CN112760306A - 一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用 - Google Patents

一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用。本发明所涉及的酯类水解酶基因经大肠杆菌E.coli菌株异源表达后，在45℃达到最大酶活性，当pH值在6.0至9.0之间保持高活性，对高盐度、多种有机溶剂和去垢剂均有较强耐受性，且还能耐受Ba2+、Mg2+等金属离子。Aln1对于短链脂肪酸具有高催化活性。该基因所编码的Aln1可应用于废水处理、精细化工、制药和环境修复等领域的工业生产。

Description

一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯 类水解酶及其编码基因、应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用。
背景技术
酯类水解酶广泛存在于微生物、动物和植物中，是一种能够催化脂肪酸酯键水解或合成反应的一类水解酶的总称。酯类水解酶参与生物体多个代谢过程，在酯类运输、细胞结构构建以及能量代谢中发挥重要功能，是维持生命体生存所必需的酶类之一。
第六家族酯酶由磷脂酶和羧酸酯酶组成，与来自真核生物的溶血磷脂酶同源性较高（40%），具有广泛的底物特异性。广泛底物谱和功能多样性使该家族水解酶在诸如食品、医药、纺织、洗涤、污水处理、环境修复等领域具有广泛的潜在应用价值。
然而在一些水解条件苛刻的应用场景中，例如高盐度、含有机溶剂及去垢剂环境等，现有技术中大多数的酯类水解酶在这些水解环境中酶活性会受到严重抑制，因此限制了其实际应用，难以符合实际应用需求。因此有必要不断开发出更多可同时耐受高盐度、含有机溶剂及去垢剂环境的酯类水解酶种类，以满足不同应用场景的需求。
发明内容
本发明提供了一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用。本发明从一株细菌中筛选到一种新型第六家族酯类水解酶基因，并对该基因进行了重组表达。所获得的酯类水解酶同时对高盐度、有机溶剂和去垢剂具有较高的耐受性，可用于精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种具有酯类水解酶活性和高盐度、有机溶剂及去垢剂耐受性的分离多肽（酯类水解酶Aln1），
（a）具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a；或
（b）具有与氨基酸序列a至少90%以上同源性及至少90%以上酯类水解酶活性的氨基酸序列b；所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到；所述催化中心位于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a中的115-119，168和200位点。
在不影响水解酶Aln1蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到水解酶突变体。如前所述，本发明所述的水解酶Aln1的催化中心为SEQ ID NO:2所示的117，168，200位氨基酸位置。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域163，259，285位氨基酸位置的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。
作为优选，所述氨基酸序列b具有与氨基酸序列a至少95%以上同源性及至少95%以上酯类水解酶活性。
进一步地，所述氨基酸序列b具有与氨基酸序列a至少99%以上同源性及至少99%以上酯类水解酶活性。
作为优选，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到。
进一步地，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于3个氨基酸得到。
最优选地，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失1个氨基酸得到。
本发明针对分离自海水的细菌，通过对其基因组DNA序列分析，筛选获得水解酶基因Aln1，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。基因aln1大小为675 bp，碱基组成为100 A（14.81%）、113 T（16.74%）、245 C（36.30%）和217 G（32.15%），编码蛋白大小为224个氨基酸残基，分子量23.6 kDa。其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。氨基酸序列分析结果表明，该蛋白包含发挥酶活所需要的催化三联体Ser117-Asp168-His200，其中丝氨酸位于一段酯类水解酶家族保守序列内（Gly115- Gln116- Ser117- Gly118- Gly119），在系统发育上的关系与第六家族酯酶最近，与第六家族其它酯酶成员的序列相似度在40%以下，综上所述，Aln1应为第六家族羧酸酯酶家族中的一名新成员。
第二方面，本发明提供了一种编码上述分离多肽的多核苷酸，
（a）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a；或
（b）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a至少90%以上同源性的核苷酸序列b；所述核苷酸序列b由对核苷酸序列a中除343-357，502-504和598-600位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到。
将上述水解酶基因序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是Roseibacterium elongatum DSM 19469T基因组核苷酸，一致性为77.53%（其在GenBank数据库中的注册号为CP004372）。该基因编码催化活性中心氨基酸的密码子位于基因SEQ IDNO: 1的355-357、502-504、598-600号碱基对。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸组（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸组（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸组（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳族氨基酸组（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸组（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η. Neurath和R. L. Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork 中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204）和区域定向诱变（region-directed mutagenesis）(Derbyshire等，1986，Gene 46:145和1988，DNA 7:127)。
作为优选，所述核苷酸序列b具有与核苷酸序列a至少95%以上的同源性。
进一步地，所述核苷酸序列b具有与核苷酸序列a至少99%以上的同源性。
第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，包含与一种或多种调控序列可操作地连接的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导分离多肽的产生。
第四方面，本发明提供了一种重组表达载体，包含上述的核酸构建体。
可以用许多方式操作编码本发明水解酶的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Aln1基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1（Invitrogen Corp. San Diego. California. USA）；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）等。
进一步地，所述重组表达载体为大肠杆菌表达载体pSMT3。
第五方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，由上述重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。
作为优选，所述重组宿主细胞为细菌、酵母或哺乳动物细胞。
进一步地，所述重组宿主细胞为E. coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。
最优选地，所述重组宿主细胞为E. coli细菌。
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于水解酶Aln1的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的水解酶Aln1的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Aln1基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶Aln1。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E. coli等，可通过如下原生质体转化或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞）等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达水解酶Aln1。在一个优选的实施方案中，利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Aln1基因连接到载体上pSMT3(Herrmann, J. 1996)上，并转化至原核生物E. coli菌株，利用重组载体pSMT3-Aln1中强启动子大量表达Aln1融合蛋白。
第六方面，本发明提供了一种制备上述分离多肽的方法，包括以下步骤：
(1)在有助于产生酯类水解酶的条件下培养如上述的重组宿主细胞。
(2)回收分离、纯化多肽。
在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶Aln1的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批或固态发酵）来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。
作为优选，步骤（2）中，所得水解酶Aln1可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
作为优选，步骤（2）中，可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析（例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）或差示溶解度（例如硫酸铵沉淀）等方法。
第七方面，本发明提供了上述分离多肽或重组宿主细胞在催化酯类水解中的应用。
本发明还提供了水解酶Aln1或能表达水解酶Aln1的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶Aln1具有酯酶活性。Aln1或上述能表达Aln1的宿主菌可用于水解C2-C10链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8）和对硝基苯酚癸酸酯（C10）。
经测定表明，水解酶Aln1对酰基碳链较短酯类物质具有较好催化活性，对于短链酯类的水解活力优于长链酯类。因此，优选Aln1水解酶用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。
本发明的水解酶Aln1催化水解活性在pH范围6.0~1.0有很高的活性，最适pH为7.5。温度范围为15~60 ℃，最适反应温度55 ℃，在15~50 ℃中孵育4h，仍能保持80%以上活性。Aln1能耐受高盐度（在2 M NaCl终浓度下可保留50%以上酶活）；Aln1能耐受Mg2+和Ba2+等金属离子（对Mg2+、Ba2+能保持70 %以上的酶活，对Ca2+、Sr2+中能保持50 %左右的酶活），EDTA对酶活有促进作用，能耐受多种有机溶剂（丙酮、DMSO、乙醇、甘油、异丙醇、甲醇等）和去垢剂（吐温20和吐温80等）。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明从海水分离的的细菌中筛选获得新的高盐度、有机溶剂和去垢剂耐受的酯类水解酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化酯类水解的生产过程中。获得的水解酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产。该水解酶可应用于环境中，包括酸性、中性及碱性水解环境，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定水解酶。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等不同pH环境的生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。
附图说明
图1为酯类水解酶Aln1的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12: 对硝基苯酚十二酸酯；C14对硝基苯酚十四酸酯；C16:对硝基苯酚十六酸酯。定义底物为C2时测定值为100%。
图2为酯类水解酶Aln1最适反应pH图。
图3为酯类水解酶Aln1最适反应温度图。
图4为酯类水解酶Aln1不同温度下热稳定性图。
图5为有机溶剂对酯类水解酶Aln1活性影响图。
图6为NaCl对酯类水解酶Aln1活性影响图。
图7为二价阳离子对酯类水解酶Aln1活性影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种具有酯类水解酶活性和高盐度、有机溶剂及去垢剂耐受性的分离多肽（酯类水解酶Aln1），
（a）具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a；或
（b）具有与氨基酸序列a至少90%以上同源性及至少90%以上酯类水解酶活性的氨基酸序列b；所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到；所述催化中心位于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a中的115-119，168和200位点。
作为优选，所述氨基酸序列b具有与氨基酸序列a至少95%以上同源性及至少95%以上酯类水解酶活性。进一步地，所述氨基酸序列b具有与氨基酸序列a至少99%以上同源性及至少99%以上酯类水解酶活性。
作为优选，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到。进一步地，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于3个氨基酸得到。最优选地，所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失1个氨基酸得到。
一种编码上述分离多肽的多核苷酸，
（a）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a；或
（b）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a至少90%以上同源性的核苷酸序列b；所述核苷酸序列b由对核苷酸序列a中除343-357，502-504和598-600位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到。
作为优选，所述核苷酸序列b具有与核苷酸序列a至少95%以上的同源性。进一步地，所述核苷酸序列b具有与核苷酸序列a至少99%以上的同源性。
一种核酸构建体，包含与一种或多种调控序列可操作地连接的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导分离多肽的产生。
一种重组表达载体，包含上述的核酸构建体。可以用许多方式操作编码本发明水解酶的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Aln1基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1（Invitrogen Corp. SanDiego. California. USA）；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia BiotechInc.USA）等。
一种重组宿主细胞，由上述重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。作为优选，所述重组宿主细胞为细菌、酵母或哺乳动物细胞。进一步地，所述重组宿主细胞为E. coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。最优选地，所述重组宿主细胞为E. coli细菌。
一种制备上述分离多肽的方法，包括以下步骤：
(1)在有助于产生酯类水解酶的条件下培养如上述的重组宿主细胞。
(2)回收分离、纯化多肽。
在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶Aln1的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批或固态发酵）来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。
步骤（2）中，所得水解酶Aln1可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析（例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）或差示溶解度（例如硫酸铵沉淀）等方法。
上述分离多肽或重组宿主细胞在催化酯类水解中的应用。例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶Aln1具有酯酶活性。Aln1或上述能表达Aln1的宿主菌可用于水解C2-C10链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8）和对硝基苯酚癸酸酯（C10）。经测定表明，水解酶Aln1对酰基碳链较短酯类物质具有较好催化活性，对于短链酯类的水解活力优于长链酯类。因此，优选Aln1水解酶用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。
实施例1：水解酶基因Aln1的获取
基于分离自海水的细菌全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得aln1基因，大小为675 bp，碱基组成为100 A（14.81%）、113 T（16.74%）、245 C（36.30%）和217 G（32.15%），编码蛋白大小为224个氨基酸残基，分子量23.6 kDa。其氨基酸序列如下所示（其三字母氨基酸序列如SEQ ID No:2所示）：
MSNTLEFGRRAAASGQGDSLVIFLHGYGADSNDLLGLADPLAQHLPNTVFVAPDAPERSTVNPMGFQWFPIPWLDGSPEDLAAAAMARAATELDAFLDAMLEAEDLTPDRVVIIGFSQGTMMALHVALRRDTPFAGIVGFSGRLMEPELLADEIRARPPVLLIHGDADDVVPPQSLPEAAEALQGAGVDVYAHVMKGTGHGIAPDGLSVALAFTRQCLGLDQDA
氨基酸序列分析结果表明，该蛋白包含发挥酶活所需要的催化三联体Ser117-Asp168-His200，其中丝氨酸位于一段酯类水解酶家族保守序列内（Gly115- Gln116-Ser117- Gly118- Gly119），在系统发育上的关系与第六家族酯酶最近，与第六家族其它酯酶成员的序列相似度在40%以下，综上所述，Aln1应为第六家族羧酸酯酶家族中的一名新成员。
实施例2：基因Aln1的重组表达质粒和重组菌株的构建
将本发明获得的基因aln1克隆到表达载体上构建重组表达菌株。基于NCBI ORFFinder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物aln1F（5’-TCGCGGATCCATGAGCAACACACTTGAATT-3’，BamHI）和下游引物aln1R（5’-TCCGAGCTCTCAGGCGTCCTGGTCGAGGC-3’，Sac I），PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和Sac I双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和Sac I双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl2转化法转化至E. coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒（Omega，美国）提取阳性克隆的质粒，经BamHI和Sac I双酶切鉴定，获得675bp左右的DNA片段，经测序鉴定为基因aln1。将重组表达质粒转化到E. coli（BL21）表达菌株中，构建表达重组菌株。
实施例3：利用重组表达菌株表达重组基因Aln1
将构建好的5 ml重组表达菌株转接到250 ml含有50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃ 振荡培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.5 mM的IPTG进行诱导表达，转入16℃以200 r/min振荡培养20 h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液（500 mM 氯化钠，10mM咪唑，20 mM Tris盐酸，pH 8.0）中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni2+亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni2+亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组蛋白Aln1，分子量约24 kDa。用Brandford法测定蛋白质浓度。
实施例4：重组基因Aln1的活性检测
利用对硝基苯酚乙酸酯法测定纯化的重组水解酶Aln1活性。具体操作：1 ml反应体系中包括1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）和0.17 μg纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计（Beckman DU800型，美国）于55 ℃条件下连续测定吸光值A4052 min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生l µmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为12103.8 U/mg。
实施例5：水解酶Aln1底物特异性分析
水解酶Aln1的底物特异性分析采用体系（1 ml）：100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5），1 mM 底物，加入0.17 μg纯酶蛋白，在55℃下连续测定吸光值A405 2 min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），对硝基苯酚癸酸酯（C10），对硝基苯酚十二酸酯（C12），对硝基苯酚十四酸酯（C14），对硝基苯酚十六酸酯（C16）。经测定表明，Aln1对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯（C2、C4、C6和C8）具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚乙酸酯（C2）时催化活性最高（图1）。结果表明，水解酶Aln1对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。
实施例6：水解酶Aln1最适反应条件分析
水解酶Aln1最适反应pH在4.0到10.5范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯和0.34 μg纯酶蛋白，在45℃下连续测定吸光值A348 2 min。测定使用的缓冲液为：100 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0~6.0），100 mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH 6.0~8.0），100 mM Tris盐酸缓冲液（pH 7.5~9.0）和50 mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.0~10.5）。测定结果表明，Aln1最适反应pH为7.5，在pH 6.0~10.0范围内具有活性（图2）。
水解酶Aln1最适反应温度在15~70摄氏度范围内测定。具体操作为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）和0.34 μg纯酶蛋白，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃条件下连续测定吸光值A405 2 min。测定结果表明Aln1的反应温度范围为15~60 ℃，最适反应温度为55 ℃（图3）。
实施例7：水解酶Aln1酶学稳定性分析
水解酶Aln1的热稳定性分析具体操作为：在20至60 ℃温度区间内每10 ℃为一个梯度建立温度梯度。将酶液分别在各温度梯度条件下孵育1 h、2 h和4 h，测定酶的活性；测活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）和0.34 μg纯酶蛋白，于55 ℃下连续测定吸光值A405 2 min。结果表明，在20~50℃中孵育4h条件下，Aln1仍能保持80%以上活性（图4），说明Aln1具有较好的热稳定性。
有机溶剂对水解酶Aln1活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入有机溶剂，测定酶的活性。加入有机溶剂的用量与种类有15%（v/v）：丙酮（Acetone）、乙腈（Acetonitrile）、乙醇（Ethanol）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Glycerol）、异丙醇（Isopropanol）和甲醇（Methanol）；1%（v／v）：吐温20（Tween 20）、吐温80（Tween 80）、TritonX-100和SDS，测酶活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）和0.34 μg纯酶蛋白，于55℃下连续测定吸光值A4052 min。测定结果表明，Aln1能耐受丙酮、DMSO、乙醇、甘油、异丙醇、甲醇、吐温20和吐温80等有机溶剂及去垢剂（图5）。
NaCl对水解酶Aln1活性影响的测定具体操作为：向反应体系中加入不同浓度NaCl，测定酶活性。NaCl浓度为0-4.5 M。测酶活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）和0.34 μg纯酶蛋白，于55℃下连续测定吸光值A405 2 min。测定结果表明，在NaCl终浓度为2 M时，酯酶Aln1可保留50%以上的活性（图6）。
二价阳离子对水解酶Aln1活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Sr2+、Zn2+和乙二胺四乙酸（EDTA），测定酶活性。测酶活体系为：加入1 mM对硝基苯酚乙酸酯，100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）和0.34 μg纯酶蛋白，于55℃下连续测定吸光值A405 2 min。于50℃下连续测定吸光值A405 2 min。测定结果表明，Aln1对Mg2+、Ba2+有强耐受性，能保持70 %以上的酶活，在Ca2+、Sr2+中能保持50 %左右的酶活，EDTA对酶活有促进作用（图7）。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 自然资源部第二海洋研究所
中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一种具有高盐度、有机溶剂及去垢剂高耐受性的第六家族酯类水解酶及其编码基因、应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> 海洋细菌(Rhodophyticola sp.)
<400> 1
atgagcaaca cacttgaatt tggccgccgc gcggctgcat cggggcaggg cgacagcctg 60
gtgatcttcc tgcacggcta tggcgccgat agcaacgacc tgctcggcct cgccgatccg 120
ctggcgcagc acctgccgaa cacggttttc gtcgccccgg atgcgccgga acgctcgacc 180
gtgaacccga tggggttcca gtggttcccg atcccctggc tcgacggctc gcccgaggat 240
ctggccgccg cggccatggc gcgcgccgcg accgaactcg atgccttcct cgacgcgatg 300
ctggaggcgg aagacctgac ccccgaccgc gtcgttatca tcgggttcag tcagggcacc 360
atgatggcgt tgcacgtggc cctgcgccgc gacacgccct tcgccggcat cgtcggcttt 420
tcgggccggt tgatggaacc ggaactgctc gccgacgaga tccgcgcccg cccgcccgtc 480
ctcttgatcc atggcgatgc cgatgacgtg gtgccgccgc aaagcctgcc cgaggccgcc 540
gaggcgctgc aaggcgcggg cgtcgatgtc tatgcccatg tcatgaaagg caccggccac 600
ggcatcgcgc ccgatggcct gtccgtggcg ctggccttca ctcgccaatg cctcggcctc 660
gaccaggacg cctga 675
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> 海洋细菌(Rhodophyticola sp.)
<400> 2
Met Ser Asn Thr Leu Glu Phe Gly Arg Arg Ala Ala Ala Ser Gly Gln
1 5 10 15
Gly Asp Ser Leu Val Ile Phe Leu His Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Asn
20 25 30
Asp Leu Leu Gly Leu Ala Asp Pro Leu Ala Gln His Leu Pro Asn Thr
35 40 45
Val Phe Val Ala Pro Asp Ala Pro Glu Arg Ser Thr Val Asn Pro Met
50 55 60
Gly Phe Gln Trp Phe Pro Ile Pro Trp Leu Asp Gly Ser Pro Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Ala Ala Ala Met Ala Arg Ala Ala Thr Glu Leu Asp Ala Phe
85 90 95
Leu Asp Ala Met Leu Glu Ala Glu Asp Leu Thr Pro Asp Arg Val Val
100 105 110
Ile Ile Gly Phe Ser Gln Gly Thr Met Met Ala Leu His Val Ala Leu
115 120 125
Arg Arg Asp Thr Pro Phe Ala Gly Ile Val Gly Phe Ser Gly Arg Leu
130 135 140
Met Glu Pro Glu Leu Leu Ala Asp Glu Ile Arg Ala Arg Pro Pro Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile His Gly Asp Ala Asp Asp Val Val Pro Pro Gln Ser Leu
165 170 175
Pro Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gln Gly Ala Gly Val Asp Val Tyr Ala
180 185 190
His Val Met Lys Gly Thr Gly His Gly Ile Ala Pro Asp Gly Leu Ser
195 200 205
Val Ala Leu Ala Phe Thr Arg Gln Cys Leu Gly Leu Asp Gln Asp Ala
210 215 220

Claims (9)

1.一种具有酯类水解酶活性和高盐度、有机溶剂及去垢剂耐受性的分离多肽，其特征在于：
（a）具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a；或
（b）具有与氨基酸序列a至少90%以上同源性及至少90%以上酯类水解酶活性的氨基酸序列b；所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到；所述催化中心位于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列a中的115-119，168和200位点。
2.如权利要求1所述的分离多肽，其特征在于，所述氨基酸序列b具有与氨基酸序列a至少95%以上同源性及至少95%以上酯类水解酶活性；或
所述氨基酸序列b由在氨基酸序列a的基础上，在远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到。
3.一种编码如权利要求1或2所述分离多肽的多核苷酸，其特征在于：
（a）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a；或
（b）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列a至少90%以上同源性的核苷酸序列b；所述核苷酸序列b由对核苷酸序列a中除343-357，502-504和598-600位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列b具有与核苷酸序列a至少95%以上的同源性。
5.一种核酸构建体，其特征在于：包含与一种或多种调控序列可操作地连接的如权利要求3或4的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导分离多肽的产生。
6.一种重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求5所述的核酸构建体。
7.一种重组宿主细胞，其特征在于：由权利要求6所述的重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。
8.一种制备如权利要求1或2所述分离多肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在有助于产生酯类水解酶的条件下培养如权利要求8所述的重组宿主细胞；
(2)回收分离、纯化多肽。
9.权利要求1或2所述分离多肽或权利要求8所述重组宿主细胞在催化酯类水解中的应用。
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GENBANK: "Alphabeta fold hydrolase(rhodophyticola sp.DY48-A3-103)", 《GENBANK》 *

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