CN110106111B - 一种假单胞菌制剂的制备方法、制剂产品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种假单胞菌制剂的制备方法、制剂产品及其应用，属于农业生物技术领域，所述制备方法包括在种子培养基、发酵培养基中培养菌体以及在发酵的一定时期加入一定量胁迫物质，胁迫发酵一段时间后，将发酵液利用喷雾干燥、流化床、湿法造粒任一种方式制备成假单胞菌制剂，本发明还提供一种假单胞菌制剂，所述假单胞菌制剂可用于防治多种植物土传病害，特别是对蔬菜青枯病，尤其是植物枯萎病有较好的防治效果，比用常规方法生产的活菌制剂具有更强的活力和抗逆能力，作用功能更多，更适合于生产应用，本发明所述制备方法可有效提高假单胞菌在高温中的存活率，改善了假单胞菌不能在高温中良好存活的缺点。

Description

一种假单胞菌制剂的制备方法、制剂产品及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种假单胞菌制剂的制备方法、制剂产品及其应用。

背景技术

荧光假单胞菌是典型的革兰氏阴性杆菌，呈单个或成对排列，一端丛毛菌，运动活泼，偶见无鞭毛无动力的菌株。荧光假单胞菌的营养要求不高，在普通培养基、麦康凯和沙门、志贺菌属在琼脂培养基平板上均可生长。最适生长温度为25℃～30℃，大多数菌株能在4℃生长，37℃～42℃则不生长。荧光假单胞菌在KB培养基上产生水溶性荧光素(青脓素)，在紫外线(366nm)照射下呈黄绿色或蓝白色荧光。荧光假单胞菌分布广泛且能适应多种生态环境。荧光假单胞菌主要通过抑制根际病原菌来体现其防治效果，主要的机理有产生一系列抗生素，通过噬铁素竞争铁原子，根系表面的侵略性定殖，产生次级代谢产物以及诱导植物抗性。荧光假单胞菌对多种植物病原菌都具有拮抗作用，如：禾顶囊壳小麦变种，黑曲霉，立枯丝核菌，灰葡萄孢，稻梨孢，烟草疫酶，烟草炭疽病，尖孢镰刀菌，核盘菌。近年来，国内外均有报道分离到抗农作物病害的荧光假单胞菌，而且许多菌株能抗多种农作物病害。王平等分离到一株荧光假单胞菌能通过分泌铁载体抑制油菜核病菌；周洪友等报道了荧光假单胞菌拮抗菌株对番茄青枯病的防治；Ramette1等研究发现荧光假单胞菌产生的藤黄酚等次级代谢产物对烟草根黑腐病有很好的抑制作用。

但是，由于荧光假单胞菌在高温中基本不生长，在制剂生产加工过程中极易因温度较高而失活。目前只有通过冷冻干燥法生产制剂成功的案例，但是冷冻干燥的成本很高，限制了荧光假单胞菌的商业化生产。液体制剂又存在运输不方便和货架期短的问题。

因此，需要提供一种制备方法，来解决荧光假单胞菌在制剂加工中极易因温度较高而失活的问题。

发明内容

本发明的目的是通过对荧光假单胞菌发酵后处理，来刺激荧光假单胞菌产生对后续高温的抗性，进而增加荧光假单胞菌在制剂生产中的存活率，以解决假单胞菌在加工过程中存活率较低的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种假单胞菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将假单胞菌接种于种子培养基中，培养12小时，作为种子液；

(2)将步骤(1)中的种子液另接种于发酵培养基中培养，培养时间15-40小时，得到发酵液；

(3)将步骤(2)得到的发酵液进行离心处理，收集步骤(2)所述发酵液中的菌体，然后将所述菌体再次接种于含有胁迫物质的发酵培养基中，继续培养，得到含耐热性强的假单胞菌菌体的发酵液；

(4)将步骤(3)得到的发酵液利用喷雾干燥、流化床、湿法造粒任一种方式制备成假单胞菌制剂。

进一步的，所述的假单胞菌为荧光假单胞菌SN15-2，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.17211，保藏日期为：2019年01月18日，分类命名为：荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步的，步骤(1)中所述的种子培养基为：蛋白胨：10-50g/L，甘油：5-20mL/L，MgSO₄·7H₂O：0.5-10g/L，K₂HPO₄：1-15g/L。所述种子培养基配方优选：蛋白胨：20g/L，甘油：10mL/L，MgSO₄·7H₂O：1.5g/L，K₂HPO₄：1.5g/L。

进一步的，所述发酵培养基为：牛肉浸膏：1-10g/L，蛋白胨：3-12g/L，蔗糖：5-20g/L。所述发酵培养基优选：牛肉浸膏：3g/L，蛋白胨：5g/L，蔗糖：10g/L。

进一步的，步骤(3)中继续培养时间为10-80分钟，优选20-60分钟。

进一步的，所述胁迫物质为NaCl、H₂O₂、乙醇、HCl、山梨糖醇、甜菜碱、海藻糖的一种或其混合物。

进一步的，所述胁迫物质的浓度为NaCl：5-300g/L；H₂O₂：0.1-2.5mL/L；乙醇：0.02-0.2mL/L；HCl：0.01-0.3mL/L；山梨糖醇：0.2-2g/L；甜菜碱：5-30g/L；海藻糖：2-25g/L。

第二方面，本发明提供了一种假单胞菌制剂。

所述制剂产品由假单胞菌发酵液与粘结剂或保护剂混合，通过喷雾干燥、流化床、湿法造粒等方式制成，所述喷雾干燥、流化床、湿法造粒等方式本领域技术人员可按照常规手段制备，在此不做赘述。

所述粘结剂选自白炭黑、硅藻土、高岭土、活性炭及其混合物；所述保护剂选自玉米淀粉、阿拉伯树胶、环糊精明胶、甘露醇及其混合物。

进一步的，所述制剂，包括但不限于利用所述发酵液制备成的水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂。

水剂由发酵液与所述保护剂混合制成，活菌含量为10⁸-10¹¹cfu/mL，优选为10⁸-10¹⁰cfu/mL。

粉剂由发酵液与所述粘结剂混合制成，活菌含量为10⁷-10¹⁰cfu/mL，优选为10⁸-10⁹cfu/mL。

粒剂与微胶囊剂由发酵液与粘结剂和保护剂通过喷雾干燥，流化床等加工制成，活菌含量为10⁷-10¹⁰cfu/mL，优选为10⁸-10⁹cfu/mL。

第三方面，本发明提供所述制剂产品在防治植物病害中的应用。

进一步的，所述植物病害为植物枯萎病。

进一步的，所述植物枯萎病为茄科蔬菜青枯病。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过加入胁迫物质胁迫假单胞菌来提高其耐热性，然后将发酵液、粘结剂与保护剂有机复配，通过喷雾干燥、流化床、湿法造粒等工艺形成假单胞菌制剂。在假单胞菌的发酵后期加入胁迫物质，一方面胁迫物质产生的环境压力刺激假单胞菌对压力做出应答，而这种应答反应能够对其他的非生物环境压力产生交叉保护的作用；另一方面是胁迫物质的加入刺激了假单胞菌体内如海藻糖，甜菜碱等具有保护作用的物质含量的提升，增强了菌体的耐受性，因此解决了假单胞菌在制备制剂过程中遇高温易失活的问题。

本发明的制剂产品可用于防治多种植物土传病害，特别是对植物枯萎病，尤其是茄科蔬菜青枯病有较好的防治效果。通过本发明生产出的制剂比普通方式生产的制剂产品具有更高的菌含量，制剂中菌体具有更强的生活力和抗逆能力，作用功能更多，更适合于生产应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1不同浓度NaCl胁迫下荧光假单胞菌耐热性情况；

图2为实施例2不同浓度H₂O₂胁迫下荧光假单胞菌耐热性情况。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的假单胞菌为荧光假单胞菌SN15-2，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.17211，保藏日期为：2019年01月18日，分类命名为：荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述的耐热性检测方法如下：

将每个处理组的发酵液用流化床制备成制剂。在制备之前和制备之后进行菌含量测定，细胞计数在KB平板上进行，一式三份。将KB平板在33℃温育48小时后计数菌落，计算cfu/mL。用损伤指数来进行荧光假单胞菌SN15-2耐热性评定，损伤指数越小，则荧光假单胞菌耐热性越强。损伤指数的计算方式为：损伤指数＝log(N0/Nf),其中，N0是流化床制备之前的发酵液中的菌含量，Nf为流化床制备成制剂后制剂中的菌含量。

流化床过程中所用粘结剂选自白炭黑、硅藻土、高岭土、活性炭及其混合物；所用保护剂选自玉米淀粉、阿拉伯树胶、环糊精及其混合物。粘结剂的用量为发酵液的5％-25％(kg/L)，保护剂的用量为30％-90％(kg/L)，优选为所述粘结剂的用量为发酵液的10％-25％(kg/L)，所述保护剂的用量为40％-70％(kg/L)。

流化床进风温度为：40-100℃，优选为：40-60℃；空气流量：10-40Hz，优选为15-30Hz；喷枪压力：0.1-0.3MP；进样流量50-100L/h。

实施例1：不同浓度NaCl胁迫对荧光假单胞菌制剂耐热性的影响

将荧光假单胞菌SN15-2接种于种子培养基，所述种子培养基配方为：蛋白胨：20g/L，甘油：10mL/L，MgSO₄·7H₂O：1.5g/L，K₂HPO₄：1.5g/L；种子培养基在28℃，200rpm下培养12h，作为种子液；然后以2％(v/v)的接种比例接种至含有50mL发酵培养基的锥形瓶中，所述发酵培养基配方为：牛肉浸膏：3g/L，蛋白胨：5g/L，蔗糖：10g/L；发酵培养基中在28℃，200rpm下培养至稳定期后期；然后8000rpm离心5min收集新鲜菌体，并用无菌水洗涤三次去除残余的培养基，分别加入50mL含有0g，0.5g，0.7g，0.9g，1.1g，1.3g NaCl的新鲜发酵培养基中继续培养60min，0g作为对照组,在第15min，30min，45min，60min，取样5mL，每个处理组用流化床制备成制剂，所述流化床制备制剂的过程为本领域技术人员的常规方式，在此不做赘述。将所述制剂进行耐热性检测实验，探究不同浓度NaCl胁迫对荧光假单胞菌制剂耐热性的影响。每组设置三个重复样本。

实验结果表明，常规发酵后(NaCl的加入量为0g)发酵液的菌含量为8.72×10¹⁰CFU/mL,形成制剂后菌含量只有1.58×10⁶CFU/克。在50mL培养基中加入0.7g及更多的NaCl时，所制备的制剂中荧光假单胞菌SN15-2的损伤指数逐渐变小，说明经过盐胁迫适应的荧光假单胞菌SN15-2的耐热性有所提高，其中加入0.9g NaCl胁迫适应45min的效果最明显，加入0.9g NaCl胁迫适应45min的发酵液中的菌含量为3.22×10¹⁰CFU/mL,形成制剂后菌含量为1.46×10⁸CFU/克。损伤指数具体数值如表1。

表1不同浓度Nacl胁迫下荧光假单胞菌的损伤指数

实施例2：不同浓度H₂O₂胁迫对荧光假单胞菌制剂耐热性的影响

将荧光假单胞菌SN15-2接种于种子培养基，所述种子培养基配方为：蛋白胨：20g/L，甘油：10mL/L，MgSO₄·7H₂O：1.5g/L，K₂HPO₄：1.5g/L，种子培养基在28℃，200rpm下培养12h，作为种子液；然后以2％(v/v)的接种比例接种至含有50mL发酵培养基的锥形瓶中，所述发酵培养基配方为：牛肉浸膏：3g/L，蛋白胨：5g/L，蔗糖：10g/L；发酵培养基28℃，200rpm下培养至稳定期；然后8000rpm离心5min收集新鲜菌体，并用无菌水洗涤三次去除残余的培养基，然后分别加入50mL含有0mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM H₂O₂的新鲜发酵培养基中继续培养60min，0mM作为对照组。在第15min，30min，45min，60min，取样5mL，利用流化床制备成制剂，对所述制剂进行耐热性检测实验，每组设置三个重复样本。

实验结果表明，常规发酵(H₂O₂的加入量为0mM)后发酵液的菌含量为8.56×10¹⁰CFU/mL,形成制剂后菌含量只有2.35×10⁶CFU/克。当在50mL培养基中加入H₂O₂时，制剂中的荧光假单胞菌SN15-2的损伤指数变小，说明经过H₂O₂氧化胁迫适应的荧光假单胞菌SN15-2的耐热性有所提高，其中加入30mM，处理30min的H₂O₂胁迫适应后的效果最明显，加入30mM的H₂O₂胁迫适应后发酵液的菌含量为7.53×10¹⁰CFU/mL,形成制剂后菌含量为5.25×10⁸CFU/克。损伤指数具体数值见表2。

表2不同浓度H₂O₂胁迫下荧光假单胞菌的损伤指数

实施例3

制备方法同实施例1，不同之处仅在于加入的胁迫物质为乙醇，其中加入10mM的乙醇，处理30min的效果最明显，损伤指数为1.72±0.19，常规发酵后(乙醇的加入量为0mM)发酵液的菌含量为8.72×10¹⁰CFU/mL,形成制剂后菌含量为1.58×10⁶CFU/克，经乙醇胁迫适应后的发酵液中菌含量为8.82×10¹⁰CFU/mL，形成制剂后菌含量为1.52×10⁸CFU/克，对青枯病的防治效果为52.13％±1.12。

实施例4

制备方法同实施例1，不同之处仅在于加入的胁迫物质为山梨糖醇和海藻糖的混合物，经山梨糖醇和海藻糖的混合物胁迫适应后的发酵液中菌含量为8.81×10¹⁰CFU/mL，形成制剂后菌含量为1.48×10⁸CFU/克，对青枯病的防治效果为53.01％±2.23。

应用例1：假单胞菌制剂对青枯病的盆栽防效分析

供试药剂：假单胞菌制剂(实施例1制得)；对照药剂为200PPM硫酸链霉素和清水。

供试作物：番茄。

药剂用量：常规制备假单胞菌制剂含量为2.35×10⁶CFU/克，胁迫处理制备假单胞菌制剂含量为5.25×10⁸CFU/克，假单胞菌制剂200倍稀释，200PPM硫酸链霉素，以清水作空白对照。

实验安排：实验在光照培养箱中进行，每天光照时间为16h，温度为25℃。非光照时间温度设为22℃，土壤湿度保存在60％左右，待幼芽长出两片子叶，灌根接种青枯病菌(1.2×10⁶CFU/g干土)，24h后，用假单胞菌制剂稀释液灌根，并设置200PPM硫酸链霉素和清水作为对照。

接种病原菌15d后，按照姚协丰等提出的病害严重度标准对番茄发病情况进行分级。病害严重度和防治效果的计算公式：

假单胞菌制剂对青枯病的盆栽防效分析的结果见表3。

表3盆栽实验中假单胞菌制剂稀释液对青枯病的防治效果

注：表中数据是三次重复的平均值，同列不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

如表3所示，假单胞菌制剂、胁迫适应后假单胞菌制剂和硫酸链霉素都能够显著降低番茄青枯病病害的严重程度。但胁迫适应后假单胞菌制剂的防治效果达到57.13％，显著高于硫酸链霉素的32.67％。经过胁迫适应后的假单胞菌制剂和未处理的假单胞菌制剂相比，防治效果也显著提高，说明本发明的处理对假单胞菌的防治效果不造成影响，还能提高防治效果。

应用例2：假单胞菌制剂对枯萎病的盆栽防效分析

供试药剂：假单胞菌制剂(实施例2制得)；对照药剂为200PPM硫酸链霉素和清水。

供试作物：西瓜。

药剂用量：常规制备假单胞菌制剂含量为2.35×10⁶CFU/克，胁迫处理制备假单胞菌制剂含量为5.25×10⁸CFU/克，假单胞菌制剂200倍稀释，200PPM嘧菌酯水分散粒剂溶液，以清水作空白对照。

实验安排：实验在光照培养箱中进行，每天光照时间为16h，温度为25℃。非光照时间温度设为22℃，土壤湿度保存在60％左右，待幼芽长出两片子叶，灌根接种枯萎病菌(1.3×10⁶CFU/g干土)，24h后，用假单胞菌制剂稀释液灌根，并设置200PPM嘧菌酯水分散粒剂溶液和清水作为对照。

病害程度与防治效果计算与实施例3相同。

假单胞菌制剂对枯萎病的盆栽防效分析见表4。

表4盆栽实验中假单胞菌制剂稀释液对枯萎病的防治效果

注：表中数据是三次重复的平均值，同列不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

如表4所示，假单胞菌制剂、胁迫适应后的假单胞菌制剂和嘧菌酯都能够显著降低西瓜枯萎病病害的严重程度。但胁迫适应后的假单胞菌制剂的防治效果达到52.93％，显著高于嘧菌酯的30.46％。经过胁迫适应后的假单胞菌制剂和未处理的制剂相比防治效果显著提高，说明本发明的处理对假单胞菌的防治效果不造成影响，还能提高防治效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种假单胞菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将假单胞菌接种于种子培养基中，培养12小时，作为种子液；

（2）将步骤（1）中的种子液另接种于发酵培养基中培养，培养时间15-40小时，得到发酵液；

（3）将步骤（2）得到的发酵液进行离心处理，收集步骤（2）所述发酵液中的菌体，然后将所述菌体再次接种于含有胁迫物质的发酵培养基中，继续培养，得到含耐热性强的假单胞菌菌体的发酵液；

（4）将步骤（3）得到的发酵液利用喷雾干燥、流化床、湿法造粒任一种方式制备成假单胞菌制剂；

所述胁迫物质为NaCl、乙醇、H₂O₂的一种或其混合物；

每升发酵液中添加胁迫物质NaCl 10-26g；每升发酵液中添加H₂O₂ 400-1000mM；每升发酵液中添加乙醇200mM；

所述菌体接种于含有胁迫物质的发酵培养基中，继续培养时间为10-80分钟；

所述的假单胞菌为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SN15-2，保藏编号为CGMCC No.17211。

2.根据权利要求1所述的一种假单胞菌制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的种子培养基为：蛋白胨：10-50 g/L，甘油：5-20 mL/L，MgSO₄·7H₂O：0.5-10 g/L，K₂HPO₄：1-15 g/L。

3.根据权利要求1所述的一种假单胞菌制剂的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基为：牛肉浸膏：1-10 g/L，蛋白胨：3-12 g/L，蔗糖：5-20 g/L。

4.一种如权利要求1所述的制备方法制备得到的制剂产品。

5.根据权利要求4所述的制剂产品，其特征在于，包括但不限于利用所述发酵液制备成的水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂。

6.根据权利要求4或5所述的一种制剂产品在防治茄科蔬菜青枯病病害中的应用。

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