CN104694429A - 一种极长链霉菌菌株sl01、其微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种极长链霉菌菌株sl01、其微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

一种极长链霉菌菌株SLO1、其微生物菌剂及其应用，所述菌株SLO1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9543，保藏日期为2014年8月25日。本发明还包括含有该极长链霉菌的微生物菌剂及其该极长链霉菌在抑制多种植物病原真菌中的应用，含有该极长链霉菌的微生物菌剂在防治棉花枯萎病中的应用。本发明极长链霉菌菌株SLO1对棉花枯萎菌的拮抗作用显著，SLO1发酵液盆栽防效可达75.24％；本发明微生物菌剂制备工艺简单，成本低，与棉花种子拌种能够有效抑制棉花枯萎病的发生，符合我国绿色生产的要求，属于环境友好型产品，并且具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。实验证明，该微生物菌剂大田单次使用处理150d后，其防效均在50.0％以上，可分别提高棉花的籽棉亩单产25.8％，皮棉亩单产25.1％。

Description

一种极长链霉菌菌株SL01、其微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种生防放线菌菌株SL01、其微生物菌剂及其应用，具体涉及一种极长链霉菌菌株SL01、其微生物菌剂及其应用。
背景技术
由尖镰孢萎蔫专化型引起的棉花枯萎病是棉花生产中最严重的病害之一，被称为棉花的不治之症---“癌症”。该病为害棉花维管束组织，可引起叶片变色、干枯甚至脱落，常使棉苗枯死、植株畸形，叶片功能下降。轻病株发育迟缓，结铃少，纤维品质和产量下降，重病株于苗期或蕾铃期枯死，甚至毁种改茬，能在棉株整个生长周期内侵染和为害，老棉区发病尤为严重，造成巨大损失。
目前，防治棉花枯萎病主要采用传统的化学药剂如多菌灵、甲基托布津等，虽然化学药剂对棉花枯萎病具有一定的防效，但长期使用已造成严重的环境污染，且易引起病原菌产生抗药性。随着现代农业可持续发展的需要，生物防治作为一种新型的绿色防治措施，以其低残留、低污染、且不引起病害抗性等优点，已逐渐受到青睐。生物防治的关键在于挑选出抑菌普广，且对靶标病原菌具较强拮抗能力、持效期长的拮抗微生物及其制剂的制备。例如现有技术CN201210425944.4公开了一种生防菌及其在防治棉花枯黄萎病中的应用，然而该发明中生防菌42561发酵液对棉花枯萎病和棉花黄萎病的盆栽防治效果分别为36.73％和44.82％；对棉花枯黄萎病的田间防治在第三次施药后的第15和30天，其防治效果分别达到33.06％和41.65％，防治效果均不理想。CN201210466796.0公开了一种防治棉花病害的生物菌剂及其制备方法，该发明中生物菌剂制备过程复杂，同时成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够高效拮抗棉花枯萎病的极长链霉菌菌株SL01、其微生物菌剂及其应用，该微生物菌剂制备简单，成本低。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
本发明之一种极长链霉菌(Streptomyces longissimus)菌株SL01，革兰氏染色为阳性，该菌株在高氏平板上生长良好，气生菌丝鲑鱼红色，基内菌丝玫瑰红色，菌落呈圆形，表面有粉状隆起、褶皱，边缘规则，有土腥味；菌丝直形，不卷曲，有分枝，无横隔，孢子短柱状，能产生几丁质酶；该菌株淀粉水解和硫化氢产生呈阳性，牛奶不凝固、明胶不液化，可利用葡萄糖、果糖、山梨糖等，不利用纤维素、蔗糖、阿拉伯糖、木糖；经培养特征、菌体形态、生理生化特性以及16s rDNA序列分析鉴定，菌株SL01属于极长链霉菌；16srDNA序列已经登录GenBank，SL01的序列号码为KM670435。该菌株已于2014年8月25日进行了保藏，保藏号为CGMCC No.9543；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其简称为CGMCC；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。
进一步，所述菌株SL01的16S rDNA部分序列的GenBank登录号为KM670435。
本发明之一种极长链霉菌菌株SL01在抑制棉花枯萎菌、棉花黄萎菌、西瓜枯萎菌、番茄叶霉菌、番茄灰霉菌、苹果腐烂菌、棉花炭疽菌和粉红聚端孢菌中的一种或多种植物病原真菌中的应用。
本发明之一种微生物菌剂，包括所述极长链霉菌菌株SL01。
进一步，所述极长链霉菌菌株SL01总活菌数不低于1×108cfu/g。
本发明之一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)极长链霉菌SL01的保存：将纯化的SL01菌株接种于高氏培养基斜面上，在25～28℃恒温培养箱内培养3～5天后于2～6℃冰箱保存；
(2)极长链霉菌SL01的活化：将保存的极长链霉菌SL01划线转接到高氏平板中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；
(3)极长链霉菌SL01种子液的制备：将步骤(2)中制备的极长链霉菌SL01的菌落接种到高氏液体培养基中，28～30℃，120～180rpm摇床振荡培养48～96h，调节浓度至1×107cfu/mL～9×107cfu/mL，得到种子液；
(4)微生物菌剂的制备：将步骤(3)中制备的发酵液无菌操作台内以接种量为20～30％(种子液体积数V/基质质量m)与基质混合均匀，28～30℃，相对湿度20～30％，发酵培养8～10天后，即得微生物菌剂初产物，测定其含菌量并干燥，即得微生物菌剂。
进一步，包括以下步骤：
(1)极长链霉菌SL01的保存：将纯化的SL01菌株接种于高氏培养基斜面上，在25℃恒温培养箱内培养4天后于4℃冰箱保存；
(2)极长链霉菌SL01的活化：将保存的极长链霉菌SL01划线转接到高氏平板中，置于培养箱28℃恒温培养5天；
(3)极长链霉菌SL01种子液的制备：将步骤(1)中制备的极长链霉菌SL01的菌落接种到高氏液体培养基中，28℃，150rpm摇床振荡培养72h，调节浓度至107cfu/mL，得到种子液，其中，所述高氏液体培养基为可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，自来水1000mL，pH 7.2～7.4，灭菌1.05kg/cm2，20min；
(4)微生物菌剂的制备：将步骤(2)中制备的种子液，以接种量为25％((种子液体积数V/基质质量m))与基质混合均匀，28℃，相对湿度25％，发酵培养9天后，即得微生物菌剂初产物(即菌株SL01发酵液)，测定其含菌量并干燥，即得微生物菌剂，其中，所述基质为85％大米粉、12％玉米秸秆、3％小米粉，灭菌1.05kg/cm2，20min。
本发明之一种微生物菌剂在防治棉花枯萎病中的应用。
进一步，在室内防治中，将所述微生物菌剂初产物(即菌株SL01发酵液)调节浓度至2×106cfu/mL～2×107cfu/mL，均匀喷洒植株叶片至泾流或10mL/株灌根处理。
进一步，在大田防治中，按照微生物菌剂与土壤的质量比为1∶100充分混匀，在棉花播种时，按10g/颗棉花种子的量拌种施用。
本发明之极长链霉菌菌株SL01、其微生物菌剂具有如下优点：
(1)防病作用：本发明极长链霉菌菌株SL01对棉花枯萎菌的拮抗作用显著，微生物菌剂初产物盆栽防效可达75.24％；且其微生物菌剂中含有1×108cfu/g以上的能够高效拮抗棉花枯萎病菌生长的极长链霉菌SL01，该微生物菌剂与棉花种子拌种能够有效抑制棉花枯萎病的发生，从而减少生产中化学药剂的使用，降低环境污染和病原菌抗药性的产生，提高棉花的产量和品质。实验证明，该微生物菌剂大田单次使用处理150d后，其防效均在50.0％以上。
(2)促生作用：施用本发明微生物菌剂后对棉花植株的营养生长和生殖生长等有明显的促进作用，实验证明，本发明微生物菌剂可分别提高棉花的籽棉亩单产25.8％，皮棉亩单产25.1％。
(3)绿色无公害：本发明微生物菌剂是由极长链霉菌、部分培养基和基质组成，均为无毒无公害物质，在棉花生产中使用具有无毒、无污染、无残留的优点，是环境友好型产品，克服了传统化学药剂防治棉花枯萎病带来的环境危害及病原菌抗药性，符合我国绿色生产的要求，并且制备工艺简单，成本低，具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。
附图说明
图1为极长链霉菌SL01对棉花枯萎菌皿内对峙图。
图2为极长链霉菌SL01对棉花炭疽菌皿内对峙图。
图3为极长链霉菌SL01对棉花枯萎菌菌丝的抑制作用(图A为被抑制菌丝，图B为正常菌丝)。
图4为极长链霉菌SL01对棉花炭疽菌菌丝的抑制作用(图A为被抑制菌丝，图B为正常菌丝)。
图5为极长链霉菌SL01的扫描电镜图。
图6为极长链霉菌菌株SL01系统发育树。
图7为极长链霉菌SL01的微生物发酵粉剂。
图8为极长链霉菌SL01对棉花枯萎菌分生孢子萌发的抑制作用(图A为SL01发酵液处理24h分生孢子萌发情况；图B为对照24h分生孢子萌发情况)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：极长链霉菌菌株SL01的获得及抑菌谱测定
采集自陕西泾阳棉花地块的土壤，用平板稀释法分离获得一株菌落为玫瑰红色的菌株，经纯化后，以棉花黄萎菌、棉花枯萎菌、西瓜枯萎菌、番茄叶霉菌、番茄灰霉菌、苹果腐烂菌、苹果炭疽菌、粉红聚端孢菌8种病原菌为靶标，测定SL01的抑菌谱，由表1及图1～图4可知，极长链霉菌菌株SL01抑菌谱较广，对上述8种病原真菌都具有较强的拮抗作用，其拮抗作用均在69.0％以上，特别对棉花枯萎菌的抑制作用最强(77.76％)。
表1  极长链霉菌SL01对不同病原真菌的抑制作用
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例2：拮抗菌株的鉴定
1、形态特征及生理生化鉴定：依据《链霉菌鉴定手册》记载的实验内容和实验方法，对菌株SL01进行鉴定，菌株SL01在高氏平板上生长良好，气生菌丝鲑鱼红色，基内菌丝玫瑰红色，菌落呈圆形，表面有粉状隆起、褶皱，边缘规则，有土腥味。菌丝直形，不卷曲，有分枝，无横隔，孢子短柱状，孢子丝直形，孢子短柱状，革兰氏阳性，能产生几丁质酶，见图5。该菌株淀粉水解和硫化氢产生呈阳性，牛奶不凝固、明胶不液化，可利用葡萄糖、果糖、山梨糖等，不利用纤维素、蔗糖、阿拉伯糖、木糖。
2、16S rDNA鉴定：将菌株SL01接种到高氏液体培养基中，25℃、150rpm恒温振荡器中培养6天，离心去上清收集菌丝体装入2mL离心管中，采用改良CTAB方法提取该菌株的基因组DNA，以提取的总DNA作为模板，放线菌通用引物：
上游引物PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，如SED ID NO：2所示；
下游引物PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，如SED ID NO：3所示，进行PCR扩增；PCR反应体系25μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，Mix1 2.5μL，模板DNA1.0μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸30s，72℃终延伸2min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测为1500bp左右的PCR产物，用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化，回收样品送至南京金斯瑞有限公司进行测序，菌株SL01的16S rDNA序列全长有1530个碱基序列构成，如SED ID NO：1所示，在GenBank登录号为KM670435。将序列结果在NCBI文库中进行BLAST同源比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列作为参比对象，采用软件MEGA4.0构建系统进化树，见图6，生防放线菌菌株SL01与链霉菌(Streptomyces longissimus)的16S rDNA基因序列(相似性为100％)聚在同一个系统进化分支上，故将该生防放线菌鉴定为极长链霉菌SL01。
综上，根据培养特征、菌体形态、生理生化特性以及16sDNA序列分析，确定菌株SL01属于极长链霉菌(Streptomyceslongissimus)。
实施例3：微生物制剂的制备
将保存的极长链霉菌SL01划线转接到高氏平板中，置于培养箱28℃恒温培养5天；将获得的极长链霉菌SL01的菌落边缘3个菌饼(Φ＝6mm)接种到装瓶量为150/250mL的高氏液体培养基中，28℃、150rpm摇床振荡培养72h，调节浓度至107cfu/mL，为种子液；将种子液于无菌操作台内以25％(V/m)接种量与基质混合均匀，28℃，相对湿度25％，发酵培养9天后，即得微生物菌剂初产物，测定其含菌量并干燥，即得微生物菌剂，见图7。
其中，高氏液体培养基由可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，自来水补足至1000mL，pH调至7.2～7.4，在1.05kg/cm2蒸气压力下，灭菌20min制备而成；
基质由85％大米粉、12％玉米秸秆、3％小米粉，在1.05kg/cm2蒸气压力下，灭菌20min制备而成。
实施例4：微生物菌剂初产物的室内防病作用
将实施例3中获得的微生物菌剂初产物调节浓度至2×106cfu/mL，均匀喷洒植株叶片(番茄--灰霉病，黄瓜--白粉病)至泾流或10mL/株灌根(西瓜--枯萎病，棉花--枯萎病见图8、黄萎病)处理。由表2可知，菌株SL01发酵液对四种植株的5种病害均有不同程度的防效，其中，菌株SL01发酵液对棉花枯萎病的防效可达75.24％；同时，由图8可知，SL01发酵液对处理24h棉花枯萎病分生孢子萌发的抑制作用强。
表2  极长链霉菌SL01对不同病害的防效
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例5：微生物菌剂中菌株SL01的田间存活能力
SL01在植株组织内的定殖可有效保证其生防作用的发挥。将实施例3制备的微生物菌剂与大田土壤按1∶100(m∶m)充分混匀后，在棉花播种时按10g/颗棉花种子的量拌种施用该土壤混合菌剂，自然环境下生长。待棉花幼苗出土后，每隔30天取其根际土壤及根、茎、叶等组织，采用组织研磨法，在高氏一号培养基平板上测定SL01在根际及棉花不同组织内的定殖情况。由表3可知，整个测定时间内，SL01在棉花根际土壤和棉花根组织中均有定殖，甚至在测定前90天内其茎组织内也有定殖。
表3  极长链霉菌SL01的田间存活能力
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例6：微生物菌剂的大田促生作用
将实施例3制备的微生物菌剂与大田土壤按1∶100(m∶m)充分混匀后(混合土壤中SL01浓度约为106cfu/g土壤)，在棉花播种时，按10g/颗棉花种子的量拌种施用该土壤混合菌剂，自然环境下生长，以大田土壤为空白对照，每组处理重复3个片区。
微生物菌剂对营养生长的影响：待出苗60天后对棉花植株的根长、地上部分的株高、叶面积、鲜重、干重等相关生理指标进行测定。由表4测定结果可知，SL01微生物菌剂对大田棉花幼苗的营养生长有一定的促进作用，尤其在干物质的积累方面有较明显的促进作用。
表4  不同土壤处理对棉花生长的影响
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
微生物菌剂对棉花产量的影响：按上述播种和管理方法，待棉花进入生殖生长时，在生殖生长阶段测定各项生理指标。统计、调查、测产方法按照全国棉花高产创建示范片测产验收办法进行。由表5可知，SL01微生物菌剂可较为明显的提高棉花的籽棉亩单产(25.8％)和皮棉亩单产(25.1％)，对棉花的产量有一定的提高。
表5  不同土壤处理对棉花产量的影响
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例7：微生物菌剂对大田棉花枯萎病的防治
将实施例3制备的微生物菌剂与大田土壤按1∶100(m∶m)充分混匀后，在棉花播种时按10g/颗棉花种子的量拌种施用该土壤混合菌剂，以大田土壤和稀释1000倍后的50％多菌灵处理土壤作为对照，待棉花幼苗长至2叶1心至3叶1心时，将用麦粒沙扩繁培养的棉花枯萎菌对相应的小区土壤处理(病原物活菌量∶生防菌活菌量＝1∶10)，进行大田病原物的接种。接种后每隔30d调查1次病情，待对照病情稳定后停止调查，参照中华人民共和国棉花枯萎病分级标准(GB/T22101.4-2009)，根据各调查的病情指数来衡量供试该微生物菌剂对棉花枯萎病的防病效果，每个处理设3次重复。
棉花枯萎病严重度分级标准：
0级：植株健全，无任何表面症状；
1级：整株轻微感病，只有1到2片叶子出现黄花、皱缩或鸡爪状；
2级：整株一半叶片黄化或有黄色网状斑纹、焦枯、株型稍微反常；
3级：整株一半以上叶片黄化或表现焦黄色网状斑纹、焦枯、枝条有深黑色枯纹，株型极度畸形，半边凋萎且无健全枝叶；
4级：整株枯死或只剩光杆。
防效计算方法：
病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(总株数×最高级值)×100
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100
由表6田间防病试验防治效果可知，该微生物菌剂两年间对大田棉花枯萎病的防效均较多菌灵药剂对照高，且其防效稳定，可降低棉花枯萎病的发病率，降低病情指数，处理150d后其防效均在50.0％以上。
表6  SL01微生物菌剂对棉花枯萎病的田间防效
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
综上可知，菌株SL01对棉花枯萎病菌有较好的拮抗作用，其微生物菌剂对田间棉花枯萎病的发生具有效的防治作用。

Claims (10)

1.一种极长链霉菌(Streptomyces longissimus)菌株SL01，其特征在于，所述菌株SL01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9543，保藏日期为2014年8月25日。
2.根据权利要求1所述极长链霉菌菌株SL01，其特征在于，所述菌株SL01的16S rDNA部分序列的GenBank登录号为KM670435。
3.根据权利要求1或2所述的极长链霉菌菌株SL01在抑制棉花枯萎菌、棉花黄萎菌、西瓜枯萎菌、番茄叶霉菌、番茄灰霉菌、苹果腐烂菌、棉花炭疽菌和粉红聚端孢菌中的一种或多种植物病原真菌中的应用。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述极长链霉菌菌株SL01。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述极长链霉菌菌株SL01总活菌数不低于1×108cfu/g。
6.一种如权利要求4或5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化菌株：将保存的极长链霉菌SL01划线转接到高氏平板中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；
(2)制备种子液：将步骤(1)中制备的极长链霉菌SL01的菌落接种到高氏液体培养基中，在28～30℃，120～180rpm摇床振荡培养48～96h，调节浓度至1×107cfu/mL～9×107cfu/mL，得到种子液；
(3)制备微生物菌剂：将步骤(2)中制备的种子液，以种子液体积数与基质质量比为20～30％接种量与基质混合均匀，28～30℃，相对湿度20～30％，发酵培养8～10天后，即得微生物菌剂初产物，测定其含菌量并干燥，即得微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化菌株：将保存的极长链霉菌SL01划线转接到高氏平板中，置于培养箱28℃恒温培养5天；
(2)制备种子液：将步骤(1)中制备的极长链霉菌SL01的菌落接种到高氏液体培养基中，28℃，150rpm摇床振荡培养72h，调节浓度至107cfu/mL，得到种子液，其中，所述高氏液体培养基由可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，自来水补足至1000mL，pH调至7.2～7.4，在1.05kg/cm2蒸气压力下，灭菌20min制备而成；
(3)制备微生物菌剂：将步骤(2)中制备的种子液，以种子液体积数与基质质量比为25％接种量与基质混合均匀，28℃，相对湿度25％，发酵培养9天后，即得微生物菌剂初产物，测定其含菌量并干燥，即得微生物菌剂，其中，所述基质由85％大米粉、12％玉米秸秆、3％小米粉，在1.05kg/cm2蒸气压力下，灭菌20min制备而成。
8.根据权利要求4或5所述的微生物菌剂在防治棉花枯萎病中的应用。
9.根据权利要求8所述的微生物菌剂在防治棉花枯萎病中的应用，其特征在于，在室内防治中，将所述微生物菌剂初产物调节浓度至2×106cfu/mL～2×107cfu/mL，均匀喷洒植株叶片至泾流或10mL/株灌根处理。
10.根据权利要求8所述的微生物菌剂在防治棉花枯萎病中的应用，其特征在于，在大田防治中，按照微生物发酵粉剂与土壤的质量比为1∶100充分混匀，在棉花播种时，按10g/颗棉花种子的量拌种施用。
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