CZ309548B6 - Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) - Google Patents
Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309548B6 CZ309548B6 CZ2019-473A CZ2019473A CZ309548B6 CZ 309548 B6 CZ309548 B6 CZ 309548B6 CZ 2019473 A CZ2019473 A CZ 2019473A CZ 309548 B6 CZ309548 B6 CZ 309548B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- marker
- fluorescently labeled
- pcr amplification
- simultaneous detection
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Sada primerů pro stanovení genotypu jabloně Malus x domestica Borkh v jediné reakci metodou fragmentační analýzy, kteráobsahuje primery, jejichž sekvence jsou uvedeny na obr. 1.
Description
Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Oblast techniky
Řešení se týká sady primem pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy a způsobů jejího použití pro odlišení jednotlivých genetických variant jabloní.
Dosavadní stav techniky
Jabloň domácí (Malus x domestica Borkh.) je velmi důležitou zemědělskou komoditou, která patří mezi 20 nejproduktivnějších plodin na světě měřeno výnosem v tunách. Je pěstována převážně v oblastech mírného pásu na severní i jižní polokouli. Největším světovým pěstitelem je Čína, největším exportérem pak Polsko. Na konci minulého století bylo na světě popsáno více než 10 000 různých odrůd (Janick J, 1996) a nové neustále přibývají z důvodu snahy vylepšit současné odrůdy, ať už z hlediska zvyšování rezistence k nej častějším jablečným patogenům, nebo z hlediska zlepšování jakosti plodů a ekonomiky jejich pěstování a skladování.
Jabloň domácí patří mezi cizosprašné rostliny, po opylení tedy vzniká hybridní genetický materiál nesoucí DNA pocházející od obou rodičů. Oproti tomu jsou odrůdy jabloní udržovány a množeny vegetativně roubováním, popřípadě očkováním na vhodné podnože, takže genetická informace je při tomto způsobu množení odrůd zachovávána beze změny a odpovídá původnímu zdrojovému organizmu. Jednotlivé odrůdy lze tak jednoznačně charakterizovat na úrovni DNA tzv. genotypizací. Znalost příslušných genotypů je pak možné využít např. pro ověřování pravosti odrůd jabloní, sledování segregace v potomstvu, stanovení rodičovské příbuznosti, fýlogenetické studie aj.
Genom jabloně domácí byl poprvé publikován v roce 2010 (Velasco R, 2010) a poté byl resekvenován na dvojitém haploidu v roce 2017 (Daccord N, 2017), kdy došlo ke zpřesnění jeho sekvence a celkové délky (přibližně 650 Mbp). Díky těmto pracím bylo zjištěno, že genom jabloně je značně složitý, a to z důvodu poměrně nedávné částečné duplikace genomu, kdy z původních 9 chromozómů vzniklo nynějších 17 chromozómů základní sady. V dřívějších dobách navíc došlo k rozsahově menším duplikacím některých částí genomu. Z tohoto důvodu se velké úseky sekvencí vyskytují na různých místech genomu, což velmi komplikuje molekulárně genetickou analýzu genomu jabloně. Další komplikací může být nestejný počet sad chromozómů vyskytující se u různých odrůd. Většina odrůd jabloně je diploidních, přibližně 10 % však tvoří triploidní odrůdy, vzácně se vyskytují dokonce i tetraploidní odrůdy (Janick J, 1996).
Pro charakterizaci jednotlivých odrůd nebo hybridů lze s výhodou využít genotypování pomocí SSR markérů (simple sequence repeats), kdy se využívá délkového polymorfýsmu jednotlivých alel, který lze jednoduše detekovat metodou fragmentační analýzy (obecné pojednání o SSR markérech a jejich použití pro genotypizací u rostlin lze nalézt např. ve Vieira ML, 2016). Metoda fragmentační analýzy sestává z kroků: 1) izolace DNA testovaného organizmu; 2) specifická PCR pro jednotlivé SSR markéry a 3) stanovení délky příslušných amplikonů, nejčastěji a nejpřesněji pomocí kapilární elektroforézy.
Pro jabloně byla nalezena řada SSR markérů vhodných pro genotypizací, popřípadě jiné účely, ale z důvodu srovnatelnosti výsledků mezi jednotlivými pracovišti je vhodné používat standardizovanou sadu. První sada využívala 12 SSR markérů amplifikováných ve třech multiplexed!, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry, avšak při použití těchto 12 SSR markérů byla při analýze 2162 odrůd jabloní pěstovaných v East Mailing Research (Velká Británie) identifikována řada odrůd se shodným genotypem. Část z nich tvořily známé klony a shoda genotypů u nich byla očekávána, u dalších se mohlo jednat o neznámé/nežádoucí duplicity
- 1 CZ 309548 B6 v genofondu, ale též o náhodnou shodu v daných SSR markérech bez ohledu na příbuznost. Autoři proto doporučili pečlivé fenotypické porovnání a dodatečnou analýzu dalších SSR markérů pro odlišení těchto odrůd (Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010; Fernandez F, 2013). I přes nedostatky uvedené výše byla sada těchto 12 SSR markérů a postup jejich identifikace schváleny Evropským kooperativním programem pro rostlinné genetické zdroje (ECPGR; www.ecpgr.cgiar.org/working-groups/maluspyrus) jako standardizovaný protokol pro identifikaci jabloní pro srovnatelnost výsledků mezi jednotlivými pracovišti.
V další studii proběhlé na jabloních byla pro snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými odrůdami tato sada rozšířena na 16 SSR markérů (Urrestarazu J, 2016), takže došlo k řádovému snížení možnosti genetické shody mezi odlišnými vzorky. Nevýhody této sady jsou však následující: 1) Sada 16 SSR markérů byla analyzována ve čtyřech multiplexed!, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry. Pro charakterizaci jednoho vzorkuje tak nutné provést čtyři nezávislé analýzy, což analýzu značně prodražuje, zvyšuje se časová náročnost i pracnost celého postupu i pravděpodobnost vzniku chyby. 2) V sadě 16 SSR markérů jsou dva (Hi02c07; CH-Vfl), které se nacházejí na stejném chromozomu 1. Pro vyloučení vlivu vazby mezi jednotlivými markéry je však vhodnější, aby každý marker pocházel z jiného chromozomu. 3) Sada 16 SSR markérů tak pokrývá pouze 15 chromozomů z celkových 17. Pro další snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými vzorky by proto bylo výhodné použít sadu 17 SSR markérů, z nichž každý pochází z jiného chromozomu, a pro omezení nákladů, pracnosti a možnosti vzniku chyb by bylo výhodné provádět analýzu všech 17 SSR markérů v jediné reakci.
Podstata vynálezu
Nedostatky dle současného stavu techniky - nevyužívání markérů, které by ležely každý na jiném chromozomu - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá vtom, že byl vypuštěn druhý marker z chromozomu 1 (CH-Vfl) a nově byly zařazeny markéry NZ01a6 pro chromozom 4 a CH05e04 pro chromozom 16; ostatní markéry doporučené ECPGR byly zachovány pro zajištění zpětné kompatibility výsledků.
Nedostatky dle současného stavu techniky - zejména nezbytnost provádět čtyři nezávislé analýzy pro charakterizaci každého vzorku a s tím související finanční a časová náročnost, pracnost a potenciálně vyšší chybovost - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
-2CZ 309548 B6
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZ01a6 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05f06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA,
-3CZ 309548 B6 přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhlO obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01f03b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02cll obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01f02 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI47 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC,
-4CZ 309548 B6 přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhOl obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
Výše uvedené primery SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 15 a SEQ ID NO. 33 vykazují homologii vyšší než 90 % k primerům z Liebhard R, 2002. V tomto dokumentu však autoři neuvažovali použít primery k vytvoření systému pro současnou detekci všech markérů v jediné reakci; výše uvedené primery pro amplifikaci příslušných SSR markérů byly navíc použity v kombinaci s jinými párovými primery než v citovaném dokumentu; a míra shody výše citovaných primem s primery dle tohoto vynálezu je koincidencí, neboť ve všech případech je příslušná genomická oblast výhodná pro návrh primem pro amplifikaci příslušného markem.
Výše uvedené kombinace primem pro amplifikaci jednotlivých SSR markem jsou vhodné pro současnou nebo individuální analýzu výše uvedených markem u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) metodou fragmentační analýzy. Ve výhodném provedení technického řešení jsou PCR amplikony příslušných SSR markem detekovány pomocí kapilární elektroforézy s tím, že každý amplikon je fluorescenčně označen. Fluorescenční označení amplikonů je zajištěno použitím fluorescenčně značeného primem v PCR reakci tak, aby bylo možné amplikon identifikovat. V ještě výhodnějším provedení technického řešení jsou amplikony označeny pomocí odlišných fluoro fórů pro jednotlivé SSR markéry v takové kombinaci, která umožňuje současnou detekci a jednoznačnou identifikaci všech 17 SSR markem v jedné reakci.
Návrh sady primem podle technického řešení pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) byl proveden v několika krocích: 1) analýza sekvencí použitých SSR markem, zejména s ohledem na výše uvedené duplikace genomu jabloně; 2) optimalizace kombinace délek amplikonů a fluorescenčního značení fragmentů, která by umožňovala současnou detekci všech 17 SSR markem vjedné reakci; 3) návrh primem pro detekci jednotlivých SSR markem; 4) optimalizace PCR podmínek.
- 5 CZ 309548 B6
Prvním krokem pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) je izolace genomové DNA, následuje PCR s využitím sady primem pro specifickou amplifikaci výše uvedených SSR markem a stanovení délky amplikonů pomocí fragmentační analýzy využívající kapilární elektroforézu. Finálním krokem je vyhodnocení přítomnosti jednotlivých alel pro každý SSR marker.
Příklady provedení vynálezu jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojeným nárokem a podrobně popsána v popisu vynálezu. Odborník v obom bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR, uvedených primem a fluorescenčního označení primem tak, aby nedošlo ke snížení specificity PCR detekce jednotlivých SSR markem. Odborník v obom bude schopen též snížit počet současně detekovaných SSR markem v jedné reakci, případně vytvořit nové kombinace detekovaných SSR markem pomocí uvedených primem v jedné reakci.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Návrh sekvencí primem
Do kolekce SSR markem byly přidány markéry pro chromozom 4 (NZOlaó; Guilford P, 1997) a chromozom 16 (CH05e04; Liebhard R, 2002), neboť jsou velmi polymorfní, a tak vhodné pro účely genotypování.
Pro detekci všech 17 SSR markem v jedné reakci byly navrženy nové primery pro PCR amplifikaci jednotlivých SSR markem tak, aby celý systém fůngoval ve své komplexnosti a amplifikované fragmenty měly správnou délku umožňující jejich jednoznačnou identifikaci pomocí fragmentační analýzy.
Sekvence jednotlivých SSR markem a jejich okolí byly získány z referenčního genomu jabloně domácí Malus x domestica Borkh., odrůda Golden Delicious, Annotation Version 102; Genome Reference Number: ASM211411vl.
Na základě homologií k dalším chromozomálním oblastem jabloně byly jednotlivé SSR markéry rozděleny do zamýšlených velikostních pásem amplifikovaných produktů v kombinaci s příslušnými fluorofory tak, aby bylo možné provést specifickou amplifikaci a detekci všech 17 SSR markem v jedné reakci.
Primery byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance. Při navrhování primem pro multiplexovou PCR analýzu byly zohledněny následující požadavky: 1) vysoká specificita primem eliminující necílené amplifikace z důvodu parciální duplikace genomu jabloně; 2) obdobná teplota tání všech primem; 3) eliminace tvorby dimerů mezi jednotlivými primery.
Přehled sekvencí primem, jejich nasedání na referenční sekvence a očekávané velikosti amplikonů pro jednotlivé SSR markéry pro příslušné chromozomy ukazuje tabulka 1.
Tabulka 1. Souhrnné informace o použitých primerech
-6CZ 309548 B6
| ChrD- HJ-DZOm | SSR markér | Velikojt- ELI páamo (bp) | SEQ ID NO. | Referenční sekvence v GenBank (pozice) | Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastup nj e A n ebo T) |
| 1 | HiO2eO7 Ůl· | 400-450 | SEQ ID NO. 1 | KC_041789.1 (17459006174589S2) | rCTACAACAAAAIACCCAATAC ACC |
| SEQ ID NO. í | NC_041789.1 (1745860717458627} | CTAAGCATCCCGAITGAAAGG | |||
| 2 | CH02c06 bj | 400-450 | SEQ ID NO. 3 | NC_041790.1 (2011732020117296) | AGTTTCGTAAGAGAACCTTGAT CTC |
| SEQ ID NO. 4 | KC_041790.1 (20116B9320116917) | ATCCACTTACTAAGAACTACCG TTG | |||
| 3 | GD12Ú1 | 300-350 | SEQ ID NO. 5 | KC_041791.1 (1669290816692931) | TTCTTCTATGAACGGTGAIAAA GC |
| SEQ ID NO. 6 | KC_041791.1 (1669321516693196) | GAATGTGAGGCGrrCCTGAG | |||
| 4 | NZMafi | 450-500 | SEQ ID NO. 7 | KC_041792.1 (2939965829399640) | AITCCCTGGCGAGAAAAGC |
| SEQ ID NO. 8 | KC_041792.1 (2939915829399177) | CTTGGTAGGIGTCGGAGCAG | |||
| 5 | CHD5fO6 | 400-450 | SEQ ID NO. 9 | NC_041793.1 (2237304822373028) | rAGATCCGGTCACTCTCCACT |
| SEQ ID NO. 10 | NC_041793.1 (2237264022372661} | AACACCCCATCAATCAGAAAG A | |||
| 6 | CHO3J0 7^ | 200-250 | SEQ ID NO. 11 | KC_041794.1 (8U362Ě-81136041 | rGTGAAAIGTAATTCAAATCAA TGC |
-7 CZ 309548 B6
| ChRiT můz&m | SSR marker | Vulikcetní písmo tbpl | SEQID NO. | Referenční eck vence v Gen Bank Ipoziu) | Sekvencí 5 -3 (dle iupac: w ustupuje A nebe T} |
| 7 | CHÍUťúí b1 | 200250 | SED to NO. 13 | NC 041785-1 (17314831-1731490» | gagaaqgctaacaůaaatstgg i |
| SEC JO NO. 14 | NC_041785-1 (17315070-1731 í 0511 | G CCnTGTAATCATGGCTCC | |||
| 0 | CrtDlhlO b] | 1QQ-15O | SEÚ ID NQ· 13 SEC IĎ NO. 1B | NC 041706.1 (27444000-27444029) NC 041786 1 (2744+G9&-27444570I | GCAAAGATAGGTAGAWATGCCA AASGAGGGATTGTTTGTGCA |
| g | CHŮ1ftJ3b | 100-150 1 | b SEQID NO. 17 SEQID NO. 18 | NC 041797.1 (972Í625-9725S44) Ν0_ϋ4Ί79?.1 (9725755-9725737) | AAAACCCTÁGC CCCACGGWj ACTC’CCATCGCGCTCCAC । |
| 10 | CH0ŽC11 t* | 400-450 | SEQID NO. 19 SEC ID NO. 20 | NC O4179É.1 (24201 &2-242βΐ875) NC-041790.1 (24262 GB 1-24262 LX Ti | CTCAGOTATTArTTTG’TTCTGCG GuflAACÁCÁTHATAGAAAMGGAGC | |
| 11 | w | 300-350 | SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO.ÍÍ | NC 041799.1 (9734415-9734437) NC 041 TM 1 (9734728-9704705) | GCTCrTCG4AAATGGCGTAC ATATTTGAQATTGGTGATGAGACG |
| 12 | 30(7350 | SEQ ID NC 041800.1 NO. 23 (33530441-23030411¾ SEQ ID NC 0410X1 ΝΩ 24 (23630139.2383016(¾ | GAGAAGAACAACAACAGAGAACG GAAATAGGGTAGCACCAGATGG | ||
| 13 | GDU7< | 300-350 | &EQ ID NC 041WU NO. 25 (ai4WO &149420i SEQID ND 041001.1 NO, 26 (3149730-8149711) | CAGTG^ACCC GCCAAATA7C GATCGGAAGGCGAAAGACTC | |
| 14 | CBO+bO? n | 30OÍ60 | SEQ ID NO. 27 SEQID NO. 28 | NC 041602.1 124205365-24205385) NC_O4l83ř.1 (2420558 i 24205582) | AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG CCCTGATGOCCTCCACTAAC |
| 15 | ChOídOS | 200-250 | SEQ JD NO. 29 | NGJMWD3-1 ¢50159446-50150469) | CAACnTGCTAADCTCTCATTGAA |
| 5EQ ID NO. 30 | NC 041633.1 150159630-50159553) | AGGATGACC1TGAGATTGATQC | |||
| 1. 16 | 10M5O | SEQ ID NO· 31 SEQID NO. 32 | NCJH1804-1 (4351657-4351078) Pre A WC 041004.1 (4351709-4351708) Pra T vlsslnl Bůkvůníř | TTGAACTTCGÁCCGČAACACCÁ ACATGGWIAAGGCATAGJCAGG । | |
| 17 I | CHOíhOl ta* | 100-153 L__ | SEQ ÍĎ NO- 33 SEQ ID NO. 34 | NU_04’005.1 (0601304-6601365) NC 041005.1 (56012WXC1201) | ŮAAA3 ACTTQ C AGTG3GAG C TTTAGGAGTGGGTFTGAGAAGG |
SSR markéry popsáiy v: al Silverberg-Dilworth E, ZOOS b) Lieotiard R 2002. ¢) Hckanson SC, 1990, d| Guilford P, 19&7
Příklad 2: Stanovení genotypu jabloně domácí (Malusx domestica Borkh.)
Pro amplifikaci SSR markérů byla použita DNA izolovaná z listů jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
-8CZ 309548 B6
Tabulka 2. Koncentrace a fluorescenční značení použitých primem
| Primer SEQ ID NO. | FluDre^EEiicDÍ značení | Výsledná koncentrace tAI |
| SEQ ID NO. 1 | - | 625 |
| SEQ ID NO. 1 | PET | 625 |
| SEOEDNO. 3 | víc | 750 |
| SEQ ED NO. 4 | - | 750 |
| SEOEDNO 5 | víc | 625 |
| SEQ ED NO. 6 | - | 625 |
| SEQ ID NO. 7 | NED | 250 |
| SEOEDNO. 8 | - | 250 |
| SEQ ED NO. 9 | NED | 375 |
| SEQ ID NO. 10 | - | 375 |
| SEO ID NO. 11 | FAM | 500 |
| SEQ ID NO. 11 | - | 500 |
| SEO ID NO. 13 | 312.5 | |
| SEQ ID NO. 14 | víc | 312,5 |
| SEQ ID NO. 15 | víc | 312,5 |
| SEO ID NO. 16 | 312.5 | |
| SEQ ID NO. 17 | PET | B7.5 |
| SEO ID NO. 18 | B7.5 | |
| SEQ ID NO. 19 | FAKÍ | 750 |
| SEQ ID NO. 10 | - | 750 |
| SEO ID NO. 11 | FAKÍ | 250 |
| SEQ ID NO. 11 | - | 250 |
| SEQ ID NO. 13 | NED | 212,5 |
| SEO ID NO. 14 | - | 212.5 |
| SEQ ID NO. 15 | PET | 312,5 |
| SEO ID NO. 16 | 312.5 | |
| SEQ ID NO. 17 | PET | 187,5 |
| SEQ ID NO. 18 | - | 187,5 |
| SEO ID NO. 19 | NED | 250 |
| SEQ ID NO. 30 | - | 250 |
| SEQ ID NO. 31 | FAKÍ | 187,5 |
| SEO ID NO. 31 | - | 187.5 |
| SEQ ID NO. 33 | NED | 162,5 |
| SEQ ID NO. 34 | - | 162,5 |
PCR amplifikace probíhala v PCR cyklem Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Výsledkem je získání spektra alel pro každý SSR marker, které je unikátní pro danou genetickou variantu jabloně.
Příklad 3: Ověření shodnosti dvou odrůd jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno porovnání dvou neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) s cílem zjistit, zda se jedná o stejnou odrůdu.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími
-9CZ 309548 B6 reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle tabulky 2 v příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů u obou vzorků jabloní bylo zjištěno, že oba vzorky vykazují stejné alely ve všech SSR markérech a jsou tedy geneticky shodné - oba vzorky jsou tedy stejná odrůda jabloně.
Příklad 4: Ověření identity odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno ověření identity neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), o kterých se majitel domníval, že se jedná o odrůdy „Fragrance“ a „Golden Delicious“.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle tabulky 2 v příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo zjištěno, že vzorek označený jako odrůda „Fragrance“ neodpovídá referenční odrůdě „Fragrance“ uchovávané v genofondech jabloní přihlašovatele; naopak vzorek označený jako „Golden Delicious“ vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Golden Delicious“.
Příklad 5: Určení neznámé odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno určení odrůdy u neznámého vzorku jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), u které nebyly známy další informace.
Z listů neznámého vzorku byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle tabulky 2 v příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
- 10CZ 309548 B6
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo ujištěno, že neznámý vzorek vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Boskoopské“.
Průmyslová využitelnost
Nově navržené primery byly optimalizovány pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy s využitím 17 SSR markérů. Rozšířená sada SSR markérů a nová sada primem oproti dosavadnímu stavu techniky zpřesňují, zrychlují a zlevňují genotypování jabloní, které je využitelné jak pro ověřování pravosti odrůd jabloní (např. ověřování školkařského materiálu, prověřování identity registrovaných odrůd jabloní, testování odrůdové pravosti prodávaných jablek), tak pro vědecké účely (např. cílené šlechtění).
Seznam použité literatury
Daccord N, Celton JM, Linsmith G, Becker C, Choisne N, Schijlen E, van de Geest H, Bianco L, Micheletti D, Velasco R, Di Pierro EA, Gouzy J, Rees DJG, Guérif P, Muranty H, Duřel CE, Laurens F, Lespinasse Y, Gaillard S, Aubourg S, Quesneville H, Weigel D, van de Weg E, Troggio M, Bucher E. High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development. Nature Genetics (2017) 49, 1099-1106.
Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010, http://sciencesearch.defra.gov.uk/Default.aspx?Menu=Menu&Module=More&Location=None& Completed=0&ProjectID=15150.
Fernandez FF. Common set of ECPGR SSR markers for Malus characterization. In: Lateur M., Ordidge M., Engels J. and Lipman E. Report of a Working Group on Malus/Pyms. Fourth Meeting, 7-9 March 2012, Weggis, Switzerland. Biodiversity International, Rome, Italy (2013) 26-27.
Guilford P, Prakash S, Zhu JM, Rikkerink E, Gardiner S, Bassett H, Forster R. Microsatellites in Malus X domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics (1997) 94(2), 249-254.
Hokanson SC, Szewc-McFadden AK, Lamboy WF, McFerson JR. Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malus x domestica Borkh. core subset collection. Theor Appl Genet. (1998) 97, 671-83.
Janick J, Moore JN. Fruit breeding. Volume I: Tree and Tropical Fruits. New York: Wiley (1996).
Liebhard R, Gianfranceschi L, Koller B, Ryder CD, Tarchini R, van de Weg E, Gessler C. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.). Mol Breed. (2002) 10(4):217-41.
Silfverberg-Dilworth E, Matasci CL, van de Weg WE, van Kaauwen MPW, Walser M, Kodde LP, Soglio V, Gianfranceschi L, Duřel CE, Costa F, Yamamoto T, Koller B, Gessler C, Patocchi A. Microsatellite markers spanning the apple (Malus x domestica Borkh.) genome. Tree Genet Genomes. (2006) 2, 202-24.
Urrestarazu J, Denancé C, Ravon E, Guyader A, Guisnel R, Feugey L, Poncet C, Lateur M, Houben P, Ordidge M, Fernandez-Fernandez F, Evans KM, Paprstein F, Sedlák J, Nybom H, GarkavaGustavsson L, Miranda C, Gassmann J, Kellerhals M, Suprun I, Pikunova AV, Krasova NG,
- 11 CZ 309548 B6
Torutaeva E, Dondini L, Tartarini S, Laurens F, Duřel CE. Analysis of the genetic diversity and structure across a wide range of germplasm reveals prominent gene flow in apple at the European level. BMC Plant Biol. (2016) 16(1):130. Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, Dhingra A, Cestaro A, Kalyanaraman A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio M, Pruss D, Salvi S, Pindo M, Baldi P, 5 Castelletti S, Cavaiuolo M, Coppola G, Costa F, Cova V, Dal Ri A, Goremykin V, Komjanc M, Longhi S, Magnago P, Malacarne G, Malnoy M, Micheletti D, Moretto M, Perazzolli M, SiAmmour A, Vezzulli S, Zini E, Eldredge G, Fitzgerald LM, Gutin N, Lanchbury J, Macalma T, Mitchell JT, Reid J, Wardell B, Kodira C, Chen Z, Desany B, Niazi F, Palmer M, Koepke T, Jiwan D, Schaeffer S, Krishnan V, Wu C, Chu VT, King ST, Vick J, Tao Q, Mraz A, Stormo A, Stormo io K, Bogden R, Ederle D, Stella A, Vecchietti A, Kater MM, Masiero S, Lasserre P, Lespinasse Y, Allan AC, Bus V, Chagné D, Crowhurst RN, Gleave AP, Lavezzo E, Fawcett JA, Proost S, Rouzé P, Stěrek L, Toppo S, Lazzari B, Hellens RP, Duřel CE, Gutin A, Bumgarner RE, Gardiner SE, Skolnick M, Egholm M, Van de Peer Y, Salamini F, Viola R. The genome of the domesticated apple (Malus x domestica Borkh.). Nat Genet (2010) 42, 833-839.
Vieira ML, Santini L, Diniz AL, Munhoz Cde F. Microsatellite markers: what they mean and why they are so useful. Genet Mol Biol. (2016) 39(3):312-28.
Claims (14)
1. Sada primerů pro stanovení genotypu jabloně Malus x domestica Borkh. v jediné reakci metodou fragmentační analýzy, vyznačující se tím, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou: SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO.
2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG
SEQ ID NO.
3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO.
4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG
SEQ ID NO.
5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO.
6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG
SEQ ID NO.
7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO.
8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG
SEQ ID NO.
9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO.
10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA
SEQ ID NO.
11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO.
12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru GD12 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG,
- 13 CZ 309548 B6 přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZ01a6 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH05f06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH01h10 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH01f03b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH02c11 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH01f02 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru GD147 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
- 14 CZ 309548 B6
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markeru CH01h01 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markerů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou:
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2019473A3 CZ2019473A3 (cs) | 2021-01-27 |
| CZ309548B6 true CZ309548B6 (cs) | 2023-04-05 |
Family
ID=74188272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309548B6 (cs) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150117326A (ko) * | 2014-04-09 | 2015-10-20 | 경북대학교 산학협력단 | 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도 |
-
2019
- 2019-07-19 CZ CZ2019-473A patent/CZ309548B6/cs unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150117326A (ko) * | 2014-04-09 | 2015-10-20 | 경북대학교 산학협력단 | 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GenBank: ASM211411v1, Malus domestica cultivar Golden Delicious, Daccord, N., et al: High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development, Nat. Genet. 49 (7), 1099-1106 (2017), ISSN: 1061-4036. E-ISSN: 1546-1718. * |
| GenBank: CM007867.1, Malus domestica cultivar Golden Delicious isolate X9273 #13 chromosome 1, whole genome shotgun sequence, 3.5.2017, identical to NC_041789 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2019473A3 (cs) | 2021-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | Efficient indica and japonica rice identification based on the InDel molecular method: Its implication in rice breeding and evolutionary research | |
| US10337072B2 (en) | Copy number detection and methods | |
| KR101816573B1 (ko) | 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커 | |
| Larsen et al. | A high-throughput method for genotyping S-RNase alleles in apple | |
| CN112513298A (zh) | 用于辨别土鸡的遗传背景或品种的单核苷酸多态性标记集及其用途 | |
| CN113430285B (zh) | 与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用 | |
| Sabir et al. | Applying molecular tools for improving livestock performance: From DNA markers to next generation sequencing technologies | |
| Sheick et al. | Characterization of a novel S-RNase allele and genotyping of new apple cultivars | |
| CN109182557B (zh) | 一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的snp分子标记及其应用 | |
| Long et al. | Characterization of three new S-alleles and development of an S-allele-specific PCR system for rapidly identifying the S-genotype in apple cultivars | |
| KR101987666B1 (ko) | 배 품종 식별용 조성물 | |
| Ahmed et al. | Genetic diversity in Bibrik sheep of Pakistan elucidated through molecular characterization. | |
| CZ309548B6 (cs) | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) | |
| BR102014005635B1 (pt) | Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja | |
| CN108004236B (zh) | 玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用 | |
| CZ33375U1 (cs) | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) | |
| JP7316668B2 (ja) | カンキツ品種の識別方法 | |
| CN111705157B (zh) | 用于甘蓝自交不亲和系ⅰ类s单元型筛选的pcr标记及引物 | |
| Ko et al. | Screening transferable microsatellite markers across genus Phalaenopsis (Orchidaceae) | |
| Cova et al. | Exploiting expressed sequence tag databases for mapping markers associated with fruit development and fruit quality in apple | |
| KR102199454B1 (ko) | 배의 세포질 웅성불임 판별용 분자마커 및 이의 용도 | |
| Singh et al. | Molecular markers exploited in crop improvement practices | |
| López-Girona et al. | A high-throughput S-RNase genotyping method for apple | |
| Tazeb et al. | Molecular marker techniques and their novel applications in crop improvement: A review article | |
| Nagano et al. | Conversion of AFLP markers linked to the Sh allele at the S locus in buckwheat to a simple PCR based marker form |