CZ33375U1 - Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) - Google Patents
Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) Download PDFInfo
- Publication number
- CZ33375U1 CZ33375U1 CZ2019-36423U CZ201936423U CZ33375U1 CZ 33375 U1 CZ33375 U1 CZ 33375U1 CZ 201936423 U CZ201936423 U CZ 201936423U CZ 33375 U1 CZ33375 U1 CZ 33375U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- primers
- marker
- pcr amplification
- fluorescently labeled
- Prior art date
Links
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 title claims description 59
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 title claims description 41
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 title claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 53
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 40
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 17
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 17
- 101000926083 Homo sapiens Rab GDP dissociation inhibitor beta Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034328 Rab GDP dissociation inhibitor beta Human genes 0.000 claims description 2
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 37
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Oblast techniky
Řešení se týká sady primerů pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentaění analýzy a způsobů jejího použití pro odlišení jednotlivých genetických variant jabloní.
Dosavadní stav techniky
Jabloň domácí (Malus x domestica Borkh.) je velmi důležitou zemědělskou komoditou, která patří mezi 20 nejproduktivnějších plodin na světě měřeno výnosem v tunách. Je pěstována převážně v oblastech mírného pásu na severní i jižní polokouli. Největším světovým pěstitelem je Čína, největším exportérem pak Polsko. Na konci minulého století bylo na světě popsáno více než 10 000 různých odrůd (Janick J, 1996) a nové neustále přibývají z důvodu snahy vylepšit současné odrůdy ať už z hlediska zvyšování rezistence k nejčastějším jablečným patogenům, nebo z hlediska zlepšování jakosti plodů a ekonomiky jejich pěstování a skladování.
Jabloň domácí patří mezi cizosprašné rostliny, po opylení tedy vzniká hybridní genetický materiál nesoucí DNA pocházející od obou rodičů. Oproti tomu jsou odrůdy jabloní udržovány a množeny vegetativně roubováním, popřípadě očkováním na vhodné podnože, takže genetická informace je při tomto způsobu množení odrůd zachovávána beze změny a odpovídá původnímu zdrojovému organizmu. Jednotlivé odrůdy lze tak jednoznačně charakterizovat na úrovni DNA tzv. genotypizací. Znalost příslušných genotypů je pak možné využít např. pro ověřování pravosti odrůd jabloní, sledování segregace v potomstvu, stanovení rodičovské příbuznosti, lýlogenetické studie aj.
Genom jabloně domácí byl poprvé publikován v roce 2010 (Velasco R, 2010) a poté byl resekvenován na dvojitém haploidu v roce 2017 (Daccord N, 2017), kdy došlo ke zpřesnění jeho sekvence a celkové délky (přibližně 650 Mbp). Díky těmto pracím bylo zjištěno, že genom jabloně je značně složitý, a to z důvodu poměrně nedávné částečné duplikace genomu, kdy z původních 9 chromozómů vzniklo nynějších 17 chromozómů základní sady. V dřívějších dobách navíc došlo k rozsahově menším duplikacím některých částí genomu. Z tohoto důvodu se velké úseky sekvencí vyskytují na různých místech genomu, což velmi komplikuje molekulárně genetickou analýzu genomu jabloně. Další komplikací může být nestejný počet sad chromozómů vyskytující se u různých odrůd. Většina odrůd jabloně je diploidních, přibližně 10 % však tvoří triploidní odrůdy, vzácně se vyskytují dokonce i tetraploidní odrůdy (Janick J, 1996).
Pro charakterizaci jednotlivých odrůd nebo hybridů lze s výhodou využít genotypování pomocí SSR markérů (simple sequence repeats), kdy se využívá délkového polymorfismu jednotlivých alel, který lze jednoduše detekovat metodou fragmentační analýzy (obecné pojednání o SSR markérech a jejich použití pro genotypizací u rostlin lze nalézt např. ve Vieira ML, 2016). Metoda fragmentační analýzy sestává z kroků: 1) izolace DNA testovaného organizmu; 2) specifická PCR pro jednotlivé SSR markéry a 3) stanovení délky příslušných amplikonů, nejčastěji a nejpřesněji pomocí kapilární elektroforézy.
Pro jabloně byla nalezena řada SSR markérů vhodných pro genotypizací, popřípadě jiné účely, ale z důvodu srovnatelnosti výsledků mezi jednotlivými pracovišti je vhodné používat standardizovanou sadu. První sada využívala 12 SSR markérů amplifikovaných ve třech multiplexech, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry, avšak při použití těchto 12 SSR markérů byla při analýze 2 162 odrůd jabloní pěstovaných v East Mailing Research (Velká Británie) identifikována řada odrůd se shodným genotypem. Část z nich tvořily známé klony a shoda genotypů u nich byla očekávána, u dalších se mohlo jednat o
- 1 CZ 33375 UI neznámé/nežádoucí duplicity v genofondu, ale též o náhodnou shodu v daných SSR markérech bez ohledu na příbuznost. Autoři proto doporučili pečlivé fenotypické porovnání a dodatečnou analýzu dalších SSR markérů pro odlišení těchto odrůd (Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010; Fernandez F, 2013). I přes nedostatky uvedené výše byla sada těchto 12 SSR markérů a postup jejich identifikace schváleny Evropským kooperativním programem pro rostlinné genetické zdroje (ECPGR; www.ecpgr.cgiar.org/working-groups/maluspyrus) jako standardizovaný protokol pro identifikaci jabloní pro srovnatelnost výsledků mezi jednotlivými pracovišti.
V další studii proběhlé na jabloních byla pro snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými odrůdami tato sada rozšířena na 16 SSR markérů (Urrestarazu J, 2016), takže došlo k řádovému snížení možnosti genetické shody mezi odlišnými vzorky. Nevýhody této sady jsou však následující: 1) Sada 16 SSR markérů byla analyzována ve čtyřech multiplexech, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry. Pro charakterizaci jednoho vzorku je tak nutné provést čtyři nezávislé analýzy, což analýzu značně prodražuje, zvyšuje se časová náročnost i pracnost celého postupu i pravděpodobnost vzniku chyby. 2) V sadě 16 SSR markérů jsou dva (Hi02c07; CH-Vfl), které se nacházejí na stejném chromozomu 1. Pro vyloučení vlivu vazby mezi jednotlivými markéry je však vhodnější, aby každý marker pocházel z jiného chromozomu. 3) Sada 16 SSR markérů tak pokrývá pouze 15 chromozomů z celkových 17. Pro další snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými vzorky by proto bylo výhodné použít sadu 17 SSR markérů, z nichž každý pochází z jiného chromozomu, a pro omezení nákladů, pracnosti a možnosti vzniku chyb by bylo výhodné provádět analýzu všech 17 SSR markérů v jediné reakci.
Podstata technického řešení
Nedostatky dle současného stavu techniky - nevyužívání markérů, které by ležely každý na jiném chromozomu - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá vtom, že byl vypuštěn druhý marker z chromozomu 1 (CH-Vfl) a nově byly zařazeny markéry NZOlaó pro chromozom 4 a CH05e04 pro chromozom 16; ostatní markéry doporučené ECPGR byly zachovány pro zajištění zpětné kompatibility výsledků.
Nedostatky dle současného stavu techniky - zejména nezbytnost provádět čtyři nezávislé analýzy pro charakterizaci každého vzorku a s tím související finanční a časová náročnost, pracnost a potenciálně vyšší chybovost - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
-2CZ 33375 UI
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZ01a6 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05Í06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA,
-3 CZ 33375 Ul přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhlO obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01f03b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02cll obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01fl)2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GD147 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC,
-4CZ 33375 Ul přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhOl obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
Výše uvedené primery SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 15 a SEQ ID NO. 33 vykazují homologii vyšší než 90 % k primerům z Liebhard R, 2002. V tomto dokumentu však autoři neuvažovali použít primery k vytvoření systému pro současnou detekci všech markérů v jediné reakci; výše uvedené primery pro amplifikaci příslušných SSR markérů byly navíc použity v kombinaci s jinými párovými primery než v citovaném dokumentu; a míra shody výše citovaných primerů s primery dle tohoto vynálezu je koincidencí, neboť ve všech případech je příslušná genomická oblast výhodná pro návrh primerů pro amplifikaci příslušného markéru.
Výše uvedené kombinace primerů pro amplifikaci jednotlivých SSR markérů jsou vhodné pro současnou nebo individuální analýzu výše uvedených markérů u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) metodou fragmentační analýzy. Ve výhodném provedení technického řešení jsou PCR amplikony příslušných SSR markérů detekovány pomocí kapilární elektroforézy s tím, že každý amplikon je fluorescenčně označen. Fluorescenční označení amplikonů je zajištěno použitím fluorescenčně značeného primerů v PCR reakci tak, aby bylo možné amplikon identifikovat. V ještě výhodnějším provedení technického řešení jsou amplikony označeny pomocí odlišných fluoroforů pro jednotlivé SSR markéry v takové kombinaci, která umožňuje současnou detekci a jednoznačnou identifikaci všech 17 SSR markérů v jedné reakci.
Návrh sady primerů podle technického řešení pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) byl proveden v několika krocích: 1) analýza sekvencí použitých SSR markérů, zejména s ohledem na výše uvedené duplikace genomu jabloně; 2) optimalizace kombinace délek amplikonů a fluorescenčního značení fragmentů, která by umožňovala současnou detekci všech 17 SSR markérů v jedné reakci; 3) návrh primerů pro detekci jednotlivých SSR markérů; 4) optimalizace PCR podmínek.
Prvním krokem pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) je izolace genomové DNA, následuje PCR s využitím sady primerů pro specifickou amplifikaci výše
-5 CZ 33375 UI uvedených SSR markérů a stanovení délky amplikonů pomocí fragmentační analýzy využívající kapilární elektroforézu. Finálním krokem je vyhodnocení přítomnosti jednotlivých alel pro každý SSR marker.
Příklady provedení technického řešení jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojeným nárokem a podrobně popsána v popisu technického řešení. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR, uvedených primerů a fluorescenčního označení primerů tak, aby nedošlo ke snížení specificity PCR detekce jednotlivých SSR markérů. Odborník v oboru bude schopen též snížit počet současně detekovaných SSR markérů v jedné reakci, případně vytvořit nové kombinace detekovaných SSR markérů pomocí uvedených primerů v jedné reakci.
Příklady uskutečnění technického řešení
Příklad 1: Návrh sekvencí primerů
Do kolekce SSR markérů byly přidány markéry pro chromozom 4 (NZOlaó; Guilford P, 1997) a chromozom 16 (CH05e04; Liebhard R, 2002), neboť jsou velmi polymorfní, a tak vhodné pro účely genotypování.
Pro detekci všech 17 SSR markérů v jedné reakci byly navrženy nové primery pro PCR amplifikaci jednotlivých SSR markérů tak, aby celý systém fungoval ve své komplexnosti a amplifikované fragmenty měly správnou délku umožňující jejich jednoznačnou identifikaci pomocí fragmentační analýzy.
Sekvence jednotlivých SSR markérů a jejich okolí byly získány z referenčního genomu jabloně domácí Malus x domestica Borkh., odrůda Golden Delicious, Annotation Version 102; Genome Reference Number: ASM21141 Ivl.
Na základě homologií k dalším chromozomálním oblastem jabloně byly jednotlivé SSR markéry rozděleny do zamýšlených velikostních pásem amplifikovaných produktů v kombinaci s příslušnými fluorofory tak, aby bylo možné provést specifickou amplifikaci a detekci všech 17 SSR markem v jedné reakci.
Primery byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance. Při navrhování primerů pro multiplexovou PCR analýzu byly zohledněny následující požadavky: 1) vysoká specificita primerů eliminující necílené amplifikace z důvodu parciální duplikace genomu jabloně; 2) obdobná teplota tání všech primerů; 3) eliminace tvorby dimerů mezi jednotlivými primery.
Přehled sekvencí primerů, jejich nasedání na referenční sekvence a očekávané velikosti amplikonů pro jednotlivé SSR markéry pro příslušné chromozomy ukazuje Tabulka 1.
Tabulka 1, Souhrnné informace o použitých primerech
| Chromozom | SSR marker | Velikostní pásmo (bp) | SEQ ID NO. | Referenční sekvence v GenBank (pozice) | Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastupuje A nebo T) |
| 1 | Hi02c07 a) | 400-450 | SEQ ID NO. 1 | NC_041789.1 (1745900617458982) | TCTACAACAAAATACCCAATAC ACC |
| SEQ ID NO. 2 | NC_041789.1 (1745860717458627) | CTAAGCATCCCGATTGAAAGG |
-6CZ 33375 UI
| Chromozom | SSR marker | Velikostní pásmo (bp) | SEQ ID NO. | Referenční sekvence v GenBank (pozice) | Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastupuje A nebo T) |
| 2 | CH02c06 b) | 400-450 | SEQ ID NO. 3 | NC_041790.1 (2011732020117296) | AGTTTCGTAAGAGAACCTTGAT CTC |
| SEQ ID NO. 4 | NC_041790.1 (2011689320116917) | ATCCACTTACTAAGAACTACCG TTG | |||
| 3 | GD12c) | 300-350 | SEQ ID NO. 5 | NC_041791.1 (16692908- 16692931) | TTCTTCTATGAACGGTGATAAA GC |
| SEQ ID NO. 6 | NC_041791.1 (16693215- 16693196) | GAATGTGAGGCGTTCCTGAG | |||
| 4 | NZ01a6 d) | 450-500 | SEQ ID NO. 7 | NC_041792.1 (2939965829399640) | ATTCCCTGGCGAGAAAAGC |
| SEQ ID NO. 8 | NC_041792.1 (2939915829399177) | CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG | |||
| 5 | CH05Í06 b) | 400-450 | SEQ ID NO. 9 | NC_041793.1 (2237304822373028) | TAGATCCGGTCACTCTCCACT |
| SEQ ID NO. 10 | NC_041793.1 (2237264022372661) | AACACCCCATCAATCAGAAAG A | |||
| 6 | CH03d0 7 b) | 200-250 | SEQ ID NO. 11 | NC_041794.1 (8113628-8113604) | TGTGAAATGTAATTCAAATCAA TGC |
| SEQ ID NO. 12 | NC_041794.1 (8113416-8113435) | TTGAGAAAATGGGGCTTCTG | |||
| 7 | CH04e05 b) | 200-250 | SEQ ID NO. 13 | NC_041795.1 (17314881- 17314902) | GAGAAGGCTAACAGAAATGTG G |
| SEQ ID NO. 14 | NC_041795.1 (1731507017315051) | GCCTTTGTAATCATGGCTCC | |||
| 8 | CHOlhl 0b) | 100-150 | SEQ ID NO. 15 | NC_041796.1 (2744400627444029) | GCAAAGATAGGTAGATATATGC CA |
| SEQ ID NO. 16 | NC_041796.1 (2744409827444079) | AAGGAGGGATTGTTTGTGCA | |||
| 9 | CH01f03 bb) | 100-150 | SEQ ID NO. 17 | NC_041797.1 (9725625-9725644) | AAAACCCTAGCCCCACGGAG |
| SEQ ID NO. 18 | NC_041797.1 (9725755-9725737) | ACTCTCCATCGGGCTCCAC | |||
| 10 | CH02cll b) | 400-450 | SEQ ID NO. 19 | NC_041798.1 (2426165224261675) | CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGC G |
-7 CZ 33375 UI
| Chromozom | SSR marker | Velikostní pásmo (bp) | SEQ ID NO. | Referenční sekvence v GenBank (pozice) | Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastupuje A nebo T) |
| SEQ ID NO. 20 | NC_041798.1 (2426209124262067) | GAAACACATTTATAGAAAAAG GAGC | |||
| 11 | CH02d0 8b) | 300-350 | SEQ ID NO. 21 | NC_041799.1 (9734418-9734437) | GCTCTTCCAAAATGGCGTAC |
| SEQ ID NO. 22 | NC_041799.1 (9734728-9734705) | ATATTTGACATTGGTCATGAGA CG | |||
| 12 | CH0H02 b) | 300-350 | SEQ ID NO. 23 | NC_041800.1 (2363044123630419) | GAGAAGAACAACAACAGAGA ACG |
| SEQ ID NO. 24 | NC_041800.1 (2363013923630160) | GAAATAGGGTAGCAGCAGATG G | |||
| 13 | GD147C) | 300-350 | SEQ ID NO. 25 | NC_041801.1 (8149400-8149420) | CAGTGTTACCCGCCAAATATC |
| SEQ ID NO. 26 | NC_041801.1 (8149730-8149711) | GATCGGAAGGCGAAAGACTC | |||
| 14 | CH04c07 b) | 200-250 | SEQ ID NO. 27 | NC_041802.1 (2420536524205385) | AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG |
| SEQ ID NO. 28 | NC_041802.1 (2420558124205562) | CCCTCATGCCCTCCACTAAC | |||
| 15 | CH02c09 b) | 200-250 | SEQ ID NO. 29 | NC_041803.1 (5015944650159469) | CAACTTTGCTAACCTCTCATTG AA |
| SEQ ID NO. 30 | NC_041803.1 (5015968050159659) | AGGATGACCTTGAGATTGATGC | |||
| 16 | CH05e04 b) | 100-150 | SEQ ID NO. 31 | NC_041804.1 (4351657-4351678) | TTGAACTTCGACCGCAACACC A |
| SEQ ID NO. 32 | Pro A: NC_041804.1 (4351789-4351768) Pro T: vlastní sekvence | ACATGGWTAAGGCATAGTCAG G | |||
| 17 | CHOlhO lb) | 100-150 | SEQ ID NO. 33 | NC_041805.1 (6601384-6601365) | GAAAGACTTGCAGTGGGAGC |
| SEQ ID NO. 34 | NC_041805.1 (6601260-6601281) | TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAG G |
SSR markéry popsány v: a) Silfverberg-Dilworth E, 2006; b) Liebhard R, 2002; c) Hokanson SC, 1998; d) Guilford P, 1997
Příklad 2: Stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Pro amplifikaci SSR markérů byla použita DNA izolovaná z listů jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakěními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific),
-8CZ 33375 UI primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
Tabulka 2. Koncentrace a fluorescenční značení použitých primerů
| Primer SEQ ID NO. | Fluorescenční značení | Výsledná koncentrace nM |
| SEQ ID NO. 1 | - | 625 |
| SEQ ID NO. 2 | PET | 625 |
| SEQ ID NO. 3 | víc | 750 |
| SEQ ID NO. 4 | - | 750 |
| SEQ ID NO. 5 | víc | 625 |
| SEQ ID NO. 6 | - | 625 |
| SEQ ID NO. 7 | NED | 250 |
| SEQ ID NO. 8 | - | 250 |
| SEQ ID NO. 9 | NED | 375 |
| SEQ ID NO. 10 | - | 375 |
| SEQ ID NO. 11 | FAM | 500 |
| SEQ ID NO. 12 | - | 500 |
| SEQ ID NO. 13 | - | 312,5 |
| SEQ ID NO. 14 | víc | 312,5 |
| SEQ ID NO. 15 | víc | 312,5 |
| SEQ ID NO. 16 | - | 312,5 |
| SEQ ID NO. 17 | PET | 87,5 |
| SEQ ID NO. 18 | - | 87,5 |
| SEQ ID NO. 19 | FAM | 750 |
| SEQ ID NO. 20 | - | 750 |
| SEQ ID NO. 21 | FAM | 250 |
| SEQ ID NO. 22 | - | 250 |
| SEQ ID NO. 23 | NED | 212,5 |
| SEQ ID NO. 24 | - | 212,5 |
| SEQ ID NO. 25 | PET | 312,5 |
| SEQ ID NO. 26 | - | 312,5 |
| SEQ ID NO. 27 | PET | 187,5 |
| SEQ ID NO. | - | 187,5 |
-9CZ 33375 Ul
| 28 | ||
| SEQ ID NO. 29 | NED | 250 |
| SEQ ID NO. 30 | - | 250 |
| SEQ ID NO. 31 | FAM | 187,5 |
| SEQ ID NO. 32 | - | 187,5 |
| SEQ ID NO. 33 | NED | 162,5 |
| SEQ ID NO. 34 | - | 162,5 |
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Výsledkem je získání spektra alel pro každý SSR marker, které je unikátní pro danou genetickou variantu jabloně.
Příklad 3: Ověření shodnosti dvou odrůd jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno porovnání dvou neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) s cílem zjistit, zda se jedná o stejnou odrůdu.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů u obou vzorků jabloní bylo zjištěno, že oba vzorky vykazují stejné alely ve všech SSR markérech a jsou tedy geneticky shodné - oba vzorky jsou tedy stejná odrůda jabloně.
Příklad 4: Ověření identity odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno ověření identity neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), o kterých se majitel domníval, že se jedná o odrůdy „Fragrance“ a „Golden Delicious“.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix
- 10CZ 33375 Ul (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo zjištěno, že vzorek označený jako odrůda „Fragrance“ neodpovídá referenční odrůdě „Fragrance“ uchovávané v genofondech jabloní přihlašovatele; naopak vzorek označený jako „Golden Delicious“ vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Golden Delicious“.
Příklad 5: Určení neznámé odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno určení odrůdy u neznámého vzorku jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), u které nebyly známy další informace.
Z listů neznámého vzorku byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo zjištěno, že neznámý vzorek vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Boskoopské“.
Průmyslová využitelnost
Nově navržené primery byly optimalizovány pro stanovení genotypu jabloně domácí (Medus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy s využitím 17 SSR markérů. Rozšířená sada SSR markérů a nová sada primerů oproti dosavadnímu stavu techniky zpřesňují, zrychlují a zlevňují genotypování jabloní, které je využitelné jak pro ověřování pravosti odrůd jabloní (např. ověřování školkařského materiálu, prověřování identity registrovaných odrůd jabloní, testování odrůdové pravosti prodávaných jablek), tak pro vědecké účely (např. cílené šlechtění).
Seznam použité literatury
Daccord N, Celton JM, Linsmith G, Becker C, Choisne N, Schijlen E, van de Geest H, Bianco L, Micheletti D, Velasco R, Di Pierro EA, Gouzy J, Rees DJG, Guérif P, Muranty H, Duřel CE, Laurens F, Lespinasse Y, Gaillard S, Aubourg S, Quesneville H, Weigel D, van de Weg E,
- 11 CZ 33375 UI
Troggio M, Bucher E. High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development. Nature Genetics (2017) 49, 1099-1106
Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010, http://sciencesearch.defra.gov.uk/Default.aspx?Menu=Menu&Module=More&Location=None& Completed=0&ProiectID=l 5150
Fernandez FF. Common set of ECPGR SSR markers for Malus characterization. In: Lateur M., Ordidge M., Engels J. and Lipman E. Report of a Working Group on Malus/Pyrus. Fourth Meeting, 7-9 March 2012, Weggis, Switzerland. Biodiversity International, Rome, Italy (2013) 26-27
Guilford P, Prakash S, Zhu JM, Rikkerink E, Gardiner S, Bassett H, Forster R. Microsatellites in Malus X domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics (1997) 94(2), 249-254
Hokanson SC, Szewc-McFadden AK, Lamboy WF, McFerson JR. Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malus x domestica Borkh. core subset collection. Theor Appl Genet. (1998) 97, 671-83
Janick J, Moore JN. Fruit breeding. Volume I: Tree and Tropical Fruits. New York: Wiley (1996)
Liebhard R, Gianfranceschi L, Koller B, Ryder CD, Tarchini R, van de Weg E, Gessler C. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.). Mol Breed. (2002) 10(4):217-41
Silfverberg-Dilworth E, Matasci CL, van de Weg WE, van Kaauwen MPW, Walser M, Kodde LP, Soglio V, Gianfranceschi L, Duřel CE, Costa F, Yamamoto T, Koller B, Gessler C, Patocchi A. Microsatellite markers spanning the apple (Malus x domestica Borkh.) genome. Tree Genet Genomes. (2006) 2, 202-24
Urrestarazu J, Denancé C, Ravon E, Guyader A, Guisnel R, Feugey L, Poncet C, Lateur M, Houben P, Ordidge M, Fernandez-Fernandez F, Evans KM, Paprstein F, Sedlák J, Nybom H, Garkava-Gustavsson L, Miranda C, Gassmann J, Kellerhals M, Suprun I, Pikunova AV, Krasova NG, Torutaeva E, Dondini L, Tartarini S, Laurens F, Duřel CE. Analysis of the genetic diversity and structure across a wide range of germplasm reveals prominent gene flow in apple at the European level. BMC Plant Biol. (2016) 16(1):130
Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, Dhingra A, Cestaro A, Kalyanaraman A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio M, Pruss D, Salvi S, Pindo M, Baldi P, Castelletti S, Cavaiuolo M, Coppola G, Costa F, Cova V, Dal Ri A, Goremykin V, Komjanc M, Longhi S, Magnago P, Malacame G, Malnoy M, Micheletti D, Moretto M, Perazzolli M, Si-Ammour A, Vezzulli S, Zini E, Eldredge G, Fitzgerald LM, Gutin N, Lanchbury J, Macalma T, Mitchell JT, Reid J, Wardell B, Kodira C, Chen Z, Desany B, Niazi F, Palmer M, Koepke T, Jiwan D, Schaeffer S, Krishnan V, Wu C, Chu VT, King ST, Vick J, Tao Q, Mraz A, Stormo A, Stormo K, Bogden R, Ederle D, Stella A, Vecchietti A, Kater MM, Masiero S, Lasserre P, Lespinasse Y, Allan AC, Bus V, Chagné D, Crowhurst RN, Gleave AP, Lavezzo E, Fawcett JA, Proost S, Rouzé P, Stěrek L, Toppo S, Lazzari B, Hellens RP, Durel CE, Gutin A, Bumgamer RE, Gardiner SE, Skolnick M, Egholm M, Van de Peer Y, Salamini F, Viola R. The genome of the domesticated apple (Malus x domestica Borkh.). Nat. Genet. (2010) 42, 833-839
Vieira ML, Santini L, Diniz AL, Munhoz Cde F. Microsatellite markers: what they mean and why they are so useful. Genet Mol Biol. (2016) 39(3):312-28.
Claims (34)
1. Sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy, vyznačující se tím, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO.
2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG
SEQ ID NO.
3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO.
4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG
SEQ ID NO.
5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO.
6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG
SEQ ID NO.
7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO.
8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG
SEQ ID NO.
9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO.
10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA
SEQ ID NO.
11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO.
12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG
SEQ ID NO.
13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO.
14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC
SEQ ID NO.
15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO.
16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
SEQ ID NO.
17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO.
18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC
SEQ ID NO.
19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO.
20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC
SEQ ID NO.
21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO.
22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG
SEQ ID NO.
23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO.
24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG
SEQ ID NO.
25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO.
26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC
SEQ ID NO.
27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO.
28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC
SEQ ID NO.
29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO.
30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC
SEQ ID NO.
31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO.
32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG
SEQ ID NO.
33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO.
34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
- 13CZ 33375 UI
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZOlaó obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05Í06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhlO obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01f03b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02cll obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
- 14CZ 33375 UI
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01Í02 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GD147 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhOl obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-36423U CZ33375U1 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-36423U CZ33375U1 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ33375U1 true CZ33375U1 (cs) | 2019-11-12 |
Family
ID=68534677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-36423U CZ33375U1 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ33375U1 (cs) |
-
2019
- 2019-07-19 CZ CZ2019-36423U patent/CZ33375U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mejia et al. | Molecular, genetic and transcriptional evidence for a role of VvAGL11 in stenospermocarpic seedlessness in grapevine | |
| Sargent et al. | A microsatellite linkage map for the cultivated strawberry (Fragaria× ananassa) suggests extensive regions of homozygosity in the genome that may have resulted from breeding and selection | |
| CN112513298B (zh) | 用于辨别土鸡的遗传背景或品种的单核苷酸多态性标记集及其用途 | |
| US20160265070A1 (en) | Copy number detection and methods | |
| KR101816573B1 (ko) | 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커 | |
| KR102442563B1 (ko) | 밀의 출수기 예측용 바이오마커 | |
| Pereira et al. | Vitis vinifera L. Single-nucleotide polymorphism detection with high-resolution melting analysis based on the UDP-glucose: Flavonoid 3-O-Glucosyltransferase gene | |
| KR101987666B1 (ko) | 배 품종 식별용 조성물 | |
| NL2026532B1 (en) | InDel MOLECULAR MARKERS CLOSELY LINKED TO RICE HEADING DATE GENES AND APPLICATION THEREOF | |
| Sarkar et al. | Screening for phosphorus (P) tolerance and validation of Pup-1 linked markers in indica rice | |
| Ahmed et al. | Genetic diversity in Bibrik sheep of Pakistan elucidated through molecular characterization. | |
| JP5799600B2 (ja) | ユーカリ属の種間雑種の樹種識別法 | |
| CZ33375U1 (cs) | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) | |
| BR102014005635B1 (pt) | Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja | |
| CZ2019473A3 (cs) | Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) | |
| KR102439855B1 (ko) | 토종닭 또는 육계 신품종을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도 | |
| Cova et al. | Exploiting expressed sequence tag databases for mapping markers associated with fruit development and fruit quality in apple | |
| Singh et al. | Molecular markers exploited in crop improvement practices | |
| Tazeb et al. | Molecular marker techniques and their novel applications in crop improvement: A review article | |
| López-Girona et al. | A high-throughput S-RNase genotyping method for apple | |
| JP6566479B2 (ja) | イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用 | |
| Shen et al. | Sequence characterized amplified region (SCAR) markers-based rapid molecular typing and identification of unninghamia lanceolata | |
| Abebe | Genotype by sequencing method and its application for crop improvement (a review) | |
| CZ34114U1 (cs) | Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.) | |
| KR101515861B1 (ko) | 배추 속 식물의 외래 유전자 도입 수 확인을 위한 중합효소 연쇄반응 분석 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20191112 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20230719 |