KR101515861B1

KR101515861B1 - 배추 속 식물의 외래 유전자 도입 수 확인을 위한 중합효소 연쇄반응 분석 방법

Info

Publication number: KR101515861B1
Application number: KR1020130124571A
Authority: KR
Inventors: 박영두; 이기호
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-05-04

Abstract

본 발명은 외부 유전자의 삽입에 의해 발생한 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 도입된 외부 유전자 수를 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 외부 유전자의 삽입에 의해 돌연변이가 발생한 배추 속 식물, 또는 이와 유사한 게놈 구조를 갖는 다른 고등 식물에 도입된 외래 유전자의 도입 수를 소량의 DNA로 짧은 시간에 분석할 수 있어, 기능 유전체 연구에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

배추 속 식물의 외래 유전자 도입 수 확인을 위한 중합효소 연쇄반응 분석 방법{POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD FOR IDENTIFICATION OF INTRODUCED EXOTIC GENE NUMBER IN BRASSICACEAE}

본 발명은 외래 유전자의 도입 수 확인을 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 배추 속(Brassicaceae genus) 식물의 외래 유전자 도입 수 확인을 위한 중합효소 연쇄반응 분석 방법에 관한 것이다.

최근 20년간, 분자 생물학의 발달은 유용 유전자를 동물 및 식물에 도입 가능하게 하였다. 특히 작물 형질전환 기술은 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)에 의한 방법과 Gene gun에 의한 방법이 가장 많이 사용되었으나, 형질전환의 안정성 및 효율성 측면에서 고려해 볼 때, 아그로박테리움 법이 더 많이 이용되고 있는 실정이다.

그러나 이와 같은 아그로박테리움 법에 의한 형질전환은 종종 도입 유전자가 다수로 삽입되는 현상이 나타난다.

이와 같이 다수(multi-copy)로 도입된 유전자는 전사 단계의 발현억제 현상(transcriptional gene silencing)이나 전사 후 발현억제 현상(post transcriptional gene silencing)과 같은 상동성에 의한 발현억제 현상(homology dependent gene silencing)을 유발할 가능성이 높다.

특히 유전자 조작 작물(genetically modified crop)은 도입 유전자의 안정성이 상업화에 필수적인 조건이다. 이에 따라 개발된 유전자 조작 작물의 도입된 T-DNA 수를 확인하여 1개의 T-DNA copy만 도입된 형질전환체를 선발하는 것이 도입 유전자의 안정적 발현과 후대 유전에 있어 효과적이다.

도입 유전자의 T-DNA 수를 확인하는 방법에는 분리비 확인법과 서던 블랏(Southern blot)법이 대표적이다.

그러나, 분리비 확인법의 경우 T-DNA가 각각 단일 유전자좌(single locus)에 존재할 경우는 확인할 수 있으나, 동일한 유전자좌에 도입되는 경우 확인이 불가능하다. 또한 단일 유전자좌(single locus)에 존재하는 경우에도 확인하기까지의 시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 이에 따라 T-DNA 도입 수 검정을 위하여 서던 블랏 을 가장 많이 시행하고 있다.

또한, 서던 블랏도 많은 시간과 노력이 필요하며, 일반적으로는 방사선 동위원소를 사용해야 하므로 그 위험성을 간과할 수 없다.

한편, 실시간 중합효소 연쇄반응 분석에 의한 정량분석법은 1996년 처음 고안된 이래로 많은 정량분석 연구에 이용되어 오고 있다. 이 방법은 온도변환기(thermal cycler)와 분광분석기(spectrophotometer)를 함께 연동시켜 PCR 산물의 양적 변화를 형광시약을 이용하여 실시간으로 측정할 수 있게 하였으며, 이러한 이유로 전기영동에 의한 시각적 분석을 줄이고, 보다 신속하고 민감하게 PCR 산물의 측정을 가능하게 하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응 분석은 여러 가지 질병 진단에 유용하게 이용되고 있으며, 유전자 변형작물의 검사와 식품에서의 특정 유전자의 검사 등에 널리 이용되고 있다.

실시간 중합효소 연쇄반응 분석을 이용한 외부 유전자의 T-DNA 도입 수 검정 시, 오류를 최소화하기 위해서는 실험을 실시할 DNA 시료의 순도도 중요하지만, 작물 내에 1개만 존재하는 것으로 알려진 내생 비교 유전자(internal standard gene)를 이용한 정량화(normalization)가 필요하다.

그러나 배추의 경우, 6배체인 원시배추가 1천 500만년 동안 염색체의 융합과 분열 및 유전자의 삽입과 탈락 등의 진화 과정을 거쳐 10쌍의 염색체에 4만 9천개의 유전자를 지닌 현재의 배추 게놈(genome)이 되면서 다수의 유전자가 중복된 형태를 이루고 있어 1개만 존재하는 내생 비교 유전자가 보고된 바가 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 배추 속 작물에 도입된 외래 유전자 수를 신속 간이하게 분석하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 배추 속 작물에 1개의 copy만 존재하는 내생 유전자를 찾고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과, 외래 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 경우, 배추 속 작물에 도입된 외래 유전자의 도입 수를 간편하게 분석할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 외부 유전자가 삽입된 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 T1세대에서의 외부 유전자의 도입 수를 보다 빨리 확인하고, 개발된 형질전환체의 도입 유전자 안정성을 확보하기 위하여, 작물 내에 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자와 T-DNA 도입 수를 확인할 수 있는 프라이머 염기 서열 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 분석 방법을 이용하여, 배추 속 식물의 유전체에서 외래 유전자의 삽입 수를 결정하고, 이에 따른 유전자형 확인을 하기 위해 효과적인 중합효소 연쇄반응 분석 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 외부 유전자의 삽입에 의해 발생한 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 도입된 외부 유전자 수를 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 상기 배추 속 식물의 gDNA(genomic DNA)를 준비하는 단계; 상기 배추 속 식물의 내생 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍과 상기 외부 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량을 비교하여 상기 도입된 외부 유전자의 수(number)를 분석하는 단계;를 포함하되, 상기 내생 유전자는 상기 배추 속 식물 유전체에 1 copy만 존재하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 배추 속 식물에서 1개의 copy만 존재하는 내생 유전자와 도입된 유전자를 PCR 분석 방법을 사용하여 동시에 비교 분석하면 외래 유전자의 도입 수를 분석할 수 있으며, 이를 통해 1개 copy의 외래 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 선발하여 더욱 효과적인 주변부(flanking region) 서열 분석이 가능하게 된다. 이렇게 분석된 서열과 배추 속 식물의 DNA 라이브러리의 상동성을 조사함으로써, 외부 유전자의 삽입으로 인해 기능에 이상이 있는 유전자의 종류 및 그 유전자의 유전체 내의 위치를 분석할 수 있으므로, 유전자의 기능을 연구하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 외부 유전자의 도입 형태를 확인할 수 있어 육종 속도를 가속화할 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘PCR(polymer chain reaction)’은 살아있는 유기체 없이 간단한 합성 효소 반응을 이용하여 주형이 되는 핵산으로부터 특정 DNA를 대량으로 증폭시키는 분자 기술로 정의된다. PCR은 주형이 되는 핵산, 프라이머, DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 및 dNTP(Deoxynucleotide triphosphate)를 이용하여 핵산의 변성(denaturation), 프라이머의 결합(annealing) 및 DNA의 신장(extention)의 세 단계를 거쳐 진행된다. 각 단계에 적용되는 온도, 시간 및 반복 횟수는 PCR의 종류와 주형 DNA, 프라이머 또는 PCR 기기 등에 따라 달라질 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 PCR은 실시간으로 증폭되는 DNA의 양을 측정할 수 있어 분석이 용이한 RT-PCR 방식인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 상기 도입된 외부 유전자는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 법, Gene gun 법 등 공지된 어떠한 방식에 의해서도 도입될 수 있으며, 유전자 도입의 효율성을 제고하기 위해 T-DNA를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 상기 내생 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 내생 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍은 BrSMT1 유전자에 상보적으로 결합하는 서열번호 2 및 3의 염기서열이고, 상기 도입된 외부 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍은 T-DNA에 상보적인 서열번호 4 및 5의 염기서열일 수 있다.

본 발명에서, 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량 비교는 상기 PCR 반응 결과의 융해 곡선 분석(melting curve analysis); 및 실시한 증폭 반응의 delta-delta C_T 분석을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 외부 유전자의 삽입에 의해 발생한 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 T1 세대의 유전형을 분석하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 배추 속 식물의 gDNA(genomic DNA)를 준비하는 단계;

(b) 상기 배추 속 식물의 유전체에 1 copy만 존재하는 내생 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍과 상기 외부 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량을 비교하여 상기 내생 유전자와 상기 외부유전자의 증폭량이 동일한 경우 상기 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 T1 세대 유전형을 동형접합성(homozygous)으로 판정하고, 상기 외부 유전자의 증폭량이 상기 내생 유전자의 증폭량의 절반인 경우 상기 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체 T1 세대의 유전형을 이형접합성(heterozygous)으로 판정하는 단계.

본 발명의 상기 증폭량의 동일함 또는 절반의 의미는 엄밀한 의미의 동일함 또는 절반을 의미하는 것은 아니며, 분석과정의 오차수준을 감안하여 대략 5% 내지 15% 정도의 오차범위를 허용하는 동일함 또는 절반을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 배추 속 식물의 도입된 외부 유전자의 수를 분석하는데 이용되고, 상기 배추 속 식물 유전체에 1 copy만 존재하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 배추 속 식물의 도입된 외부 유전자의 수를 분석하는데 이용되고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 2와 서열번호 3으로 이루어진 real-time PCR용 프라이머 쌍을 제공한다.

이하, 본 발명의 정량적 real-time PCR 방법을 통한 T-DNA 도입 수 분석을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

첫째, 상기 real-time PCR에 사용되는 배추 속 식물의 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자 프라이머를 제작하기 위하여, 배추 유전체(genome)에 유일하게 존재하는 유전자 군을 1차 분석하였다.

상기 1차 분석을 위해서, the John Innes Centre(http://www.jic.ac.uk/)의Brassica DB(http://brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/)에서 제공하는 게놈 분석(genome analysis) 정보를 사용하였다.

상기 1차 분석된 정보를 NCBI의 BLAST로 2차 분석하여 배추 속에서 1개만 존재하는 내생 비교 유전자를 찾아내었다.

상기 2차 분석된 유전자를 GGbio(http://www.ggbio.com/)에서 제공하는 Flanking Sequence Tag Validator 프로그램(http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/)을 이용하여 검증하였다. 상기 상동성 분석은 육안으로나 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.

둘째, 상기 분석에서 확인한 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자와 도입된 T-DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 정량적 real-time PCR용 프라이머 쌍을 제작하였다.

상기 프라이머 쌍은 효과적인 T-DNA 도입 수 검출을 위한 real-time PCR 반응을 도모하기 위해, 18 내지 21bp로 구성하여 정확성을 상승시켰으며, real-time PCR 반응의 어닐링 온도는 58 내지 60℃ 조건으로 수행된다.

셋째, 상기 제작된 배추 속에서 1개만 존재하는 내생 비교 유전자와 도입된 T-DNA를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 정량적 real-time PCR 반응을 수행하였고, 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량을 비교하여 상기 도입된 외부 유전자의 수(number)를 분석하였다.

상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량 비교는 상기 PCR 반응 결과의 융해 곡선 분석(melting curve analysis)을 통한 증폭의 정확성 분석과 delta-delta C_T 분석을 통하여 T-DNA 도입 수를 확인하였다.

이때, 정량적 real-time PCR 반응에 사용된 주형 DNA는 배추 속 식물의 유전체에서 gDNA를 추출하는 일반적인 방법에 의해 채취된 gDNA를 사용하였다.

상기와 같이 배추 속 식물에서 1개의 copy만 존재하는 내생 유전자와 도입된 T-DNA를 RT-PCR 분석 방법을 사용하여 동시에 비교 분석함으로써, T-DNA의 도입 수를 분석할 수 있었으며, 이를 통해 1개 copy의 외래 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 선발할 수 있었다.

또한, 내생 유전자의 절반 또는 동일한 수준의 증폭량을 보이는 T-DNA 도입수를 확인함으로써, 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체 T1 세대의 유전형을 동형접합성(homozygous) 또는 이형접합성(heterozygous)으로 판정할 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 도입된 외래 유전자의 수 분석을 위한 배추 속 유전체에 1개 copy만 존재하는 내생 유전자 BrSMT1, 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 제공하며, 상기 유전자 및 프라이머 쌍을 이용하여 1개 copy의 외래 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 선발할 수 있다.

또한, 선발된 식물체의 도입 유전자 주변부(flanking region) 서열 분석을 효과적으로 수행할 수 있고, 분석된 서열과 배추 속 식물의 DNA 라이브러리의 상동성을 조사함으로써, 외부 유전자의 삽입으로 인해 기능에 이상이 있는 유전자의 종류 및 그 유전자의 유전체 내의 위치를 분석할 수 있으므로, 유전자의 기능을 연구하는 데 유용하게 사용할 수 있으며, 이를 통해 배추 품종 개량에 유용하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 외부 유전자의 삽입에 의한 돌연변이가 T1 세대로 진전 시 멘델의 유전법칙에 의해 발생하는 동형접합성(homozygous)과 이형접합성(heterozygous)을 분석할 수 있게 하여, 형질전환 작물의 육종 연한 단축에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자인 배추의 에스-아데노실메티오닌-디펜던트 메틸트렌스퍼레이즈(S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase)로 추정되는 유전자 BrSMT1를 GGbio(http://www.ggbio.com/)에서 제공하는 Flanking Sequence Tag Validator 프로그램(http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/)을 이용하여 배추 게놈에 1개만 존재함을 검증한 결과 사진이다.
도 2는 NCBI의 Blast 분석을 통하여 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자인 배추의 에스-아데노실메티오닌-디펜던트 메틸트렌스퍼레이즈로 추정되는 유전자 BrSMT1가 애기장대의 에스-아데노실메티오닌-디펜던트 메틸트렌스퍼레이즈와 81%의 상동성이 있음을 확인한 사진이다.
도 3은 본 발명을 검증하기 위하여 서울 배추 품종에 pRCV2 벡터(특허등록번호 제10-0446987호)가 도입된 형질전환 배추에 도입된 T-DNA를 서던 블랏 방법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 의해 실시된 정량적 real-time PCR 결과의 융해 곡선 분석(melting curve analysis)을 통한 증폭의 정확성 분석을 실시한 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명에 의해 실시된 정량적 real-time PCR 결과를 제조된 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 유전자 BrSMT1의 증폭 값을 기준으로 나머지 계통의 값을 delta-delta C_T법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5b는 본 발명에 의해 도입된 T-DNA 수가 분석된 결과를 각 계통별로 서던 블랏에서 확인된 T-DNA 수와 비교 분석한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 배추 속에서 1개의 copy 만 존재하는 내생 비교 유전자 발굴 및 이를 특이적으로 증폭하는 PCR 프라이머 제작

배추 속에서 1개만 존재하는 내생 유전자를 분리하기 위하여 the John Innes Centre(http://www.jic.ac.uk/)에서 제공하고 있는 Brassica DB(http:// brassica.nbi.ac.uk/ BrassicaDB/)를 이용하였다. 상기 데이터베이스의 Blast 분석을 이용한 게놈 분석(genome analysis)을 수행하여 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자 정보를 선발하였다.

상기 1차 분석된 정보를 NCBI의 BLAST로 2차 분석하여 배추 속에서 1개의 copy만 존재하는 내생 비교 유전자를 발굴하였다. 검색어는 애기장대(arabidopsis)로 하였다. 획득된 단백질 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) Genbank와 BLAST로 2차 검색하여 배추 속에서 가장 많은 일치율을 보이는 염기서열을 수집하였다.

수집된 염기서열 가운데, 높은 상동성을 보이는 부분을 BLAST 프로그램으로 찾은 뒤, 선발된 유전자를 GGbio(http://www.ggbio.com/)에서 제공하는 Flanking Sequence Tag Validator 프로그램(http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/)을 이용하여 배추 게놈(genome)에 1개의 copy만 존재함을 검증하였다.

분석 결과는 도 1과 같다. 최종 선발된 유전자는 NCBI의 BLAST 분석 결과 애기장대의 에스-아데노실메티오닌-디펜던트 메틸트렌스퍼레이즈(S-adenosyl methionine-dependent methyl transferase)로 추정되는 유전자(ACCESSION ID: NM_123170)와 81% 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

이에 따라 배추의 에스-아데노실메티오닌-디펜던트 메틸트렌스퍼레이즈(S-adenosyl methionine-dependent methyl transferase)로 추정되는 본 유전자를 BrSMT1으로 명명하였다. 분석 결과는 도 2와 같으며 BrSMT1 유전자의 염기서열은 서열번호 1과 같다.

BrSMT1 유전자를 정량적 real-time PCR을 진행하기 위한 특이적 프라이머를 제작하였다. 또한 real-time PCR 증폭 효율성을 극대화하기 위하여 증폭 단편의 크기를 100 bp 내외로 설정하였다. 이렇게 제작된 된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

[표 1]

실시예 2. 도입된 T- DNA 를 증폭하기 위한 프라이머의 제작

도입된 T-DNA를 특이적으로 증폭하는 염기서열을 기반으로 하여, 정량적 real-time PCR용 특이적 프라이머를 제작하였다.

각각의 프라이머는 효과적인 반응을 도모하기 위해 최소 18bp 이상으로 구성하여 주형 DNA에 특이적으로 결합하고 어닐링 온도를 57 내지 60℃로 하였다. 또한 real-time PCR 증폭 효율성을 극대화하기 위하여 증폭 단편의 크기를 100bp 내외로 설정하였다. 이에 따라 제작된 된 프라이머는 하기 표 2와 같다.

[표 2]

실시예 3. 정량적 real - time PCR 을 이용한 배추 내 도입된 T- DNA 수 분석

외부 DNA가 도입되어 돌연변이가 유발된 배추 속(Brassicarapas sp . pekinensis) 식물의 외부 DNA 도입 위치를 동정하기 위하여, 서울 배추 품종에 pRCV2 벡터(특허등록번호 제10-0446987호)가 도입된 형질전환 배추들의 gDNA를 각각 주형으로 사용하였다. gDNA 분리는 McCouch 등[McCouch SR, Kochert G, Yu ZH, Wang ZY, Khush GS, Coffman WR, Tanksley SD, 1998, Molecular mapping of rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 76:815-829]에 의해 제시된 방법을 이용하여 분리하였다. 그리고, 상기 각각의 형질전환 배추는 서던 블랏 방법으로 도입된 T-DNA의 수가 이미 확인된 것을 이용하였다.

이미 알려진 서던 블랏 결과는 도 3과 같으며, 도입된 T-DNA수는 표 3과 같다. 이후 확보된 gDNA를 주형으로 정량적 real-time PCR을 진행하였다.

[표 3]

3-1. 정량적 real - time PCR 반응

주형 gDNA는 200ng과 20ng의 2개를 사용하여 3회 반복으로, 상기 실시예 1에서 제조된 배추 속에서 1개만 존재하는 내생 유전자를 증폭하는 서열번호 2 및 3의 프라이머 쌍, 및 상기 실시예 2에서 제조된 도입된 T-DNA를 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍을 사용하여 Tag 중합효소(Tag polymerase)로 하기 프로토콜에 따라 real-time PCR 반응을 실시하였다.

[Real-time PCR 반응 프로토콜]

a. 예비 변성 단계: 95℃, 5분

b. 변성 단계: 95℃, 15초

c. 프라이머의 어닐링: 58℃, 15초

d. 신장 반응: 72℃, 30초(SYBR green 반응 검출)

e. b 단계로 35회 반복

3-2. 융해 곡선 분석 반응

상기 real-time PCR 반응 종료 후 반응 산물의 정확도를 확인하기 위하여 융해 곡선 분석 반응을 실시하였다. 반응은 상기 반응 산물을 이용하여 하기 프로토콜에 따라 실시하였다.

[융해곡선 분석 반응 프로토콜]

a. 예비 신장 단계: 72℃ 90초

b. 융해 분석 단계: 72℃ → 95℃ (매 5초 마다 1℃씩 상승, 동시에 SYBR green 값 분석)

3-3. 정량적 real - time PCR 결과 값 및 융해곡선 값 분석

정량적 real-time PCR 반응 종료 후 반응 결과의 융해 곡선 분석(melting curve analysis)을 통한 증폭의 정확성 분석을 실시하였다.

그 결과 T-DNA가 도입된 각 형질전환체에서 T-DNA-F(서열번호 4) 및 T-DNA-R(서열번호 5) 프라이머에 의해 증폭된 산물이 79.0 ± 0.11℃이고, 정량적 real-time PCR 값의 보정을 위한 1개만 존재하는 내생 유전자인 배추 SMT1의 경우 81.8 ± 0.13℃로 각각의 line이 모두 동일하게 증폭된 산물임을 확인하였다. 이에 따라 증폭된 산물 결과 및 발현 결과의 신뢰성을 확보하였다.

분석 결과는 도 4와 같다.

이후 신뢰성이 확보된 결과를 바탕으로 실시예 1에서 제조된 배추 속에서 1개만 존재하는 내생 유전자를 증폭 값을 기준으로 나머지 계통의 값을 delta-delta C_T법으로 분석하였다. 각각의 값의 보정은 배추의 BrSMT1의 발현 값을 이용하여 실시하였다.

또한 배추의 BrSMT1의 경우 T-DNA 수에 관계없이 모든 계통에 동일한 양이 들어 있기 때문에 각각의 배추 BrSMT1 C_T값을 2.646 × log(concentration)+27.246의 기준 서식으로 보정하였다. 이 기준 서식은 R² = 0.95로 높은 신뢰도를 가지고 있었다. 보정된 값을 바탕으로 각각의 시료의 값을 보정하였다.

분석 결과는 도 5a 및 도 5b와 같으며, 세부 분석 결과는 하기 표 4와 같다. 도입된 T-DNA 수 분석을 실시한 결과, No. 771 계통과 No. 813 계통을 제외하고는 모두 서던 블랏에서 확인한 T-DNA 수와 유사하게 나타났다.

[표 4]

여기서 No. 771과 No. 813 계통에서의 값의 차이는 유전자형과 관련이 있는 것으로 확인되었다.

본 실시예에서는 pRCV2 벡터가 도입된 형질전환 배추를 선발하여, Southern으로 도입된 T-DNA 수를 확인한 다음, 종자 증식을 위해 뇌수분으로 자가수분을 실시하였다.

이에 따라 T1 세대에서는 멘델의 법칙에 따라 동형접합성(homozygous)과 이형접합성(heterozygous)으로 분리되게 된다. 본 실험에서는 T1 종자를 직접 파종한 후 임의로 한 개채씩을 골라서 실험을 진행하였기 때문에, 각 개체별로 동형접합성과 이형접합성이 섞여 있었을 것으로 추정된다. 즉, No. 771과 No. 813은 동형접합성인 No.773 계통을 기준으로 비교할 때, 서던 블랏에서 확인한 T-DNA 수 보다 절반으로 분석되었기 때문에, No. 771 계통과 No. 813 계통은 이형접합체로 판정할 수 있다.

<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY <120> POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD FOR IDENTIFICATION OF INTRODUCED EXOTIC GENE NUMBER IN BRASSICACEAE <130> SDP50493 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1161 <212> DNA <213> Brassicaceae <400> 1 atgtcaactt cttcccagtc gtacccgatg agcgggggcg aagatctaca cagttacatc 60 cataattctt cgtaccagaa agcagccata gatagtcttc aagaaaagac aaggctatac 120 atcttagaaa agattgatct cctgagtctc aagaccggtc ttagtacttt cactattgcg 180 gattttgggt gttctgttgg ccctaacaca tttcatgctg ttcaaaacat tattgatgcg 240 gtgaaactca aacacatgaa agaaaacagt cttgtgtctc tggagttcct agtttgtttc 300 aacgatcaac ccaacaatga cttcaacaca ctctttagaa ctcaacctcc ttcctccgaa 360 cgagaatatt tctcagtcgg agttccaggc tctttttatg gccgagtgct accaagaaac 420 agcatccacg ttggacatac ttcctacacg attcattggc tttctaaagt tcccgaacat 480 gtatgtgaaa agaaatcacc agcatggaat aaaaagtaca ttcagtgtaa taatttgatt 540 gaagaagcgg caaaggctta caagatccag ttcacaaaag acatgagcac ttttcttgaa 600 gctagagccg cagagattgt gcctggagga ctgatgattt tacaaggaca atgtttgcct 660 gatggtgttc tcatgtctga aacttgggaa ggcattgtga ttgacaccat cggtgattgt 720 cttatggata tggaaaaatc ggaattgata agcgaggaaa aactcgagtc gtttagcgtg 780 ccgatatatt ttcctcagtt tagtgaattg aagggagaga ttgagcaaaa tggaagcttt 840 gcgattgaac tgatgcagac tataagccat ccatttcagg atatgcactt aaccaacgac 900 ttcaccactt ccacctttcg agctattttt agttctgtca tcgaaaaaca ttttggagaa 960 gatgtggtcg atgagttatt cgatcaactt actaagaagc tcaacaagta cccaattgat 1020 tttcaaaagt gcaagaaaca gatggtctat tgtatcgttc ttaaacgaaa tacgtagtat 1080 tgaaaatgat gatgacatgt tatgtcttca caagtcaggt cattatttaa atattgcttt 1140 gctctttaaa agagttttaa t 1161 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 caacgatcaa cccaacaatg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 3 tcggccataa aaagagcc 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 gatttcagcg tgtcctctcc a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gacgtaaggg atgacgcaca 20

Claims

외부 유전자의 삽입에 의해 발생한 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 도입된 외부 유전자 수를 분석하는 방법에 있어서,
상기 배추 속 식물의 gDNA(genomic DNA)를 준비하는 단계;
상기 배추 속 식물의 내생 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍과 상기 외부 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 반응을 통해 증폭된 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량을 비교하여 상기 도입된 외부 유전자의 수(number)를 분석하는 단계;를 포함하되,
상기 내생 유전자는 상기 배추 속 식물 유전체에 1 copy만 존재하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자인 것을 특징으로 하는 배추 속 식물에서 도입된 외부 유전자의 수를 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 PCR은 RT-PCR(real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 도입된 외부 유전자는 T-DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 내생 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍은 서열번호 2 및 3의 염기서열을 갖고, 상기 도입된 외부 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량 비교는 상기 PCR 반응 결과의 융해 곡선 분석(melting curve analysis); 및 실시한 증폭 반응의 delta-delta C_T 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 외부 유전자의 삽입에 의해 발생한 배추 속(Brassicaceae genus) 식물 돌연변이체의 T1 세대의 유전형을 분석하는 방법:
(a) 상기 배추 속 식물의 gDNA(genomic DNA)를 준비하는 단계;
(b) 상기 배추 속 식물의 유전체에 1 copy만 존재하는 내생 유전자인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍과 상기 외부 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 상기 내생 유전자와 상기 외부 유전자의 증폭량을 비교하여 상기 내생 유전자와 상기 외부유전자의 증폭량이 같은 수준인 경우 상기 배추 속 식물 돌연변이체의 T1 세대 유전형을 동형접합성(homozygous)으로 판정하고, 상기 외부 유전자의 증폭량이 상기 내생 유전자의 증폭량의 절반 수준인 경우 상기 배추 속 식물 돌연변이체 T1 세대의 유전형을 이형접합성(heterozygous)으로 판정하는 단계.
삭제
배추 속 식물의 도입된 외부 유전자의 수를 분석하는데 이용되고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 BrSMT1 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 2와 서열번호 3으로 이루어진 real-time PCR용 프라이머 쌍.