CZ2019473A3 - Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) - Google Patents

Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) Download PDF

Info

Publication number
CZ2019473A3
CZ2019473A3 CZ2019473A CZ2019473A CZ2019473A3 CZ 2019473 A3 CZ2019473 A3 CZ 2019473A3 CZ 2019473 A CZ2019473 A CZ 2019473A CZ 2019473 A CZ2019473 A CZ 2019473A CZ 2019473 A3 CZ2019473 A3 CZ 2019473A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
primers
marker
pcr amplification
fluorescently labeled
Prior art date
Application number
CZ2019473A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309548B6 (cs
Inventor
Jana Čmejlová
Jana RNDr. Čmejlová
Radek ÄŚmejla
Radek RNDr. Čmejla
Original Assignee
VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o. filed Critical VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority to CZ2019-473A priority Critical patent/CZ309548B6/cs
Publication of CZ2019473A3 publication Critical patent/CZ2019473A3/cs
Publication of CZ309548B6 publication Critical patent/CZ309548B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy, kteráobsahuje primery, jejichž sekvence jsou uvedeny na obr. 1.

Description

Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Oblast techniky
Řešení se týká sady primerů pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy a způsobů jejího použití pro odlišení jednotlivých genetických variant jabloní.
Dosavadní stav techniky
Jabloň domácí (Malus x domestica Borkh.) je velmi důležitou zemědělskou komoditou, která patří mezi 20 nej produktivnějších plodin na světě měřeno výnosem v tunách. Je pěstována převážně v oblastech mírného pásu na severní i jižní polokouli. Největším světovým pěstitelem je Čína, největším exportérem pak Polsko. Na konci minulého století bylo na světě popsáno více než 10 000 různých odrůd (Janick J, 1996) a nové neustále přibývají z důvodu snahy vylepšit současné odrůdy ať už z hlediska zvyšování rezistence k nej častějším jablečným patogenům, nebo z hlediska zlepšování jakosti plodů a ekonomiky jejich pěstování a skladování.
Jabloň domácí patří mezi cizosprašné rostliny, po opylení tedy vzniká hybridní genetický materiál nesoucí DNA pocházející od obou rodičů. Oproti tomu jsou odrůdy jabloní udržovány a množeny vegetativně roubováním, popřípadě očkováním na vhodné podnože, takže genetická informace je při tomto způsobu množení odrůd zachovávána beze změny a odpovídá původnímu zdrojovému organizmu. Jednotlivé odrůdy lze tak jednoznačně charakterizovat na úrovni DNA tzv. genotypizací. Znalost příslušných genotypů je pak možné využít např. pro ověřování pravosti odrůd jabloní, sledování segregace v potomstvu, stanovení rodičovské příbuznosti, fýlogenetické studie aj.
Genom jabloně domácí byl poprvé publikován v roce 2010 (Velasco R, 2010) a poté byl resekvenován na dvojitém haploidu v roce 2017 (Daccord N, 2017), kdy došlo ke zpřesnění jeho sekvence a celkové délky (přibližně 650 Mbp). Díky těmto pracím bylo zjištěno, že genom jabloně je značně složitý, a to z důvodu poměrně nedávné částečné duplikace genomu, kdy z původních 9 chromozómů vzniklo nynějších 17 chromozómů základní sady. V dřívějších dobách navíc došlo k rozsahově menším duplikacím některých částí genomu. Z tohoto důvodu se velké úseky sekvencí vyskytují na různých místech genomu, což velmi komplikuje molekulárně genetickou analýzu genomu jabloně. Další komplikací může být nestejný počet sad chromozómů vyskytující se u různých odrůd. Většina odrůd jabloně je diploidních, přibližně 10 % však tvoří triploidní odrůdy, vzácně se vyskytují dokonce i tetraploidní odrůdy (Janick J, 1996).
Pro charakterizaci jednotlivých odrůd nebo hybridů lze s výhodou využít genotypování pomocí SSR markérů (simple sequence repeats), kdy se využívá délkového polymorfýsmu jednotlivých alel, který lze jednoduše detekovat metodou fragmentační analýzy (obecné pojednání o SSR markérech a jejich použití pro genotypizací u rostlin lze nalézt např. ve Vieira ML, 2016). Metoda fragmentační analýzy sestává z kroků: 1) izolace DNA testovaného organizmu; 2) specifická PCR pro jednotlivé SSR markéry a 3) stanovení délky příslušných amplikonů, nejčastěji a nejpřesněji pomocí kapilární elektroforézy.
Pro jabloně byla nalezena řada SSR markérů vhodných pro genotypizací, popřípadě jiné účely, ale z důvodu srovnatelnosti výsledků mezi jednotlivými pracovišti je vhodné používat standardizovanou sadu. První sada využívala 12 SSR markérů amplifikovaných ve třech multiplexech, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry, avšak při použití těchto 12 SSR markérů byla při analýze 2 162 odrůd jabloní pěstovaných v East Malling Research (Velká Británie) identifikována řada odrůd se shodným genotypem. Část z nich tvořily známé klony a shoda genotypů u nich byla očekávána, u dalších se mohlo jednat o neznámé/nežádoucí duplicity
-1 CZ 2019 - 473 A3 v genofondu, ale též o náhodnou shodu v daných SSR markérech bez ohledu na příbuznost. Autoři proto doporučili pečlivé fenotypické porovnání a dodatečnou analýzu dalších SSR markérů pro odlišení těchto odrůd (Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010; Fernandez F, 2013). I přes nedostatky uvedené výše byla sada těchto 12 SSR markérů a postup jejich identifikace schváleny Evropským kooperativním programem pro rostlinné genetické zdroje (ECPGR; www.ecpar.cgsar.orgAvoikmg-groups/maluspvm-s) jako standardizovaný protokol pro identifikaci jabloní pro srovnatelnost výsledků mezi jednotlivými pracovišti.
V další studii proběhlé na jabloních byla pro snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými odrůdami tato sada rozšířena na 16 SSR markérů (Urrestarazu J, 2016), takže došlo k řádovému snížení možnosti genetické shody mezi odlišnými vzorky. Nevýhody této sady jsou však následující: 1) Sada 16 SSR markérů byla analyzována ve čtyřech multiplexech, kdy byly v každém multiplexu analyzovány 4 SSR markéry. Pro charakterizaci jednoho vzorku je tak nutné provést čtyři nezávislé analýzy, což analýzu značně prodražuje, zvyšuje se časová náročnost i pracnost celého postupu i pravděpodobnost vzniku chyby. 2) V sadě 16 SSR markérů jsou dva (Hi02c07; CH-Vfl), které se nacházejí na stejném chromozomu 1. Pro vyloučení vlivu vazby mezi jednotlivými markéry je však vhodnější, aby každý marker pocházel z jiného chromozomu. 3) Sada 16 SSR markérů tak pokrývá pouze 15 chromozomů z celkových 17. Pro další snížení pravděpodobnosti náhodné shody mezi odlišnými vzorky by proto bylo výhodné použít sadu 17 SSR markérů, z nichž každý pochází z jiného chromozomu, a pro omezení nákladů, pracnosti a možnosti vzniku chyb by bylo výhodné provádět analýzu všech 17 SSRmarkerů v jediné reakci.
Podstata vynálezu
Nedostatky dle současného stavu techniky - nevyužívání markérů, které by ležely každý na jiném chromozomu - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že byl vypuštěn druhý marker z chromozomu 1 (CH-Vfl ) a nově byly zařazeny markéry NZ01a6 pro chromozom 4 a CH05e04 pro chromozom 16; ostatní markéry doporučené ECPGR byly zachovány pro zajištění zpětné kompatibility výsledků.
Nedostatky dle současného stavu techniky - zejména nezbytnost provádět čtyři nezávislé analýzy pro charakterizaci každého vzorku a s tím související finanční a časová náročnost, pracnost a potenciálně vyšší chybovost - odstraňuje sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1:
SEQ ID NO. 2:
SEQ ID NO. 3 :.
SEQ ID NO. 4:.
SEQ ID NO. 5:
SEQ ID NO. 6: ।
SEQ ID NO. 7:.
SEQ ID NO. 8:
SEQ ID NO. 9:
SEQ ID NO. 10
SEQ ID NO. 11
SEQ ID NO. 12
SEQ ID NO. 13
SEQ ID NO. 14
SEQ ID NO. 15
SEQ ID NO. 16
TCTACAACAAAATACCCAATACACC CTAAGCATCCCGATTGAAAGG AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC GAATGTGAGGCGTTCCTGAG ATTCCCTGGCGAGAAAAGC CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG TAGATCCGGTCACTCTCCACT ): AACACCCCATCAATCAGAAAGA : TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC I: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG < GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG : GCCTTTGTAATCATGGCTCC i: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA .: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
- 2 CZ 2019 - 473 A3
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
NO. 17
NO. 18
NO. 19
NO. 20
NO. 21
NO. 22
NO. 23
NO. 24
NO. 25
NO. 26
NO. 27
NO. 28
NO. 29
NO. 30
NO. 31
NO. 32
NO. 33
NO. 34
AAAACCCTAGCCCCACGGAG ACTCTCCATCGGGCTCCAC CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC GCTCTTCCAAAATGGCGTAC ATATTTGACATTGGTCATGAGACG GAGAAGAACAACAACAGAGAACG GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG CAGTGTTACCCGCCAAATATC GATCGGAAGGCGAAAGACTC AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG CCCTCATGCCCTCCACTAAC CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA AGGATGACCTTGAGATTGATGC TTGAACTTCGACCGCAACACCA ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG GAAAGACTTGCAGTGGGAGC TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZ01a6 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05fD6 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA,
-3CZ 2019 - 473 A3 přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO . 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhlO obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO . 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01f03b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02cll obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01fí)2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GD147 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC,
-4CZ 2019 - 473 A3 přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhOl obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
Výše uvedené primery SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 15 a SEQ ID NO. 33 vykazují homologii vyšší než 90% k primerům z Liebhard R, 2002. V tomto dokumentu však autoři neuvažovali použít primery k vytvoření systému pro současnou detekci všech markérů v jediné reakci; výše uvedené primery pro amplifikaci příslušných SSR markérů byly navíc použity v kombinaci s jinými párovými primery než v citovaném dokumentu; a míra shody výše citovaných primerů s primery dle tohoto vynálezu je koincidencí, neboť ve všech případech je příslušná genomická oblast výhodná pro návrh primerů pro amplifikaci příslušného markéru.
Výše uvedené kombinace primerů pro amplifikaci jednotlivých SSR markérů jsou vhodné pro současnou nebo individuální analýzu výše uvedených markérů u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) metodou fragmentační analýzy. Ve výhodném provedení technického řešení jsou PCR amplikony příslušných SSR markérů detekovány pomocí kapilární elektroforézy s tím, že každý amplikon je fluorescenčně označen. Fluorescenční označení amplikonů je zajištěno použitím fluorescenčně značeného primerů v PCR reakci tak, aby bylo možné amplikon identifikovat. V ještě výhodnějším provedení technického řešení jsou amplikony označeny pomocí odlišných fluoroforů pro jednotlivé SSR markéry v takové kombinaci, která umožňuje současnou detekci a jednoznačnou identifikaci všech 17 SSR markérů v jedné reakci.
Návrh sady primerů podle technického řešení pro stanovení genotypu jabloně domácí (Medus x domestica Borkh.) byl proveden v několika krocích: 1) analýza sekvencí použitých SSR markérů, zejména s ohledem na výše uvedené duplikace genomu jabloně; 2) optimalizace kombinace délek amplikonů a fluorescenčního značení fragmentů, která by umožňovala současnou detekci všech 17 SSR markérů v jedné reakci; 3) návrh primerů pro detekci jednotlivých SSR markérů; 4) optimalizace PCR podmínek.
-5CZ 2019 - 473 A3
Prvním krokem pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) je izolace genomové DNA, následuje PCR s využitím sady primerů pro specifickou amplifikaci výše uvedených SSR markérů a stanovení délky amplikonů pomocí fragmentační analýzy využívající kapilární elektroforézu. Finálním krokem je vyhodnocení přítomnosti jednotlivých alel pro každý SSR marker.
Příklady provedení technického řešení jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojeným nárokem a podrobně popsána v popisu technického řešení. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR, uvedených primerů a fluorescenčního označení primerů tak, aby nedošlo ke snížení specificity PCR detekce jednotlivých SSR markérů. Odborník v oboru bude schopen též snížit počet současně detekovaných SSR markérů v jedné reakci, případně vytvořit nové kombinace detekovaných SSR markérů pomocí uvedených primerů v jedné reakci.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Návrh sekvencí primerů
Do kolekce SSR markérů byly přidány markéry pro chromozom 4 (NZOlaó; Guilford P, 1997) a chromozom 16 (CH05e04; Liebhard R, 2002), neboť jsou velmi polymorfhí, atak vhodné pro účely genotypování.
Pro detekci všech 17 S SR markérů v j edné reakci byly navrženy nové primery pro PCR amplifikaci jednotlivých SSR markérů tak, aby celý systém fúngoval ve své komplexnosti a amplifikované fragmenty měly správnou délku umožňující jejich jednoznačnou identifikaci pomocí fragmentační analýzy.
Sekvence jednotlivých SSR markérů a jejich okolí byly získány z referenčního genomu jabloně domácí Malus x domestica Borkh., odrůda Golden Delicious, Annotation Version 102; Genome Reference Number: ASM211411vl.
Na základě homologií k dalším chromozomálním oblastem jabloně byly jednotlivé SSR markéry rozděleny do zamýšlených velikostních pásem amplifikovaných produktů v kombinaci s příslušnými fluorofory tak, aby bylo možné provést specifickou amplifikaci a detekci všech 17 SSR markérů v jedné reakci.
Primery byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance. Při navrhování primerů pro multiplexovou PCR analýzu byly zohledněny následující požadavky: 1) vysoká specificita primerů eliminující necílené amplifikace z důvodu parciální duplikace genomu jabloně; 2) obdobná teplota tání všech primerů; 3) eliminace tvorby dimerů mezi jednotlivými primery.
Přehled sekvencí primerů, jejich nasedání na referenční sekvence a očekávané velikosti amplikonů pro jednotlivé SSR markéry pro příslušné chromozomy ukazuje Tabulka 1.
-6CZ 2019 - 473 A3
Tabulka 1. Souhrnné informace o použitých primerech
Chromozom SSR marker Velikostní pásmo (bp) SEQ ID NO. Referenční sekvence v GenBank (pozice) Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastupuje A nebo T)
1 Hi02c07 a) 400-450 SEQ ID NO. 1 NC_041789.1 (1745900617458982) TCTACAACAAAATACCCAATAC ACC
SEQ ID NO. 2 NC_041789.1 (1745860717458627) CTAAGCATCCCGATTGAAAGG
2 CH02c06 b) 400-450 SEQ ID NO. 3 NC_041790.1 (2011732020117296) AGTTTCGTAAGAGAACCTTGAT CTC
SEQ ID NO. 4 NC_041790.1 (2011689320116917) ATCCACTTACTAAGAACTACCG TTG
3 GD12C) 300-350 SEQ ID NO. 5 NC_041791.1 (1669290816692931) TTCTTCTATGAACGGTGATAAA GC
SEQ ID NO. 6 NC_041791.1 (1669321516693196) GAATGTGAGGCGTTCCTGAG
4 NZOlaó d) 450-500 SEQ ID NO. 7 NC_041792.1 (2939965829399640) ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
SEQ ID NO. 8 NC_041792.1 (2939915829399177) CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG
5 CH05f06 b) 400-450 SEQ ID NO. 9 NC_041793.1 (2237304822373028) TAGATCCGGTCACTCTCCACT
SEQ ID NO. 10 NC_041793.1 (2237264022372661) AACACCCCATCAATCAGAAAG A
6 CH03d0 7 b) 200-250 SEQ ID NO. 11 NC_041794.1 (8113628-8113604) TGTGAAATGTAATTCAAATCAA TGC
SEQ ID NO. 12 NC_041794.1 (8113416-8113435) TTGAGAAAATGGGGCTTCTG
7 CH04e05 b) 200-250 SEQ ID NO. 13 NC_041795.1 (1731488117314902) GAGAAGGCTAACAGAAATGTG G
SEQ ID NO. 14 NC_041795.1 (1731507017315051) GCCTTTGTAATCATGGCTCC
8 CHOlhl Ob) 100-150 SEQ ID NO. 15 NC_041796.1 (2744400627444029) GCAAAGATAGGTAGATATATGC CA
SEQ ID NO. 16 NC_041796.1 (2744409827444079) AAGGAGGGATTGTTTGTGCA
-7 CZ 2019 - 473 A3
Chromozom SSR marker Velikostní pásmo (bp) SEQ ID NO. Referenční sekvence v GenBank (pozice) Sekvence 5 -3' (dle IUPAC: W zastupuje A nebo T)
9 CH01Í03 bb) 100-150 SEQ ID NO. 17 NC_041797.1 (9725625-9725644) AAAACCCTAGCCCCACGGAG
SEQ ID NO. 18 NC_041797.1 (9725755-9725737) ACTCTCCATCGGGCTCCAC
10 CH02cll b) 400-450 SEQ ID NO. 19 NC_041798.1 (2426165224261675) CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGC G
SEQ ID NO. 20 NC_041798.1 (2426209124262067) GAAACACATTTATAGAAAAAG GAGC
11 CH02d0 8b) 300-350 SEQ ID NO. 21 NC_041799.1 (9734418-9734437) GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
SEQ ID NO. 22 NC_041799.1 (9734728-9734705) ATATTTGACATTGGTCATGAGA CG
12 CH01f02 b) 300-350 SEQ ID NO. 23 NC_041800.1 (2363044123630419) GAGAAGAACAACAACAGAGA ACG
SEQ ID NO. 24 NC_041800.1 (2363013923630160) GAAATAGGGTAGCAGCAGATG G
13 GD147C) 300-350 SEQ ID NO. 25 NC_041801.1 (8149400-8149420) CAGTGTTACCCGCCAAATATC
SEQ ID NO. 26 NC_041801.1 (8149730-8149711) GATCGGAAGGCGAAAGACTC
14 CH04c07 b) 200-250 SEQ ID NO. 27 NC_041802.1 (2420536524205385) AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
SEQ ID NO. 28 NC_041802.1 (2420558124205562) CCCTCATGCCCTCCACTAAC
15 CH02c09 b) 200-250 SEQ ID NO. 29 NC_041803.1 (5015944650159469) CAACTTTGCTAACCTCTCATTG AA
SEQ ID NO. 30 NC_041803.1 (5015968050159659) AGGATGACCTTGAGATTGATGC
16 CH05e04 b) 100-150 SEQ ID NO. 31 NC_041804.1 (4351657-4351678) TTGAACTTCGACCGCAACACC A
SEQ ID NO. 32 Pro A: NC_041804.1 (4351789-4351768) Pro T: vlastní sekvence ACATGGWTAAGGCATAGTCAG G
17 CHOlhO lb) 100-150 SEQ ID NO. 33 NC_041805.1 (6601384-6601365) GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
SEQ ID NO. 34 NC_041805.1 (6601260-6601281) TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAG G
SSR markéry popsány v: a) Silfverberg-Dilworth E, 2006; b) Liebhard R, 2002; c) Hokanson SC, 1998; d) Guilford P, 1997
-8CZ 2019 - 473 A3
Příklad 2: Stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Pro amplifikaci SSR markérů byla použita DNA izolovaná z listů jabloně domácí (Malus x 5 domestica Borkh.) soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
ίο Tabulka 2. Koncentrace a fluorescenční značení použitých primerů
Primer SEQ ID NO. Fluorescenční značení Výsledná koncentrace nM
SEQ ID NO. 1 - 625
SEQ ID NO. 2 PET 625
SEQ ID NO. 3 víc 750
SEQ ID NO. 4 - 750
SEQ ID NO. 5 víc 625
SEQ ID NO. 6 - 625
SEQ ID NO. 7 NED 250
SEQ ID NO. 8 - 250
SEQ ID NO. 9 NED 375
SEQ ID NO. 10 - 375
SEQ ID NO. 11 FAM 500
SEQ ID NO. 12 - 500
SEQ ID NO. 13 - 312,5
SEQ ID NO. 14 víc 312,5
SEQ ID NO. 15 víc 312,5
SEQ ID NO. 16 - 312,5
SEQ ID NO. 17 PET 87,5
SEQ ID NO. 18 - 87,5
SEQ ID NO. 19 FAM 750
SEQ ID NO. 20 - 750
SEQ ID NO. 21 FAM 250
SEQ ID NO. 22 - 250
SEQ ID NO. 23 NED 212,5
SEQ ID NO. 24 - 212,5
SEQ ID NO. 25 PET 312,5
SEQ ID NO. 26 - 312,5
SEQ ID NO. 27 PET 187,5
SEQ ID NO. 28 - 187,5
SEQ ID NO. 29 NED 250
SEQ ID NO. 30 - 250
SEQ ID NO. 31 FAM 187,5
SEQ ID NO. 32 - 187,5
SEQ ID NO. 33 NED 162,5
SEQ ID NO. 34 - 162,5
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
-9CZ 2019 - 473 A3
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Výsledkem je získání spektra alel pro každý SSR marker, které je unikátní pro danou genetickou variantu jabloně.
Příklad 3: Ověření shodnosti dvou odrůd jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno porovnání dvou neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) s cílem zjistit, zda se jedná o stejnou odrůdu.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifíkace probíhala v PCR cyklem C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů u obou vzorků jabloní bylo zjištěno, že oba vzorky vykazují stejné alely ve všech SSR markérech a jsou tedy geneticky shodné - oba vzorky jsou tedy stejná odrůda jabloně.
Příklad 4: Ověření identity odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Bylo provedeno ověření identity neznámých vzorků jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), o kterých se majitel domníval, že se jedná o odrůdy „Fragrance“ a „Golden Delicious“.
Z listů obou vzorků byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifíkace probíhala v PCR cyklem C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo zjištěno, že vzorek označený jako odrůda „Fragrance“ neodpovídá referenční odrůdě „Fragrance“ uchovávané v genofondech jabloní přihlašovatele; naopak vzorek označený jako „Golden Delicious“ vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Golden Delicious“.
Příklad 5: Určení neznámé odrůdy jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
-10CZ 2019 - 473 A3
Bylo provedeno určení odrůdy u neznámého vzorku jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), u které nebyly známy další informace.
Z listů neznámého vzorku byla provedena izolace DNA soupravou Exgene Plant SV (GeneAll) podle návodu výrobce. Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ DNA (10 ng/ml); 5 μΐ Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), primery v koncentracích a fluorescenčně označené dle Tabulky 2 v Příkladu 2, PCR voda do celkového objemu 10 μΐ.
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 98 °C/30 s; cyklování: 23x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); závěrečná extenze 72 °C/15 s.
Fragmentační analýza amplikonů byla provedena s využitím genetického analyzátoru AB3500 (ThermoFisher Scientific), vyhodnocení bylo provedeno pomocí GeneMapper® Software 5 (ThermoFisher Scientific).
Na základě porovnání spektra alel příslušných SSR markérů s databází referenčních odrůd bylo zjištěno, že neznámý vzorek vykazoval spektrum alel, které bylo identické s referenční odrůdou „Boskoopské“.
Průmyslová využitelnost
Nově navržené primery byly optimalizovány pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy s využitím 17 SSR markérů. Rozšířená sada SSR markérů a nová sada primerů oproti dosavadnímu stavu techniky zpřesňují, zrychlují a zlevňují genotypování jabloní, které je využitelné jak pro ověřování pravosti odrůd jabloní (např. ověřování školkařského materiálu, prověřování identity registrovaných odrůd jabloní, testování odrůdové pravosti prodávaných jablek), tak pro vědecké účely (např. cílené šlechtění).
Seznam použité literatury
Daccord N, Celton JM, Linsmith G, Becker C, Choisne N, Schijlen E, van de Geest H, Bianco L, Micheletti D, Velasco R, Di Pierro EA, Gouzy J, Rees DJG, Guérif P, Muranty H, Duřel CE, Laurens F, Lespinasse Y, Gaillard S, Aubourg S, Quesneville H, Weigel D, van de Weg E, Troggio M, Bucher E. High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development. Nature Genetics (2017) 49, 1099-1106 Fingerprinting the National Apple & Pear Collections, Research Project Final Report, 2010,
Fernandez FF. Common set of ECPGR SSR markers for Malus characterization. In: Lateur M., Ordidge M., Engels J. and Lipman E. Report of a Working Group on Malus/Pyrus. Fourth Meeting, 7-9 March 2012, Weggis, Switzerland. Biodiversity International, Rome, Italy (2013) 26-27
Guilford P, Prakash S, Zhu JM, Rikkerink E, Gardiner S, Bassett H, Forster R. Microsatellites in Malus X domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics (1997) 94(2), 249-254
Hokanson SC, Szewc-McFadden AK, Lamboy WF, McFerson JR. Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malus x domestica Borkh. core subset collection. Theor Appl Genet. (1998) 97, 671-83
Janick J, Moore JN. Fruit breeding. Volume I: Tree and Tropical Fruits. New York: Wiley (1996)
-11 CZ 2019 - 473 A3
Liebhard R, Gianfranceschi L, Koller B, Ryder CD, Tarchini R, van de Weg E, Gessler C. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.). Mol Breed. (2002) 10(4):217-41
Silfverberg-Dilworth E, Matasci CL, van de Weg WE, van Kaauwen MPW, Walser M, Kodde LP, Soglio V, Gianfranceschi L, Duřel CE, Costa F, Yamamoto T, Koller B, Gessler C, Patocchi A. Microsatellite markers spanning the apple (Malus x domestica Borkh.) genome. Tree Genet Genomes. (2006) 2, 202-24
Urrestarazu J, Denancé C, Ravon E, Guyader A, Guisnel R, Feugey L, Poncet C, Lateur M, Houben P, Ordidge M, Fernandez-Fernandez F, Evans KM, Paprstein F, Sedlák J, Nybom H, GarkavaGustavsson L, Miranda C, Gassmann J, Kellerhals M, Suprun I, Pikunova AV, Krasova NG, Torutaeva E, Dondini L, Tartarini S, Laurens F, Duřel CE. Analysis of the genetic diversity and structure across a wide range of germplasm reveals prominent gene flow in apple at the European level. BMC Plant Biol. (2016) 16(1):130
Velasco R, Zharkikh A, Affburtit J, Dhingra A, Cestaro A, Kalyanaraman A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio M, Pruss D, Salvi S, Pindo M, Baldi P, Castelletti S, Cavaiuolo M, Coppola G, Costa F, Cova V, Dal Ri A, Goremykin V, Komjanc M, Longhi S, Magnago P, Malacame G, Malnoy M, Micheletti D, Moretto M, Perazzolli M, Si-Ammour A, Vezzulli S, Zini E, Eldredge G, Fitzgerald LM, Gutin N, Lanchbury J, Macalma T, Mitchell JT, Reid J, Wardell B, Kodira C, Chen Z, Desany B, Niazi F, Palmer M, Koepke T, Jiwan D, Schaeffer S, Krishnan V, Wu C, Chu VT, King ST, Vick J, Tao Q, Mraz A, Stormo A, Stormo K, Bogden R, Ederle D, Stella A, Vecchietti A, Kater MM, Masiero S, Lasserre P, Lespinasse Y, Allan AC, Bus V, Chagné D, Crowhurst RN, Gleave AP, Lavezzo E, Fawcett JA, Proost S, Rouzé P, Stěrek L, Toppo S, Lazzari B, Hellens RP, Durel CE, Gutin A, Bumgamer RE, Gardiner SE, Skolnick M, Egholm M, Van de Peer Y, Salamini F, Viola R. The genome of the domesticated apple (Malus χ domestica Borkh.). Nat. Genet. (2010) 42, 833— 839
Vieira ML, Santini L, Diniz AL, Munhoz Cde F. Microsatellite markers: what they mean and why they are so useful. Genet Mol Biol. (2016) 39(3):312-28

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sada primerů pro stanovení genotypu jabloně (Malus x domestica Borkh.) v jediné reakci metodou fragmentační analýzy, vyznačující se tím, že obsahuje primery, jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 1:
    SEQ ID NO. 2:
    SEQ ID NO. 3 :.
    SEQ ID NO. 4:.
    SEQ ID NO. 5:
    SEQ ID NO. 6:
    SEQ ID NO. 7:.
    SEQ ID NO. 8:
    SEQ ID NO. 9:
    SEQ ID NO. 10
    SEQ ID NO. 11
    SEQ ID NO. 12
    SEQ ID NO. 13
    SEQ ID NO. 14
    SEQ ID NO. 15
    SEQ ID NO. 16
    SEQ ID NO. 17
    SEQ ID NO. 18
    SEQ ID NO. 19
    SEQ ID NO. 20
    SEQ ID NO. 21
    SEQ ID NO. 22
    SEQ ID NO. 23
    SEQ ID NO. 24
    SEQ ID NO. 25
    SEQ ID NO. 26
    SEQ ID NO. 27
    SEQ ID NO. 28
    SEQ ID NO. 29
    SEQ ID NO. 30
    SEQ ID NO. 31
    SEQ ID NO. 32
    SEQ ID NO. 33
    SEQ ID NO. 34
    TCTACAACAAAATACCCAATACACC CTAAGCATCCCGATTGAAAGG AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC GAATGTGAGGCGTTCCTGAG ATTCCCTGGCGAGAAAAGC CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG TAGATCCGGTCACTCTCCACT ): AACACCCCATCAATCAGAAAGA : TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC !: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG ): GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG k GCCTTTGTAATCATGGCTCC ): GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA >: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA k AAAACCCTAGCCCCACGGAG ): ACTCTCCATCGGGCTCCAC >: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG ): GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC : GCTCTTCCAAAATGGCGTAC k ATATTTGACATTGGTCATGAGACG ): GAGAAGAACAACAACAGAGAACG : GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG ): CAGTGTTACCCGCCAAATATC >: GATCGGAAGGCGAAAGACTC k AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG !: CCCTCATGCCCTCCACTAAC >: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA ): AGGATGACCTTGAGATTGATGC : TTGAACTTCGACCGCAACACCA k ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG ): GAAAGACTTGCAGTGGGAGC : TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru Hi02c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 1: TCTACAACAAAATACCCAATACACC
    SEQ ID NO. 2: CTAAGCATCCCGATTGAAAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 3: AGTTTCGTAAGAGAACCTTGATCTC
    SEQ ID NO. 4: ATCCACTTACTAAGAACTACCGTTG,
    -13 CZ 2019 - 473 A3 přičemž pro PCR amplifikaci markéru GDI2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO . 5: TTCTTCTATGAACGGTGATAAAGC
    SEQ ID NO. 6: GAATGTGAGGCGTTCCTGAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru NZOlaó obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 7: ATTCCCTGGCGAGAAAAGC
    SEQ ID NO . 8: CTTGGTAGGTGTCGGAGCAG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05Í06 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 9: TAGATCCGGTCACTCTCCACT
    SEQ ID NO. 10: AACACCCCATCAATCAGAAAGA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH03d07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 11: TGTGAAATGTAATTCAAATCAATGC
    SEQ ID NO. 12: TTGAGAAAATGGGGCTTCTG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04e05 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 13: GAGAAGGCTAACAGAAATGTGG
    SEQ ID NO. 14: GCCTTTGTAATCATGGCTCC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhlO obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO . 15: GCAAAGATAGGTAGATATATGCCA
    SEQ ID NO. 16: AAGGAGGGATTGTTTGTGCA, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01fí)3b obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 17: AAAACCCTAGCCCCACGGAG
    SEQ ID NO. 18: ACTCTCCATCGGGCTCCAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02cll obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 19: CTGAGGTATTATTTTGTTTCTGCG
    SEQ ID NO. 20: GAAACACATTTATAGAAAAAGGAGC,
    -14CZ 2019 - 473 A3 přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02d08 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO . 21: GCTCTTCCAAAATGGCGTAC
    SEQ ID NO. 22: ATATTTGACATTGGTCATGAGACG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH01fí)2 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 23: GAGAAGAACAACAACAGAGAACG
    SEQ ID NO. 24: GAAATAGGGTAGCAGCAGATGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru GD147 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 25: CAGTGTTACCCGCCAAATATC
    SEQ ID NO. 26: GATCGGAAGGCGAAAGACTC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH04c07 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 27: AGGAAGGCTGGTTATCTTGTG
    SEQ ID NO. 28: CCCTCATGCCCTCCACTAAC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH02c09 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 29: CAACTTTGCTAACCTCTCATTGAA
    SEQ ID NO. 30: AGGATGACCTTGAGATTGATGC, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CH05e04 obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 31: TTGAACTTCGACCGCAACACCA
    SEQ ID NO. 32: ACATGGWTAAGGCATAGTCAGG, přičemž pro PCR amplifikaci markéru CHOlhOl obsahuje sada primery, z nichž jeden je vhodně fluorescenčně označen pro současnou detekci všech markérů v průběhu fragmentační analýzy, a jejichž sekvence jsou
    SEQ ID NO. 33: GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
    SEQ ID NO. 34: TTTAGGAGTGGGTTTGAGAAGG.
CZ2019-473A 2019-07-19 2019-07-19 Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) CZ309548B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) 2019-07-19 2019-07-19 Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) 2019-07-19 2019-07-19 Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019473A3 true CZ2019473A3 (cs) 2021-01-27
CZ309548B6 CZ309548B6 (cs) 2023-04-05

Family

ID=74188272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-473A CZ309548B6 (cs) 2019-07-19 2019-07-19 Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309548B6 (cs)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101649589B1 (ko) * 2014-04-09 2016-08-31 경북대학교 산학협력단 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CZ309548B6 (cs) 2023-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sargent et al. A microsatellite linkage map for the cultivated strawberry (Fragaria× ananassa) suggests extensive regions of homozygosity in the genome that may have resulted from breeding and selection
US8692064B2 (en) Quantitative trait loci associated with soybean cyst nematode resistance and methods of their use
JP5788162B2 (ja) キノコの菌体選別方法及びキット
KR102141091B1 (ko) 토종닭의 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도
US20160265070A1 (en) Copy number detection and methods
Reshma et al. Molecular markers and its application in animal breeding
CN114606332A (zh) 用于判断西瓜果肉硬度的SNP位点、Hf-KASP1标记及其应用
Sabir et al. Applying molecular tools for improving livestock performance: From DNA markers to next generation sequencing technologies
Sheick et al. Characterization of a novel S-RNase allele and genotyping of new apple cultivars
KR101987666B1 (ko) 배 품종 식별용 조성물
BR102014005635B1 (pt) Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja
NL2026532B1 (en) InDel MOLECULAR MARKERS CLOSELY LINKED TO RICE HEADING DATE GENES AND APPLICATION THEREOF
CZ2019473A3 (cs) Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
CZ33375U1 (cs) Sada pro stanovení genotypu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
KR102439855B1 (ko) 토종닭 또는 육계 신품종을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
Cova et al. Exploiting expressed sequence tag databases for mapping markers associated with fruit development and fruit quality in apple
CN107177665B (zh) 功能连锁标记0707-1及其在玉米种质改良中的应用
Ahmed et al. Genetic Diversity in Bibrik Sheep of Pakistan Elucidated through Molecular Characterization
Singh et al. Molecular markers exploited in crop improvement practices
López-Girona et al. A high-throughput S-RNase genotyping method for apple
Sajana et al. Marker-assisted confirmation of maternal or zygotic origin of embryogenic cultures and regenerated plantlets of two polyembryonic mango cultivars using SSR markers
Abebe Genotype by sequencing method and its application for crop improvement (a review)
KR101515861B1 (ko) 배추 속 식물의 외래 유전자 도입 수 확인을 위한 중합효소 연쇄반응 분석 방법
CN109536633A (zh) 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用
KR102261338B1 (ko) 배의 세포질 유전자 웅성불임성 회복 관련 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 InDel 분자마커 및 이의 용도