KR20150117326A - 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사과에서 유래된 SSR(simple sequence repeat) 검출용 프라이머 세트, 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별 방법, 사과 품종 판별용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 사과품종 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트는 사과 속 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 사과의 품종을 판별할 수 있다. 또한, 사과 연구기관 및 농산물 품질관리원 및 유통업체 등에서 유통 사과의 품종 판별, 생산보급, 품종 보호권 등과 관련한 문제점을 해결하는 데 유용하게 이용할 수 있고, 프라이머 이용 여교잡(marker-assisted backcross, MAB)을 통한 사과 신품종육성에 필요한 기초 정보로 제공될 수 있다.

Description

사과에서 유래된 SSR 프라이머 및 이의 용도{SSR primer derived from apple and use thereof}
본 발명은 사과에서 유래된 SSR(simple sequence repeat) 검출용 프라이머 세트, 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별 방법, 사과 품종 판별용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
사과(Malus x domestica Borkh.)는 주요 과일 작목 중 하나이다. 한국에서는 1988년 홍로(Hongro)('Spur Earliblaze'×'Spur Golden Delicious')품종이 육성되어 2010년 아리수(Arisoo)('Yoko'×'Senshu') 품종까지 22 품종이 육종되었다. 한국에서는 18개 품종이 계획된 육종 프로그램(planned breeding programs)에서 오직 교배친으로만 이용되어 왔다. 그러나, 상기 계획된 육종 프로그램에서 제한된 수의 교배친을 이용하는 것은 작물 개량에 이용가능한 사과 생식질(germplasm)의 유전적 다양성을 제한한다는 문제점을 발생시켰다.
사과의 형태학적 및 생리학적 특성은 사과 품종 판별의 도구로 이용되어 왔다. 그러나, 상기 방법은 많은 시간 소요되고, 비싸며, 종종 주관적인 결정에 의해 이루어진 단점이 있다(Cooke R. J.(1995), Varietal identification of crop plants, p. 33-63). 다유전적(multigenic), 양적 및 환경적인 요인은 사과 품종 특성의 발현에 영향을 미치기 때문에, 국제식물신품종보호연맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)의 생화학 및 분자생물학적 기술에 대한 연구 그룹은 사과 품종 판별을 분자생물학적 프라이머를 사용하도록 요청하고 있다.
SSR(simple sequence repeat)(또는 microsatellites라 함)은 짧은 DNA 단편으로, 진핵 게놈 및 반복 단위 수의 변화에 의한 높은 다형성을 갖는다. 뿐만 아니라, 공우성 유전(co-dominant inheritance)의 특징을 갖고 있다. 모든 SSR 유전자좌(locus)는 특이적 프라이머 쌍에 의해 정의되고 있어, 이를 연구하는 실험실간의 정보 공유가 쉽다(Gianfranceschi et al.,(1998), Theor. Appl. Genet. 96:1069-1076). 사과에서는 약 300여개의 SSR 프라이머를 이용할 수 있고(Hokanson et al.,(1998), Appl. Genet, 97, 671-683 ; Gianfranceschi et al.,(1998), Appl. Genet.96,1069-107; Liebhard et al.,(2002), Molecular Breeding. 10, 217-241; Silfverberg-Dilworth et al., (2006), Tree Genetics and 205 Genomes. 2, 202-224), 상기 SSR 프라이머는 생식질 집합(germplasm collection)(Liebhard et al.,(2002), Molecular Breeding. 10, 217-241; Silfvergerg Dilworth et al.,(2006), Tree Genetics and 205 Genomes. 2, 202-224) 및 품종 판별로(Laurens et al.,(2004), Acta Hort. 663-639; Galli et al.,(2005), HortScience. 40(7), 1974-1977; Wichmann et al.,(2007), Int. J. Hort. Sci. 13(3), 37-42; I. Kiraly et al., (2009), Acta Hort. 839, 471-477) 이용되어 왔다.
이에 본 발명자는 국내 육성 사과를 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머를 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 기존에 선발된 SSR 검출용 프라이머 세트 및 골든 딜리셔스 사과 품종의 염기서열을 이용하여 제작한 SSR 검출용 프라이머 세트를 이용 시, 국내 육성 사과 22종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 44로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사과품종 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 제1항의 SSR 검출용 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 사과의 품종 판별방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 44로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사과품종 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 제1항의 SSR 검출용 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 사과의 품종 판별방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 및 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사과품종 판별을 위한 SSR(simple sequence repeat) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 SSR 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 22개의 SSR 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개의 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하여, 가장 바람직하게는 22개의 SSR 검출용 프라이머 세트를 동시에 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
상기 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍으로 이루어진 SSR 검출용 프라이머 세트는 사과품종을 판별할 수 있으나, 바람직하게는 국내 육성 사과품종이며, 더욱 바람직하게는 체세포 변이(somatic mutants)를 제외한 국내 사과품종을 판별할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "체세포 변이"는 체세포 분열중에 일어나는 유전자변이로써, 과실의 색상, 크기 또는 맛의 증가와 같은 경제적으로 중요한 특성이 하나 또는 일부 작은 영역(a few small region)이 다른 것을 의미한다.
상기 SSR 검출용 프라이머 세트는 사과속(Malus sp.) 식물로부터 유래된 것이다.
본 발명에 있어서, "사과속 식물"은 영년생 작물로서 종자로부터 개화 결실되는 시기까지 장기간이 소요되며 유전자 조성이 복잡할 뿐 만 아니라 자가불화합성의 특징도 가지고 있다. 따라서 육종 효율을 높이기 위하여 주요 형질의 유전 기구의 이해와 각종 유전자원의 수집 분류 및 평가가 중요하다.
본 발명에 있어서, 상기 사과 속은 이에 속하는 식물은 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 국내 육성 사과 품종이며, 더욱 바람직하게는 홍로(Hongro), 석광(Seokwang), 추광(Chukwang), 새나라(Saenara), 감홍(Gamhong), 화홍(Hwahong), 선홍(Sunhong), 서홍(Seohong), 섬머 드림(Summer Dream), 홍금(Honggeum), 만복(Manbok), 홍소(Hongso), 홍안(Hongan), 피크닉(Picnic), 여홍(Yeohong), 단홍(Danhong), 화영(Hwayoung), 그린볼(Greenball), 황옥(Hwangok), 화사(Hwasa), 섬머 킹(Summer King) 및 아리수(Arisoo) 품종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 SSR 검출용 프라이머 세트는 사과 속 식물에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 검출용 프라이머를 이용하여 사과 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 사과 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 30으로 표시되는 SSR 검출용 프라이머 세트는 골든 딜리셔스(golden delicious) 품종으로부터 유래된 것이다.
본 발명에 있어서, "골든 딜리셔스"는 1914년 미국에서 우연실생으로 발견된 사과 품종으로 세계적으로 널리 재배되고 있는 품종 중의 하나로, 해거리가 적고 점무늬낙엽병에 강하나 진딧물 피해를 받기 쉽다는 단점이 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1 내지 30으로 표시되는 SSR 검출용 프라이머 세트는 골든 딜리셔스의 전장 서열(NCBI GenBank Assembly ID: GCA_000148765.2)에 근거하여 크로모좀(chromosome) 염기서열 분석 정보를 다운 받아, SSR 프라이머를 감지해내는 프로그램 언어 펄(perl)을 이용하여 반복되는 염기 서열 부분을 찾아 SSR 검출용 프라이머 세트를 제작하였다.
상기 서열번호 31 내지 44로 표시되는 SSR 검출용 프라이머 세트는 HiDRAS (High-quality Disease Resistant Apples for a Sustainable Agriculture) 데이터베이스에서 유래된 것이다.
또한 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 제1항의 SSR 검출용 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 사과의 품종 판별방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 사과 속 식물에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 검출용 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬 광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물에는 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명에 따른 사과 품종을 판별하기 위한 SSR(simple sequence repeat) 검출용 프라이머 세트는 사과 속 식물의 DNA 다형성을 이용하여, 사과품종을 효과적으로 판별할 수 있어, 사과 연구기관, 농산물 품질관리원 및 유통업체 등에서 유통 사과의 품종 판별, 생산보급 및 품종 보호권 등과 관련한 문제점을 해결하는 데 유용하게 이용할 수 있고, 프라이머 이용 여교잡(marker-assisted backcross, MAB)을 통한 사과 신품종육성에 필요한 기초 정보로 제공될 수 있다.
도 1은 C.S. Chord 1967에 의한 유전적 거리를 기반으로 한 국내 육성 사과 38 품종의 계통도를 유전적 유사성을 이용하여 나타낸 도이다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 SSR 검출용 프라이머 세트 22쌍을 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개를 판별한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 SSR 검출용 프라이머 세트 22쌍을 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개를 혈통 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. DNA 추출 및 증폭
실시예 1-1. 사과 시료의 DNA 추출
본 발명의 사과 시료 DNA를 추출하고 이의 DNA양 및 순도를 검정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 국내 육성 사과 품종 22개를 판별하기 위하여, 상기 22 품종과 이의 교배친 16개 품종을 포함한 농촌진흥청 원예특작과학원에서 경정 배양(shoot tip)한 총 38 품종의 어린 잎을 채취하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 채취한 어린 잎의 DNA 추출은 Lodhi et al. 의 CTAB(cetyl-tri-methyl ammonium bromide) 방법을 변형하여 이용하였다. 시료 100㎎을 액체질소를 이용하여 막자사발에 마쇄한 후 DNA 추출 완충액(extraction buffer)(100mM Tris-HCl(pH 8.0), 500mM NaCl 및 50mM EDTA), 400㎕와 2×CTAB buffer(2% CTAB, 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.4M NaCl, 20mM EDTA(pH 8.0) 및 1% PVP-40), β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 10mM 혼합용액 400㎕ 및 10% SDS 10㎕를 첨가하여 섞었다. 상기 시료를 1.5㎖ 튜브에 옮겨 65℃에서 20분간 반응시킨 후 5M KOAc(potassium acetate) 200㎕를 첨가하여 얼음에 20분간 처리하였다. 700㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol)(25:24:1 부피비)을 첨가한 후 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액 700㎕을 취한 뒤 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 상기 상층액과 부피비가 1:1이 되도록, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1 부피비)을 700㎕ 첨가하여 다시 14,000rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 얻어 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 차가운 이소프로페놀(isopropanol)을 첨가하여 -70℃에서 10분간 처리한 후, 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 70% EtOH 1㎖를 첨가하여 원심분리하였다. 상기 원심분리된 튜브에서 펠렛을 제외한 나머지를 버리고 건조시킨 후 멸균수 50㎕로 녹였다. 상기 시료에 RNase(10㎎/㎖) 2㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 이상 처리한 뒤 -20℃에서 저장하였다.
상기 추출한 DNA의 양 및 순도를 분광광도계(Spectrophotometer)(smartspec plus spectrophotometer 273 BR 02930)를 이용하여 측정하였다.
Cultivar Reported Parentage Year Released
Hongro Spur Earliblaze×Spur Golden Delicious 1988
Seokwang Mollie's Delicious×Gala 1995
Chukwnng Fuji×Mollie's Delicious 1992
Saenara Spur Earliblaze×Spur Golden Delicious 1997
Gamhong Spur Earliblaze×Spur Golden Delicous 1992
Hwahong Fuji×Sekaiichi 1992
Sunhong Hongro×Chukwang 2000
Seohong Tsugaru×Chukwang 2004
Summer Dream Tsugaru×Natsumidori 2005
Honggeum Senshu×Hongro 2004
Manbok Earliblaze×Fuji 2006
Hongso Yoko×Hongro 2006
Hongan Fuji×Jonathan 2006
Picnic Fuji×Sansa 2008
Yeohong Jonathan×Fuji 2007
Danhong Sport of Fuji 2008
Hwayoung Sport of Fuji 2008
Greenball Golden Delicious×Fuji 2008
Hwangok Kougetsu×Yataka Fuji 2009
Hwasa Mollie's Delicious×Fuji 2009
Summer King Fuji×Golden Delicious 2010
Arisoo Yoko×Senshu 2010
실시예 1-2. SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 선발
국내 육성 사과 품종 22개를 판별하기 위하여, 상기 22 품종과 이의 교배친 16개 품종을 포함한 총 38품종의 유전적 다양성을 분석하기 위하여, 하기와 같은 2가지 방법으로 SSR 검출용 프라이머 세트를 선발하였다.
보다 구체적으로, 첫번째 방법으로 HiDRAS(High-quality Disease Resistant Apples for a Sustainable Agriculture)에 보고된 300개의 SSR 프라이머에서 선별하였다.
또한, 두번째 방법으로 골든 딜리셔스(Golden Delicious) 사과 품종의 전장 서열(NCBI GenBank Assembly ID: GCA_000148765.2)에 근거하여 SSR 프라이머를 제작하였다. 보다 구체적으로, NCBI taxonomy에서 사과 학명(malus domestica)을 검색하여 genomic DNA에 관련된 프로젝트를 선택하고, 크로모좀(chromosome) 염기서열 분석 정보를 다운 받아, SSR 프라이머를 감지해내는 프로그램 언어 펄(perl)을 이용하여 반복되는 염기 서열 부분을 찾았다. 상기 감지된 SSR 프라이머 정보 중 동일한 크로모좀 상의 유사한 영역 또는 다른 크로모좀에 위치했지만 유사한 영역을 90% 이상 제거하였다. 최종 SSR 프라이머 영역을 도출하여 6,442개의 SSR 프라이머를 개발하고, 다른 프라이머와 중복되는 227개를 제거하여, 17개의 크로모좀 별로 선발하여 총 6,165개의 SSR 프라이머를 선발하였다(표 2). 이 중 15개의 SSR 프라이머 세트를 품종간의 다형성(polymorphism) 테스트를 기반으로 선택하였다. 상기 프라이머의 사이즈 범위(mer)는 18 내지 22이며, 온도 범위는 58 내지 64℃이고, GC 함량 범위는 40 내지 60이며, PCR 산물 크기는 100 내지 250bp가 되도록 하였다. 골든 딜리셔스 품종을 기반으로 제작한 SSR 프라이머를 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 HiDRAS에 보고된 300여개의 SSR 프라이머 중에서 CH05g08(서열변호 31 및 32), Hi07d08(서열변호 33 및 34), Hi04e04(서열변호 35 및 36), CH04e03(서열변호 37 및 38), CH03d07(서열변호 39 및 40), Hi05b09(서열변호 41 및 42) 및 CH03d08(서열변호 43 및 44)의 총 7개 SSR 프라이머 세트를 선별하였다.
또한, 골든 딜리셔스 사과 품종을 바탕으로 제작한 SSR 프라이머는 KFBG-2(서열변호 1 및 2), KFBG-4(서열변호 3 및 4), KFBG-7(서열변호 5 및 6), KFBG-9(서열변호 7 및 8), KFBG-11(서열변호 9 및 10), KFBG-12(서열변호 11 및 12), KFBG-13(서열변호 13 및 14), KFBG-16(서열변호 15 및 16), KFBG-20(서열변호 17 및 18), KFBG-24(서열변호 19 및 20), KFBG-26(서열변호 21 및 22), KFBG-32(서열변호 23 및 24), KFBG-36(서열변호 25 및 26), KFBG-43(서열변호 27 및 28) 및 KFBG-45(서열변호 29 및 30)의 총 15개의 SSR 프라이머 세트를 선별하였다.
따라서, 국내 육성 사과 품종 22개를 판별하기 위한 총 22쌍의 SSR 프라이머를 선발하였다

Chromosome
Detected SSR markers		 After remove overlap

SSR markers		 Percentage of overlap

(%)
Chr1 335 329 1.8
Chr2 436 417 4.6
Chr3 393 381 3.1
Chr4 273 262 4.2
Chr5 406 389 4.4
Chr6 296 285 3.9
Chr7 319 309 3.2
Chr8 381 364 4.7
Chr9 401 384 4.4
Chr10 409 390 4.9
Chr11 454 442 2.7
Chr12 387 368 5.2
Chr13 443 422 5.0
Chr14 373 344 8.4
Chr15 551 517 6.6
Chr16 267 258 3.5
Chr17 318 304 4.6
Total 6,442 6,165 4.5
Mean 378.9 362.6 4.5
Marker 서열번호 F/R Sequence
5'-3'
KFBG-2 1 F CTG GAG AAA GGA TCT TGA GAA
GTT GTG GCT TAG ACA TTT GCA
2 R
KFBG-4 3 F CTA GCC GAC ATT CAC CTC TC
GTT CTT CAG CGC ACT GGA GTT
4 R
KFBG-7 5 F CTG AAT ATA CTC CCT GCC AAC
GTT GGT GCA GCA CGC TGA CAA
6 R
KFBG-9 7 F GAT GCA GGC TCG GAT TGT AA
GTT TGA GTT GTT CTG CTA AGC
8 R
KFBG-11 9 F GAG AAT AGT CCT AAG CAG CAG
GTG TTA GTC CTC CCA TTA AGA
10 R
KFBG-12 11 F TTA GTT TGC GGA TTG ACA GGG A
GTG AAT CAG TGT CTT CCA GGT T
12 R
KFBG-13 13 F GTA GAC GGC TTG ACA AAT CAC
GTC TTC CAG TTC CGA GCT TAC
14 R
KFBG-16 15 F TTC TTG GGT GTG GCC GTA CAA
GTG AAA TGA CGA TGC TGC CCT
16 R
KFBG-20 17 F GGA GCC AGT ATC GTC CTC TC
GTG CTG CCA TGC CTA GTG AAC
18 R
KFBG-24 19 F TGA GAA CGT TTT GTA GGG AAG
GTT TAA TCT CAC CTG ATG AGG A
20 R
KFBG-26 21 F TAC TTT ATG CTG AGC TGG CAC
GTG TGT TCC TAG GCT CTA ATC
22 R
KFBG-32 23 F GTG GTG CTC ATT CGT CAA AGA
GTG CGC ATA TCC GAC TTC AC
24 R
KFBG-36 25 F GTC AAT TAG GCA CCA AGT TTA G
GTC AGG GAG GCC ATA GTT TCA
26 R
KFBG-43 27 F TCA CGA TTA AGT CAT GTC AGC
GTA ATT TGA CCA TCG TGG GCA
28 R
KFBG-45 29 F ATG TTA TCG AGC GAG TAG TCA
GTT CAG GAG ATT GAG GGA TGA
30 R
CH05g08 31 F CCA AGA CCA AGG CAA CAT TT
CCC TTC ACC TCA TTC TCA CC
32 R
Hi07d08 33 F TGA CAT GCT TTT AGA GGT GGA C
GTT TGA GGG GTG TCC GTA CAA G
34 R
Hi04e04 35 F GA CCA CGA AGC GCT GTT AAG
GTT TCG GTA ATT CCT TCC ATC TTG
36 R
CH04e03 37 F TTG AAG ATG TTT GGC TGT GC
TGC ATG TCT GTC TCC TCC AT
38 R
CH03d07 39 F CAA ATC AAT GCA AAA CTG TCA
GGC TTC TGG CCA TGA TTT TA
40 R
Hi05b09 41 F AAA CCC AAC CCA AAG AGT GG
GTT TCT AAC GTG CGC CTA ACG TG
42 R
CH03d08 43 F CAT CAG TCT CTT GCA CTG GAA A
TAG GGC TAG GGA GAG ATG ATG A
44 R
실시예 2. SSR 분석
상기 실시예 1-1에서 추출한 사과 시료의 DNA 및 상기 실시예 1-2에서 선별한 SSR 프라이머 세트를 이용하여 SSR 분석을 하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR) 증폭을 수행하기 위하여 반응 혼합물은 20ng 주형 DNA(template DNA), 각 10μM 실시예 1-2에서 선발한 하기 표 2에 나타낸 SSR 프라이머, 5㎕의 2×Hot Taq Master Mix (PKT)을 이용하였고 최종 부피가 10㎕이 되도록 하였다. PCR은 94℃에서 5분 동안 전-변성(pre-denaturation) 단계, 94℃에서 30초 조건으로 35주기, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분; 및 72℃에서 7분 연장 단계로 수행하였다. 상기 증폭된 PCR산물을 확인하기 위하여 자동모세관 겔 영동장치(Fragment AnalyzerTM, Advanced Analytical Technologies, Inc, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 3. SSR 분석을 통한 국내 육성 사과 품종간 다형성 탐색
선발된 SSR 프라이머 세트 22개를 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개를 판별하기 위하여, 이의 교배친 16개 품종을 포함한 총 38 품종의 대립인자 수(No. of alleles), 대립인자의 분자량 크기 범위 (Range of allele size(bp)), 유전자 다양성(Genetic diversity) 및 다형성 정보 함량 (Polymorphic information content, PIC) 값을 구하기 위하여, 하기와 같은 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, SSR 단편 산물은 PRO Size 2.0 소프트웨어(Advanced Analytical Technologies Inc., USA)를 이용하여 데이터 적용하기 위해 적절한 포맷으로 바꾸어 대립인자 분자량 크기 범위를 측정하였으며, 자동모세관 겔 영동장치(Fragment Analysis)에 샘플 분석 시 대립인자 크기를 ±2-bp 오차 범위로 두어 이용하였다.
또한, 22개의 SSR 프라이머 세트의 다형성 밴드로 다형성 정보 함량(polymorphism information content, PIC)을 계산하였다. PIC 값은 유전자좌에서 대립인자 다양성의 측정값을 나타낸다. PCR-기반 프라이머는 하기 수학식 1로 계산하였으며, Pij는 j의 PCR 패턴의 빈도를 나타낸다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Figure pat00001
Marker No. of alleles Range of allele size(bp) Genetic diversity PIC
KFBG-2 17 242 - 273 0.8923 0.8833
KFBG-4 13 172 - 236 0.8608 0.8453
KFBG-7 25 212 - 260 0.9467 0.9441
KFBG-9 17 211 - 235 0.9048 0.8970
KFBG-11 13 189 - 212 0.8767 0.8643
KFBG-12 6 144 - 152 0.6794 0.6222
KFBG-13 11 154 - 181 0.8310 0.8166
KFBG-16 22 154 - 268 0.9172 0.9115
KFBG-20 13 189 - 211 0.8165 0.7956
KFBG-24 12 235 - 280 0.8051 0.7813
KFBG-26 11 183 - 241 0.8310 0.8112
KFBG-32 9 170 - 235 0.8134 0.7882
KFBG-36 19 217 - 248 0.8954 0.8870
KFBG-43 20 226 - 255 0.9103 0.9039
KFBG-45 24 156 - 182 0.9301 0.9259
CH05g08 25 165 - 198 0.9335 0.9297
Hi07d08 13 176 - 190 0.8729 0.8603
Hi04e04 24 174 - 261 0.9356 0.9319
CH04e03 26 173 - 228 0.9387 0.9354
CH03d07 28 171 - 221 0.9404 0.9374
Hi05b09 14 122 - 140 0.8681 0.8547
CH03d08 16 118 - 139 0.8847 0.8745
Mean 17 118 - 280 0.8766 0.8637
표 4에 나타낸 바와 같이, 총 378개의 다형성 대립인자가 증폭되었으며, 각 SSR 프라이머 세트 당 대립인자 수는 6 내지 28로, 평균 17개임을 확인하였다. 유전자좌 당 PIC 값은 KFBG-12(서열번호 11 및 12) 프라이머 세트에서 0.6222로 나타났고, 이로부터 CH03d07(서열번호 39 및 40) 프라이머 세트까지 0.9374까지의 범위임을 확인하였다. 또한, PIC 평균 값은 0.8637임을 확인하였다.
실시예 4. SSR 분석을 통한 국내 육성 사과 품종간 유전적 유연관계 분석
선발된 22쌍의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개의 판별을 위해, 상기 22 품종과 이의 교배친 16개 품종을 포함한 총 38품종의 유전적 유연 관계 분석을 하기와 같이 수행하였다.
기본적인 유전적 유연관계 다이어그램은(primary genetic relationship diagram) 근연접합법(neighbor-joining method)의 C.S. Chord (1967) 거리 함수(distance function)에 의해 수득한 유전적 거리(genetic distances)를 이용하여 그렸다. 최종 다이어그램(diagram)은 PowerMarker V3.25(Bioinformatics program in North Carolina State University) 및 트리뷰(TreeView)를 이용하여 그렸다. 품종간 유전적 유연관계를 바탕으로, 38개의 품종을 크게 6개의 그룹으로 분류하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 제Ⅰ그룹에는 갈라(Gala, 뉴질랜드에서 기원); 몰리스 딜리셔스(Molie's Delicious, 미국에서 기원); 아리수(Arisoo, Yoko×Senshu); 츠가루(Tsugaru, 일본에서 기원); 화사(Hwasa, Mollie's Delicious× Fuji); 섬머 킹(Summer king, Fuji×Golden Delicious); 코게츠(Kougetsu, 일본에서 기원); 및 황옥(Hwangok, Kougetsu×Yataka Fuji) 품종이 포함되었다.
제Ⅱ그룹은 여홍(Yeohong, Jonathan×Fuji); 서홍(Seohong, Tsugaru×Chukwang); 만복(Manbok, Earliblaze×Fuji); 얼리블레이즈(Earliblaze, 미국에서 기원); 스퍼 얼리블레이즈(Spur Earliblaze, 미국에서 기원); 홍소(Hongso, Yoko×Hongro); 요코(Yoko, 미국에서 기원); 및 나츠미도리(Natsumidori, 일본에서 기원) 품종이 포함되었다.
제Ⅲ그룹은 골든 딜리셔스(Golden Delicious, 미국에서 기원); 선홍(Sunhong, Hongro×Chukwang); 감홍(Gamhong, Spur Earliblaze×Spur Golden Delicous); 스퍼 골든 딜리셔스(Spur Golden Delicious, 미국에서 기원); 및 추광(Chukwang, Fuji×Gollie's Delicious) 품종이 포함되었다.
제Ⅳ그룹은 섬머 드림(Summer Dream, Tsugaru×Natsumidori); 서광(Seokwang, Mollie's Delicious×Gala); 화홍(Hwahong, Fuji×Sekaiichi); 홍안(Hongan, Fuji×Jonathan); 산사(Sansa, 일본에서 기원); 조나단(Jonathan, 미국에서 기원); 피크닉(Picnic, Fuji×Sansa); 그린볼(Greenball, Golden Delicious×Fuji); 화영(Hwayoung, Sport of Fuji); 및 단홍(Danhong, Sport of Fuji) 품종이 포함되었다.
제Ⅴ그룹은 홍로(Hongro, Spur Earliblaze×Spur Golden Delicious); 센슈(Senshu, 일본에서 기원); 및 세카이치(Sekaiichi, 일본에서 기원) 품종이 포함되었다.
제Ⅵ그룹은 새나라(Saenara, Spur Earliblaze×Spur Golden Delicious); 홍금(Honggeum, Senshu×Hongro); 야다카 후지(Yadaka Fuji, 일본에서 기원); 및 후지(Fuji, 일본에서 기원) 품종이 포함되었다.
이에 따라, 한국에서 육성된 품종 및 이의 교배친 16 품종 대부분은 같은 그룹에서 나누어졌음을 확인하였다. 따라서, 국내 육성 사과 품종 22개 사이의 유전자 유연관계는 이미 알려진 계통(pedigree)과 기본적으로 일치함을 확인하였다.
실시예 5. SSR 프라이머 세트를 이용한 국내 육성 사과 품종 판별
5-1. SSR 프라이머 세트를 이용한 국내 육성 사과품종 판별
선발된 22쌍의 SSR 프라이머 세트를 이용한 국내 육성 사과 품종 22개를 판별하기 위하여, 상기 22 품종과 이의 교배친 16개 품종을 포함한 총 38품종의 대립유전자의 크기 확인을 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 선발한 총 22개의 프라이머 세트를 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개와 이의 교배친 16개 품종을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 PCR한 후, 자동모세관겔영동장치(Fragment AnalyzerTM, Advanced Analytical Technologies, Inc, USA)를 이용하여 전기영동 한 뒤, Pro size 2.0을 이용하여 분석하여, 각 프라이머 세트에 대한 각 품종별로 확인된 대립유전자의 크기(base pair, bp)를 확인하였다. 또한, 품종 판별을 위해 프라이머 세트별로 확인된 bp 중 유전자형 결과가 특이적인 품종을 판별해 내어, 단일 프라이머로는 판별 되지 않을 경우 2개 이상을 조합하여 국내 육성 사과 품종을 판별하여 확인된 bp를 확인하였다(도 2a, 도 2b 및 도 2c). 상기 도 2a, 도 2b 및 도 2c에서 나타낸 22개의 프라이머 세트를 이용하여 판별한 국내 육성 사과 품종의 SSR 데이터의 정확도를 확인하기 위하여, 본 발명에서 추정된 대립인자와 공지된 유전자형 혈통을 비교하였다. 그 결과를 도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 국내 육성 사과 품종 22개와 SSR 프라이머 세트 22개 사이에서, 혈통 76% (337/440)가 일치함을 확인하였다.
5-2. 최소한의 SSR 프라이머 세트를 이용한 국내 육성 사과품종 판별
최소한의 프라이머 세트만으로 국내 육성 사과 품종 22개가 판별 가능한지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 선발한 총 22개의 프라이머 세트를 이용하여 국내 육성 사과 품종 22개 및 이의 교배친 품종 16개를 상기 실시예 2와 같은 방법으로 PCR한 후, 자동모세관 겔 영동장치(Fragment AnalyzerTM, Advanced Analytical Technologies, Inc, USA)를 이용하여 전기영동 한 뒤, Pro size 2.0을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Marker combination Distinguishable pairs (no.)
Observed not observed
CH03d07 24 14
CH03d07 + KFBG-7 14 0
도 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 체세포 변이(somatic mutants)를 제외한 나머지 국내 육성 사과 품종의 성공적인 분화는 CH03d07 (서열변호 39 및 40) 및 KFBG-7(서열변호 5 및 6) SSR 프라이머 세트를 이용하여 판별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 세 품종의 parent-offspring relationship
아직 혈통이 정확히 알려지지 않은 감홍(Gamhong), 홍안(Hongan) 및 그린볼(Green Ball)의 혈통을 찾기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법을 이용하여, S-genotype(Heo et al.,(2011), Environ. Biotechnol. 52(2): 158-162)을 기반으로 상기 세 품종의 후보 품종을 선발하였다. 감홍 (S1S9) 품종은 요코(Yoko)(S3S9), 후지(Fuji)(S1S9), 세카이치(Sekaiichi)(S3S9), 추광(Chukwang)(S3S9) 및 조나단(Jonathan)(S7S9)을 후보 혈통 품종으로서 선발하였다.
또한, 홍안(S1S3) 품종은 스퍼 골든 딜리셔스(Spur Golden Delicious)(S1S3), 홍로(Hongro)(S1S3), 츠가루(Tsugaru)(S3S7) 및 나츠미도리(Natsumidori)(S3S9)를 후보 혈통 품종으로서 선발하였다.
또한, 그린볼(Green Ball)(S3S7) 품종은 몰리스 딜리셔스(Molie? Delicious) (S3S7), 츠가루(Tsugaru)(S3S7), 조나단(Jonathan)(S7S9) 및 산사 (Sans)(S5S7)를 후보 혈통 품종으로서 선발하였다. 상기 세 품종의 혈통을 분석하기 위하여, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 선발한 SSR 프라이머를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
Cultivar Reported parents Our results
Gamhong(S1S9) Spur Earliblaze(S1S19)×Spur Golden Delicious(S2S3) Spur Earliblaze(S1S19)×Fuji(S1S9)
Hongan(S1S3) Fuji(S1S9)×Jonathan(S7S9) Fuji(S1S9)×Hongro(S1S3) or Natumidori (S3S9)
Green Ball(S3S7) Golden Delicious(S2S3)×Fuji(S1S9) Golden Delicious(S2S3)×Jonathan(S7S9)
표 6에 나타낸 바와 같이, 22개의 SSR프라이머 분석 결과, 감홍 품종의 각 유전자좌에 대한 하나의 대립인자는 CH03d08(서열번호 43 및 44) SSR 프라이머를 제외하고 후지 품종에서 유래되었음을 확인하였다.
또한, 홍안 품종은 두 개의 가능한 혈통을 확인하였다. 그 중 하나는, 홍안 품종의 각 유전자좌에 대한 하나의 대립인자는 KFBG-7(서열번호 5 및 6) 및 KFBG-24(서열번호 19 및 20) SSR 프라이머 세트를 제외하고 홍로 품종에서 유래되었음을 SSR 프라이머 분석 결과로서 확인하였다. 또 다른 것은 홍안 품종의 각 유전자 좌에 대한 하나의 대립인자는 KFBG-45(서열번호 29 및 30) 및 CH04e03(서열번호 35 및 36) SSR 프라이머를 제외하고, 나츠미도리 품종에서 유래되었음을 SSR 프라이머 분석 결과로서 확인하였다.
또한, 그린볼 품종의 각 유전자좌에 대한 하나의 대립인자는 조나단 품종에서 유래되었음을 확인하여, 그린볼은 골든딜리셔스 및 조나단 품종에서 유래되었음을 SSR 프라이머 분석 결과로서 확인하였다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> SSR primer derived from apple and use thereof <130> KNU1.187 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-2 forward primer <400> 1 ctggagaaag gatcttgaga a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-2 reverse primer <400> 2 gttgtggctt agacatttgc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-4 forward primer <400> 3 ctagccgaca ttcacctctc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-4 reverse primer <400> 4 gttcttcagc gcactggagt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-7 forward primer <400> 5 ctgaatatac tccctgccaa c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-7 reverse primer <400> 6 gttggtgcag cacgctgaca a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-9 forward primer <400> 7 gatgcaggct cggattgtaa 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-9 reverse primer <400> 8 gtttgagttg ttctgctaag c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-11 forward primer <400> 9 gagaatagtc ctaagcagca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-11 reverse primer <400> 10 gtgttagtcc tcccattaag a 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-12 forward primer <400> 11 ttagtttgcg gattgacagg ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-12 reverse primer <400> 12 gtgaatcagt gtcttccagg tt 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-13 forward primer <400> 13 gtagacggct tgacaaatca c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-13 reverse primer <400> 14 gtcttccagt tccgagctta c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-16 forward primer <400> 15 ttcttgggtg tggccgtaca a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-16 reverse primer <400> 16 gtgaaatgac gatgctgccc t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-20 forward primer <400> 17 ggagccagta tcgtcctctc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-20 reverse primer <400> 18 tactttatgc tgagctggca c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-24 forward primer <400> 19 tgagaacgtt ttgtagggaa g 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-24 reverse primer <400> 20 gtttaatctc acctgatgag ga 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-26 forward primer <400> 21 tactttatgc tgagctggca c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-26 reverse primer <400> 22 gtgtgttcct aggctctaat c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-32 forward primer <400> 23 gtggtgctca ttcgtcaaag a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-32 reverse primer <400> 24 gtgcgcatat ccgacttcac 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-36 forward primer <400> 25 gtcaattagg caccaagttt ag 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-36 reverse primer <400> 26 gtcagggagg ccatagtttc a 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-43 forward primer <400> 27 tcacgattaa gtcatgtcag c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-43 reverse primer <400> 28 gtaatttgac catcgtgggc a 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-45 forward primer <400> 29 atgttatcga gcgagtagtc a 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KFBG-45 reverse primer <400> 30 gttcaggaga ttgagggatg a 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH05g08 forward primer <400> 31 ccaagaccaa ggcaacattt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH05g08 reverse primer <400> 32 cccttcacct cattctcacc 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi07d08 forward primer <400> 33 tgacatgctt ttagaggtgg ac 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi07d08 reverse primer <400> 34 gtttgagggg tgtccgtaca ag 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi04e04 forward primer <400> 35 gaccacgaag cgctgttaag 20 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi04e04 reverse primer <400> 36 gtttcggtaa ttccttccat cttg 24 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH04e03 forward primer <400> 37 ttgaagatgt ttggctgtgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH04e03 reverse primer <400> 38 tgcatgtctg tctcctccat 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH03d07 forward primer <400> 39 caaatcaatg caaaactgtc a 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH03d07 reverse primer <400> 40 ggcttctggc catgatttta 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi05b09 forward primer <400> 41 aaacccaacc caaagagtgg 20 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hi05b09 reverse primer <400> 42 gtttctaacg tgcgcctaac gtg 23 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH03d08 forward primer <400> 43 catcagtctc ttgcactgga aa 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH03d08 reverse primer <400> 44 tagggctagg gagagatgat ga 22

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 및 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사과품종 판별을 위한 SSR(simple sequence repeat) 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍으로 이루어진 것인, 사과품종 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 사과속(Malus sp.) 식물로부터 유래된 것인, 사과품종 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 30으로 표시되는 프라이머 쌍은 골든 딜리셔스(golden delicious) 품종으로부터 유래된 것인, 사과품종 판별을 위한 SSR 검출용 프라이머 세트.
  5. (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 제1항의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 사과의 품종 판별방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것인 사과의 품종 판별방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것인 사과의 품종 판별방법.
  8. 제1항의 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 조성물.
  9. 제1항의 SSR 검출용 프라이머 세트를 포함하는 사과 품종 판별용 키트.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180046907A (ko) * 2016-10-28 2018-05-09 경북대학교 산학협력단 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물
CZ309548B6 (cs) * 2019-07-19 2023-04-05 VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110074204A (ko) * 2009-12-24 2011-06-30 대한민국(농촌진흥청장) 사과의 품종 판별용 ｓｃａｒ 표지 및 이의 용도
KR20130013464A (ko) * 2011-07-28 2013-02-06 경상북도(농업기술원) 감 품종 판별용 프라이머 세트

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110074204A (ko) * 2009-12-24 2011-06-30 대한민국(농촌진흥청장) 사과의 품종 판별용 ｓｃａｒ 표지 및 이의 용도
KR20130013464A (ko) * 2011-07-28 2013-02-06 경상북도(농업기술원) 감 품종 판별용 프라이머 세트

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank CP003642.1, 2013.07.22. *
이창후 등. 농업특정연구과제 연구보고서, 과수품종 구별을 위한 표지개발(Development of DNA Marker for Identification of Fruit). 주관연구기관: 고려대학교 생명환경과학대학, 2004.* *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180046907A (ko) * 2016-10-28 2018-05-09 경북대학교 산학협력단 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물
CZ309548B6 (cs) * 2019-07-19 2023-04-05 VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)

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