JPS6016229B2 - 微生物菌体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物菌体の製造方法に関する。

近年、飼料、食料、医薬品、工業用原料等として微生物
菌体を有効に利用する方策が探究されている。又微生物
菌体を工業的に有効に製造するために、化学工業で安価
にかつ大量に供給される見通しのあるメタノールを炭素
源として使用することが期待されている。本発明者等は
、かかる事情に鑑み、主たる炭素源としてメタノールを
好気的に資化し、効率よく培養できる微生物菌体を自然
界より汎く探策した結果、細菌の新菌種シュードモナス
キュートェンシスを発見し、これを利用して微生物菌
体を経済的にかつ大量に製造する方法を確立した。

本発明の要旨は、シュードモナス キュートェンシスに
属する細菌をメタノールを主たる炭素源とする培地で、
培養物より菌体を採取することを特徴とする、微生物菌
体の製造方法に存する。本発明における微生物菌体は、
菌学的性質からすればシュードモナス属に属するものと
みられるが、シュードモナス属に属する公知の菌種と比
較すると種々の点で相違しているで、これを新菌種と断
定し、シュードモナス キュートェンシス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓＫｙｏｔｏｅｎｓｉｓ）と命名した。本発
明における微生物菌体の代表的なものは、シユードモナ
ス キユートエンシス ＤＳ一２２（微生物受託番号
徴工研菌寄第４０９ｙ号）であるが、この細菌の菌学的
性質を次に示す。【ａ｝ 形態 肉汁液体培地及び肉汁寒天培地にて３７０で３日間培養
した。

■ 細胞の形および大きさ：樺菌、（０．５）×（１．
７〜１．８）山■ 細胞の集団：単細胞または双細胞 ■ 運動性の有無：運動性あり。

極鞭毛を有する。■ 胞子の有無：なし。

■ グラム染色性：グラム陰性 ■ 抗酸性：陰性 ｛ｂ｝ 次の各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養：３７ｑ０で３日間培養で旺盛な
生育。

コロニーは外形が円形で大きさは３〜４脚。表面は粕面
く周辺は全緑あるいは波状。乳黄白色で、光沢がなく不
透明。硬度は粘鋼。■ メタノール含有寒天平板培養：
３７０で５日間培養で旺盛な生育。

コロニーは外形が円形。

大きさは３〜４．５肌。隆起はへそ状（中央部が凹状）
。表面は粕面。周辺は全縁。乳白色で光沢がなく不透明
。硬度は粘稲。■ 肉汁寒天斜面培養：３７０で３日間
培養で接種線に一様に生育。

隆起は中程度で、表面は平滑。辺縁は全縁あるいは波状
。乳黄色で、光沢がなく不透明。硬度は粘楓。■ メタ
ノール寒天斜面培養：３で○で５日間培養で接種線に一
様に生育。

隆起は中程度で、表面は粗面、辺縁は波状あるし、は裂
波状。乳白色で薄桃色の色素を生ずる。極めてにぷい光
沢を有し不透明。硬度は粘鋼。■ 肉汁液体静置培養：
３７ｑ０で３日間培養で生育は中程度。

沈澱なし。表面に菌膜を形成する。■ 肉汁液体振糧培
養：３７０で３日間培養で旺盛に生育し濁る。

沈澱あり。不透明。■ べプトン水液体振濠培養：３７
０で日間培養で全体に旺盛に生育し、濁る。

沈澱あり。■ メタノール含有液体静暦培養：３７℃で
３日間培養で全体に旺盛に生育し、濁る。

沈澱あり。薄い菌環を形成する。不透明。■ メタノー
ル含有液体振縁培養：３７０で３日間培養で旺盛に生育
し、濁る。

沈澱あり。不透明。■ 肉汁穿刺培養：３７℃で３日間
培養で、表面のみ生育する。

表面は乳黄色。■ 肉汁ゼラチン穿刺培養：３０午０で
５日間培養′ で表面の生育及び沈澱あり。

ゼラチンを液化する。■ リトマスミルク：３７０で培
養。

凝固する。‘ｃ｝ 次の生理学的性質■ 硝酸塩の還元
：腸性 ■ 脱窒反応：陰性 ■ Ｍ庇テスト：陰性 ＠ ＶＰテスト：腸性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陰性 ■ デンプンの加水分解：陽性 ■ クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒの培地で陽性■ 無機
窒素源：アンモニウム塩及び硝酸塩をそれぞれ利用する
。

■ 色素の生成：キングＡ，Ｂ塔地で有色色素を生じな
い。

■ ウレアーゼ：腸性 ■ オキシダーゼ：腸性 ■ カタラーゼ：腸性 ■ 生育の範囲：後記のメタノール含有液体塔地を用い
、温度およびｐＨを変化した（ｐＨはＨＣＩ又はＮａＯ
Ｈ 水溶液の添加で調整した。

）ｐＨ５〜９の範囲で生育するが ｐＨ６〜８が好適。

ｐＨ４及び１０では生育しない。

温度５〜４５℃で生育するが２５〜４〆０が好 適。

４８℃では生育しない。

■ 酸素に対する態度：好気性。

■ ○−Ｆテスト（Ｈｕ熱 いｉｆｓｏｎ法による）：
グルコースを酸化的に代謝する。

■ 下記の糠類から酸及びガスの生成の有無：べプトン
水を用いて糖濃度１重量％、温度３７００で１０日間培
養した。

酸 ガス （１）Ｌーアラビノース ■Ｄーキシロース 【３’Ｄ−グルコース 十 ｛４）○ーマンノース ＋ 【５）Ｄ−フラクトース ＋ （６）Ｄ−ガラクトース ｛７’麦芽糖 十 ｛８）ショ糖 ＋ ｛９１ 乳糖 ＯＱ トレハロース ＋ （１１）Ｄ−ソルビット ＋（弱い）−（１２）Ｄ
ーマンニツト ＋（１３）イノシツト （１心グリセリン 十 （１５）デンプン ＋ ■ 糖類の資化性：後記のメタノール含有液体塔地にお
いて、糖をメタノールの代りに使用し、糖濃度０．５重
量％、湿度３７０で１０日間培養した。

‘１１ Ｌーアラビノース ＋ ｛２’Ｄーキシロース ‘３｝ Ｄーグルコース ＋ 【４，Ｄーマンノース 十 【５１ Ｄ−フラクトース ＋ ‘６ー Ｄ−ガラクトース ＋ ‘７）麦芽糖 十 ■ショ糖 十 ‘９’ 乳糖 ００ トレハロース ＋ （１１）○ーソルビツト ＋ （１２）Ｄーマンニツト ＋ （１３）イノシツト ＋ （１の グリセリン 十 （１５）デンプン 十 ‘ｄ｝ 分離源：土壌 尚上記培養試験における、メタノール含有寒天塔地及び
メタノール含有液体培地は次の通りとした。

‘１｝ メタノール含有寒天塔地 ＫＨ２Ｐ０４１．５夕、Ｎａ２ＨＰ０４３．２夕、（Ｎ
凡）２Ｓ０４３夕、Ｍが０４・７日２００．５夕、Ｃａ
Ｃ１２・２日２００．１夕、ＦｅＳ０４・７日２００．
０１夕、ＺｎＳ０４・７日２０１．４の夕、ＣｕＳ。

４．９日２００．２５の夕、Ｎａ２ＭＯＯ４．２比００
．２４肌夕、ＣｏＣ１２・母ＬＯＯ．２４仇 夕、Ｍｎ
Ｓ０４・弧２０１．２の夕、寒天２０夕、蒸溜水１夕を
１２０００で１８分間殺菌した後、メタノール２０夕を
無菌的に添加したもの。

‘２〕 メタノール含有液体培地 メタノール含有寒天培地において寒天２０夕を使用せず
、又メタノール量を５のこしたもの。

実験方法は「パージェイス マニュアル オブデターミネイテイブバクテリオロジ Ｊ（ 氏ｒ蟹ｙ ’ ｓ Ｎ均ｎ雌ｌ ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ−鞍ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
８版（１９７仏王）、「細菌学実習提要Ｊ（医科学研究
所学友会橋、改訂版１９７３王丸善株式会社発行）及び
「微生物の分類と同定」（長谷川武治編著１９７３羊東
京大学出版会発行）に従った。

前記の菌学的性質を前記のパージェィス マニュアルに
おける分類基準に従い検討すると、シュードモナス属に
属することが確認できた。本菌と前記文献において分類
されているシュードモナス属の主要な２期蚤とを、同書
中の表に記載された性質において対比した。炭素源の資
化性以外の性質において対比すると、鞭毛を有すること
、４１℃で増殖すること、脱窒反応が陰性であること、
ゼラチンを液化すること等からシュードモナス ァルカ
リゲネス（ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅ肥ｓ
）が最も近いと考えられる。しかし本菌とシユードモナ
スアルカリゲネスを資化性も含めた全ての性質で対比す
ると、本菌の特徴とするメタノールの資化性の他に、デ
ンプンの加水分解性、グルコース、トレハロース、ィノ
シツトの資化性において相違する。又他の公３句文献か
らは、比較的近い菌種として持開昭５０−７１８８６号
公報におけるシュードモナスメ タ カルボハイリス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｔｈａｃａｒｂｈｙｌｉｓ
）、樽関昭４９−６１９２号公報におけるシユードモナ
ス メタノールオキシダンス（ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓｍ
ｅｔｈａ肌ｌｏｘｉ船ｎｓ）、持開昭５１−４１４９び
号公報におけるシュードモナス メタノリチカ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏＭｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｔｉｃａ）が挙げ
られる。

しかし本菌は、シュードモナス メタカルボ／、ィリス
とは硫化水素を生成しないこと、クエン酸を利用するこ
と、多数の各種の糖類から酸の生成、Ｌーアラビノース
、ィ／シット、グリセリンを資化すること、乳糖を資化
しないこと等から相違するものである。

又シュードモナス メタノールオキシダンスとは、硝酸
塩の還元が陽・性であること、ウレアーゼが陽性である
こと、生育温度、多数の各種の糠類からの酸の生成、乳
糖の質化性等において相違する。更に又、シュードモナ
スメタノリチカとは、硫化水素を生成しないこと、デン
プンを加水分解すること、クエン酸を利用すること、生
育の温度範囲、多数の各種の糠類からの酸の生成、乳糖
の資化性等において相違する。上記のように本菌は公知
のシュードモナス属のいずれとも著しい相違を有するも
のであることが確認できた。従って本菌をシュードモナ
ス属の新菌種と断定したものである。

本発明における菌体の培養に当っては、好気的液体培養
法が好適である。

培養温度は５〜４５℃の範囲であって、好適には２５〜
４〆○であり、ＰＨは５〜９であって、好適には６〜８
である。培養は回分培養でも連続培養でもよい。培地に
は主たる炭素源としてメタノールを使用するが、メタノ
ールの量は５０タノク以下であるのが好ましい。

窒素源としては、無機物としてアンモニウム塩、硝酸塩
等が、有機物として尿素、カゼイン、コーンステイーブ
リカ−、ベプトン、酵母エキス、肉エキス等が、隣源と
しては燐酸塩などが、硫黄源としては硫酸塩などが用い
られる。又マグネシウム、カリウム、カルシウム、ナト
リウム、鉄、マンガン、銅、亜鉛、モリブデン、コバル
ト、ホウ素などの金属源としてはその金属塩を適当量加
え、必要に応じてビタミン類、アミノ酸などの菌体の生
育に必ず必要とされる物質もしくは生長促進物質が添加
される。

又培地としては、メタノール、窒素源、無機物、ビタミ
ン、アミノ酸等の生育に必須とされる物質もしくは生長
促進物質が適量含有されるものであれば天然塔地であっ
てもよい。培地のｐＨの調節はリン酸塩とアンモニアに
よるのが便利である。培養物より菌体を採取するには、
炉週、遠心分離等を常法に従って行なえばよく、又洗練
、乾燥を施すこともできる。

本発明によれば、化学工業から豊富に供給されるメタノ
ールを主たる炭素源として利用でき、シュードモナス
キュＬトェンシスに属する微生物３菌体を収率よく大量
に製造することができる。

又得られた菌体は、蛋白質に富むので飼料、食料等に利
用できる他、医薬原料、工業用原料などに有効利用でき
る。以下に本発明の実施例を記す。

３実施例 １ＫＨ２Ｐ０４ １．
５タ Ｎａ２ＨＰ０４ ３．２夕 （Ｎは）２Ｓ０４ ３タ ＭｇＳ０４・７日２０ ０．５夕
４ＣａＣ１２・２ＬＯ ０．１タＦｅＳ０４
・７日２０ ０．０２夕 ２ｎＳ。

４・７日２０ ２．８の９ ＣｕＳ。

４・ＱＨ２０ ０．５の夕 Ｎも舵０４・２日２０ ０．４８雌 ＣｄＣ１２・母も〇 ０．４＆ｏ ＭｕＳ。

４・９日２０ ２．４の９ 蒸溜水 １そ 上記の各成分からなる培地５００の上を容量が１そのミ
ニジャ−に入れ、１２０℃で１５分間殺菌後、メタノー
ル５夕を無菌的に添加した。

これに、上記と同組成の培地で、３７０で２岬時間とか
けて前培養して得られたシュードモナスキュートェンシ
スＤＳ−２２の菌体を含む前培養液を２容量％となるよ
う楯菌し、１３重量％アンモニア水でＰＨを７．０に維
持しつつ３７０で２ｑ時間、通気及び縄梓条件下に培養
を行なった。この培養物を遠心分離にかけて菌体を分離
し、更に水洗を行なった後、１００ｑｏで２風寿間をか
けて乾燥し、培養物１そ当り４．３夕の割合で乾燥菌体
を得た。この培養の対数増殖期の世代交代時間は１．虫
時間であった。又菌体の粗蛋白含量は７塁重量％であっ
た。実施例 ２ 実施例１におけると同組成の培地１．２〆を容量が２．
５そのジャーファーメンターに入れ、１２０午０で２船
ご間殺菌後メタノ‐ルを１２多無菌的に添加し、これと
同組成の培地で３７０で２独特間前培養して得られたシ
ュ−ドモナスキュートェンシスＤＳ−２２の菌体を含む
前培養液を５容量％となるよう楯菌し、鱗重量％アンモ
ニア水でｐＨを７．０に維持しつつ３７０で通気機梓条
件下に培養を行なった。

培養開始から２餌時間後の菌体濃度は４．３夕／そであ
った。この培養物１〆当り次の金属塩水溶液を添加した
。１０重量％ＫＨ２Ｐ０４水溶液１８の‘、５重量％Ｎ
ａ２ＨＰ０４水溶液７７の上、１の重量％ＭａＳ０４・
７日２０水溶液１８の‘、１の重量％ＣａＣ１３・２日
２０水溶液３．５私、１重量％ＦｅＳ０４・７比○水溶
液５の‘、１重量％ＺｎＳ０４・７日２０水溶液３の‘
、１重量％ＣｕＳ０４・８ＬＯ水溶液０．６の‘、１重
量％ＭｎＳ０４・班２０水溶液０．７の‘、０．１重量
％日２ＢＱ水溶液２の‘、又培養開始から２餌時間後か
らメタノールを培養物中の濃度が１〜５夕／夕を維持す
るように自動添加した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナスキユートエンシスに属する細菌を、
   メタノールを主たる炭素源とする培地で培養し、培養物
   より菌体を採取することを特徴とする、微生物菌体の製
   造方法。 ２ シユードモナスキユートエンシスに属する細菌が、
   シユードモナスキユートエンシスＤＳ−２２であること
   を特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の微生物菌体
   の製造方法。