CN112779188A

CN112779188A - 一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用

Info

Publication number: CN112779188A
Application number: CN202110078547.3A
Authority: CN
Inventors: 吴月红; 施晓威; 许学伟; 孟凡旭; 周鹏; 程虹
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Second Institute of Oceanography MNR
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Second Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112779188B

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用。本发明从西太平洋深层海水分离出一株中温细菌SIOC 00011，其菌株所产的酯类水解酶在45℃达到最大酶活性，当pH值在6.0至9.0之间保持高活性，对高盐度有较强耐受性，能耐受Ba²⁺、Mg²⁺等金属离子。Ala2对于短链脂肪酸具有高催化活性，最适底物为对硝基苯酚己酸酯。该基因所编码的Ala2的热稳定性和对高盐度较强的适应性，使其可应用于废水处理、精细化工、制药和环境修复等含盐条件下的工业生产。

Description

一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用。

背景技术

酯类水解酶广泛存在于微生物、动物和植物中，是一种能够催化脂肪酸酯键水解或合成反应的一类水解酶的总称。酯类水解酶参与生物体多个代谢过程，在酯类运输、细胞结构构建以及能量代谢中发挥重要功能，是维持生命体生存所必需的酶类之一。第IV家族酯酶与哺乳动物的激素敏感型脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）高度同源，因此又被称为细菌来源HSL家族酯酶。有研究表明，海洋细菌来源的酯酶多数属于这一家族。该家族酯酶具有多种不同的细菌来源，表现出优良的动力学特性，对短链对硝基苯酚酯和三丁酯具有普遍的催化水解活性。广泛底物谱和功能多样性使该家族水解酶在诸如食品、医药、纺织、洗涤、污水处理、环境修复等领域具有广泛的潜在应用价值，成为国内外研究热点。

然而在一些水解条件苛刻的应用场景中，例如高盐度等，现有技术中大多数的脂类水解酶在这些水解环境中酶活性会受到严重抑制，因此限制了其实际应用，难以符合实际应用需求。因此有必要不断开发出更多可耐受高盐度的酯类水解酶种类，以满足不同应用场景的需求。

发明内容

本发明提供了一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用。本发明从西太平洋深层海水分离出一株中温细菌SIOC 00011，其菌株所产的酯类水解酶具有高催化活性和高盐度耐受性，可用于广泛pH条件下高温反应中酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。可用于精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌，分离自西太平洋深层海水，命名为SIOC 00011，已于2020年12月22日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC NO：61379，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；微生物分类命名为中温细菌Altererythrobacter aerophilus。

本发明的中温细菌SIOC 00011具有分泌酯类水解酶的功能，且其分泌的酯类水解酶，催化活性高，在pH值=6.0-9.0之间保持高活性（最大酶活的50%以上），最适pH为8.0；温度范围为10~60 ℃，最适温度45 ℃；在15~40 ℃中孵育4h，仍能保持50%以上活性；对高盐度有较强耐受性，在为2.5 M NaCl浓度下可保留40%以上的活性，在2 M NaCl浓度下孵育5h，仍能保持30%以上的活性。此外，其能耐受Ba²⁺、Mg²⁺等金属离子，其活性会被Cd²⁺、Co²⁺、Cu² ⁺、Mn²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，EDTA对酶活有促进作用。该酯类水解酶对于短链脂肪酸具有高催化活性，最适底物为对硝基苯酚己酸酯。该酯类水解酶的热稳定性和对高盐度较强的适应性，使其可应用于废水处理、精细化工、制药和环境修复等含盐条件下的工业生产。

第二方面，本发明提供了一种产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌的突变体，所述突变体为所述中温细菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

作为优选，所述突变体具有与所述中温细菌至少90%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少90%以上的酯类水解酶活性。

作为进一步优选，所述突变体具有与所述中温细菌至少95%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少95%以上的酯类水解酶活性。

最优选地，所述突变体具有与所述中温细菌至少99%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少99%以上的酯类水解酶活性。

第三方面，本发明提供了一种含有所述中温细菌或含有所述突变体的菌体培养物。

作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

第四方面，本发明提供了一种由所述中温细菌或所述突变体分泌的酯类水解酶。

第五方面，本发明提供了一种制备所述酯类水解酶的方法，包括以下步骤：

(1)在有助于产生酯类水解酶的条件下培养所述中温细菌或所述突变体。

(2)回收分离、纯化酯类水解酶。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酯类水解酶的营养培养基中培养菌株。例如，可以通过在合适培养基中进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批或固态发酵）来培养菌株。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。

作为优选，步骤（2）中，所得酯类水解酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

作为优选，步骤（2）中，可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析（例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）或差示溶解度（例如硫酸铵沉淀）等方法。

第六方面，本发明提供了所述中温细菌或所述突变体或所述菌体培养物或所述酯类水解酶在催化酯类水解中的应用。

本发明还提供了上述物质在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯类水解酶具有酯酶活性，可用于水解C2-C10链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8）和对硝基苯酚癸酸酯（C10）。

经测定表明，酯类水解酶对酰基碳链较短酯类物质具有较好催化活性，对于短链酯类的水解活力优于长链酯类。因此，优选用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

（1）本发明的中温细菌SIOC 00011具有分泌酯类水解酶的功能，且其分泌的酯类水解酶，催化活性高，在pH值=6.0-9.0之间保持高活性（最大酶活的50%以上），最适pH为8.0；温度范围为10~60 ℃，最适温度45 ℃；在15~40 ℃中孵育4h，仍能保持50%以上活性；对高盐度有较强耐受性，能耐受Ba²⁺、Mg²⁺等金属离子，EDTA对酶活有促进作用。

（2）本发明的中温细菌SIOC 00011所产的酯类水解酶对于短链脂肪酸具有高催化活性，最适底物为对硝基苯酚己酸酯。该酯类水解酶的热稳定性和对高盐度较强的适应性，且可应用于环境中，包括酸性、中性及碱性水解环境，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定水解酶。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等不同pH环境的生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为酯类水解酶Ala2的底物特异性图。其中，C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12:对硝基苯酚十二酸酯；C14对硝基苯酚十四酸酯；C16:对硝基苯酚十六酸酯。定义底物为C6时测定值为100%。

图2为酯类水解酶Ala2最适反应pH图。

图3为酯类水解酶Ala2最适反应温度图。

图4为酯类水解酶Ala2不同温度下热稳定性图。

图5为有机溶剂对酯类水解酶Ala2活性影响图。

图6-7为NaCl对酯类水解酶Ala2活性影响图。

图8为二价阳离子对酯类水解酶Ala2活性影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌，分离自西太平洋深层海水，命名为SIOC 00011，已于2020年12月22日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCCNO：61379；微生物分类命名为中温细菌Altererythrobacter aerophilus。

一种产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌的突变体，所述突变体为所述中温细菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。作为优选，所述突变体具有与所述中温细菌至少90%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少90%以上的酯类水解酶活性。作为进一步优选，所述突变体具有与所述中温细菌至少95%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少95%以上的酯类水解酶活性。最优选地，所述突变体具有与所述中温细菌至少99%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少99%以上的酯类水解酶活性。

一种含有所述中温细菌或含有所述突变体的菌体培养物。作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

一种由所述中温细菌或所述突变体分泌的酯类水解酶。

一种制备所述酯类水解酶的方法，包括以下步骤：

(2)回收分离、纯化酯类水解酶。

作为优选，步骤（2）中，所得酯类水解酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。此外，可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析（例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）或差示溶解度（例如硫酸铵沉淀）等方法。

所述中温细菌或所述突变体或所述菌体培养物或所述酯类水解酶在催化酯类水解中的应用。本发明还提供了上述物质在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯类水解酶具有酯酶活性，可用于水解C2-C10链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8）和对硝基苯酚癸酸酯（C10）。经测定表明，酯类水解酶对酰基碳链较短酯类物质具有较好催化活性，对于短链酯类的水解活力优于长链酯类。因此，优选用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。

实施例1：中温细菌SIOC 00011所产酯类水解酶Ala2的活性检测

利用对硝基苯酚己酸酯法测定纯化的酯类水解酶活性。具体操作：1 ml反应体系中包括1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄- Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计（Beckman DU800型，美国）于45 ℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生l µmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为14586 U/mg。

实施例2：酯类水解酶Ala2底物特异性分析

水解酶Ala2的底物特异性分析采用体系（1 ml）：100 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0），1 mM 底物，加入0.0016 μg纯酶蛋白，在45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯（C2），对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚己酸酯（C6），对硝基苯酚辛酸酯（C8），对硝基苯酚癸酸酯（C10），对硝基苯酚十二酸酯（C12），对硝基苯酚十四酸酯（C14），对硝基苯酚十六酸酯（C16）。经测定表明，Ala2对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯（C2、C4、C6和C8）具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯（C6）时催化活性最高（图1）。结果表明，酯类水解酶Ala2对酰基碳链较短酯类物质具有较好催化活性，对于短链酯类的水解活力优于长链酯类。

实施例3：酯类水解酶Ala2最适反应条件分析

水解酶Ala2最适反应pH在4.0到10.5范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1 mM对硝基苯酚己酸酯和0.0016 μg纯酶蛋白，在45℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2 min。测定使用的缓冲液为：100 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0~6.0），100 mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH 6.0~8.0），100 mM Tris盐酸缓冲液（pH 7.5~9.0）和50 mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.0~10.5）。测定结果表明，Ala2最适反应pH为6.0，在pH5.0~10.5范围内具有活性（图2）。

水解酶Ala2最适反应温度在25~55摄氏度范围内测定。具体操作为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄- Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，分别在10、20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明Ala2的反应温度范围为10~60 ℃，最适反应温度为45 ℃（图3）。

实施例4：酯类水解酶Ala2酶学稳定性分析

水解酶Ala2的热稳定性分析具体操作为：在20至60 ℃温度区间内每10 ℃为一个梯度建立温度梯度。将酶液分别在各温度梯度条件下孵育1 h、2 h和4 h，测定酶的活性；测活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，于45 ℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min。结果表明，在20~40摄氏度中孵育4 h条件下，Ala2仍能保持50%以上活性（图4），说明Ala2具有较好的热稳定性。

有机溶剂对水解酶Ala2活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入有机溶剂，测定酶的活性。加入有机溶剂的用量与种类有15%（v/v）：丙酮（Acetone）、乙腈（Acetonitrile）、乙醇（Ethanol）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Glycerol）、异丙醇（Isopropanol）和甲醇（Methanol）；1%（v/v）：吐温20（Tween 20）、吐温80（Tween 80）、TritonX-100和SDS，测酶活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min。测定结果表明，SDS、吐温20、吐温80、乙醇、DMF和乙腈对Ala2活性抑制作用较为明显（图5）。

NaCl对水解酶Ala2活性影响的测定具体操作为：向反应体系中加入不同浓度NaCl，测定酶活性。NaCl浓度为0-4.5 M。测酶活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min。测定结果表明，在NaCl终浓度为2.5 M时，酯酶Ala2可保留40%以上的活性（图6）。进一步测定了在2 M NaCl浓度下，酯酶Ala2的酶活随时间变化的关系，实验结果显示，酯酶Ala2在2 M NaCl浓度下孵育5 h，仍能保持30%以上的活性（图7）。

二价阳离子对水解酶Ala2活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸（EDTA），测定酶活性。测酶活体系为：1 ml反应体系中，加入1 mM对硝基苯酚己酸酯，100 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=8.0）和0.0016 μg纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2 min。测定结果表明，Ala2活性会被Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ca²⁺和Cd²⁺明显抑制，Mg²⁺和Ba²⁺几乎不影响Ala2的酶活，EDTA对酶活有促进作用（图8）。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌，其特征在于：所述中温细菌命名为SIOC 00011，已于2020年12月22日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCCNO：61379；微生物分类命名为中温细菌Altererythrobacter aerophilus。

2.一种产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述中温细菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有与权利要求1所述中温细菌至少90%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与权利要求1所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少90%以上的酯类水解酶活性。

4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有与权利要求1所述中温细菌至少95%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与权利要求1所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少95%以上的酯类水解酶活性。

5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有与权利要求1所述中温细菌至少99%以上同源性的核苷酸序列，且该突变体与权利要求1所述中温细菌分泌的酯类水解酶具有至少99%以上的酯类水解酶活性。

6.一种含有如权利要求1所述中温细菌或含有如权利要求2-5之一所述突变体的菌体培养物。

7.如权利要求6所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

8.一种由权利要求1所述中温细菌或权利要求2-5之一所述突变体分泌的酯类水解酶。

9.一种制备权利要求8所述酯类水解酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)在有助于产生酯类水解酶的条件下培养权利要求1所述中温细菌或权利要求2-5之一所述突变体；

(2)回收分离、纯化酯类水解酶。

10.如权利要求1所述中温细菌或权利要求2-5之一所述突变体或权利要求6或7所述菌体培养物或权利要求8所述酯类水解酶在催化酯类水解中的应用。