JPH04316482A - インジゴ生成能を有するシュードモナス属に属する微生物の培養方法 - Google Patents
インジゴ生成能を有するシュードモナス属に属する微生物の培養方法Info
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- JPH04316482A JPH04316482A JP11076991A JP11076991A JPH04316482A JP H04316482 A JPH04316482 A JP H04316482A JP 11076991 A JP11076991 A JP 11076991A JP 11076991 A JP11076991 A JP 11076991A JP H04316482 A JPH04316482 A JP H04316482A
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インジゴ生成能を有す
るシュードモナス属に属する微生物の培養方法に関し、
さらに詳しくは、該微生物のインジゴ生成能及び菌体収
量を向上させる培養方法に関する。
るシュードモナス属に属する微生物の培養方法に関し、
さらに詳しくは、該微生物のインジゴ生成能及び菌体収
量を向上させる培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、インジゴは工業用染料として広く
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。
【０００３】また、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている（Ｂｕｒｔ Ｄ．Ｅｎｓｌｅｙ，Ｂａｒｒｙ
Ｊ．Ｒａｔｚｋｉｎ，Ｔｉｍｔｈｙ Ｄ．Ｏｓｓｌｕ
ｎｄ ａｎｄ Ｍａｒｙ Ｊ．Ｓｉｍｏｎ；Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，ｖｏｌ．２２２，Ｐ．１６７−１６９（１９８３
））。しかしながら、該酵素を工業的に使用するために
は、酵素活性を低下させることなく、また高収量で該酵
素含有微生物を得ることが必要であり、インジゴ生成能
を有する微生物の実際的な培養方法の開発が望まれてい
る。
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている（Ｂｕｒｔ Ｄ．Ｅｎｓｌｅｙ，Ｂａｒｒｙ
Ｊ．Ｒａｔｚｋｉｎ，Ｔｉｍｔｈｙ Ｄ．Ｏｓｓｌｕ
ｎｄ ａｎｄ Ｍａｒｙ Ｊ．Ｓｉｍｏｎ；Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，ｖｏｌ．２２２，Ｐ．１６７−１６９（１９８３
））。しかしながら、該酵素を工業的に使用するために
は、酵素活性を低下させることなく、また高収量で該酵
素含有微生物を得ることが必要であり、インジゴ生成能
を有する微生物の実際的な培養方法の開発が望まれてい
る。
【０００４】また、従来、インジゴ生成能を有するシュ
ードモナス属に属する微生物を培養するときに、主炭素
源として、キシレン、トルエン又はｍ−メチルベンジル
アルコ−ルを用いることが知られていたが（Ｎ．Ｍｅｒ
ｍｏｄ ｅｔａｌ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４
，３２１（１９８６））、キシレンやトルエンは、微生
物のインジゴ生成能及び菌体収量に影響するという問題
点があった。
ードモナス属に属する微生物を培養するときに、主炭素
源として、キシレン、トルエン又はｍ−メチルベンジル
アルコ−ルを用いることが知られていたが（Ｎ．Ｍｅｒ
ｍｏｄ ｅｔａｌ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４
，３２１（１９８６））、キシレンやトルエンは、微生
物のインジゴ生成能及び菌体収量に影響するという問題
点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イン
ジゴ生産菌のインジゴ生成能及び菌体収量を向上させる
ことができる培養方法を提供することにある。
ジゴ生産菌のインジゴ生成能及び菌体収量を向上させる
ことができる培養方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、インジゴ
生産菌の工業的培養方法を確立するために、反応条件等
について鋭意検討した結果、主炭素源として用いるキシ
レン又はトルエンの添加濃度が０．３ （Ｗ／Ｖ）％を
超えると、菌体の増殖及び酵素の生成が阻害されること
を見出し、本発明を完成するに至った。
生産菌の工業的培養方法を確立するために、反応条件等
について鋭意検討した結果、主炭素源として用いるキシ
レン又はトルエンの添加濃度が０．３ （Ｗ／Ｖ）％を
超えると、菌体の増殖及び酵素の生成が阻害されること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、培養中のキシレン又
はトルエンの培地濃度が０．３ （Ｗ／Ｖ）％を超えな
いようにキシレン又はトルエンを断続的又は連続的に添
加して培養することを特徴とするインジゴ生成能を有す
るシュードモナス属に属する微生物の培養方法である。
はトルエンの培地濃度が０．３ （Ｗ／Ｖ）％を超えな
いようにキシレン又はトルエンを断続的又は連続的に添
加して培養することを特徴とするインジゴ生成能を有す
るシュードモナス属に属する微生物の培養方法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
培養方法は、インジゴ生成能を有するシュードモナス属
に属する微生物に利用することができるが、特にシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ・ｓｐ．ＭＹ−
６菌株が好適に用いられる。本菌株の菌学的性質とその
分類学的性質は次の通りである。
培養方法は、インジゴ生成能を有するシュードモナス属
に属する微生物に利用することができるが、特にシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ・ｓｐ．ＭＹ−
６菌株が好適に用いられる。本菌株の菌学的性質とその
分類学的性質は次の通りである。
【０００９】Ｉ．顕微鏡的性質
（ａ） 細胞の形及び大きさ：桿菌、１×２〜４μｍ（
ｂ） 多形性の有無：無し （ｃ） 運動性：有り （ｄ） 鞭毛の着生状態：極鞭毛 （ｅ） 胞子の有無：無し （ｆ） グラム染色：陰性
ｂ） 多形性の有無：無し （ｃ） 運動性：有り （ｄ） 鞭毛の着生状態：極鞭毛 （ｅ） 胞子の有無：無し （ｆ） グラム染色：陰性
【００１０】ＩＩ．培養的性質
（ａ） 肉汁寒天培地における生育：有り（ｂ） 資化
可能な炭素源：グルコース、酢酸、コハク酸、フマル酸
、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロール、Ｌ−
バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン
可能な炭素源：グルコース、酢酸、コハク酸、フマル酸
、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロール、Ｌ−
バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン
【００１１】
ＩＩＩ．生育条件 （ａ） 生育温度：１０〜４０℃ （ｂ） 生育ｐＨ：６〜８ （ｃ） 酸素要求性：好気性
ＩＩＩ．生育条件 （ａ） 生育温度：１０〜４０℃ （ｂ） 生育ｐＨ：６〜８ （ｃ） 酸素要求性：好気性
【００１２】ＩＶ．生理学的性質
（ａ） オキシダーゼ：陽性
（ｂ） カタラーゼ：陽性
（ｃ） ＤＮＡ中のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量：
６１％ （ｄ） デンプンの加水分解：陰性 （ｅ） プロトカテキン酸の分解：陽性
６１％ （ｄ） デンプンの加水分解：陰性 （ｅ） プロトカテキン酸の分解：陽性
【００１３】以
上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・システ
マティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）」第２巻（１９８６年）より検索した。 その結果、本菌はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ｕｓ） 属に属する菌株であると同定されたが、種につ
いては炭素源の資化性その他の性質から合致しない点が
あり、新菌株と考えられた。従って本発明においてはシ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ・ｓｐ．Ｍ
Ｙ−６と呼称することとする。なお本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１
１９６３号（ＦＥＲＭＰ−１１９６３）として寄託され
ている。
上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・システ
マティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）」第２巻（１９８６年）より検索した。 その結果、本菌はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ｕｓ） 属に属する菌株であると同定されたが、種につ
いては炭素源の資化性その他の性質から合致しない点が
あり、新菌株と考えられた。従って本発明においてはシ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ・ｓｐ．Ｍ
Ｙ−６と呼称することとする。なお本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１
１９６３号（ＦＥＲＭＰ−１１９６３）として寄託され
ている。
【００１４】炭素源としては、ｐ−キシレン、ｍ−キシ
レン又はトルエンが好適に用いられ、炭素源濃度は、０
．３ （Ｗ／Ｖ）％を超えないように、好ましくは０．
２ （Ｗ／Ｖ）％を超えないように断続的又は連続的に
培地に添加する。
レン又はトルエンが好適に用いられ、炭素源濃度は、０
．３ （Ｗ／Ｖ）％を超えないように、好ましくは０．
２ （Ｗ／Ｖ）％を超えないように断続的又は連続的に
培地に添加する。
【００１５】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩
；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等
の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩
；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等
の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。
【００１６】無機物としては、リン酸カリウム、硝酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。
【００１７】培養温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のｐＨは６〜９、
好ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のｐＨは６〜９、
好ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。
【００１８】本発明により培養した菌体を本酵素反応に
利用する場合、該菌体はそのまま使用することができる
が、菌体の処理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕
した破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽
出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成
分を沈殿させた粗精製物の形で使用することもでき、さ
らに、該菌体又はこれら処理物を必要により固定化して
用いることもできる。
利用する場合、該菌体はそのまま使用することができる
が、菌体の処理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕
した破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽
出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成
分を沈殿させた粗精製物の形で使用することもでき、さ
らに、該菌体又はこれら処理物を必要により固定化して
用いることもできる。
【００１９】該菌体又はその処理物の存在下でのインジ
ゴ生成の反応は、従来の酵素反応と同様に、インド−ル
０．１〜２ｍＭを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６
〜９）あるいは水溶液（ｐＨ６〜９）中で、２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃の温度で、通常１０〜７２
時間反応させる。反応は、攪拌しながら行うのが好まし
い。
ゴ生成の反応は、従来の酵素反応と同様に、インド−ル
０．１〜２ｍＭを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６
〜９）あるいは水溶液（ｐＨ６〜９）中で、２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃の温度で、通常１０〜７２
時間反応させる。反応は、攪拌しながら行うのが好まし
い。
【００２０】反応に使用する微生物菌体又はその処理物
の添加量は、特に制限されるものではないが、一般に、
０．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）が用いられる。反応後、反応
液からのインジゴの分離、精製は、それ自体該知の方法
、例えば、溶媒（クロロホルム）抽出等の方法で行うこ
とができる。
の添加量は、特に制限されるものではないが、一般に、
０．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）が用いられる。反応後、反応
液からのインジゴの分離、精製は、それ自体該知の方法
、例えば、溶媒（クロロホルム）抽出等の方法で行うこ
とができる。
【００２１】
（実施例１）（ＮＨ２ ）ＳＯ４ ：３ｇ，ＫＨ２ Ｐ
Ｏ４ ：０．５ｇ，Ｋ２ ＨＰＯ４ ：０．５ｇ，Ｍｇ
ＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ２ ・２Ｈ
２ Ｏ：１０ｍｇ，ＮａＣｌ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２ Ｏ：１０ｍｇ、酵母エキス１ｇ及び蒸留水：１
０００ｍｌ（ｐＨ７．０）の培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌
処理したものに、インジゴ生成菌であるシュードモナス
・ＳＰ． ＭＹ−６菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６３
）を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。
Ｏ４ ：０．５ｇ，Ｋ２ ＨＰＯ４ ：０．５ｇ，Ｍｇ
ＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ２ ・２Ｈ
２ Ｏ：１０ｍｇ，ＮａＣｌ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２ Ｏ：１０ｍｇ、酵母エキス１ｇ及び蒸留水：１
０００ｍｌ（ｐＨ７．０）の培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌
処理したものに、インジゴ生成菌であるシュードモナス
・ＳＰ． ＭＹ−６菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６３
）を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。
【００２２】また、上記と同様の滅菌培地１０００ｍｌ
を５０００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン
、ｐ−キシレン又はトルエンを表１に示す実験区の濃度
になるように添加した後、上記振盪培養液２０ｍｌを接
種し、これを３０℃にて２４時間振盪培養した。得られ
た培養液の１００ｍｌを遠心分離（８００ｒｐｍ ，１
５分間、４℃）して集菌した。その集菌菌体の湿菌体重
量を測定し、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン又はトルエン
の濃度が０．２ （Ｗ／Ｖ）％のときの湿菌体重量を１
００として換算した各炭素源濃度の湿菌体重量の相対値
を菌体収量（％）として求めた。結果を表１に示す。
を５０００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン
、ｐ−キシレン又はトルエンを表１に示す実験区の濃度
になるように添加した後、上記振盪培養液２０ｍｌを接
種し、これを３０℃にて２４時間振盪培養した。得られ
た培養液の１００ｍｌを遠心分離（８００ｒｐｍ ，１
５分間、４℃）して集菌した。その集菌菌体の湿菌体重
量を測定し、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン又はトルエン
の濃度が０．２ （Ｗ／Ｖ）％のときの湿菌体重量を１
００として換算した各炭素源濃度の湿菌体重量の相対値
を菌体収量（％）として求めた。結果を表１に示す。
【００２３】上記の方法で調製した菌体を酵素源とし、
反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０）１００
ｍｌに懸濁後、インド−ル１ｍＭを添加し、振盪しなが
ら３０℃で２４時間反応させた。生成したインジゴ量を
、常法［Ｈ． ＫＥＩＬ， Ｃ．Ｍ． ＳＡＩＮＴ ａ
ｎｄ Ｐ．Ａ． ＷＩＬＬＩＡＭＳ， Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １６９，Ｎｏ．
２，Ｐ．７６４−７７０（１９８７） ］に従い定量し
、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン又はトルエンの濃度が０
．２ （Ｗ／Ｖ）％のときのインジゴ量を１００として
換算した各炭素源濃度のインジゴ量の相対値をインジゴ
生成量（％）として求めた。結果を表１に示す。
反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０）１００
ｍｌに懸濁後、インド−ル１ｍＭを添加し、振盪しなが
ら３０℃で２４時間反応させた。生成したインジゴ量を
、常法［Ｈ． ＫＥＩＬ， Ｃ．Ｍ． ＳＡＩＮＴ ａ
ｎｄ Ｐ．Ａ． ＷＩＬＬＩＡＭＳ， Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １６９，Ｎｏ．
２，Ｐ．７６４−７７０（１９８７） ］に従い定量し
、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン又はトルエンの濃度が０
．２ （Ｗ／Ｖ）％のときのインジゴ量を１００として
換算した各炭素源濃度のインジゴ量の相対値をインジゴ
生成量（％）として求めた。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、インジゴ生産菌
のインジゴ生成能及び菌体収量を向上させることができ
るので、高収率でインジゴを製造することができる。
のインジゴ生成能及び菌体収量を向上させることができ
るので、高収率でインジゴを製造することができる。
Claims (1)
- 【請求項１】 培養中のキシレン又はトルエンの培地
濃度が０．３ （Ｗ／Ｖ）％を超えないようにキシレン
又はトルエンを断続的又は連続的に添加して培養するこ
とを特徴とするインジゴ生成能を有するシュードモナス
属に属する微生物の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11076991A JPH04316482A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | インジゴ生成能を有するシュードモナス属に属する微生物の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11076991A JPH04316482A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | インジゴ生成能を有するシュードモナス属に属する微生物の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04316482A true JPH04316482A (ja) | 1992-11-06 |
Family
ID=14544120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11076991A Pending JPH04316482A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | インジゴ生成能を有するシュードモナス属に属する微生物の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04316482A (ja) |
-
1991
- 1991-04-17 JP JP11076991A patent/JPH04316482A/ja active Pending
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