CN100494349C - 邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用，所述邻苯二甲酸二丁酯降解菌是乙酸钙不动杆菌属(Acinetobacter calcoacetius)的菌株TS2H，该菌能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，将DBP完全矿化成CO2和H2O；在纯培养条件下，该菌48h能将无机盐培养基中40mg/L的DBP降解98%以上，在中性和偏酸性的较宽pH范围内均能较好的降解BDP；该菌能耐受Cu、Zn、Cd等重金属，不仅有较强的DBP降解能力，而且也有较强的环境适应能力，可用于修复废水生物处理和污染环境。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
技术背景
邻苯二甲酸酯(PAEs)作为重要的化工原料被大量地用于塑料生产，尤其是聚乙烯塑料(PVC)的增塑剂和软化剂，同时也用于驱虫剂和化妆品等生产中。当前，PAEs己成为全球性的有机污染物，它广泛地存在于自然环境中，不但成为土壤、大气和水体中常被检出的持久性污染物，而且也对食品、油脂以及饮用水等形成了污染。其中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)由于具有发育和胚胎毒性，被美国环境保护局列为优先控制污染物。
由于邻苯二甲酸二丁酯化学稳定性很好，自然条件下很难通过水解等化学作用分解，除了会有很少一部分发生光化学分解外，绝大部分的邻苯二甲酸二丁酯主要是通过生物降解途径从环境中慢慢消失的。因此，利用微生物的降解作用将邻苯二甲酸二丁酯转化为无害物质被认为是去除环境中的邻苯二甲酸二丁酯最佳手段。
目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离出许多具有降解邻苯二甲酸二丁酯的能力的细菌、真菌和放线菌，细菌由于其生化上的多种适应能力及易诱发突变株而占主要地位。但已报道的细菌对于PAEs的生物降解，其降解速率还不能满足实际污染控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有降解邻苯二甲酸二丁酯存在的难题，提供一种能高效降解邻苯二甲酸二丁酯的菌种。
本发明的另一个目的是提供上述菌种在在废水生物处理和环境污染修复中用于降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
本发明所提供的降解菌来源于华南农业大学蔬菜地的土壤，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的乙酸钙不动杆菌属(Acinetobacter calcoaceticus)的菌株TS2H，菌体形态为短杆至球状，白色，单个排列，表面光滑不透明，边缘整齐，主要的生物学特性为接触酶阳性，氧化酶阴性，非发酵型。菌株16S rDNA的GenBank登陆号为EF151807，于2006年12月22日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M206143。
该菌的最适生长条件为：pH＝5～8，温度30～40℃。
该菌能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，将DBP完全矿化成CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌48h能将无机盐培养基中40mg/L的DBP降解98％以上。如果添加适量的营养物质蛋白胨可提高该菌降解的效率。菌株Acinetobactercalcoaceticus TS2H在中性和偏酸性的较宽pH范围内均能较好的降解DBP，另外，该菌能耐受Cu、Zn、Cd等重金属，并且在较高(100mg/L)的DBP浓度范围内，该菌对DBP的降解也不会有太大影响。这些说明菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H不仅有较强的DBP降解能力，而且也有较强的环境适应能力，这将对该菌将在工业废水的生物处理和污染环境的生物修复中发挥重要作用。
附图说明
图1为Acinetobacter calcoaceticus TS2H的细胞生长与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的降解曲线图；
图2为DBP浓度对菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H的降解率影响图谱。
其中，图1中各条曲线代表的意义为：
—口—培养液中DBP的残留率，—◆—培养液中Acinetobacter calcoaceticus TS2H的菌密度。
具体实施方式
实施例1：Acinetobacter calcoaceticus TS2H的分离与降解邻苯二甲酸二丁酯的性能
现场采集广州华南农业大学蔬菜地的土壤，采用水-硅油(体积比4:1)双相体系驯化邻苯二甲酸二丁酯降解菌，邻苯二甲酸二丁酯起始浓度保持40mg/L。水相无机盐培养液(MSM)成分：KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，NH4Cl 0.8g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，FeCl3.6H2O 0.02g/L，经过若干代反复驯化，在固体培养基(NR)中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解的能力，最后得到一株邻苯二甲酸二丁酯的高效降解菌Acinetobacter calcoaceticus TS2H，该菌经16S rDNA鉴定为乙酸钙不动杆菌属(Acinetobacter calcoaceticus)。NR成分：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂条15g，蒸馏水1L，调pH为7.0。
将Acinetobacter calcoaceticus TS2H接种至含邻苯二甲酸二丁酯40mg/L的MSM培养基中，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，在第0、15、24、39、48、63、71h分别取样测定培养液中菌密度和邻苯二甲酸二丁酯残留率，实验结果见图1。由图1的DBP降解曲线可以看出，培养初期(0～10h)，菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H对DBP的降解能力较弱，随着培养时间的延长，Acinetobacter calcoaceticus TS2H对DBP的降解作用增强，接下来的10～40h之间DBP的降解非常快，到48h的时候，DBP的降解率已经达到98.64％。细胞计数结果也表明，菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H能够利用培养基中的DBP进行生长。细胞生长曲线表明降解初期细胞生长有一点缓慢，之后的生长较快，48h的时候菌密度达到5×108个/mL。
本实施例说明分离所得到的Acinetobacter calcoaceticus TS2H可利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解邻苯二甲酸二丁酯的能力。
实施例2：pH对邻苯二甲酸二丁酯降解作用的影响
调节MSM培养基为不同pH值(4～10)，在起始DBP浓度为40mg/L的条件下，培养40h，测定pH值对菌体生长的影响。表1是pH对邻苯二甲酸二丁酯降解作用的影响；由表1可以看出，菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H在不同pH条件下对DBP的降解能力不同。在pH为7时，对DBP的降解作用最强，其降解率达62％，而此条件下不接菌对照的DBP的降解率仅为0.3％；在pH为10时降解率受到较大的抑制，仅为11％，说明菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H在偏酸性环境中更有利于降解DBP。培养液中活菌计数的结果也有同样的趋势，在pH为7时，150r/min振荡培养40h，培养液中活菌数为7.2×108个/mL，而pH为偏碱性条件下培养液中活菌数下降一半以上，下降趋势比偏酸性环境中明显。
本实施例说明菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H在中性和偏酸性的较宽pH范围内均能较好的降解BDP，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
表1
实施例3：添加葡萄糖、蛋白胨、苯甲酸钠对Acinetobacter calcoaceticus TS2H细胞生长与邻苯二甲酸二丁酯降解率的影响。
将Acinetobacter calcoaceticus TS2H接种至含DBP40mg/L的MSM培养基中，然后在培养液中分别添加100mg/L的葡萄糖蛋、蛋白胨、苯甲酸钠作为营养物质，同时做不添加物质、不接种菌只加DBP等对照实验。在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，40h后测定培养液中菌密度和DBP残留量，计算DBP的降解率。表2是添加葡萄糖、蛋白胨、苯甲酸钠对Acinetobacter calcoaceticus TS2H细胞生长与DBP影响；从表2可知，添加了葡萄糖或苯甲酸钠会降低菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H对DBP的利用，同时菌密度也比只加DBP要低，而添加营养物质蛋白胨的培养液中菌密度显著增加，DBP的降解率也得到提高。
本实施例说明添加适量营养物质蛋白胨可促进Acinetobacter calcoaceticus TS2H的生长，同时提高它对DBP的降解率。
表2
实施例4：不同重金属离子对菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H降解邻苯二甲酸二丁酯的影响
将TS2H接种至含邻苯二甲酸二丁酯40mg/L的MSM培养基中，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，分别加入不同的重金属离子Zn2+(71.94mg/L)、Cd2+(12.41mg/L)、以及Cu2+(10.72mg/L)、不添加重金属做对照，培养40h进行DBP降解试验。表3是重金属离子对菌株降解邻苯二甲酸二丁酯的影响；由表3可知，不同重金属离子对菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H降解DBP的影响不同。Zn2+(71.94mg/L)、Cu2+(10.72mg/L)的存在与不加重金属对照，Acinetobacter calcoaceticus TS2H的生长和DBP的降解稍有降低，而Cd2+(12.41mg/L)对Acinetobacter calcoaceticus TS2H降解DBP有一定的抑制作用，40h后菌密度与不加重金属对照相比下降1个数量级，DBP降解率虽也有较大的下降，但仍有48％。
本实施例说明菌株TS2H在一定浓度的Zn2+、Cd2+和Cu2+条件下仍可较高效地降解DBP，为该菌在有重金属复合污染环境中的应用提供了基础和保证。
表3
实施例5：邻苯二甲酸二丁酯浓度对菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H降解邻苯二甲酸二丁酯的影响
无机盐液体培养基中加入DBP正己烷溶液，使DBP的浓度分别为5、40、100和300mg/L。Acinetobacter calcoaceticus TS2H在DBP浓度分别为40、100和300mg/L无机盐液体培养基中，150r/min振荡培养40h，DBP的降解率分别为62.00％、24.30％与6.41％。同样条件下，在DBP浓度为5mg/L时，菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H对DBP的降解率为92.85％(如图2)。从绝对降解量看，在DBP浓度分别为5、40、100和300mg/L无机盐液体培养基中，降解量分别为4.64、24.80、24.30和19.23mg/L。由此可以看出，菌株Acinetobacter calcoaceticus TS2H对100mg/L内较高浓度的DBP也具有较好的降解效能，但当DBP浓度达到300mg/L时，降解效能受到一定的抑制。
本实施例说明菌株TS2H可在较高(100mg/L)的浓度范围内较好的降解DBP，为其在DBP污染环境的修复提供了保证。
Claims (2)
1.一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌，其特征在于：是乙酸钙不动杆菌TS2H(Acinetobacter calcoaceticus TS2H)CCTCC M 206143，菌体形态为短杆至球状，白色，单个排列，表面光滑不透明，边缘整齐，主要的生物学特性为接触酶阳性，氧化酶阴性，非发酵型。
2.权利要求1所述降解菌在废水生物处理或环境污染修复中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN86106566A (zh) * | 1985-08-09 | 1988-04-20 | 吉斯特-布罗卡迪斯公司 | 新的脂解酶及其在除垢组合物中的应用 |
| CN1563342A (zh) * | 2004-02-10 | 2005-01-12 | 凌亮 | 用于处理高难度废水的微生物制剂及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 邻苯二甲酸二丁酯的微生物降解. 曾锋等.环境科学，第20卷第5期. 1999 |
| 邻苯二甲酸二丁酯的微生物降解. 曾锋等.环境科学，第20卷第5期. 1999 * |
Also Published As
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|---|---|
| CN101008001A (zh) | 2007-08-01 |
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Assignee: HANGZHOU NATURE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: South China University of Technology Contract record no.: 2011440000477 Denomination of invention: Dibutyl phthalate degradation bacterium and its uses Granted publication date: 20090603 License type: Exclusive License Open date: 20070801 Record date: 20110531 |
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