CN116179359A - 一种海洋来源的皮落青霉及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋来源的皮落青霉及其培养方法和应用，所述皮落青霉皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种，保藏编号为CCTCC NO：M 20221447。该菌种的代谢产物具有较强抑菌功能，本发明优化了该菌种的培养基和培养条件，选择抗菌活性化合物产量较高的培养基和培养条件进行发酵，旨在获得更多的目标产物，操作简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋来源的皮落青霉及其培养方法和应用。
背景技术
由于独特的环境条件，海洋孕育的生物资源比陆地环境更为丰富。海洋环境的特殊性，例如高压，温度变化以及缺少营养条件等，在有限空间内得以生存及保护物种的多样性，这使他们进化出一套复杂的″生存系统″，例如采用化学策略利用二次代谢产生的大量生物活性分子。
青霉属真菌属腐生类真菌，是自然界中一类重要的分解者，存在于从土壤到植被、空气、室内环境和各种食品的各种生境中。其可以产生多种多样的次级代谢产物，主要由聚酮类、生物碱、萜类、大环内酯等化学结构类型组成，成为天然药物的重要来源。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种海洋来源的皮落青霉(Penicilliumcrustosum)S14菌种，其中：所述皮落青霉皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种，保藏编号为CCTCC NO：M 20221447，于2022年09月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种的培养方法，其由以下步骤组成，
(1)种子液制备；
(2)发酵：将大米固体发酵培养基置于发酵罐中，高压灭菌，将种子液接种于发酵罐中，进行发酵培养，得到发酵产物。
作为本发明所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14 菌种的培养方法的一种优选方案：步骤(1)中，所述种子液制备，是将S14 菌种接种到PDA平板培养基上，在28℃的温度下培养3d，当平板培养基上有菌丝长出后，用接种环蘸取孢子粉末和菌丝接种至PDB液体培养基中，在28℃的温度下，转速200r/m振荡培养3d。
作为本发明所述的海洋来源的皮落青霉(Penicilliumn crustosum)S14 菌种的培养方法的一种优选方案：步骤(2)中，所述大米固体发酵培养基的配方是：1000g大米、33g海水晶、0.075g硫酸镁、1000.0ml H2O，混合均匀后，调节pH＝7.0-7.5，121℃高压灭菌。
作为本发明所述的海洋来源的皮落青霉(Penicilliumn crustosum)S14 菌种的培养方法的一种优选方案：步骤(2)中，所述进行发酵培养，是在28℃，黑暗条件下发酵培养30d。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述培养方法得到的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种在制备抗耐药菌的抗菌化合物中的应用。其中，所述耐药菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林表皮葡萄球菌。
作为本发明所述所述的应用的一种优选方案：将发酵培养得到的发酵产物，用乙醇浸泡后，超声浸提，减压抽滤得到滤液，减压旋蒸，将减压旋蒸得到的滤液用乙酸乙酯萃取，之后再次减压旋蒸得到发酵浸膏，将所述发酵浸膏用甲醇溶解得到发酵粗提物。
作为本发明所述所述的应用的一种优选方案：将所述发酵粗提物经过硅胶层析柱分离，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱液逐步洗脱，将分离得到的组分进行抗菌活性组分筛选；将筛选得到的活性组分进行抗菌活性组分筛选；将筛选得到的活性组分用ODS柱层析进行进一步纯化，用水-甲醇作为洗脱液逐步洗脱，将分离得到的组分再次进行抗菌活性组分筛选，将筛选得到的活性组分用 HPLC纯化，得到纯绿青霉醇。
本发明的有益效果：本发明筛选一株海洋来源的皮落青霉S14，发现该菌种的代谢产物具有较强抑菌功能，并从该菌种中分离出具有抑菌功能的代谢产物，本发明优化了该菌种的培养基和培养条件，选择抗菌活性化合物产量较高的培养基和培养条件进行发酵，旨在获得更多的目标产物，操作简单，成本低廉。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为皮落青霉S14在MEA培养基上生长4天的图片。
图2为皮落青霉S14菌丝棉兰染色显微图片(X40)。
图3为皮落青霉S14在大米固体培养基和玉米固体培养基上发酵粗提物活性初筛。
图4为皮落青霉S14在不同培养基和培养条件下的次级代谢产物活性结果。
图5为纯绿青霉醇的13C-NMR(A)、1H-NMR(B)、HPLC色谱(C) 图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明菌株：皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221447。该菌种分离于我国南海海泥样品。
实施例1：
菌株形态鉴定和分子生物学鉴定：
培养基配方：
PDA培养基：马铃薯浸粉5g、葡萄糖20g、琼脂20g、海水晶33g、蒸馏水定容至1L，pH＝6.0。
MEA培养基：麦芽糖提取物20g、蛋白胨1g、葡萄糖20g、CuSO4.5H2O 0.005g、ZnSO4.7H2O0.01g、琼脂20g、海水晶33g、蒸馏水容至1L，pH＝7.0，高压灭菌。
PDB液体培养基：真菌培养基：马铃薯浸粉10g、葡萄糖20g、海水晶 33g、蒸馏水定容至1L，pH＝6.0，高压灭菌。
制备种子液：将S14菌株接种到PDA平板培养基上，在黑暗条件下，28℃的温度下培养3d，当平板培养基上有菌丝长出后，用接种环蘸取孢子粉末和菌丝接种至200ml PDB液体培养基中，在28℃的温度，黑暗条件下，转速 200r/m振荡培养3d。
形态鉴定：采用三点法，将步骤(1)得到的种子液接种在MEA平板培养基上，每点接种2ul种子液，待种子液被MEA培养基完全吸收之后，在恒温培养箱中倒置培养5天，温度28℃。制备菌丝玻片：采用插片法，将盖玻片高压灭菌，以45°插入至接种点附近，于恒温培养箱中倒置培养5d，温度 28℃，得到菌株S14的菌落，菌落形态特征是：如图1所示，菌落表面呈致密细粉状，菌丝体颜色为墨绿色，中心区域轻微隆起，边缘区域颜色为白色，有色素生成，无渗出液，菌落反面接近于黄色。菌丝玻片用棉兰染色，如图2 所示，用显微镜在40倍镜下观察，菌丝有隔菌丝，分生孢子头疏松直柱状，顶囊呈伞状，分生孢子较小，形态特征与青霉属真菌相近。
分子生物学鉴定：挑取MEA平板上的菌丝，使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并以此为模板扩增管家基因5.8S rDNA和28S rDNA的基因间隔序列(The nuclear ribosomalinternal transcribed spacer region，ITS)。
ITS PCR扩增引物序列如下所示：
ITS1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′
lTS4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′
PCR条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30个循环；72℃后延伸5min。
菌株S14经ITS1和ITS4引物扩增产物，由南京擎科生物科技有限公司完成测序扩增序列测序结果如下所示：
将测序结果通过序列比，最相似种属是：皮落青霉Penicillium crustosum。
实施例2：
菌株发酵：
(1)种子液制备：将S14菌株接种到PDA平板培养基上，在28℃的温度下培养3d，当平板培养基上有菌丝长出后，加入蒸馏水，用接种环洗下菌丝，将孢子悬液接种至200mlPDB液体培养基中，在28℃的温度下，转速 200r/m振荡培养3d，种子液中菌种浓度为1×108CFU/ml。
(2)小批量发酵：将种子液按照1ml/10g的比例接种到20g固体培养基中，考虑到海洋真菌生存环境的特殊性，为尽可能提高发酵产率，本发明优选了两种固体培养基，包括大米培养基以及玉米培养基。
大米培养基配方为：1000g大米、33g海水晶、0.075g硫酸镁、1000.0ml H2O，调节pH＝7.0，121℃高压灭菌；
玉米培养基：1000.0g玉米，33g海水晶，20.0g麦芽糖，20.0g山梨醇， 3.0g酵母，0.5g色氨酸，10.0g谷氨酸钠，0.5gK2HPO4，0.3g MgSO4·7H2O， 1000.0ml H2O，调节pH＝7.0，121℃高压灭菌。
培养环境分别为日光灯光照和黑暗环境，培养温度均为28℃，培养30天，得到小批量发酵产物。每组设置两个平行实验。
将小批量发酵得到的产物用3倍体积(60ml)的乙醇浸泡过夜，超声浸提30min，减压抽滤得到滤液，重复此步骤三次，合并所得滤液，减压旋蒸得到发酵浸膏，加入5ml甲醇溶解浸膏获得发酵粗提物，经无菌滤膜过滤 (0.22um)，滤液发酵粗提物用于后续的抑菌实验。
抑菌实验所用指示菌共计8种：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus epidermidis，MRSE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Saureus，MRSA)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)。
指示菌活化：
MHB液体培养基配方：可溶性淀粉1.5g、酸水解酪蛋白17.5g、牛肉粉 2.0g，调节PH至7.5，加蒸馏水定容至20ml。
挑取指示菌接种至20ml MHB液体培养基中，200r/m，37℃振荡培养过夜，培养至OD600nm约为0.1，按照每个培养皿100μL的指示菌培养液的量均匀涂布在MHB培养基平板上；使用直径约为6mm的无菌打孔器在涂布了指示菌的MHB平板上打孔，每孔中加入30μL的发酵粗提物；以100μ g/ml的氯霉素作为阳性对照，以甲醇为阴性对照。在37℃的恒温培养箱中培养18h。
皮落青霉S14在大米固体培养基和玉米固体培养基上进行小批量发酵的粗产物抑菌活性实验结果见图3和图4，发现采用玉米进行发酵得到的发酵粗提物仅对3株指示菌有抑制作用，推测产生这一现象可能由于大米与玉米含有的营养物质种类和含量不同，其中大米的蛋白质含量高于玉米，且玉米质硬，不利于真菌的生长，故选择大米固体培养基进行后续大量发酵。
(3)大批量发酵：配制4kg的大米固体发酵培养基，50g/罐，分装在 80个发酵罐中，121℃高压灭菌。将步骤(1)得到的种子液以5ml/罐进行接种，在28℃，黑暗条件下发酵培养30d，得到的大批量发酵产物，用3倍体积的乙醇(150ml/罐)浸泡过夜，第二天超声浸提30min，减压抽滤得到滤液，重复此步骤三次。合并所得滤液，减压旋蒸到原体积的四分之一，减压旋蒸所得滤液用1倍体积的乙酸乙酯萃取后再经减压旋蒸得到发酵浸膏35g，用于后续分离纯化。
实施例3：
目标化合物的分离纯化：
(1)将35g发酵浸膏用20ml甲醇溶解，然后用100-200目规格的硅胶 G拌样，用硅胶G层析柱分离，用二氯甲烷-甲醇逐步洗脱，洗脱梯度依次为： CH2Cl2、CH2Cl2-MeOH(80∶1)、CH2Cl2-MeOH(60∶1)、CH2Cl2-MeOH(40∶1)、 CH2Cl2-MeOH(20∶1)、CH2Cl2-MeOH(10∶1)。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)为指示菌进行活性组分筛选(筛选方法参见实施例2)，发现CH2Cl2-MeOH(20∶1)和CH2Cl2-MeOH(10∶1)这2个浓度梯度洗脱的产物均具有抗菌活性，合并筛选后的活性组分进行下一步分离。
(2)将合并的活性组分，用ODS柱层析进行进一步纯化，用H2O-MeOH逐步洗脱，洗脱梯度为H2O、H2O-MeOH(80∶20)、H2O-MeOH(60∶40)、 H2O-MeOH(40∶60)、H2O-MeOH(20∶80)、MeOH。将过柱后的样品以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为指示菌进行活性组分筛选，活性组分筛选方法实施例2，发现H2O-MeOH(20∶80)洗脱的产物具有抗菌活性，将活性组分进行下一步薄层色谱层析。
(3)薄层色谱层析：为考察步骤(2)得到的活性组分中的成分组成，选用薄层色谱进行了小量分离和分析，以期为后续分离纯化提供参考，展开剂组分为CH2Cl2-MeOH(20∶1)，按千分之一的比例加入甲酸以防拖尾。用毛细血管吸取适量样品点在薄层板上，放入预先饱和的展开室，展开结束后紫外灯下(254nm)检测条带；
(4)将步骤(2)得到的的活性组分用半制备HPLC纯化，MeOH-H2O(50： 50)，流速2ml/min；等度洗脱，得到目标化合物纯绿青霉醇。上述分离得到的纯绿青霉醇为淡紫色固体，分子式为：C15H11NO3，结构式如下式所示：
采用实施例2大米固体发酵培养基在黑暗环境下进行大批量发酵，计算得纯绿青霉醇的产量为：每kg大米得到15mg纯绿青霉醇。
实施例4：
化合物抗菌活性筛选及MIC测定∶
(1)指示菌活化：将指示菌：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、鲍曼不动杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌接种至20ml MHB液体培养基中，37℃，200r/m振荡培养过夜，培养至OD600nm约为0.1。
(2)稀释菌液：加入MHB液体培养基，调整指示菌的浓度至吸光度等于0.3(1×108CFU/ml)，继续将指示菌菌液稀释至1×105CFU/ml。
(3)MIC梯度稀释：在96孔板中，第2列加入198μl所述稀释后的指示菌菌液，第2至10列加入100μl所述稀释后的指示菌菌液，第11列加入 98μl所述稀释后的指示菌菌液，第12列加入空白培养基。
(4)加药：在上述第1列中加入浓度为20mg/ml纯绿青霉醇的母液2μ I，在第11列加入浓度为5mg/ml氯霉素2μl。
(5)倍比稀释：从第1列孔中吸取100μl加入到第2列中，依次按二倍稀释法稀释至第10列。
(6)培养：将96孔板放入37℃培养箱中静置培养18h。使培养基澄清的最低化合物浓度，即为该化合物对不同的指示菌的MIC。纯绿青霉醇对各指示菌的抑菌MIC实验结果见表1。
表1纯绿青霉醇对各指示菌的抑菌MIC
| Test Organism | MIC(ug/ml) |
| S.aureus | 25 |
| MRSA | 25 |
| MRSE | 50 |
| E.coli | >100 |
| A.baumannii 19606 | >100 |
| K.aerogene | ＞100 |
| P.aeruginosa PA01 | ＞100 |
| Mluteus | >100 |
抑菌测试结果表明该化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性很强，MIC为25μg/ml(见表1)，对于另一种耐药致病菌耐甲氧西林表皮葡萄球菌的抑菌活性也非常优异，MIC为50μg/ml。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种，其特征在于：所述皮落青霉皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种，保藏编号为CCTCC NO：M 20221447。
2.权利要求1所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种的培养方法，其特征在于：由以下步骤组成，
(1)种子液制备；
(2)发酵：将大米固体发酵培养基置于发酵罐中，高压灭菌，将种子液接种于发酵罐中，进行发酵培养，得到发酵产物。
3.根据权利要求2所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种的培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述种子液制备，是将S14菌种接种到PDA平板培养基上，在28℃的温度下培养3d，当平板培养基上有菌丝长出后，，用接种环蘸取孢子粉末和菌丝接种至PDB液体培养基中，在28℃的温度下，转速200r/m振荡培养3d。
4.根据权利要求2或3所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种的培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述大米固体发酵培养基的配方是：1000g大米、33g海水晶、0.075g硫酸镁、1000.0ml H2O，混合均匀后，调节pH＝7.0-7.5，121℃高压灭菌。
5.根据权利要求2或3所述的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种的培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述进行发酵培养，是在28℃，黑暗条件下发酵培养30d。
6.权利要求4所述培养方法得到的海洋来源的皮落青霉(Penicillium crustosum)S14菌种在制备抗耐药菌的抗菌化合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐药菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林表皮葡萄球菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将发酵培养得到的发酵产物，用乙醇浸泡后，超声浸提，减压抽滤得到滤液，减压旋蒸，将减压旋蒸得到的滤液用乙酸乙酯萃取，之后再次减压旋蒸得到发酵浸膏，将所述发酵浸膏用甲醇溶解得到发酵粗提物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述发酵粗提物经过硅胶层析柱分离，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱液逐步洗脱，将分离得到的组分进行抗菌活性组分筛选；将筛选得到的活性组分进行抗菌活性组分筛选；将筛选得到的活性组分用ODS柱层析进行进一步纯化，用水-甲醇作为洗脱液逐步洗脱，将分离得到的组分再次进行抗菌活性组分筛选，将筛选得到的活性组分用HPLC纯化，得到纯绿青霉醇。
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| GR01 | Patent grant | ||
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