酯的回收率作为100%。

在上述条件下，橄榄油和油酸之间的折光率之比若按峰面积计算为0.85，按峰高计算为1.1。

实例1

菌株Sp9酯酶发酵的冷冻干燥上清液的制备

将类产碱假单胞菌Sp9菌株（CBS467.85）接种入含有30毫升灭菌的脑-心脏浸出液（BHⅠ）培养基（Difco）的100毫升锥形瓶中，于30℃在转速为300rpm的轨道振荡器上振荡培养16小时。将在脑一心浸出液中已生长的细胞接种到2升锥形瓶中培养，此瓶含有500毫升灭菌的脱脂牛乳培养基。脱脂牛乳培养基的制备如下：

-100克脱脂牛乳（Difco）;

-去离子水加到1升，

-灭菌前调整PH到7.0

-灭菌条件：110℃，30分钟。

该含有脱脂牛乳培养基的摇瓶在250-300rpm的轨道振荡器上振摇48小时。为产生脂所用的生长温度为20℃。培养基于8-10℃下用转速10，000g离心（型号为Sorvall    R    GSA）。离心后的上清液冷冻干燥即得到脂酶制剂。

其它产生脂酶菌株的发酵，如CBS460.85，461.85，468.85，471.85和473.85，ATCC29625和DSM2672（EP-A-130064）菌株用类似的方法进行，只是CBS468.85菌株的生长温度为30℃。

按照本实例所获得的脂酶制剂已用于实例4-8中所述的稳定性实验。

实例2

菌株Thai    Ⅳ    17-1脂酶发酵冷冻干燥上清液的制备

将施氏假单胞Thai菌株17-1（CBS461.85）接种入含有30ml灭菌脑一心浸出液培养基的100ml锥形瓶中，转速为300rpm的轨道振荡器上30℃振菌培养16小时。将脑一心浸出液中生长的细胞接种入含有500ml灭菌的GSM培养基的2升锥形瓶中培养。GSM培养基的制备如下：

-100g脱脂牛乳（Difco或Oxoid）;

-去离子水加到1升;

-加入4N    NaOH以调节PH到7.8;

-搅拌下将温度调到40℃;

-然后加入MAXATASE（Gist-brocades）溶液;

-控制该温度和PH1小时，然后将PH调节到7。在110℃灭菌30分钟。MAXATASE溶液的制备如下：

25ml去离子水中加入1g MAXATASE粉末（2.372×10⁶德福特单位/克），充分振摇5-10分钟。不溶物在索瓦尔离心机SS34型转速为10，000转/分离心除去。上清液经MILLIPORE公司生产的0.22微粒的滤器过滤。滤液中加入每升中含有10%脱脂牛乳，在摇瓶中于转速为250-300转/分的轨道振摇器上，于20℃振摇48小时。然后将培养基于8-10℃下用索瓦尔GSA离心机上以10，000g速度离心。所得上清液在乙二胺四乙酸处理过的渗析管中用50体积的10毫摩尔Tris-Hcl（PH8）缓冲液进行渗析，温度为4℃，在24小时内，更换两次缓冲液。渗析，将渗析袋中的内容物混合并冷冻干燥。

除CBS.473.85菌株外，在实例1中提及的所有其它的菌株的发酵方法都以相似的方式进行。根据本实例所得到的含脂酶的上清液（除由菌株M-1得到的脂酶外），均用于进行实例9和10所描述的实验。

实例3

菌株M-1脂酶发酵的冷冻干燥上清液的制备

将类产碱假单胞菌M-1菌株（CBS.473.85）接种入含有500毫升灭菌脑一心浸出液（BHⅠ）培养基（Difco）的500毫升锥形瓶中，于30℃在280转/分的轨道振摇器上振荡培养18小时。在BHⅠ中生长的细胞接种入含有10升灭菌的培养基1或培养基2的20升发酵罐中培养。

-培养基1的制法如下：

1000克脱脂牛乳悬浮于去离子水中，使体积达9.5升;调节温度到30℃和加入氢氧化钠溶液使PH达7.8;在1小时中，加入33×10⁶ADU（＝26×10⁶DU）的MAXACAL

（吉斯特-花锦）以进行蛋白酶处理（30℃，PH7.0-7.8）。加入0.5-10毫升防沫剂后，于110℃高压灭菌30分钟。

-培养基2的制法如下：

400克酪蛋白悬浮于5升去离子水中;用氢氧化钠溶液调PH到9.0，温度为50℃。加入5×10⁷ADU（＝4×10⁷DU）MAXACAL，以进行蛋白酶处理;温孵过程（90分钟，50℃ PH9.0）可通过迅速加热（于90℃保温5分钟）而终止。冷却至25℃后，加入硫酸溶液，调PH到7.0。

加入其它成分（奶油50g;Mg SO₄·7H₂O5g;Mn SO₄·4H₂O0.1g及防沫剂SAG471 0.5-10毫升），再加去离子水使最后体积到10升，于120℃高压灭菌65分钟。

培养基冷至发酵温度（30℃），发酵条件为：

气流：0.167vvm

搅拌：1000转/分

PH：6.5-10.0（最好是6.8-8.0）发酵时间在35-72小时之间。

发酵后，肉汤培养基用海蒂希（Hettich）离心机（4000g，8-10℃）离心30分钟。上清液冷却至0℃，在搅拌下加入固体（NH₄）₂SO₄使浓度达70%（重量/重量）。生成的沉淀用索瓦尔离心机（10，000g，4-5℃）离心20-25分钟，以与上清液分开。沉淀于0℃用10毫摩尔Tris-Hcl缓冲液（PH8）处理，并于20分钟内加入冷却的丙酮（＜-7℃），使沉淀浓度为65%（重量/重量）。离心后，沉淀用10毫摩尔Tris-Hcl缓冲液（PH8）处理，并于4℃下用50体积的相同缓冲液渗析，24小时内换透析液2次。渗析后，进行冷冻干燥，得到产物的活性为6000TLU/g。

实例1中提及的所有其它的菌株，可用类似的方法制备，但是需略作下述改动：对菌株Sp9只能用培养基1;除了菌株IN    Ⅱ-5的发酵温度为20或30℃外，所有其它菌株的发酵温度均匀20℃。

实例4

于35、40和50℃、8克ALL-碱/升条件下类产碱假单胞菌的脂酶稳定性实验

来源：冷冻干燥的上清液

除垢溶液：ALL-碱，8克/升

pH：如表中所示

a.温度：35℃

b.温度：40℃

实例5

于40和50℃、4克ALL-碱/升条件下类产碱假单胞菌的脂酶稳定性实验

a.来源：冷冻干燥的上清液

除垢溶液：ALL-碱，4克/升

pH：如表中所示

温度：40℃

b.温度：冷冻干燥上清液

除垢溶液：ALL-碱，4克/升

pH：如表中所示

温度：50℃

实例6

于40和50℃、6克ALL-碱/升条件下类产碱假单胞菌Sp9菌株脂酶的稳定性实验

来源：Sp9菌株冷冻干燥的上清液

除垢溶液：ALL-碱，6克/升

pH：如表中所示

a.温度：40℃

实例7

于40℃、5克ALL-碱/升条件下施氏假单胞菌Thai    Ⅳ    17-1脂酶的稳定性实验

来源：Thai    Ⅳ    17-1菌株的冷冻干燥的上清液

除垢溶液：ALL-碱，5克/升

pH：9.0

温度：40℃

时间（分钟）	残留活性（％）
		025	100109

实例8

于40和50℃、8克ALL-碱/升条件下乙酸钙不动杆菌菌株脂酶的稳定性实验

来源：Gr    Ⅴ-39菌株（CBS460.85）的冷冻干燥的上清液

除垢溶液：ALL-碱，8克/升

pH：10.3

a.温度：40℃

TLU/1x 10-3	时间（分钟）	残留活性（％）
			4.9	01530	10010080

b.温度：50℃

TLU/1x 10-3	时间（分钟）	残留活性（％）
			23.6	01530	100275

实例9

本实例论述了按SLM-试验在洗涤过程中由类产碱假单胞菌Sp9，IN    Ⅱ-5，Gr    Ⅵ-15，M-7，ATCC29625，施氏假单胞菌ThaiⅡ-5和乙酸钙不动杆菌Gr    Ⅴ-39产生的脂酶的性能，该试验对组成酶与新式洗涤组合物（TPP）、粉状去垢组合物（ALL-碱）和液体配方（TIDE液）的成分的一致性进行了核对。

SLM-试验按本发明的第18-19页所述的方法进行、初步实验表明，在所用的条件下，在洗涤过程中纺织物上存留着相当数量的由于脂酶的作用所生成的脂肪酸和残留的甘油三酯。

上述脂酶的性能和空白试验，用SLM法进行了测定，条件如下：

-标准自来水（STW）用碱调pH到9.1。

-三聚磷酸钠（TPP）：2和10克/升（pH9.1）。

-液体TIDE：2和4克/升（pH7.5）。

-ALL-碱：2，4和8克/升（pH9.2-9.6）。

所加入的脂酶活性单位（20TLU）是从按实例2和菌株为M-1时按实例3而产生的冷冻干燥样品获得的。活性如下：

结果列于下述表中。

这些表清楚地表明本发明的脂酶对纺织物上的油脂有溶脂性质，尤其是在洗涤条件下，它们在液体和粉状除垢剂中有优良的性能。

实例10

本实例说明了在洗涤条件下，本发明的某些脂酶与漂白剂或蛋白裂解酶作用的一致性。脂酶的性能是用SLM-法测定的，如于本说明书第18-19页中所阐述的，测定的条件如下：

-ALL-碱+漂白活化剂（TADE30%）：4克/升（pH9.1）。

-ALL-碱+TADE+漂白剂（NaBO₃·4H₂O，13%），

4克/升（pH9.1）。

-ALL-碱+TADE+蛋白酶（2000DU/克去垢剂）：4克/升（pH9.1）。

被加入的脂酶活性单位（TLU）是由按实例2和菌株为M-1时按实例3（见实例9）产生的冷冻干燥样品得到的。

脂酶菌株：INⅡ-5，M-1，Gr    Ⅵ-15及ATCC29625。

蛋白酶：MAXATASE，MAXATASE（DU/升）的蛋白水解活性是按德福特（Delft）方法测定的，载于美国油脂化学会志60卷（1983）1672页。

结果列于下述表中。结果的表达方式与实例9相同。

A.从菌株IN    Ⅱ-5得到的碱性脂酶

条件    回收率（%）

甘油三脂    游离脂肪酸    总量

ALL-碱+TADE    4.4    62.4    66.8

ALL-碱+TADE+    5.7    64.5    70.2

漂白剂

ALL-碱+TADE+    2.2    61.1    63.3

MAXATASE

B.由菌株M-1得到的碱性脂酶

D.由菌株ATCC29625得到的碱性脂酶

这些表也清楚地表明本发明的脂酶对纺织物上的油脂有溶脂性质，尤其是在洗涤条件下，它们在液体和粉状除垢剂中有优良的性能。

Claims (19)

1、一种溶脂酶，它是从类产碱假单胞菌(ATCC29625除外)、施氏假单胞菌和乙酸钙不动杆菌所选择的细菌株中获得，这种酶进一步的特征为：

a)最适pH范围为8-10.5pH是在测定真脂酶单位的条件下在pH恒定仪上测定的；

b)在温度为60℃或60℃以下、pH为7-11之间的洗涤条件下，在含去垢剂温度为10克/升的水溶液中显示出有效的脂酶活性；

2、按照权利要求1所述的溶脂酶，它是从CBS467.85，CBS468.85，CBS471.85和CBS473.85或其变种或其突变型菌株选择出的类产碱假单胞菌中得到的;

3、按照权利要求1所述的溶脂酶，它是从施氏假单胞菌CBS461.85和乙酸钙不动杆菌CBS460.85或其变种或其突变株所选择出的菌株得到的;

4、按照权利要求1所述的溶脂酶，它是自亚种Citrulli和Konjaci或其变种或其突变型菌株所选择出的类产碱假单胞菌变异株中得到的;

5、一种生产如权利要求1中规定的溶脂酶的方法，包括在营养培养基中培养选自除ATCC29625外的类产碱假单胞菌，施氏假单胞菌和乙酸钙不动杆菌的细菌株，以形成富含脂酶的培养液，并从培养液分离出脂酶;

6、按照权利要求5所述的方法，其中产碱假单胞菌株选自CBS46785，CBS468.85，CBS471.85和CBS473.85。

7、按照权利要求5所述的方法，其菌株选自施氏假单胞菌CBS461.85和乙酸钙不动杆菌CBS460.85;

8、一种洗涤组合物，它包含一种溶脂酶，该酶是由类产碱假单胞菌、施氏假单胞菌和乙酸钙不动杆菌选出的菌种产生的，该酶进而鉴定为：

a）最适pH范围为8-10.5，pH是在如所述的测定真脂酶单位的条件下，在pH恒定仪上测定的;

b）在温度为60℃或60℃以下、pH为7-11之间的洗涤条件下，在除垢剂温度为10克/升的水溶液中显示出有效的脂酶活性;该溶脂酶还可与一种除垢剂或在该混合物中常用的任何其它成份合用。

9、按照权利要求8所述的组合物，其中菌株选自产碱假单胞菌CBS467.85，CBS468.85，CBS471.85，CBS473.85和ATCC29625，施氏假单胞菌CBS461.85以及乙酸钙不动杆菌CBS460.85;

10、根据权利要求8所述的组合物，其中脂酶活性范围为每克组合物有1-20，000真脂酶单位（TLU）;

11、根据权利要求8-10中的任何一项所述的组合物，它除含有溶脂酶外，还含有蛋白溶解酶;

12、根据权利要求11所述的组合物，其中蛋白水解活性的范围为50-10，000德福特单位/克;

13、一种酶促除垢添加剂，其中含有在权利要求8或9中所规定的溶脂酶，蛋白酶和任选的淀粉酶;

14、根据权利要求13所述的一种酶促除垢添加剂，其脂酶活性为每克添加剂10²-10⁶真脂酶单位（TLU）;

15、根据权利要求13或14所述的一种酶促除垢添加剂，其中蛋白酶水解蛋白的活性为每克添加剂5×10⁴-10⁶德尔特单位（Du）;

16、根据权利要求13-15中的任何一项所述的酶促除垢添加剂，它为颗粒形或球粒形;

17、根据权利要求13-15中的任何一项所述的酶促除垢添加剂，它是以含有一种酶稳定剂的液体形式存在。

18、一种洗涤方法，包括使用如权利要求8-12中的任何一项所述的洗涤组合物，洗涤过程中pH在7-11的范围内，温度为60℃或低于60℃。

19、根据权利要求8或9所规定的溶脂酶在洗涤组合物或酶促除垢添加剂中的用途。