CN113453540A

CN113453540A - 抗根肿病芸苔属植物

Info

Publication number: CN113453540A
Application number: CN202080014711.8A
Authority: CN
Inventors: T·N·T·恩古耶; G·崇戈; J·德夫拉梅尼克; G·瓦格纳
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: EA202192253A1; WO2020168166A3; JP2022520396A; CA3129911A1; CL2021002119A1; AU2020221290A1; CN113453540B; EP3923705A4; EP3923705A2; US20220201954A1; WO2020168166A2

Abstract

本发明提供低芥酸抗根肿病芸苔属植物，植物材料和种子，特征在于这些产物在其基因组中携带特定的CrS根肿病抗性基因座。还提供允许检测CrS根肿病抗性基因座的工具。

Description

抗根肿病芸苔属植物

发明领域

本发明涉及控制芸苔属(Brassica)中疾病的领域。提供其基因组中包含根肿病抗性基因的芸苔属植物，和尤其芥酸水平低的芸苔属植物。还提供产生这类植物和检测根肿病抗性基因的方法和工具。

发明背景

根肿病是一种由芸苔根肿菌引起的疾病，其侵袭十字花科(Brassicaceae)植物，包括许多重要的蔬菜和广亩作物。认为全部十字花科成员均是芸苔根肿菌的潜在宿主(Dixon，2009，J Plant Growth Regul 28：194)。易感的栽培作物包括如下者的全部变种：甘蓝(B.oleracea)、西方冷凉蔬菜类(Occidental cole vegetables)(抱子甘蓝、卷心菜、西兰花/绿花茎甘蓝、花椰菜、烹饪用和饲用羽衣甘蓝、球茎甘蓝)；芜青(B.rapa)(同义词：菜心(B.campestris))(包括蔓青、芜菁、野油菜(sarson))，和为数众多提供叶用和根用蔬菜的东方变体如大白菜(Brassica rapa var.pekinensis)和小白菜(Brassica rapavar.pekinensis)(白菜)；欧洲油菜，包括甘蓝型油菜(swede)(芜菁甘蓝(rutabaga))、欧洲油菜和饲用油菜；和种子、调味品(芥菜)及从埃塞俄比亚芥(B.carinata)、黑芥(B.nigra)和芥菜(B.juncea)衍生的蔬菜作物。相关的属如萝卜(萝卜属(Raphanus))、十字花科杂草，例如，白芥属(Sinapis)和装饰性观赏植物，包括紫罗兰(紫罗兰属物种(Matthiola spp))和壁花(桂竹香(Cheiranthus cheiri))，可以感染。科学模式植物拟南芥(Arabidopsis)也是病原体宿主(Dixon，2009，上文)。

根肿病症状发展以受累植物的根上形成棒形瘿为特征。因此，抑制感染根摄取养分和水。地上部分症状包括萎蔫、生长迟缓、黄化和提前衰老(Hwang等人，2012，Mol PlantPathol 13：105)。

估计根肿病存在于大约10％其中栽培宿主植物的全部区域(Diederichsen等人，2009，J Plant Growth Regul 28：265)。根肿病已经主要在上个世纪成为蔬菜作物疾病。但是，在2003年，发现阿伯塔省的中央部分存在12块根肿病侵染的商业卡诺拉油菜田块。此后，确认肿病侵染的田块数稳定增长，并且，截止2019年，阿伯塔省超过3353块田地(超过35,000公顷)、萨斯喀彻温省51个田块和曼尼托巴省35个田块已经鉴定为遭受芸苔霜霉(P.brassicae)侵染(Strelkov等人，2019，Canadian Journal of Plant Pathology41：sup1：129)。在采用魁北克境内根肿病侵染田块上培育的卡诺拉油菜的研究中报道产量损失80％-91％。种子质量也明显降低，含油量下降4.7％-6.1％和1000粒种子重量下降13％-26％(Hwang等人，2012，上文)。

植物抗性是对抗根肿病的强有力工具。最近放行的抗性栽培品种属于三个芸苔属物种(Brassica sp.)：欧洲油菜、甘蓝和芜青(Diederichsen等人，2009，上文)。

已经鉴定了欧洲饲用蔓青(B.rapa ssp，rapifera)的抗性源，如‘Gelria R‘，‘Siloga’，‘Debra’和‘Milan White’，它们已经用来转移根肿病抗性基因至白菜(Pia等人，2009，J Plant Growth Regul 28：252)。许多种族特异性、单一和显性R基因的确存在于芜青中(综述于Neik等人，2017，Frontiers in Plant Science 8：1788中)。Crr2、CRc和Crr4分别定位至染色体A01、A02和A06。在染色体A03上鉴定到几种主要基因：CRa、Crr3、CRb、CRb^Kato和CRk。已经在染色体A08上定位不同的主要基因或QTL：来自欧洲饲用蔓青ECD04的PbBa8.1(Chen等人2013 PLoS ONE 8(12)：e85307)、来自‘Siloga’的QS_B8.1(Pang等人，(2014)Hort Environ Biotechnol 55：540-547)、来自‘Pluto’的Rcr9(Yu等人2017，Scientific Reports 7：4516)、Crrla和Crrlb(Hatakeyama等人，2013，PLOS one 8：e54745)。

在甘蓝中，几乎完全尚未鉴定抗性种质。甘蓝中的根肿病抗性遗传似乎为多基因性。(Piao等人，2009，上文)。已经在甘蓝中发现至少22个QTL，表明甘蓝中根肿病抗性的复杂遗传基础。由于不同定位研究使用不同的根肿病抗性源及不同的芸苔霜霉分离株，不可能比较这些QTL(Piao等人，2009，上文)。

已经在几个欧洲油菜栽培种中还观察到根肿病抗性。已经在欧洲油菜中鉴定到至少22个根肿病抗性QTL。一个主基因，Pb-Bn1，已经定位到连锁群DY4上，并且已经分别在染色体DY4和DY15上鉴定到至少两个加性QTL。此外，有或无加合效应情况下九个区域之间的上位互作已经定位。已经在双单倍体群体中鉴定到一个主基因和两个衍生自ECD04的隐性基因。在通过使栽培种

(甘蓝)和ECD-04(芜青)杂交所形成的再合成欧洲油菜中，八条染色体上检出十九个对七个分离株表达抗性的QTL，其中四者在染色体N03上彼此紧密连锁，并且三者在染色体N08上连锁。基因CRk和Crr3位于N03上的相似区域PbBn-k-2、PbBn-1-1和PbBn-01：60-1。CRa和CRb独立于它们之外。PbBn-01.07-2、PbBn-l-2和PbBn-a-1与欧洲油菜中染色体N08上的BRMS088连锁，后者还与芜青的R8上的Crr1连锁。PbBn-k-1位于染色体N02上。位于N03和N19上的QTL贡献强烈效应并赋予广谱抗性(Piao等人，2009，上文；和Werner等人，2008，TheorAppl Genet116：363；Neik等人，2017，Frontiers inPlant Science 8：1788)。

直至现在，已经克隆两个根肿病抗性基因：CRa和Crr1a。芜青CRa基因已经精细定位并且已经将TIR-NBS-LRR基因鉴定为CRa基因(Ueno等人，2012，Plant Mol Biol 80：621)。Crr1a基因已经定位并从芜青欧洲饲用蔓青“Siloga”分离。Crr1a还编码一种TIR-NB-LRR抗病性蛋白(Hatakeyama等人，2013，上文和WO2012/039445)。

来自芜青的CRb基因已经精细定位至140kb基因组区域。在该区域内，其中预测了十四种功能性蛋白质，其中有Rho家族蛋白和两种TIR-NBS-LRR蛋白，它们可能是CRb的候选基因(Kato等人，2013，Breeding Science 63：116)。这种精细定位的CRb基因重命名为CRb^Kato，因为其在基因组上的位置与较早定位的CRb基因不匹配(Zhang等人2014，Molecular Breeding 34：1173)。

为了增加栽培种抗性的持久性，不同根肿病抗性基因组合入单个品系将是繁育对更宽范围生理小种具有抗性的栽培种的重要手段。因此，为了使用标记辅助选择和转基因方案，在无连锁累赘情况下叠加基因，仍需要开发与根肿病抗性基因连锁的分子标记。本发明提供根肿病抗性基因座，如下文在不同实施方案、实施例和权利要求中所述。

本发明优选实施方案的总结

在本发明的第一实施方案中，提供一种芸苔属植物，其在种子油中包含＜2％芥酸并且在包含标记M4的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座。在另一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M5的标记区间的染色体区段中。在另一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M8的标记区间的染色体区段中，而其中在又一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M11的标记区间的染色体区段中。在又一个实施方案中，本发明的植物包含标记等位基因M4/R，而在又一个实施方案中，本发明的植物包含标记等位基因M4/R和M5/R，或包含标记等位基因M4/R，M5/R、M6/R和M7/R。

在另一个实施方案中，本发明的芸苔属植物不包含标记等位基因M3/R、或M2/R、或M1/R或其组合。

在又一个实施方案中，本发明的芸苔属植物是欧洲油菜(Brassica napus)或芜青(Brassica rapa)植物，而在又一个实施方案中，本发明的芸苔属植物是欧洲油菜WOSR植物或欧洲油菜SOSR植物。

在另一个方面，本发明的芸苔属植物是是欧洲油菜WOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M7的标记区间。在又一个方面本发明的芸苔属植物是欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M5的标记区间，如包含标记M4至M8的标记区间的欧洲油菜SOSR植物，如欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段从按照登录号NCIMB 43341保藏在NCIMB的参考种子可获得。

在另一个方面，本发明的芸苔属植物抵抗芸苔霜霉(P.brassicae)致病型P2、P3、P5、P6或P8或抵抗分离株CR11。

在又一个方面，本发明的芸苔属植物对所述根肿病抗性基因座为杂合，而在另一个方面，本发明的芸苔属植物对所述根肿病抗性基因座为纯合。

又一个实施方案提供还包含赋予除草剂耐受性的基因的本发明芸苔属植物。在另一个实施方案中，其中所述赋予除草剂耐受性的基因是赋予草铵膦(glufosinate)或草铵膦(glufosinate ammonium)抗性的基因或赋予草甘膦抗性(glyphosate)基因。

还提供本发明植物的种子。

本发明的另一个方面提供一种用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括(a)鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的从M4至M5的10cM标记区间范围内有至少一个标记的至少一株芸苔属植物，和(b)选择包含所述CrS根肿病抗性基因座的植物。在又一个实施方案中，所述方法包括鉴定至少一株芸苔属植物，所述植物在M4至M11的标记区间内包含至少一个标记并且不包含标记等位基因M3/R、或不包含标记等位基因M2/R，或不包含标记等位基因M1/R，而在另一个实施方案中，使用从M4至M5的标记区间内的标记，鉴定所述芸苔属植物。

本发明的另一个实施方案提供一种用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括(a)使包含CrS根肿病抗性基因座的第一芸苔属植物与第二植物杂交；和(b)鉴定从M4至M5的10cM标记区间范围内包含至少一个标记的后代植物。在又一个实施方案中，所述方法包括鉴定后代植物，所述后代植物在M4至M11的标记区间内包含至少一个标记并且不包含标记等位基因M3/R、或不包含标记等位基因M2/R，或不包含标记等位基因M1/R。

在另一个实施方案中，提供一种用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括使用基因组编辑，向不包含CrS根肿病抗性基因座的植物引入CrS根肿病抗性基因座。

本发明的另一个目的是提供从M4至M5的10cM标记区间范围内至少一个标记鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的用途。本发明的另一个目的是提供记M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10和/或M11鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的用途。

在又一个方面，提供一种用于田间保护本发明栽培植物群的方法，其中通过施加包含一种或多种除草活性成分的组合物控制杂草。在又一个方面，所述植物包含赋予赋予草铵膦(glufosinate)抗性或草铵膦(glufosinate ammonium)抗性的基因或赋予草甘膦(glyphosate)抗性的基因，并且除草剂是草铵膦或草铵膦(glufosinate ammonium)或草甘膦(glyphosate)。

附图简述

图1.CrS根肿病抗性基因座的定位。

图2.抗性分级对回归亲本等位基因(AA)纯合的、对回归亲本和供体等位基因(AB)杂合的和对峰标记的供体等位基因(BB)纯合的株系。

图3.在春油菜(SOSR)易感株系中渐渗CrS根肿病抗性的回交方案。

图4.卡诺拉油菜品质CrS根肿病抗性株系的选择方案。渐渗春油菜(SOSR)易感株系中。

图5.标记辅助的CrS根肿病抗性回交。RP＝回归亲本。MAS：标记辅助选择。

图6.CrS根肿病抗性进入易感冬油菜(WOSR)中的渐渗方案。

一般定义

如本文所用的“根肿病抗性基因”指与缺少抗性基因或具有该基因无功能(或失活)形式的植物相比，向植物如十字花科植物(如芸苔属植物)赋予增强的芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)抗性的DNA序列或与之相关的DNA序列。

如本文所用的“根肿病”指由病原体芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的疾病。

如本文所用的“根肿病抗性”指针对一个或多个芸苔根肿菌分离株的抗性，如，但不限于针对如Williams(1966)Phytopathology，56，624-626分类的芸苔根肿菌致病型P2、P3、P5、P6和/或P8的抗性，和/或针对分离株CR11的抗性，和/或针对基于Strelkov等人2018，Can J Plant Pathology第284页加拿大根肿病分类计数集(CCD)的分离株(包括2B、3A、5X和8P)的抗性。所述抗性指与对照植物上造成的损伤相比，根肿病感染引起的损伤减少。可以将损伤评定为例如根上形成棒形瘿、出现萎蔫、生长迟缓、黄化、过早衰老等。特别地，损伤减少表现为，当植物在田间疾病压力下培育时，与对照植物相比，产量损失减少。这种产量损失可以例如归因于以下事实：抗性增强的植物中减少或阻止了病原体的感染、繁殖、扩散或存活。所述抗性还可以指完全有抗性的植物，即，其上找不到疾病症状的植物。

可以使用零至三的标度，评估根肿病抗性：零：无棍状，一：＜25％的根系呈棍状；二：25至50％的根系呈棍状；三：＞50％的根系呈棍状(Humpherson-Jones，1989，TestsAgro Cult 10：36)。可以使用以下等式计算疾病指数(ID)：

[(#类0中的植物*0)+([(#类1中的植物*1)+(#类2中的植物*2)+(#类3中的植物*3)]/总植物数*3

(Strelkov等人，2006，Can J Plant Pathol 28：467)。

可以理解，环境条件，如位置、天气状况和疾病压力，以及评估疾病症状的人的个体感知，可能影响根肿病抗性评定。因此，对比试验中这些因素的变异应当最小化。可以根据本发明应用本领域已知的任何其他抗性等级，以降本发明的植物与对照植物比较。

抗根肿病的植物指用根肿病病原体人工感染时按零分或一分评估的植物。抗根肿病群体是疾病指数(ID)小于30％的群体。根肿病抗性增加的植物是这样的植物，其中呈棍状的根系的百分数降低至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少70％、或至少95％或100％，即无棍状，或指这样的植物群体，其中疾病指数降低至少3％、或至少5％、或至少8％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少70％、或至少95％或100％，即该群体的全部植物均划分为类0(无棍状)。

如本文所用，“CrS根肿病抗性基因座”、或“CrS抗性基因座”或“CrS基因座”是赋予针对如Williams(1966)Phytopathology，56，624-626分类的芸苔根肿菌致病型P2、P3、P5、P6和/或P8的抗性，和/或针对分离株CR11的抗性的基因座。CrS根肿病抗性基因座指一个在染色体上的位置。可以依据染色体遗传图上的定位，或依据染色体的物理位置上的定位，例如当基因组序列可获得时，鉴定这个位置。

如本文所用的“基因座”(复数为诸基因座)是基因在染色体上占据的位置。“根肿病抗性基因座”指染色体上其中根肿病抗性基因位于其中的位置。可以依据染色体的遗传图上的定位，鉴定这个位置。这个定义中包括染色体中根肿病抗性基因座位于其中的基因组DNA片段(或区段)。所述根肿病抗性基因座可以是CrS根肿病抗性基因座或另一个根肿病抗性基因座。可以处于染色体上以下位置处的不包含本发明CrS根肿病抗性基因的基因座称作“CrS根肿病易感性基因座”，所述的位置对应于其中CrS根肿病抗性基因位于抗性株系中其处的位置。如本文所用，QTL(数量性状基因座)指基因组上与可度量特征(即，性状)对应的位置，如本发明描述的CrS基因座。

如本文中所用，术语基因的“等位基因”意指基因或特定基因座的任意一个或多个备选形式。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座(基因座的复数式)处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上或可能存在于同源染色体上。

如本文中所用，术语“同源染色体”意指这样的染色体，它们含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同的基因，但可能含有这些基因的不同等位基因。同源染色体是减数分裂期间配对的染色体。代表某生物的全部生物学特征的“非同源染色体”形成一个集合，并且细胞中的集合数目称作倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每条同源染色体从不同的亲本继承。在四倍体物种中，存在两组二倍体基因组，因而这两个基因组的染色体称作“同源染色体”(并且类似地，这两个基因组的基因座或基因称作同源基因座或基因)。同样地，四倍体物种具有二组二倍体基因组等。二倍体、四倍体或六倍体植物物种可以在特定基因座包含巨大数目的不同等位基因。芸苔属物种(Brassica sp.)的倍性水平是二倍体(芜青，AA；黑芥(Brassica nigra)，BB；甘蓝(Brassica oleracea)，CC)和四倍体(芥菜(Brassica juncea)，AABB；欧洲油菜，AACC；埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)，BBCC)。

如本文中所用，术语“杂合”意指两个不同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。相反，如本文中所用，术语“纯合”意指两个相同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。

特定基因或基因座的等位基因可以具有特定的外显率，即它可以是显性、部分显性、共显性、部分隐性或隐性的。显性等位基因是特定基因座或基因的变体，在生物中以杂合形式存在时，所述变体导致与纯合形式存在时相同的表型。在另一方面，隐性等位基因是等位基因的变体，其中杂合形式下，所述变体受显性等位基因支配，因此产生显性等位基因赋予的表型，而仅在纯合形式下才产生隐性表型。部分显性、共显性或部分隐性指这样的情况，其中杂合子显示作为对特定基因座或基因的一个等位基因纯合的生物和对其另一个等位基因纯合的生物之间中间物的表型。这种中间表型是部分或不完全显性或外显的展示。当部分显性出现时，后代当中通常观察到一系列表型。这适用于部分隐性的等位基因。

如本文所用，术语“染色体区间”是单一染色体上基因组DNA的连续线性范围。“染色体区间”可以由遗传图限定并且可以基于标记的遗传位置确定。“染色体区间”也可以基于染色体的物理结构限定，例如由基因组序列限定。

术语“标记区间”指由标记限定的染色体区间。从第一标记至第二标记的标记区间是从所述第一所述标记至第二标记的染色体区间，包括所述标记。第一标记和第二标记之间的标记区间是在所述第一标记和所述第二标记之间的染色体区间。标记区间可以由遗传图限定并且可以基于标记的遗传位置。标记区间也可以基于染色体的物理结构限定，例如基于基因组序列。

鉴定的染色体区段及其标记的位置在表示为重组频率或图谱单位时，在本文中作为一般信息提供。使用特定的芸苔属群体，获得本文所述的实施方案。因此，参考使用的群体，将具体区段和标记的位置表示为图谱单位。预期以图谱单位给出的具体区段和标记的数目可以在栽培品种之间变动并且不是DNA区段和标记的必需定义的部分，否则的话例如通过核苷酸序列描述DNA区段和标记。

如本文所用，“遗传图”或“连锁图”是物种或实验性群体的表，所述表就重组频率而言相对于彼此显示其遗传标记的位置。连锁图是基于同源染色体交叉互换期间标记之间重组频率的图。

基因组的“物理图”指绝对距离(例如，按碱基对测量)，如基于基因组序列的距离。物理图上标记的位置可以例如通过将标记序列针对基因组序列做blast检索来确定。

如本文所用，术语“遗传连锁”、“连锁”、“与......连锁”或“连锁状态”指位于给定染色体上的基因或标记一起传递至下一世代个体的可度量概率。因此，术语“连锁”可以指以大于0.5的概率与某基因一起传递的一个或多个基因或标记(在标记/基因位于不同染色体的情况下，从独立分配过程预期所述概率)。因为两个基因或标记在染色体上的接近程度与基因或标记将一起传递至下一世代个体的概率直接相关，所以术语“遗传连锁”还可以在本文中指位于相同染色体上彼此约50厘摩(cM)或更小范围内的一个或多个基因或标记。遗传连锁通常以cM中表述。厘摩是计量遗传连锁的重组频率的单位，定义为基因或标记之间按照100计算一个减数分裂产物为重组的距离，或换言之，厘摩等于染色体上一个遗传基因座处的标记将与第二基因座处的标记因单一世代中杂交而分离的1％机会。它经常用来推算沿着染色体的距离。与cM相对应的碱基对的数目跨各基因组(染色体的不同区域具有不同的互换倾向)和各物种(即基因组总尺寸)大幅度变动。因此，在这个方面，术语连锁可以是约50cM、或更小如约40cM、约30cM、约20cM、约10cM、约7.5cM、约6cM、约5cM、约4cM、约3cM、约2.5cM、约2cM或甚至更小的分离。表8中详述了与CrS根肿病抗性基因座连锁的标记的具体实例。

参考序列的基因组上某位置的“上游”指5’方向。结合基因组参考序列，上游方向指所述位置的较低数字。基因组上某位置的“上游”意指处于遗传图上朝着较低数字的方向。

参考序列的基因组上某位置的“下游”指3’方向。结合基因组参考序列，下游方向指所述位置的较高数字。基因组上某位置的“下游”意指处于遗传图上朝着较高数字的方向。

遗传图上某位置的“左侧”或“在左侧”指遗传位置的较低数字的方向(按cM计)。例如，“左侧翼标记”是在QTL区间中具有群体位置中最低数字的标记。标记的“左侧”是遗传图上具有较低数字的位置(按cM计)。

遗传图上某位置的“右侧”或“在右侧”指遗传位置的较高数字的方向(按cM计)。例如，“右侧翼侧标记”是在QTL区间中具有群体位置中最高数字的标记。标记的“右侧”是遗传图上具有较高数字的位置(按cM计)。

“回交”指可以籍此将(单一)性状(如根肿病抗性)从一个遗传背景(“供体”)转移入另一个遗传背景(即，“回归亲本”的背景)(例如不包含这个CrS基因或基因座的植物)的育种方法。杂交后代(例如，通过含有CrS的植物与缺少CrS的植物杂交所获得的F1植物；或从F1自交获得的F2植物或F3植物等)与亲本(“回归亲本”)“回交”。在反复回交(BC1、BC2等)和任选地自交(BC1F1、BC2F1等)后，将一个遗传背景的性状并入另一个遗传背景中。

“标记辅助选择”或“MAS”是利用与特定基因座或特定染色体区域(例如渐渗片段)遗传连锁的分子标记的存在，就特定基因座或区域(渐渗片段)的存在而选择植物的方法。例如，与CrS基因座遗传和/或物理连锁的分子标记可以用来检测和/或选择包含CrS基因座的植物。分子标记基因座的遗传连锁越近，则该标记经由减数分裂重组从该基因座脱离的可能性更小。

“LOD-评分”(可能性的对数(10为底))指经常用于动物种群和植物种群中关联分析的统计检验。LOD评分比较如果二个基因座(分子标记基因座和/或表型性状基因座)的确连锁则获得检验数据的可能性与存粹因偶然而观察相同数据的可能性。正LOD评分支持连锁的存在并且大于3.0的LOD评分视为连锁的证据。LOD评分+3表示正观察的连锁并非偶然发生的1000至1可能性。

如本文所用，“分子标记”或“标记”指多态性基因座，即多态性核苷酸(所谓的单核苷酸多态性或SNP，也称作多态性碱基)或多态性DNA序列(其可以是特定DNA序列在某个特定基因座处的插入或缺失，或多态性DNA序列)。标记指在基因组中具有固定位置的可测量遗传特征，其通常以孟德尔方式遗传并且可以用于对目的性状作图。因而，分子标记可以是短DNA序列，诸如围绕单个碱基对即单核苷酸多态性或SNP的序列，或是长DNA序列，诸如微卫星或简单序列重复(SSR)。标记的本质取决于所用的分子分析法并可以在DNA、RNA或蛋白质水平检测。可以使用分子标记，诸如但不限于RFLP(限制性片段长度多态性；Botstein等人(1980)，Am J Hum Genet 32：314-331；Tanksley等人(1989)，Bio/Technology 7：257-263)、RAPD[随机扩增的多态性DNA；Williams等人(1990)，NAR 18：6531-6535]，AFLP[扩增片段长度多态性；Vos等人(1995)NAR 23：4407-4414]、SSR或微卫星[Tautz等人(1989)，NAR17：6463-6471]进行遗传作图。适宜的引物或探针由所用作图方法决定。

可以通过多态性基因座5’侧翼序列、多态性基因座(其可以是SNP中的多态性碱基)和多态性基因座的3’侧翼区的身份鉴定标记。

如本文所用，作为“标记M1”、“标记M2”指示给“标记Mx”或作为“M1”、“M2”指示给“Mx”的标记指如本文上述的多态性基因座(或多态性碱基)。

术语“标记等位基因”指在特定植物中一条染色体处存在的标记的形式(即，多态性基因座形式)。一般，某标记可以作为二个标记等位基因存在或可以称作具有或包含二个标记等位基因。如本文所用，术语“单倍型”指如某种植物或(相关)植物群组内部存在的标记等位基因的特定组合。如本文所述，标记等位基因可以是抗性株系中存在的标记的形式(CrS根肿病抗性标记等位基因)。易感株系中存在的相同标记的形式可以称作CrS根肿病易感性标记等位基因。

如本文所用，标记指示为“标记M1/R”、“标记M2/R”至“标记Mx/R”或“M1/R”、“M2/R”至“Mx/R”指抗性源(或抗性供体株系)中存在的标记等位基因(或，多态性基因座形式)。表9中给出了抗性源的含有抗性源的多态性碱基的标记等位基因实例。

如本文所用，标记指示为“标记M1/S”、“标记M2/S”至“标记Mx/S”或“M1/R”、“M2/S”至“Mx/S”指易感株系(或易感亲本)中存在的标记等位基因。表9中给出了含有易感株系的多态性碱基的易感源的标记等位基因实例。

显而易见的是，当本文中提到本发明的特定基因组序列中的某个SNP基因型或SNP等位基因(或标记基因型或标记等位基因)时，这还涵盖在该基因组序列的变体中的SNP基因型或等位基因，即与所提及序列(如本发明标记的序列)同源(例如相对其包含至少85％、90％、95％、98％、99％(基本上)或更多序列同一性)的基因组序列中的SNP基因型或等位基因。因此在一个方面，本文中对SEQ ID NO：1至22中任一者的任何提及还涵盖SEQ ID NO：1至22中任一者的变体(同源序列)，所述变体相对于所述序列包含至少85％、90％、95％、98％、99％或更大序列同一性(使用例如程序‘Needle’)，但包含所述SNP(标记)基因型或等位基因。

术语

(

是KeyGene N.V.(Wageningen，荷兰)的注册面标)、“AFLP分析”和“AFLP标记”根据标准术语学使用[Vos等人(1995)，NAR 23：4407-4414；EP0534858；http：//www.keygene.com/keygene/techs-apps/]。简而言之，AFLP分析是通过PCR扩增方式检测多个DNA限制性片段的DNA指纹技术。AFLP技术通常包括以下步骤：(i)用两种限制酶、优选六碱基切割酶和四碱基切割酶如EcoRI、PstI和MseI限制性消化DNA；(ii)将双链接头诸如EcoRI、PstI和MseI接头连接至限制性片段的末端；(iii)使用互补于所述接头和限制位点序列的两条引物扩增所述限制性片段的子集并通过一至三个“选择性”核苷酸在其3’末端延伸，即，通过使用延伸入限制性片段的引物实现选择性扩增，仅扩增那些其中引物延伸匹配限制性位点侧翼核苷酸的片段。AFLP引物因而具有特定序列并且每条AFLP引物具有专门代码(引物代码及其序列可以在Keygene网站：http：//www.keygene.com/keygene/pdf/PRIMERCO.pdf找到；所述文献通过引用方式并入本文)；(iv)扩增的限制性片段在变性凝胶板或毛细管上进行凝胶电泳；(v)借助放射自显影、磷成像术或其他方法可视化DNA指纹。使用这种方法，可以在不知道核苷酸序列的情况下通过PCR可视化限制性片段集合。如本文中所用，AFLP标记是具有特定大小的DNA片段，其通过实施AFLP分析生成并在凝胶上作为条带可视化。每个AFLP标记通过用来扩增该标记的引物组合而特指，后附所扩增DNA片段的近似大小(以碱基对计)。可以理解这些片段的大小可以根据实验室条件和所用设备略微变动。本文中每次通过提到引物组合和片段的具体大小提到AFLP标记时，应理解这种大小是近似的并且包含或意在包括不同实验室中观察到的轻微变动。每个AFLP标记代表基因组中的某个基因座。

术语“SSR”指简单序列重复或微卫星[Tautz等人(1989)，NAR 17：6463-6471]。短的简单序列段作为高度重复性元件出现于全部真核基因组中。简单序列基因座通常显示广泛的长度多态性。这些简单序列长度多态性(SSLP)可以通过聚合酶链反应(PCR)分析法检出并用于真伪检验、群体研究、连锁分析和基因组作图。

可以理解分子标记可以转换成其他类型的分子标记。当本发明中谈到特定分子标记时，可以理解，该定义包括用于检测最初通过该特定分子标记鉴定的遗传变异的其他类型分子标记。例如，如果使用已知方法将AFLP标记转换成另一种分子标记，则这种其他标记纳入本定义。例如，使用如Meksem等人[(2001)，Mol Gen Genomics 265(2)：207-214]、Negi等人[(2000)，TAG 101：146-152]、Barret等人(1989)，TAG 97：828-833]、Xu等人[(2001)，Genome 44(1)：63-70]、Dussel等人[(2002)，TAG 105：1190-1195]或Guo等人[(2003)，TAG103：1011-1017]中所述的标准技术，AFLP标记可以转换成序列特异性标记，诸如，但不限于STS(测序-标记-位点)或SCAR(序列-表征-扩增-区域)标记。例如，Dussel等人[(2002)，TAG105：1190-1195]将与抗性连锁的AFLP标记转换成基于PCR的序列加标签的位点标记诸如indel(插入/缺失)标记和CAPS(切割的扩增的多态性序列)标记。

合适的分子标记例如是SNP标记(单核苷酸多态性)、AFLP标记、微卫星、小卫星、随机扩增多态性DNA(RAPD)标记、RFLP标记、序列表征的扩增区域(SCAR)标记，和其他标记，诸如Hu等人，2007，Genet Resour Crop Evol 54：1667-1674)描述的TRAP标记。

本领域广泛已知用于标记检测或用于分析基因组DNA的标记存在情况的方法和测定法法。可以例如在使用Taqman的基于杂交的方法(例如，等位基因特异性杂交)、Invader、基于PCR的方法、基于寡核苷酸基于的方法或基于测序的方法中检出标记的存在情况。

检测SNP标记的可用测定法例如是竞争性Allele-特异性PCR。为了开发KASP-测定法，选择SNP上游的70个或更多个碱基对和其下游的70个或更多个碱基对下游并且设计两个等位基因特异性正向引物和一个等位基因特异性反向引物。参见，例如Allen等人，2011，Plant Biotechnology J.9，1086-1099，尤其KASP测定法第1097-第1098页(所述文献通过引用方式并入本文)。

用于检测SNP和插入缺失的其他方法包括基于延伸探针-核酸杂交分子的单碱基的方法。这些SNP检测方法基于毗邻于多态性且对两个等位基因相同的探针杂交，和在延伸引物时并入可检测核苷酸残基的核苷酸延伸。来自已添加核苷酸的可检出信号用来确定已添加核苷酸的同一性，从中确定相关等位基因的同一性。参见，例如Gunderson等人，2006，Methods Enzymol 410：359(通过引用方式并入本文)。

如本文所用的“与CrS根肿病抗性基因座连锁的分子标记”，或“与CrS根肿病抗性基因座存在连锁的分子标记”指基因组的区域中在至少50％情况下作为单一遗传单位随CrS根肿病抗性基因座一起继承的分子标记。因此，在这个方面，术语连锁可以是约50cM、或更小如约40cM、约30cM、约20cM、约10cM、约7.5cM、约6cM、约5cM、约4cM、约3cM、约2.5cM、约2cM或甚至更小的分离。表8中详述了与CrS根肿病抗性基因座连锁的标记的具体实例。所述“与CrS根肿病抗性基因座连锁的分子标记”因此是与CrS抗根肿病基因连锁的标记。

“与CrS根肿病抗性基因座连锁的分子标记”，或“与存在CrS根肿病抗性基因座连锁的分子标记”也可以是在标记区间的10cM范围内、7.5cM范围内、6cM范围内、5cM范围内、4cM范围内、3cM范围内、2.5cM范围内、2cM范围内，或1cM内范围内或0.5cM范围内的标记，所述标记介于标记M4至M5之间(含M4至M5)，或介于标记M4至M5之间(含M4至M5)，或介于标记M4至M7之间(含M4至M7)，或介于标记M4至M11之间(含M4至M11)。这类分子标记可以是位于如下标记区间内的标记：标记M4至M5之间(含M4至M5)、或标记M4至M7之间(含M4至M7)，或标记M4至M11之间(含M4至M11)。这种标记因此可以是染色体上从M4至M11的10cM标记区间(包括标记M4和M11)内部某位置处的任何标记。位于M4和M11的标记区间(含M4和M11)内的标记的实例是如表8中具体说明的标记。

如本文所用的“十字花科”或“十字花科植物”，指属于十字花科(也称作十字花科(Cruciferae)科)的植物。十字花科植物的实例为，但不是限于，芸苔属物种(Brassicasp.)，如欧洲油菜、甘蓝、芜青、埃塞俄比亚芥、黑芥和芥菜；萝卜属(Raphanus)物种，如鼠尾萝卜(Raphanus caudatus)、野萝卜(Raphanus raphanistrum)和萝卜(Raphanussativus)；紫罗兰属(Matthiola)物种；桂竹香属(Cheiranthus)物种；亚麻荠属(Camelina)物种，如亚麻荠(Camelina sativa)；两节荠属(Crambe)物种，如深海两节荠(Crambeabyssinica)和西班牙两节荠(Crambe hispanica)；芝麻菜属(Eruca)物种，如芝麻菜(Eruca vesicaria)；白芥属(Sinapis)物种如白芥(Sinapis alba)；二行芥属(Diplotaxis)物种；独行菜属(Lepidium)物种；豆瓣菜属(Nasturtium)物种；诸葛菜属(Orychophragmus)物种；辣根属(Armoracia)物种、山嵛菜属(Eutrema)物种；独行菜属(Lepidium)物种；和拟南芥属物种。

“芸苔属植物”指异源四倍体或双二倍体欧洲油菜(AACC，2n＝38)、芥菜(AABB，2n＝36)、埃塞俄比亚芥(BBCC，2n＝34)，或指二倍体芜青(同义词：菜心(B.campestris))(AA，2n＝20)、甘蓝(CC，2n＝18)或黑芥(BB，2n＝16)。

“菜籽油菜(oilseed rape)”或“芸苔属(Brassica)油菜”或“油料作物”指作为作物栽培的菜籽油菜，如欧洲油菜、芜青、芥菜(Brassica juncea)或埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)。

“冬油菜”或“WOSR”是在晚夏至早秋栽种、越冬并且在下一个夏季收获的芸苔属油菜。WOSR通常需要春化以开花。

“春油菜”或“SOSR”是在早春栽种并在晚夏收获的芸苔属油菜。SOSR不需要春化以开花。

如本文所用的“芥酸”是单不饱和ω-9脂肪酸，意指22：1ω9或22：1。

“低芥酸”或“低芥酸”是种子油中芥酸小于2％。

“卡诺拉油菜品质”或“卡诺拉油菜品质油”是每克晾干的无油饼粕含有小于2％芥酸和小于30微摩尔芥子油苷类的油。

“生物样品”可以是植物或植物的部分如植物组织或植物细胞。

如本文所用的“提供基因组DNA”指提供包含来自植物的基因组DNA的样品。样品可以指已经从所述植物获得的组织样品，如，例如，叶样品，其包含来自所述植物的基因组DNA。样品还可以指从组织样品获得的基因组DNA，如已经从组织(如叶样品)获得的基因组DNA。提供基因组DNA可以包括，但不需要包括，从组织样品纯化基因组DNA。提供基因组DNA因此还包括从植物或较大组织片获得组织材料并从中制备粗提物或裂解物。

如本文中所用，“试剂盒”指一组试剂，所述试剂的目的在于实施本发明的方法，更具体地在于鉴定生物样品中的CrS根肿病抗性基因或确定包含CrS根肿病抗性基因的植物材料的接合性状态。更具体地，本发明试剂盒的优选实施方案包含用于鉴定CrS根肿病抗性基因的至少两种特异性引物或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性引物。任选地，试剂盒还可以包含任何其他试剂。备选地，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可以包含与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中CrS根肿病抗性基因存在情况的至少一种特异性探针，或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性探针。任选地，该试剂盒还可以包含使用所述特异性探针鉴定生物样品中CrS根肿病抗性基因的任何其他试剂(如但不限于杂交缓冲液、标记物)。

如本文中所用的术语“引物”包括能够在模板依赖的过程如PCR中引发新生核酸合成的任意核酸。一般而言，引物是具有10个至30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长序列。引物可以按双链形式提供，不过优选单链形式。探针可以作为引物使用，不过将探针设计为与靶DNA或RNA结合并且不需要用于扩增过程中。

当谈及特异性引物时，如本文中所用的术语“识别”指以下事实：特异性引物在本发明方法中所述的条件(如PCR鉴定方案条件)下与特定核酸序列特异性杂交，因而特异性由阳性对照和阴性对照的存在决定。

如本文所用的“分离的DNA”指不在其天然基因组背景下出现的DNA，无论其长度和序列是什么。分离的DNA可以例如指与其基因组背景物理分离的DNA，如基因组DNA的片段。分离的DNA也可以是人工产生的DNA，如化学合成的DNA，或如经由扩增反应(如本领域公知的聚合酶链反应(PCR))产生的DNA。分离的DNA还可以指在其不天然存在其中的DNA背景中存在的DNA。例如，分离DNA可以指质粒中存在的一段DNA。另外，分离的DNA可以指另一个与它天然存在的背景相异的染色体背景下(诸如例如在基因组中异于天然位置的另一个位置、在另一个与它天然存在的物种相异的物种的基因组中或在人工染色体中)存在的一段DNA。

除非另外说明，否则无论何时提到本发明的“植物”或“多个植物”时，应当理解，本文还涵盖植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、纤维、分开的部分如根、叶、花、花粉等)、植物的仍保留亲本区别特征(尤其果实开裂特性)的子代、如通过自交或杂交获得的种子，例如(通过使两个近交亲本系杂交所获得的)杂交种子、杂交植物和从中衍生的植物部分。

如本文所用，“产生繁殖材料”指本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子的任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、嫁(芽)接、微繁殖、匍匐茎或长匐茎、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、嵌条(striking)或插条、双鳞片)、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如无融合生殖、体细胞杂交)。

出于本发明目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分数)指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x100)除以比较的位置的数目。空位(即，比对结果中这样的位置，其中一个残基存在于一个序列中，但不存在于另一个序列中)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS，Rice等人，2000，Trends inGenetics 16(6)：276-277；例如参见http：//www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch，1970，J Mol Biol 48(3)：443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且用于蛋白质的默认计分矩阵是EBLOSUM62。应当清楚，每逢RNA分子的核苷酸序列通过参照相应DNA分子的核苷酸序列定义时，该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都应当被替换为尿嘧啶(U)。是否指DNA分子或RNA分子将从本申请的上下文中显而易见。

如本文所用，“包含”应解释为特指存在如所提到的特征、整数、步骤或组分，但是不排除存在或附加一种或多种特征、整数、步骤或组分或它们的群组。因此，例如，包含一个核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所引述更多的核苷酸或氨基酸，即，包含于更大的核酸或蛋白质中。包含以结构方式或功能方式定义的核酸的嵌合基因可以包含额外的DNA区域等。

发明详述

本发明基于芸苔属(Brassica)中CrS根肿病抗性基因座的鉴定。惊讶地，发现可以在原种芸苔属变种中渐渗CrS根肿病抗性基因座，并且可以获得低芥酸株系。

在本发明的第一实施方案中，提供一种芸苔属植物，其在种子油中包含＜2％芥酸并且在包含标记M4的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座。在另一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M5的标记区间的染色体区段中。在另一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M8的标记区间的染色体区段中，而在又一个实施方案中，所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M11的标记区间的染色体区段中。在又一个实施方案中，本发明的植物包含标记等位基因M4/R，而在又一个实施方案中，本发明的植物包含标记等位基因M4/R和M5/R，或包含标记等位基因M4/R，M5/R、M6/R和M7/R。

本发明的植物可以含有＜2％芥酸，或＜1.5％芥酸，或＜1％芥酸，或0％芥酸。

标记区间可以是如CrS供体中遗传图上55.49至57.50cM、或55.49至55.67cM、或55.49至58.77cM、或55.49至59.14cM、或55.49至59.32cM、或55.49至66.98cM存在的区域，如本文实施例中所示的遗传图上。可以理解，标记M4可以是标记等位基因M4/R或其中标记M4的标记等位基因是“A”，标记M5可以是标记等位基因M5/R，或其中标记M5的标记等位基因是“T”，标记M6可以是标记等位基因M6/R或其中标记M6的标记等位基因是G，标记M7可以是标记等位基因M7/R，或其中标记M7的标记等位基因是T。进一步，可以理解，标记M8可以是标记等位基因M8/R，或其中标记M8的标记等位基因可以是C，标记M9可以是标记等位基因M9/R，或其中标记M9的标记等位基因可以是T，标记M10可以是标记等位基因M10/R，或其中标记M10的标记等位基因可以是A，标记M11可以是标记等位基因M11/R，或其中标记M11的标记等位基因可以是“A”。

标记区间可以是如存在于CrS供体中的对应于Darmor-bzh(版本8.1)基因组序列上位置10,369,430bp至位置10,375,744bp或位置10,369,430bp至位置9,699,466bp或位置10,369,430bp至位置933,572bp的区域，如Bayer等人，2017，Plant Biotech J.15，第1602页所描述，其中位置10,369,430bp处的碱基是A；位置10,3757,44bp处的碱基是T，并且，任选地，位置9,801,311bp处的碱基是G，并且，任选地，位置9,699,466bp处的碱基是T，并且，任选地，位置933,572bp处的碱基是A。

本发明的芸苔属植物可以在标记区间中包含任何额外的标记，如M5和/或M6。

CrS根肿病抗性基因座可以包含于标记M4至M5的标记区间中或M4至M6的标记区间中或M4至M7的标记区间中或标记M4至M8的标记区间中或标记M4至M9的标记区间中或标记M4至M10的标记区间中，或标记M4至M11的标记区间中。

CrS根肿病抗性基因、或CrS抗性基因或CrS基因位于CrS根肿病抗性基因座中。换而言之，CrS根肿病抗性基因座指包含CrS根肿病抗性基因的基因基因座。

包含CrS根肿病抗性基因座的芸苔属种子已经在2019年1月21日按照登录号NCIMB43341保藏在NCIMB(NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，巴克斯本，阿伯丁AB21 9YA，苏格兰，英国)。

旁侧有如本文中所述标记的染色体区间例如是具体提到的标记如下表3和表8中所列的标记之间，或是未明确显示、但也有所提到的标记对旁侧的其他标记之间。本领域普通技术人员可以容易地在基因组区或任何上文列出的标记对旁侧的区域鉴定新标记。这类标记无需是SNP标记，而可以是映射至这个基因组区或亚基因组区的任何类型的基因型或表型标记。优选地，这类标记以遗传和物理方式连锁于本发明描述的本发明CrS基因座。标记优选地表示CrS基因座以非来源特异性方式存在。

可以理解，其中标记M4左侧的染色体区间从易感回归亲本衍生的植物不含来自抗性供体亲本的高介酸表型。

本发明的芸苔属植物也可以是不包含标记等位基因M3/R、不包含标记等位基因M2/R、不包含标记等位基因M1/R、不包含标记等位基因M3/R和M1/R或不包含标记等位基因M2/R和标记等位基因M1/R的植物。本发明的芸苔属植物可以在标记M3的左侧或在标记M2的左侧不包含衍生自CrS供体亲本的染色体区段。本发明的芸苔属植物可以不包含与如上文Bayer等人所述的Darmor-bzh(版本8.1)基因组序列的位置11,256,444bp相对应的位置下游及包括该位置的衍生自CrS供体亲本的染色体区段。本发明的芸苔属植物可以在参考如本文实施例中所述的遗传图与遗传位置53.14cM相对应的遗传位置的左侧不包含衍生自CrS供体亲本的染色体区段。植物可以因此不包含标记M3的标记等位基因“A”，和/或可以不包含标记M2的标记等位基因“A”，和/或可以不包含标记M1的标记等位基因“T”。

如本文定义的“M1/R”是其中多态性碱基为“T”的标记M1的标记等位基因。

如本文定义的“M1/S”是其中多态性碱基为“C”的标记M1的标记等位基因。

如本文定义的“M2/R”是其中多态性碱基为“A”的标记M2的标记等位基因。

如本文定义的“M2/S”是其中多态性碱基为“G”的标记M2的标记等位基因。

如本文定义的“M3/R”是其中多态性碱基为“A”的标记M3的标记等位基因。

如本文定义的“M3/S”是其中多态性碱基为“G”的标记M3的标记等位基因。

如本文定义的“M4/R”是其中多态性碱基为“A”的标记M4的标记等位基因。

如本文定义的“M4/S”是其中多态性碱基为“C”的标记M4的标记等位基因。

如本文定义的“M5/R”是其中多态性碱基为“T”的标记M5的标记等位基因。

如本文定义的“M5/S”是其中多态性碱基为“C”的标记M5的标记等位基因。

如本文定义的“M6/R”是其中多态性碱基为“G”的标记M6的标记等位基因。

如本文定义的“M6/S”是其中多态性碱基为“A”的标记M6的标记等位基因。

如本文定义的“M7/R”是其中多态性碱基为“T”的标记M7的标记等位基因。

如本文定义的“M7/S”是其中多态性碱基为“C”的标记M7的标记等位基因。

如本文定义的“M8/R”是其中多态性碱基为“C”的标记M8的标记等位基因。

如本文定义的“M8/S”是其中多态性碱基为“T”的标记M8的标记等位基因。

如本文定义的“M9/R”是其中多态性碱基为“T”的标记M9的标记等位基因。

如本文定义的“M9/S”是其中多态性碱基为“C”的标记M9的标记等位基因。

如本文定义的“M10/R”是其中多态性碱基为“A”的标记M10的标记等位基因。

如本文定义的“M10/S”是其中多态性碱基为“G”的标记M10的标记等位基因。

如本文定义的“M11/R”是其中多态性碱基为“A”的标记M11的标记等位基因。

如本文定义的“M11/S”是其中多态性碱基为“G”的标记M11的标记等位基因。

在另一个方面，本发明的芸苔属植物是是欧洲油菜WOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M7的标记区间。在又一个方面本发明的芸苔属植物是欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M5的标记区间，如包含标记M4至M8的标记区间的欧洲油菜SOSR植物，如欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段能够从按照登录号NCIMB 43341保藏在NCIMB的参考种子获得。

欧洲油菜WOSR植物可以在包含标记M4至M9或标记M4至M10、或标记M4至M11的标记区间的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座。欧洲油菜WOSR植物可以不包含标记等位基因M2/R，或可以不包含标记等位基因M2/R和M1/R。所述欧洲油菜WOSR植物可以在标记M3的左侧或在标记M2的左侧、或与如上文Bayer等人所述的Darmor-bzh(版本8.1)基因组序列的位置11,256,444bp相对应的位置下游、或与如上文Bayer等人所述的Darmor-bzh(版本8.1)基因组序列的位置12,499,060bp的位置下游、或在参考如本文实施例中所述的遗传图与遗传位置53.14cM相对应的遗传位置的左侧或在参考如本文实施例中所述的遗传图与位置51.99cM相对应的遗传位置的左侧，不包含衍生自CrS供体亲本的染色体区段。

欧洲油菜SOSR植物可以在包含标记M4至M5或标记M4至M6、或标记M4至M7、或标记M4至M8、或标记M4至M9、或标记M4至M10、或标记M4至M11的标记区间的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座。欧洲油菜SOSR植物可以不包含标记等位基因M3/R，或可以不包含标记等位基因M3/R和M1/R。所述欧洲油菜SOSR植物可以在标记M3的左侧、或与如上文Bayer等人所述的Darmor-bzh(版本8.1)基因组序列的位置11,256,444bp相对应的位置下游、或在参考如本文实施例中所述的遗传图与遗传位置53.14cM相对应的遗传位置的左侧，不包含衍生自CrS供体亲本的染色体区段。

显而易见，包含CrS根肿病抗性基因座的本发明植物可以在具体说明的标记区间中含有来自抗性源(来自CrS供体亲本)的标记等位基因。例如，在包含标记M4至M7的标记区间的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座的植物可以含有标记等位基因M4/R和M7/R，或可以含有标记等位基因M4/R、M5/R、M6/R和M7/R。所述植物可以进一步包含标记等位基因M8/R，并且任选地，标记等位基因M9/R，并且任选地，标记等位基因M10/R，并且任选地，标记等位基因M11/R。

在另一个方面，本发明的芸苔属植物抵抗芸苔霜霉致病型P2、P3、P5、P6或P8或抵抗分离株CR11。芸苔属植物也可以抵抗一些最近鉴定的致病型，包括基于Strelkov等人2018，Can J Plant Pathology第284页加拿大根肿病分类计数集(CCD)的2B、3A、5X和8P。

在又一个方面，本发明的芸苔属植物对所述根肿病抗性基因座为杂合，其中在另一个方面，本发明的芸苔属植物对所述根肿病抗性基因座为纯合。

赋予除草剂抗性的基因可以是bar或pat基因，其赋予草铵膦(glufosinateammonium)(

或

)抗性[通过引用方式并入的EP 0 242 236和EP 0 242246]；或者任何修饰的EPSPS基因，如来自玉米的2mEPSPS基因[通过引用方式并入的EP 0508 909和EP 0 507 698]，或者赋予草甘膦(

)抗性的草甘膦乙酰转移酶、或草甘膦氧化还原酶，或者赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈水解酶，或赋予针对磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、三唑并嘧啶类或嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸类的耐受性的任何修饰的AHAS基因，如目前作为

卡诺拉油菜销售的耐受咪唑啉酮的菜籽油菜突变体PM1和PM2。另外，本发明的植物可以另外含有赋予增加的含油量或改进的油组成的内源基因或转基因，如12：0 ACP硫酯酶增加以获得高月桂酸酯，赋予授粉控制；诸如诸如在花药特异性启动子控制下的barnase以获得雄性不育，或在花药特异性启动子控制下的barstar以赋予雄性不育的恢复；或诸如Ogura胞质雄性不育和能育性的核恢复子。

额外含有赋予草铵膦(glufosinate ammonium)(

or

)抗性的基因的本发明植物可以含有编码膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)酶的基因，如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)双丙胺膦(bialaphos)抗性基因(bar)的编码性序列。这类植物可以例如包括如WO01/41558中所述的原种事件MS-BN1和/或RF-BN1，或如WO01/31042中或WO2014/170387中所述的原种事件MS-B2和/或RF-BN1，或组合这些事件的任何。

含有赋予草甘膦(glyphosate)(

)抗性的基因的本发明植物可以含有草甘膦抗性EPSPS，如CP4 EPSPS，或N-乙酰转移酶(gat)基因。这类植物可以例如包括如WO02/36831中所述的原种事件RT73，或如WO11/153186中所述的原种事件MON88302，或如WO2012/071040中所述的原种事件DP-073496-4。

本发明的植物还可以是卡诺拉油菜品质植物。

还提供本发明植物的种子。

使用分子标记，可以鉴定CrS根肿病抗性基因座的存在。

在M4至M5的标记区间的10cM内的标记可以是在M4至M5的区间的10cM、或8cM、或5cM、或3cM、或2cM、或1cM、或0.5cM内部的标记，或可以是在M4至M11的区间内部的标记，或可以是在M4至M10的区间内部的标记，或可以是在M4至M9的区间内部的标记，或可以是在M4至M8的区间内部的标记，或可以是在M4至M7的区间内部的标记，或可以是在M4至M6的区间内部的标记，或可以是在M4至M5的区间内部的标记。在M4至M5的标记区间的10cM内部的标记可以包括标记M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10和M11中任一者。

合适的是，使用本领域已知的方法，可以开发与CrS根肿病抗性基因座连锁的标记。可以基于CrS基因座的遗传信息开发适于本发明的新标记。可以理解，可以通过以下方式开发这类标记：比较来自芸苔属抗性系的CsS根肿病抗性基因座的序列与芸苔属易感系中相同基因座的序列；鉴定CsS根肿病抗性基因座中不出现于相应芸苔属易感系基因座中的特定序列区域。“与CrS根肿病抗性基因座连锁的分子标记”因此可以是检测CrS根肿病基因座存在情况的标记。与CsS根肿病抗性基因座连锁的分子标记也可以是在CsS根肿病抗性基因座侧翼的序列中的标记，所述标记在包含CsS根肿病抗性基因座的株系和缺少该因座、但在至少50％情况下作为单一遗传单位随CsS根肿病抗性基因座一起继承的株系之间有多态性。检测CrS根肿病抗性基因座存在情况的合适标记是标记M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10和M11中任一者。

适合确定CrS根肿病抗性基因座存在情况的标记可以是与CrS根肿病抗性基因座连锁的标记，如表8的标记，尤其在抗性供体亲本和易感回归亲本之间有多态性的CrS根肿病抗性标记等位基因。

可以理解，可以通过鉴定标记等位基因M4/R、M5/R、M6/R、M7/R、M8/R、M9/R、M10/R和M11/R的存在实施包含CrS根肿病抗性基因座的植物。

可以依据不存在与CrS根肿病抗性基因座(CrS根肿病抗性标记等位基因)连锁的标记等位基因，如依据不存在具有抗性株系中检出的多态性碱基的表8的CrS根肿病抗性标记等位基因，确定不存在CrS根肿病抗性基因座。另外，适合确定不存在CrS根肿病抗性基因座的标记可以是与CrS根肿病易感性基因座连锁的标记等位基因(CrS根肿病易感性标记等位基因；即易感回归亲本中的等位基因)。与CrS根肿病易感性基因座连锁的CrS根肿病易感性标记等位基因的实例是回归亲本中检出多态性碱基的表8标记等位基因。

可以通过不存在来自抗性源的具体说明的标记等位基因确定不存在标记等位基因。可以，但不必须通过确定存来自易感株系的相应标记等位基因，确定来自抗性源的标记等位基因不存在。例如，可以通过确定M3/S、或M2/S或M1/S的存在，确定不存在标记等位基因M3/R、或M2/R或M1/R。

可以用第一引物和第二引物和任选地用探针分析根据本发明的标记的存在，选自由根据本发明CrS根肿病抗性基因的15至30个核苷酸、或15至25个核苷酸、或18至22个核苷酸的序列组成的第一引物，与根据本发明CrS根肿病抗性基因的15至30个核苷酸、或15至25个核苷酸或18至22个核苷酸的序列互补的第二引物，并且其中CrS根肿病抗性基因上所述第一和所述第二引物之间的距离介于1和400个碱基之间、或1和150个碱基之间，并且其中相对于CrS编码性序列，第一引物位于所述第二引物上游，以及与在所述第一和所述第二引物之间的CrS根肿病抗性基因序列的至少15个核苷酸，或至少18个核苷酸，但不多于25个核苷酸，或不多于22个核苷酸相同的探针，条件是第一引物的序列或第二引物的序列或所述探针的序列不存在于芸苔属易感植物相应基因座中。所述探针可以是标记过的，诸如例如在美国专利5,538,848中描述的。

可以用识别CrS序列和芸苔属易感株系中相应基因座的如上文所述的第一和第二引物、识别如上文所述的CrS根肿病抗性基因序列、但不识别芸苔属易感株系中所述第一引物和所述第二引物之间序列的第一探针以及识别芸苔属易感株系中所述第一引物和所述第二引物之间序列、但不识别CrS根肿病抗性基因序列的第二探针，分析根据本发明的标记的存在，并且其中第一探针的所述标签物异于第二探针的标签。

分析根据本发明的标记的存在情况的其他合适引物是如上文所述的识别CrS序列和芸苔属易感株系中相应基因座二者的第一引物的标记、识别CrS序列但不识别芸苔属易感株系中相应基因座的第二引物和识别芸苔属易感株系中相应基因座但不识别CrS序列的第三引物。所述第二和第三引物可以如上文所示那样标记，并且所述第二引物可以含有异于所述第三引物的标签。

可以例如通过以下方式鉴定对CrS根肿病抗性基因特异和对芸苔属易感株系中相应基因座特异的PCR产物：凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，对于包含许多插入或缺失的核苷酸的CrS根肿病抗性基因座和芸苔属易感株系中相应基因座，其导致从CrS根肿病抗性基因座和对芸苔属易感植物中相应基因座扩增的片段之间的大小的差异，从而所述片段可以在凝胶上肉眼可见地分开)；凝胶电泳或毛细管电泳后评估这两个不同片段的存在或不存在，因而CrS根肿病抗性基因座的诊断性PCR扩增可以任选地与易感株系中相应基因座的诊断性PCR扩增无关地进行；对扩增的片段直接测序；或基于荧光的检测方法。

可以用与紧邻标记上游的碱基杂交的探针，随后是引物延伸，其中DNA聚合酶通过添加与标记互补的碱基延伸杂交的引物，分析本发明标记的存在。并入的碱基被标记，并且检测到对已并入碱基特异的标记物确定标记等位基因。

在上述方法或用途的任一者中，标记和标记等位基因可以定位至相同的染色体区间并且可以选自如上文对其他实施方案和方面所述的相同群组。

如本文所述，还提供任何包含等位基因的标记，所述等位基因与位于染色体A08上的功能性CrS基因连锁。

本文中还提供如本说明书通篇范围内所述那样的包含CrS抗性基因的染色体片段。在一个方面，染色体片段与其天然环境分离。在另一个方面，它在植物细胞中，特别在芸苔属细胞中。另外，本文提供染色体片段的分离部分，其包含位于染色体A08上的CrS抗性基因。这种染色体片段可以例如是重叠群(contig)或框架(scaffold)。

还描述了包含染色体区段中CrS根肿病抗性基因座的染色体片段，所述染色体区段包含标记M4至M5的标记区间，所述染色体片段还包含标记等位基因M3/S、或M2/S、或M1/S或其组合。

可以通过将包含CrS根肿病抗性基因座的染色体区段(如包含标记M4至M5的标记区间的染色体区段)交换不包含CrS抗性基因座的芸苔属植物中的相应基因组区段，引入CrS根肿病抗性基因座。备选地，该方法可以包括测定CrS抗性基因座的序列，如包含标记M4至M5的标记区间的染色体区段，测定不包含CrS抗性基因座的芸苔属植物的相应染色体区段的序列，并且使用基因编辑，将不包含CrS抗性基因座的所述芸苔属植物的所述染色体区段的序列替换为所述CrS抗性基因座的所述染色体区段的序列。可以通过交换染色体片段或通过在序列中产生独立变化，进行序列替换。

因此，使用这些技术，可以通过对与CrS基因座对应的现有基因座产生想要的变化，或备选地在相应的具体基因组位置处引入一个或多个(例如，如本文所述的)CrS基因的完整序列，使缺少CrS基因的植物转化成CrS根肿病抗性植物。

如本文所用，基因组编辑，也称作基因编辑、基因组工程化指定向修饰基因组DNA，其中可以在基因组中插入、缺失、修饰或替换DNA。基因组编辑可以使用序列特异性酶(如核酸内切酶、切刻酶、碱基转化酶)和/或供体核酸(例如dsDNA、寡聚物)在DNA中引入想要的变化。可以进行编程以识别特定DNA序列的序列特异性核酸酶包括大范围核酸酶(meganucleases)(MGN)、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和RNA指导或DNA指导的核酸酶如Cas9、Cpfl、CasX、CasY、C2c1、C2c3、某些基于Argonaut的系统(参见，例如Osakabe和Osakabe，Plant Cell Physiol.2015Mar；56(3)：389-400；Ma等人，MolPlant.2016Jul 6；9(7)：961-74；Bortesie等人，Plant Biotech J，2016，14；Murovec等人，Plant Biotechnol J.15：917-926，2017；Nakade等人，Bioengineered第8卷，第3期：265-273，2017；Burstein等人，Nature 542，37-241；Komor等人，Nature 533，420-424，2016；所述文献均通过引用的方式并入本文作为参考)。供体核酸可以用作修复序列特异性核酸酶所致DNA断口的模板。供体核酸也可以如此用于基因编辑，不引入DNA断口，以将所需的变化引入基因组DNA。

可以用来鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的标记可以是标记M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10或M11或其任意组合。在一个优选的实施方案中，可以用来鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的标记可以是标记M4、M5、M6和/或M7。在另一个的优选实施方案中，标记M4可以用来鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物。

进一步，在左侧翼为CrS根肿病抗性基因座的标记可以用来鉴定有CrS根肿病抗性基因座且芥酸低的植物。可以用来鉴定有CrS根肿病抗性基因座且芥酸低的植物的标记可以是不包含供体等位基因的M3；不包含供体等位基因的M2；或不包含供体等位基因的标记M1。

在又一个方面，提供一种用于田间保护本发明栽培植物群的方法，其中通过施加包含一种或多种除草活性成分的组合物控制杂草。在又一个方面，所述植物包含赋予草铵膦(glufosinate)抗性或草铵膦(glufosinate ammonium)抗性的基因或赋予草甘膦(glyphosate)抗性的基因，并且除草剂是草铵膦(glufosinate)或草铵膦(glufosinateammonium)或草甘膦(glyphosate)。

可以通过使两个近交亲本系杂交，产生本发明植物的杂交种子，其中近交亲本系之一包含本发明的CrS根肿病抗性基因。近交系可以包含处于纯合形式的CrS根肿病抗性基因。杂交体可以含有杂合形式的CrS根肿病抗性基因。为了产生纯杂交种子，亲本系之一是雄性不育的并且用另一系的花粉授粉。通过成行培育亲本系并仅收获雄性不育亲本的F1种子，产生纯杂交种子。可以使用如EP 0,344,029或US 6,509,516中所述的系统以产生雄性不育亲本系，其中编码植物毒性蛋白(barnase)的基因在绒毡层特异性启动子如TA29控制下表达，确保选择性破坏绒毡层细胞。用嵌合基因pTA29：barnase转化植物产生了其中完全阻止花粉形成过程的植物[Mariani等人，(1990)，Nature 347：737-741]。De BlOck和DeBrouwer[(1993)，Planta 189：218-225]描述了包含嵌合pTA29-barnase基因的欧洲油菜植物的花药发育过程的细胞化学和组织化学分析。为了恢复雄性不育植物的后裔中能育性，将雄性不育植物(MS亲本)与携带能育性恢复基因的转基因植物(RF亲本)杂交，所述能育性恢复基因在表达时能够抑制或阻止雄性不育基因的活性[美国专利号5,689,041；5,792,929；De BlOck和De Brouwer，上文]。WO96/26283中描述了共调节基因在产生雄性不育植物中用来增加具有良好农艺学性能的转化体的频率的用途。通常，当不育性DNA编码barnase时，共调节性DNA将编码barstar，优选地使用优化的barstar基因，如公开的PCT专利申请WO98/10081中描述。可以理解，不同启动子可以用来驱动barnase表达，旨在使得植物雄性不育。同样，barstar可以可操作地连接于不同的启动子，如来自花椰菜花叶病毒的35S。

也可以使用其他技术生成雄性不育植物，如胞质雄性不育/恢复系统[例如Ogura系统，已公开美国专利申请20020032916、US 6,229,072、WO97/02737、US 5,789,566或US6,365,798、WO98/54340的Polima系统、或WO95/09910的Kosena系统、US 5,644,066]。

雄性不育(MS)亲本或育性恢复(RF)亲本任一者或二者均可以包含本发明的CrS根肿病抗性基因。这点可以通过将CrS根肿病抗性基因引入至原种欧洲油菜株系并且随后引入雄性不育或能育性恢复者来实现。备选地，可以通过使包含CrS根肿病抗性基因的植物与MS亲本或RF-亲本杂交，将CrS根肿病抗性基因直接引入MS或RF亲本系。从MS和RF亲本之间杂交产生的F1杂交种子将随后含有CrS根肿病抗性基因。

适合本发明的是包含CrS根肿病抗性基因座的分离的核酸分子，其中所述CrS根肿病抗性基因座位于M4至M5的区间内部。如本文所述的分离的核酸分子还可以表征为不包含标记等位基因M3/R或不包含标记等位基因M2/R、或不包含标记等位基因M1/R。

具体地说，本发明方法和试剂盒适合确定CrS根肿病抗性基因座的存在情况。使用至少一种分子标记，可以确定CrS根肿病抗性基因座的存在，其中所述一个分子标记与如本文定义的CrS根肿病抗性基因座的存在连锁。

可以提供试剂盒，其含有经专门设计以检测本发明标记等位基因的引物和/或探针。试剂盒的组分可以针对以下目的专门调整：质量控制(例如，种子批的纯度)、检测CrS根肿病抗性基因在植物材料或者包含或衍生自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在。可以通过使用特异性针对CrS基因座和芸苔属易感株系中相应基因座的备选性引物和/或探针集合，确定CrS抗根肿病基因的接合性状态。

合适本发明的是一种产生无根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：播种来自包含CrS根肿病抗性基因的本发明芸苔属植物的种子，在田间培育植物，任选地用杀真菌剂喷洒植物并且收获。

通过开发特异性识别CrS根肿病抗性基因座中序列的引物，本发明的CrS根肿病抗性基因座可以用来开发分子标记。

还提供一种产生食品、饲料或工业产品的方法，所述方法包括获得本发明的植物或其部份并从该植物或其部份制备食品、饲料或工业产品。在又一目的中，所述食品或饲料是油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质；或所述工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养药。

在一些实施方案中，本发明的植物细胞，即包含CrS根肿病抗性基因的植物细胞，以及根据本发明的方法产生的植物细胞可以是非繁殖性细胞。

根据本发明获得的植物可以在常规育种方案中用来产生更多具有相同特征的植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入存在本发明CrS基因的特征。获得的植物还可以用于产生繁殖材料。本发明的植物还可以用来产生通过本发明方法获得的植物的配子、种子(包括碾碎的种子和种籽饼(seed cakes))、种子油、胚(合子胚或体细胞胚)、子代或杂交体。还涵盖从本发明植物获得的种子。

通过引用的方式完整并入本文中提及或援引的全部专利、专利申请和出版物或对公众公开(包括互联网上的出版物)。

在名称为“190202_ST25.txt”、具有5千字节(如Microsoft

中测量的大小)的文件中所含的序列表含有xx个序列：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：22，在此以电子提交方式提交并且通过引用的方式并入本文。

在说明书和实施例中参考以下序列：

SEQ ID No.1：标记1的5’侧翼序列

SEQ ID No.2：标记1的3’侧翼序列

SEQ ID No.3：标记2的5’侧翼序列

SEQ ID No.4：标记2的3’侧翼序列

SEQ ID No.5：标记3的5’侧翼序列

SEQ ID No.6：标记3的3’侧翼序列

SEQ ID No.7：标记4的5’侧翼序列

SEQ ID No.8：标记4的3’侧翼序列

SEQ ID No.9：标记5的5’侧翼序列

SEQ ID No.10：标记5的3’侧翼序列

SEQ ID No.11：标记6的5’侧翼序列

SEQ ID No.12：标记6的3’侧翼序列

SEQ ID No.13：标记7的5’侧翼序列

SEQ ID No.14：标记7的3’侧翼序列

SEQ ID No.15：标记8的5’侧翼序列

SEQ ID No.16：标记8的3’侧翼序列

SEQ ID No.17：标记9的5’侧翼序列

SEQ ID No.18：标记9的3’侧翼序列

SEQ IDNo.19：标记10的5’侧翼序列

SEQ IDNo.20：标记10的3’侧翼序列

SEQ ID No.21：标记11的5’侧翼序列

SEQ ID No.22：标记11的3’侧翼序列

除非在实施例中另外指出，否则全部重组DNA技术按照“Sambrook J和Russell DW(编者)(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York”中和“Ausubel FA，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA and Struhl K(编者)(2006)Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley&Sons，New York”中所述的标准方案实施。

“Croy RDD(编者)(1993)Plant Molecular Biology LabFax，BIOS ScientificPublishers Ltd.，Oxford and Blackwell Scientific Publications，Oxford”中和“Brown TA，(1998)Molecular Biology LabFax，2nd Edition，Academic Press，SanDiego”中描述了标准材料和参考文献。用于聚合酶链反应(PCR)的标准材料和方法可见“McPherson MJ和

SG(2000)PCR(The Basics)，BIOS Scientific Publishers Ltd.，Oxfbrd”中和“PCR Applications Manual，第3版(2006)，Roche DiagnosticsGmbH.Mannheim or www.roche-applied-science.com“中。

应当理解，在以下实施例的任何实验室方案如PCR方案中的众多参数可能需要针对具体实验室条件调整，并且可以略加修改以获得类似结果。例如，使用在PCR方法中制备DNA或选择其他引物的不同方法可以决定PCR方案的其他最佳条件。但是，这些调整对本领域技术人员将是显而易见的，并且在目前的PCR应用手册中进一步详述。

实施例

1.根肿病抗性供体开发

从分离型合成欧洲油菜材料中，在生长箱中使用根肿病野外混合物作为接种物进行根肿病抗性筛选。这种允许选出抗性植物并且对作为CrS存在的单一显性抗性基因表征和命名，从所述基因通过DH方法开发固定株系(fixed line)。

孢子悬液接种籽苗

将植物播种于36穴一次性塑料托盘中，每穴一株植物，并置于下部无孔以防止泄漏并降低掺杂流风险的塑料容器中。任由每个托盘中一个空穴开放，以置水进入托盘，从而植物从根取得水。通过接种后5-7天在籽苗基部依住籽苗茎小心地滴下孢子悬液，用孢子悬液接种植物。在生长箱中按20/16C(昼/夜)温度和16小时光周期培育植物。

疾病评级

为了评估根肿病严重程度，接种后4-6周，从土壤小心地取出植物并按0至3分评定疾病严重程度(Kuginuki等人，1999；Xue等人，2008)，其中：0＝无擦伤，1＝一些小擦伤(在＜1/3根上的小擦伤)，2＝中等擦伤(1/3-2/3根上的小尺寸至中等尺寸的擦伤)，和3＝严重擦伤(＞2/3根上中等至大尺寸擦伤)。随后根据如Strelkov等人，(2006)改良的Horiuchi和Hori(1980)公式计算疾病指数(ID)：

其中：n是属于某个类别的植物的数目；N是实验单位中植物的总数；并且0、1、2和3是症状严重程度类别。将等级0和1视为抗性表型并将2和3视为易感表型。

选择九株抗性植物并且用作CrS根肿病抗性基因的DH供体(表1)。

表1.生长箱中单株植物上的筛选结果。

*基于0-3分级量表，其中0-1＝R(抗性)和2-3＝S(易感)。

合成性欧洲油菜(napus)供体具有不符合卡诺拉油菜品质标准(其为每克晾干的无油饼粕＜2％芥酸(C22：1)和＜30微摩尔总芥子油苷类)的高芥酸和高芥子油苷含量，这使得难以直接使用该来源进行商用繁育。

在生长箱中对一个衍生自9个抗性CrS供体的小DH群体用野外混合物筛选根肿病抗性并且选择1株抗性DH植物作为抗性供体。从这株植物收获的种子形成抗性供体株系。质量数据取自这个种批：

芥子油苷类：90.41μmol/g

C22：1：11.5％

使用选定的抗性DH植物作为SOSR杂交的供体。对于WOSR，供体源自同一初始的分离型合成欧洲油菜材料。

1.1.供体对不同根肿病致病型(芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae))的抗性谱

表征抗性供体株系依据来自加拿大(使用第1段中描述的选定抗性DH株系)和欧洲(德国、法国、荷兰和英国，使用生长箱中从初始的分离型合成欧洲油菜材料衍生的植物)的差异性致病型和野外分离株(表2)。

表2.对加拿大和欧洲根肿病致病型的抗性供体反应。将加拿大致病型如Williams(1966)Phytopathology，56，624-626那样分类；将欧洲致病型如Som6等人(1996)PlantPathology，45，432-439那样分类。

2.定位用群体开发和选择的供体株系中抗性基因座的分子图

从1中描述的初始的合成欧洲油菜分离型材料起，抗性植物与易感WOSR株系杂交以产生F2定位用群体。F2群体用来定位CrS的抗性基因座。使用生长箱接种法，对279个F2个体就分离株CR11抗性进行表型分型，并且对其进行基因分型。

在染色体A08(N08)上鉴定单个QTL(图1和表3)。

表3.CrS的QTL区间内部的标记。

在QTL峰标记，分析三个基因分型类别下F2植物的表型分布(纯合兼回归亲本(AA)或供体等位基因(BB)，和杂合(AB))(图2)。在QTL峰标记，杂合植物具有与供体亲本等位基因的纯合植物相似的抗性水平，表明抗性为显性。

3.开发卡诺拉油菜品质和根肿病抗性SOSR

使用第1段中所述的DH供体植物，遵循回交方案并且结合针对P3、P5、P6和P8等份额混合物的抗性表型选择，将CrS根肿病抗性渐渗SOSR中，如图3中所示。

实现针对广谱不同根肿病致病型有抗性的BC3F3株系。然而，该株系具有高芥酸(表4)，表明高芥酸与CrS根肿病抗性连锁。芥子油苷类水平是22.4μmol/g。

表4.BC3F3株系的抗性和芥酸水平(％)。RP1是图3的示意图中用于BC3F3的回归亲本。

表型	RP1	BC3F3	易感检查
				P3	S	R	S
P5	S	R	S
				P6	R	R	S
P8	S	R	S
				混合致病型	S	R	S
芥酸(％)	0	12.92	0

表5.田间筛选带CrS根肿病抗性的雌性繁育系。检查：回归亲本。*基于0-3分级量表，其中0-1＝R(抗性)和2-3＝S(易感)。**ID：疾病指数(％)。

表6.在阿伯塔省的四个位置田间筛选有CrS根肿病抗性的杂交体。**ID＝疾病指数(％)。杂交体1和2：无CrS的杂交体。杂交体3：来自BC3F3与无CrS的另一株系杂交的结果。

在田间存在天然根肿病侵染(未知的致病型组合物)的情况下培育具有纯合态CrS根肿病抗性的BC3F3繁育系并且筛选抗性。结果示于表5和表6。

借助额外的回交(在BC5F2处)通过以下方式选择卡诺拉油菜品质株系：使用芥酸的表型分型移除高芥酸连锁累赘并且遵循图4中的方案，使用标记辅助回交方案和CrS的QTL区域标记，选择CrS的存在，并且用包含P2、P3、P5、P6和P8的单一孢子致病型的混合物进行抗性筛选。

为了确定品质参数，从选择的BC5F2植物产生下一代BC5F3株系。在BC5F3株系中，芥子油苷类的水平是12μmol/g并且芥酸水平是0.8％。因此在BC5代中移除高芥酸连锁累赘。

随后采用标记辅助回交方法(使用不同的回归亲本)，新产生的抗根肿病和卡诺拉油菜品质SOSR BC5F2用作根肿病抗性性状渐渗计划中的供体，以遵循图5中的方案选择携带较短渐渗片段的抗性株系。包含P2、P3、P5、P6和P8的单一孢子致病型混合物用于对回交世代进行表型分型。

使用不同的回归亲本(IL2至IL7)开发了六个BC3F3渐渗株系。确定回归亲本、供体株系(衍生自抗性BC5F2植物的BC5F3)和渐渗株系的抗性谱。表7显示了供体株系显示宽抗性并且，全部渐渗株系均显示与供体株系相同的抗性谱。进一步，从渐渗株系IL4选择一株BC3F2植物(IL4 BC3F2)。这个株系衍生自异于IL4 BC3F3植物的个体。IL4 BC3F2植物具有与IL4 BC3F3植物相同的抗性谱。

标记用来鉴定为CrS根肿病抗性所需的染色体区域。IL4 BC3F3在左侧含有最少数目的CrS标记，界定了左侧处为CrS根肿病抗性所需的染色体区域。IL4 BC3F2在右侧含有最少数目的CrS标记，界定了右侧处为CrsS根肿病抗性所需的染色体区域。表8中显示BC5F2供体植物(表8中作为IL1指示)和渐渗株系的标记数据。

4.开发卡诺拉油菜品质和根肿病抗性WOSR

还用如图6中所示的方案，将CrS抗性基因座渐渗WOSR良种繁育系中。如前所述，供体植物源自与SOSR杂交方案中所用供体相同的初始分离型欧洲油菜材料。使用芸苔根肿菌分离株CR11结合标记-供体等位基因选择，进行表型选择。

在BC1F1代中，获得具有低水平芥酸的株系。

表8中显示的BC1F1渐渗株系(根肿病抗性、低芥酸含量)和BC2F1渐渗株系(根肿病抗性、低芥酸含量)的标记数据。

5.芥酸低的CrS抗性基因座在染色体A08上的位置

表8中显示用于WOSR和SOSR中根肿病抗性基因座渐渗的标记。对于每个标记，提供在公共基因组参照物Darmor-bzh(版本8.1，Bayer等人.，2017，Plant Biotech J.15，第1602页)上的位置和在(第2段中描述的)F2 WOSR遗传图上的遗传位置。基于其在F2遗传图上的遗传位置考虑标记顺序，表8表明：在抗性基因座的左侧，标记M1至M3不为抗性所需(参见，最近标记M3的IL4)，而在右侧，标记M6-M11不为抗性所需(参见，最近标记M6的IL4BC3F2)。这表明，在标记M3和标记M6之间的标记区间(或，标记M4至标记M5的标记区间)足够用于基于F2遗传图的CrS根肿病抗性。

当比较来自F2 WOSR遗传图的标记顺序与基因组参照物Darmor-bzh(v 8.1)上的顺序时，标记M9出现不一致性。为了在表8中展示WOSR和SOSR中来自不同回交的全部基因分型信息，我们已经遵循F2 WOSR遗传图上的遗传位置(其使用与WOSR BC1F1和BC2F1相同的初始亲本构建)展示了标记顺序。

另外，表8显示，与基于F2遗传图从标记M4至标记M11的片段那样长的片段可以用来获得根肿病抗性，同时不引入高芥酸。

被转化成RP处在标记M4的左侧上(使用F2群体中标记的遗传位置)的植物在种子中具有低芥酸水平。在右侧，标记M11在染色体的末端，并且赋予高芥酸的区域因此可以不位于M11的右侧。这显示供体中赋予高芥酸的区域位于标记M4的左侧。为了获得低芥酸的植物，在标记M4的左侧处的区域应当衍生自RP。由于FAE1是油菜中芥酸生物合成过程的关键基因，使用登录号EU543282作为blast查询对象并使用基因组的公共结构性注释(Bayer等人，上文)确定基因位置，检查其在Darmor-bzh基因组上的位置。该基因的一个拷贝位于染色体A08上(其将会对应于BnaA08g11590D2-Darmor-bzh基因组上的位置11,261,862bp至11,263,382bp)。

包含CrS根肿病抗性基因座和低水平芥酸的芸苔属种子已经在2019年1月21日按照登录号NCIMB 43341保藏在NCIMB(NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，巴克斯本，阿伯丁AB21 9YA，苏格兰，英国)。

6.在转基因方案中验证CRR1a根肿病抗性基因

进行blast分析以鉴定CRR1a根肿病抗性基因(如Hatakeyama等人(2013)PLos One8(1)e54745所描述；登录号AB605024)在Darmor-bzh公共基因组(版本8.1)上的位置。使用基因组的公共结构性注释(Bayer等人，上文)，该基因将会对应于染色体A08上从10,531,290至10,532,568bp定位的BnaA08g10690D2基因。这对应于标记M3和标记M4之间的标记区间，考虑Darmor-bzh基因组上这两个标记的位置(参见表8)。

将CRR1a基因(如Hatakeyama等人(2013)PLos One 8(1)e54745描述；登录号AB605024)在组成型35S启动子的控制下克隆并转化入易感性欧洲油菜植物。在温室条件用芸苔根肿菌分离株CR6攻击植物。对总计4个转基因株系及其相应的分离型株系评估根肿病抗性。

使用储存在-20℃的来自先前实验的有症状植物的棍状根制备接种物。通过40ml蒸馏水中使用Polytron，均化有症状根。使所得匀浆穿过Miracloth，此后离心(2000g持续10分钟)以尽可能多地移除植物残渣。使所得上清液进入一只新的50ml管并且在显微镜中检查静止的结构物。观察到球状小孢子，确认接种物中存在芸苔霜霉。通过使用获得的孢子悬液或蒸馏水(模拟接种)蘸根，接种十日龄转基因植物。在蘸根10分钟后，将植物转移至土壤并且在分隔的托盘中维护。在接种后(dpi)60天评估植物症状。纳入两个抗性繁育系作为对照。模拟接种的植物无一在60dpi后显示根症状。如预期，对于两个对照繁育系，未获得症状和棍状根。

有CRR1a基因的转基因株系显示有症状的棍状根。

这些数据显示CRR1a基因就针对分离株CR6的根肿病抗性而言不够用。

Claims

1.一种芸苔属植物，在种子油中包含<2％芥酸并且在包含标记M4的染色体区段中包含CrS根肿病抗性基因座。

2.根据权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M5的标记区间的染色体区段中。

3.根据权利要求1或2所述的芸苔属植物，其中所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M8的标记区间的染色体区段中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的芸苔属植物，其中所述CrS根肿病抗性基因座处于包含标记M4至M11的标记区间的染色体区段中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的芸苔属植物，其中所述植物包含标记等位基因M4/R。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的芸苔属植物，其中所述植物包含标记等位基因M4/R和M5/R，或其中所述植物包含标记等位基因M4/R、M5/R、M6/R和M7/R。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的芸苔属植物，其中所述植物不包含标记等位基因M3/R、或M2/R、或M1/R或其组合。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的芸苔属植物，其是欧洲油菜(Brassica napus)或芜青(Brassica rapa)植物。

9.根据权利要求8所述的芸苔属植物，其是欧洲油菜WOSR植物或欧洲油菜SOSR植物。

10.根据权利要求9所述的芸苔属植物，其是欧洲油菜WOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M7的标记区间。

11.根据权利要求9所述的芸苔属植物，其是欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M5的标记区间。

12.根据权利要求11所述的芸苔属植物，其是欧洲油菜SOSR植物，其中所述染色体区段包含标记M4至M8的标记区间。

13.根据权利要求12所述的芸苔属植物，其中所述染色体区段从按照登录号NCIMB4334l保藏在NCIMB的参考种子可获得。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的芸苔属植物，其抵抗芸苔霜霉(P.brassicae)致病型P2、P3、P5、P6或P8或抵抗分离株CR11。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的芸苔属植物，其中所述植物对所述根肿病抗性基因座为杂合。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的芸苔属植物，其中所述植物对所述根肿病抗性基因座为纯合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的芸苔属植物，所述植物还包含赋予除草剂耐受性的基因。

18.根据权利要求17所述的芸苔属植物，其中所述赋予除草剂耐受性的基因是赋予草铵膦(glufosinate)或草铵膦(glufosinate ammonium)抗性的基因或赋予草甘膦抗性(glyphosate)或基因。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的芸苔属植物的种子。

20.用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括

(a)鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的从M4至M5的10cM标记区间范围内有至少一个标记的至少一株芸苔属植物，并且

(b)选择包含所述CrS根肿病抗性基因座的植物。

21.根据权利要求20所述的方法，包括鉴定至少一株芸苔属植物，所述植物在M4至M11的标记区间内包含至少一个标记并且不包含标记等位基因M3/R、或不包含标记等位基因M2/R，或不包含标记等位基因M1/R。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中使用从M4至M5的标记区间内的标记，鉴定所述芸苔属植物。

23.用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，所述方法包括

(a)使包含CrS根肿病抗性基因座的第一芸苔属植物与第二植物杂交；并且

(b)鉴定从M4至M5的10cM标记区间范围内包含至少一个标记的后代植物。

24.根据权利要求23所述的方法，包括鉴定后代植物，所述后代植物在M4至M11的标记区间内包含至少一个标记并且不包含标记等位基因M3/R、或不包含标记等位基因M2/R，或不包含标记等位基因M1/R。

25.用于产生抗根肿病芸苔属植物的方法，包括使用基因组编辑，向不包含CrS根肿病抗性基因座的植物引入CrS根肿病抗性基因座。

26.从M4至M5的10cM标记区间范围内至少一个标记鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的用途。

27.标记M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10和/或M11鉴定包含CrS根肿病抗性基因座的植物的用途。

28.用于田间保护根据权利要求17或18所述的栽培植物群的方法，其中通过施加包含一种或多种除草活性成分的组合物控制杂草。

29.根据权利要求28所述的方法，其中植物是根据权利要求18所述的植物，并且除草剂是草铵膦(glufosinate)或草铵膦(glufosinate ammonium)或草甘膦(glyphosate)。