CZ34114U1 - Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.) - Google Patents

Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.) Download PDF

Info

Publication number
CZ34114U1
CZ34114U1 CZ2020-37606U CZ202037606U CZ34114U1 CZ 34114 U1 CZ34114 U1 CZ 34114U1 CZ 202037606 U CZ202037606 U CZ 202037606U CZ 34114 U1 CZ34114 U1 CZ 34114U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
allele
seq
columnar
apple
primers
Prior art date
Application number
CZ2020-37606U
Other languages
English (en)
Inventor
Jana Čmejlová
Radek ÄŚmejla
Original Assignee
VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o. filed Critical VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.
Priority to CZ2020-37606U priority Critical patent/CZ34114U1/cs
Publication of CZ34114U1 publication Critical patent/CZ34114U1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.)
Oblast techniky
Řešení se týká sady primerů a sond pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.), která umožňuje současně detekovat alelu divokého typu a mutovanou alelu způsobující sloupcový růst jabloní, kde mutovaná alela pochází z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’. Uvedená sada je vhodná pro molekulárními markéry asistovanou selekci jabloně s potenciálním sloupcovým růstem metodou PCR v reálném čase.
Dosavadní stav techniky
Přirozená architektura jabloně (Malus x domestica Borkh.) je velmi důležitou charakteristikou pro pěstitele, jelikož má vysoký dopad na produkci plodů, náklady a množství práce potřebné pro udržování sadů. Pro vysokou produkci plodů na hektar potřebují stromy s obvyklým habitem velmi intenzivní péči, zejména řez, a obvykle také vyžadují opěrné systémy, které představují vysoké ekonomické náklady. Existuje však přirozeně vzniklá mutace, která velmi ovlivňuje architekturu jabloní a navozuje růst téměř ideálního sloupcového tvaru stromu. Tato mutace byla identifikována v šedesátých letech minulého století v Kanadě jako spontánní mutantní výhon na odrůdě s normálním růstem ‘Mclntosh’ a byla nazvána ‘Mclntosh Wijcik’ po jejím objeviteli (Fisher, 1970). Sloupcový habitus je geneticky daný znak, který se projevuje kompaktním růstem s krátkými intemodii, omezeným počtem bočních výhonů a bohatým obrostem krátkých plodonošů (Fisher, 1970; Petersen, 2013). Tento habitus umožňuje v sadech velmi hustou dvouřadou výsadbu stromů ve sponu 0,50 m x 0,50 m x 3,00 m s přibližně 10 000 stromy na hektar, v důsledku čehož se velmi výrazně zvyšují výnosy z osázené plochy. Sad osázený jabloněmi se sloupcovým růstem vyžaduje minimální řez a není nutné budovat opěrný systém (Petersen, 2013). Sloupcové jabloně také vykazují časnější kvetení, což umožňuje návratnost nákladů v kratší době (cca po 4 letech) než u jabloní s normálním růstem (Zhang, 2011; Petersen, 2013). Sloupcové jabloně zároveň produkují vyšší výtěžky zjednoho stromu než standardní jabloně (Lazar, 2015) a jsou odolnější i vůči suchu. Vzhledem k tomu, že jsou plody nahloučené v krátké vzdálenosti od kmene, může být v sadech použita mechanizace pro strojovou sklizeň, což dále snižuje náklady a pracnost. Výše uvedené vlastnosti proto činí sloupcové odrůdy jabloní velmi atraktivní pro pěstitele jablek.
Bohužel tyto jabloně také velmi často vykazují střídavou plodnost (Blažek, 2011) a první vyšlechtěné sloupcové odrůdy nebyly vhodné pro pěstování k tržnímu účelu pro špatné chuťové vlastnosti, krátkou skladovatelnost a vysokou citlivost k chorobám (Petersen, 2013). V současnosti registrované sloupcové odrůdy z druhé generace křížení, jako jsou například Cumulus, Rondo, Redcats nebo Pompink, mají mnohem lepší vlastnosti, avšak přesto stále nacházejí uplatnění pouze v malých zahradách, úzkých prostorech a nádobách a jejich rozšíření do sadů není běžné. Velkopěstiteli jsou požadovány vynikající růstové/plodové vlastnosti, kterých současné sloupcové odrůdy zatím nedosahují. Z těchto důvodů jsou každoročně po celém světě prováděna nová a nová křížení, aby byly vyprodukovány excelentní odrůdy sloupcových jabloní.
Identifikace sloupcového růstu u semenáčů na základě jejich fenotypu však může být spolehlivě provedena nejdříve po 2 až 3 letech pěstování (Blažek, 1992; Baldi, 2012), přesto i po této době zůstává řada fenotypů s nejednoznačným růstem (Baldi, 2012; Petersen, 2013), což přináší nemalé náklady a zbytečnou práci vynaložené na udržování nechtěných hybridů. Proto je velmi potřebný vývoj jednoduché, spolehlivé a rychlé metody pro molekulárními markéry asistovanou selekci jabloní se sloupcovým růstem, která by umožňovala selekci již ve stádiu několikatýdenních semenáčů.
- 1 CZ 34114 U1
Dlouhou dobu byla hledána příčinná mutace sloupcového růstu. Na základě křížení a segregace fenotypů bylo určeno, že se jedná o monogenní dominantní alelu nazvanou (Co) (z anglického „Columnar“), jelikož mutantní fenotyp segregoval přibližně v poměru 1:1 s normálním růstem (Lapins, 1969). Conner a kol. (1997) zamapovali odpovídající lokus na chromozóm 10. Bylo vyvinuto několik více či méně spolehlivých molekulárních markérů pro detekci sloupcového růstu (pro přehled viz Petersen, 2013). Příčinnou mutaci se podařilo nakonec identifikovat na základě resekvenování dříve identifikované oblasti genomu spojené s tímto znakem u odrůd ‘Mclntosh’ a‘Mc!ntosh Wijcik’ a porovnání získaných sekvencí. Wolters et al. (2013) identifikovali 8,2kb (upravená velikost podle corrigendum Wolters, 2015) inzerci nového typu mobilního DNA elementu pravděpodobně specifického pro tribus Pyraea. Jelikož nebyl narušen žádný gen kódující protein, byla provedena analýza exprese vybraných genů v okolí této inzerce. V této studii bylo zjištěno, že nejvýraznější změnou v pupenech odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’ je 14násobné zvýšení exprese MdCo31 genu kódujícího domnělou 2OG-Fe(II) oxygenázu v porovnání s odrůdou ‘Mclntosh’. Gen MdCo31 pocházející z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’ a rostliny s kontrolovanou architekturou stromu transformované tímto genem se staly předmětem Evropského patentu EP2754711A1. Nezávislou skupinou bylo potvrzeno, že nadměrná exprese tohoto genu vtransgenním tabáku a jabloních navodila fenotypy s krátkými intemodii, podobně jako u sloupcových jabloní (Okada, 2016). Sekvence, k jejíž inzerci v tomto lokusu došlo, byla později identifikována jako retrotranspozon Gypsy-44, který byl v opačné orientaci vložen do dalšího retrotranspozonu s názvem Gypsy-33 (Otto, 2014).
V dosavadním stavu techniky jsou uvedeny pouze poměrně pracné a časově náročné metody spočívající v amplifikaci cílového úseku metodou PCR a následné detekci vzniklých fragmentů elektroforézou na agarózovém gelu.
Například ve Wolters et al. (2013) jsou použity primery pro detekci levé a pravé hranice inzerce retrotranspozonu Gypsy-44, specifická amplifikace alely divokého typu (WT) není v této publikaci nijak řešena. Tento detekční systém byl použit i v Evropském patentu EP 2754711 Al. Hlavní nevýhodou tohoto přistupuje nemožnost odlišení heterozygotních jabloní v tomto lokusu (WT/Co) od homozygotních (Co/Co). Tato znalost je však pro šlechtitele zásadní, neboť oba tyto druhy genotypů mohou mít odlišný fenotypový projev, a navíc při použití v dalším křížení je výhodné pracovat s genotypy Co/Co, neboť všichni jejich potomci budou vykazovat sloupcový růst a molekulárně genetická analýza nebude potřebná.
Otto a kol. (2014) detekovali mutaci pocházející z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’ amplifikaci oblastí z levé i pravé hranice inzerce retrotranspozonu Gypsy-44. Amplifikace alely divokého typu (WT) probíhala v další PCR reakci. Na obrázku příslušných agarózových gelů v uvedené publikaci je sice možné rozlišit genotypy obsahující sloupcovou alelu a alelu divokého typu, použité primery však vedly ke vzniku nespecifických fragmentů. Dle znalostí původců přihlášky autoři nezveřejnili sekvence použitých primerů.
Další systém pro detekci lokusu sloupcového růstu jabloní navrhl Okada et al. (2016), kdy k amplifikaci obou alel dochází v jediné PCR reakci. Nevýhody tohoto systému však jsou poměrně slabá amplifikace mutované sloupcové alely (Co) a opět analýza PCR produktů pomocí agarózové elektroforézy, která je pracná a nevhodná pro rychlou rutinní analýzu tisíců vzorků, které se běžně zpracovávají v rozsáhlejších šlechtitelských programech.
Podstata technického řešení
Výše uvedené nedostatky - u jednotlivých metodik dle současného stavu techniky se jedná o nemožnost odlišit homozygoty Co/Co, nezbytnost dvou PCR reakcí pro 1 vzorek, vznik nespecifických fragmentů, popřípadě slabou amplifikaci sloupcové alely a ve všech používaných metodách použití pracné a časově náročné analýzy pomocí agarózového gelu - odstraňuje sada primerů a sond pro současnou PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) a mutované
-2 CZ 34114 U1 sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně domácí (Malus * domestica Borkh.) podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsou
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO. 4)
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO. 5), kde hybridizační sondy jsou vhodně označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO. 4) a pro PCR detekci mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO. 5).
Výše uvedený primer SEQ ID NO. 1 se částečné překrývá s primerem z Okada, 2016. Příslušný překryv obou primerů je však koincidencí, neboť tato genomická oblast je výhodná pro návrh primerů pro amplifikaci daného lokusu. Primer SEQ ID NO. 1 byl navržen tak, aby došlo k optimální amplifikaci nemutované alely divokého typu (WT) v kontextu celého detekčního systému metodou alelické diskriminace pomocí real-time PCR, o které se Okada et al. nezmiňují. Navíc je primer SEQ ID NO. 1 použit v kombinaci s jiným reverzním primerem. Ostatní primery vykazují nižší než 85% homologii k primerům známým z dosavadního stavu techniky, popřípadě jsou zcela nové. V dosavadním stavu techniky se sondy nepoužívaly a jejich sekvence jsou nové.
Výše uvedené kombinace primerů pro amplifikaci jednotlivých alel lokusu sloupcového růstu jsou vhodné pro současnou nebo individuální analýzu výše uvedených alel u jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.). Při analýze menšího počtu vzorků je možné obě alely detekovat po klasické (tzv. end-point) PCR elektroforézou na agarózovém gelu. Ve výhodném provedení technického řešení jsou PCR amplikony obou příslušných alel detekovány v přítomnosti značených sond alelickou diskriminací metodou PCR v reálném čase. Ve výhodném provedení technického řešení jsou hybridizační sondy pro detekci jednotlivých alel značeny fluorescenčně, aještě výhodněji pomocí odlišných fluoroforů pro jednotlivé alely, což umožňuje jejich současnou detekci v jedné PCR reakci.
-3 CZ 34114 U1
Návrh sady primerů podle technického řešení pro stanovení alel lokusu sloupcového růstu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) byl proveden v několika krocích: 1) porovnání sekvencí alely divokého typu (WT) z odrůdy ‘Mclntosh’ (GenBank č: KF530875, HF968766) a mutované alely (Co) z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’ (GenBank č: KF530876, HF968765) pro definici přesné pozice inzerce retrotranspozonu Gypsy-44; 2) analýza sekvencí z hlediska identifikace jednotlivých strukturních elementů obou retrotranspozonů (Gypsy-44 a Gypsy-33) a unikátních sekvencí a výběr vhodných oblastí pro navržení primerů a sond; 3) návrh primerů a sond pro současnou detekci a rozlišení obou alel v jedné reakci s ohledem na zajištění specifíty celého systému v kontextu jablečného genomu. Organizace celého lokusu sloupcového růstu včetně přibližné polohy navrženého systému primerů a sond je schematicky zachycena na Obrázku 1.
Pro navržení Forward primerů 1 pro detekci alely divokého typu (WT) byla vybrána oblast unikátní v jablečném genomu ležící před 5' LTR retrotranspozonu Gypsy-33, což zajišťuje specifitu tohoto primerů v rámci jablečného genomu. Bezprostředně za ní byla navržena Sonda 1 tak, aby její většina ležela také v unikátní sekvenci. Pro Reverse primer 1 byla vybrána oblast 5' LTR retrotranspozonu Gypsy-33, která se u mutované sloupcové alely (Co) nachází až za místem inzerce retrotranspozonu Gypsy-44, aby mohl být Reverse primer 1 použit pro amplifikaci obou alel. Vzhledem k vysokému výskytu těchto retrotranspozonů v jablečném genomu bude tento primer nespecifický a bude rozpoznávat mnoho míst genomu. Specifitu amplifikace a detekce tak budou zajišťovat v jablečném genomu unikátní Forward primer 1, popřípadě Sonda 1.
Oblast pro navržení Forward primerů 2 pro detekci mutované alely bylo nezbytné vymezit v 3' LTR Gypsy-44, z tohoto důvodu bude tento primer opět nespecifický v kontextu jablečného genomu. Na amplifikaci mutované alely se bude podílet taktéž nespecifický Reverse primer 1. Spojení obou retrotranspozonů v této orientaci je však v jablečném genomu unikátní, jak bylo ověřeno analýzou Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi7PAGE _TYPE=BlastSearch& PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&BLAST_SPEC=OGP_3750_12882), proto je použití těchto dvou nespecifických primerů pro amplifikaci mutované sloupcové alely (Co) v kontextu jablečného genomu možné, i když bude účinnost amplifikace do určité míry snížena nasedáním primerů i na ostatní retrotraspozony téhož typu. Pro zvýšení specifíty při detekci byla navržena sonda pro detekci mutované sloupcové alely (Co) na rozhraní obou zúčastněných retrotranspozonů.
Přehled přesných pozic navržených primerů a sond včetně analyzovaných strukturních elementů jednotlivých alel lokusu sloupcového růstu je uveden v Tabulce 1, nasedání primerů a sond na jednotlivé alely lokusu sloupcového růstu je uvedeno na Obrázku 2A, respektive 2B.
Tabulka 1: Pozice navržených primerů a sond včetně strukturních elementů jednotlivých retrotranspozonů (jak byly uvedeny autory příslušných sekvencí) u alely divokého typu (WT) (GenBank č.: HF968766), respektive mutované sloupcové alely (Co) (GenBank č.: HF968765) lokusu sloupcového růstu jabloně. Komponenty navržené sady primerů a sond jsou uvedeny tučně.
-4 CZ 34114 U1
Malus domestica, alela divokého typu (WT) (GenBank č.: HF968766)
Rys 5' pozice 3 'pozice Délka Poznámka
Forward primer 1 21 483 21 505 23 nt unikátní v jablečném genomu
Sonda 1 21 509 21 538 30 nt hranice unikátní sekvence a 5' LTR Gypsy-33
5' LTRGypsy-33 21 532 21 881 350 nt
Reverse primer 1 * 21 697 21 715 19 nt v 5 LTR Gypsy-33
Retrotranspozon Gypsy-33, vnitřní část 21 882 25 128 3 247 nt
3' LTRGypsy-33 25 129 25 478 350 nt
Malus domestica, mutovaná sloupcová alela (Co) (GenBank č.: HF968765)
Rys 5' pozice 3 'pozice Délka Poznámka
Forward primer 1 69 302 69 324 23 nt unikátní v jablečném genomu
Sonda 1 69 328 69 357 30 nt hranice unikátní sekvence a 5' LTR Gypsy-33
1. část 5' LTR Gypsy- 33 69 351 69 402 52 nt
3' LTR Gypsy-44* Forward primer 2 Retrotranspozon Gypsy-44, vnitřní část* 69 403 71 296 71 359 71 358 71 321 75 651 1 951 nt 26 nt 4 293 nt 100% homologie s 5' LTR ...θΧΡ.?.Χ.:.4.4................................................................................................................. v 3' LTR Gypsy-44
5' LTR Gypsy-44* 75 652 77 602 1 951 nt 100% homologie s 3' LTR Gypsy-44
Forward primer 2 77 540 77 565 26 nt v 5' LTR Gypsy-44
Sonda 2 77 589 77 618 30 nt hranice 5' LTR Gypsy-44 a 5' LTR Gypsy-33
Reverse primer 1* 77 716 77 734 19 nt v 5' LTR Gypsy-33
2. část 5' LTR Gypsy33 77 603 77 900 298 nt obsahuje 5nukleotidovou duplikaci v místě inzerce
Retrotranspozon Gypsy-33, vnitřní část 77 901 81 159 3 259 nt obsahuje více TC repetic než alela divokého typu
3' LTRGypsy-33 81 160 81 509 350 nt
* na komplementárním řetězci
Z Tabulky 1 a Obrázku 2B vyplývá, že Forward primer 1 a Sonda 1 jsou schopné rozpoznat i mutovanou sloupcovou alelu (Co). Nicméně Reverse primer 1 pro případnou amplifikaci se 5 nachází ve vzdálenosti téměř 8,5 kb od místa nasedání Forward primeru 1, amplifikace s těmito dvěma primery při použití dostatečně krátkého času polymerace tedy nebude účinně probíhat. Forward primer 2 bude u mutované sloupcové alely (Co) nasedat na dvou místech (v 5' LTR Gypsy-44 a 3' LTR Gypsy-44, neboť tyto sekvence vykazují 100% homologii), primer nasedající v 3' LTR (pozice 71296 vHF968765) však opět nebude schopen tvořit při PCR dostatečné ίο množství produktu, jelikož je vzdálen od Reverse primeru 1 téměř 6,5 kb.
Prvním krokem pro stanovení alel lokusu sloupcového růstu jabloně domácí (Malus x domestica Borkh.) je izolace genomové DNA, následuje PCR s využitím sady primerů a sond pro specifickou amplifikaci výše uvedených alel a stanovení délky amplikonů elektroforézou 15 v agarózovém gelu, ve výhodnějším provedení s použitím sond analýzou fluorescenčního signálu po provedení PCR v reálném čase. Finálním krokem je vyhodnocení přítomnosti jednotlivých alel.
Příklady provedení technického řešení jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojeným nárokem a podrobně popsána v popisu technického řešení. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR, uvedených primerů a sond, včetně jejich fluorescenčního značení, aby nedošlo ke snížení specifícity PCR detekce jednotlivých alel lokusu sloupcového růstu.
Objasnění výkresů
Obrázek 1: Schematický nákres uspořádání retrotranspozonů a systému primerů a sond v lokusu sloupcového růstu jabloně u alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co). V případě mutované sloupcové alely (Co) se pro amplifíkaci účinně použije pouze Forward primer2 nasedající v oblasti 5' LTR Gypsy-44, amplifíkace z ostatních forwardových primerů nebude probíhat z důvodu velké vzdálenosti od reverzního primerů a krátkého času polymerace při PCR.
Obrázek 2: Místa nasedání navržených primerů a sond. Reverse primer 1 je uveden v opačné (forwardové) orientaci. A) Alela divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu (GenBank č: HF968766); B-l) až B-3) Mutovaná sloupcová alela (Co) téhož lokusu (GenBank č: HF968765). V případě mutované sloupcové alely (Co) se pro amplifíkaci účinně použije pouze Forward primer 2 nasedající v pozici 77540, amplifíkace z ostatních forwardových primerů nebude probíhat z důvodu velké vzdálenosti od reverzního primerů a krátkého času polymerace při PCR.
Obrázek 3: Reprezentativní separace PCR produktů alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) na agarózové gelové elektroforéze. WT/WT =‘Mclntosh’; WT/Co = ‘Mclntosh Wijcik’; Co/Co = hybrid z křížení dvou sloupcových rodičů nesoucí pouze mutované alely (Co). Paralelně byla amplifíkována negativní kontrola bez přítomnosti DNA.
Obrázek 4: Příklad analýzy metodou PCR v reálném čase. Křivky s kroužky - HEX fluorescence (Sonda 1); křivky bez kroužků - FAM fluorescence (Sonda 2). A) 35 vzorků homozygotních pro alelu divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu jabloně; B) 35 vzorků heterozygotních v tomto lokusu (Co/WT) a C) 6 vzorků homozygotních pro mutovanou sloupcovou alelu (Co).
Příklady uskutečnění technického řešení
Příklad 1: Návrh sekvencí primerů a sond
Nejprve byly porovnány sekvence alely divokého typu (WT) z odrůdy ‘Mclntosh’ (GenBank č: KF530875, HF968766) a mutované alely (Co) z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’ (GenBank č: KF530876, HF968765) pro definici přesné pozice inzerce retrotranspozonů Gypsy-44, a to pomocí nástroje pro porovnávání sekvencí Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Analýzou sekvencí z hlediska identifikace jednotlivých strukturních elementů obou retrotranspozonů (Gypsy-44 aGypsy-33) a unikátních sekvencí pro zajištění co nejvyšší specifíty byly vybrány vhodné oblasti pro navržení primerů a sond, aby mohl celý systém s krátkými reakčními časy fungovat jak při klasické PCR s analýzou na agarózovém gelu, tak při amplifíkaci PCR v reálném čase, tj. aby byly fragmenty přijatelně dlouhé pro obě metody (kolem 200 bp).
Při navrhování primerů pro multiplexovou PCR analýzu byly zohledněny následující požadavky: 1) co nejvyšší specificita primerů eliminující necílené amplifíkace z důvodu vysokého výskytu
-6 CZ 34114 U1 zúčastněných retrotranspozonů vgenomu jabloně; 2) obdobná teplota tání všech primerů a k tomu přiměřená teplota tání sond; 3) eliminace tvorby dimerů mezi jednotlivými komponentami systému.
Konkrétně byly pomocí softwaru Vector NTI Advance vybrány následující sekvence jednotlivých primerů a sond:
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO. 4) a
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO. 5).
Navržené primery budou při PCR s časem polymerace 30 sekund, což je výrobcem polymerázy čas doporučený pro amplifikaci úseků o délce 200 bp, schopné účinně dávat vznik fragmentům uvedeným v Tabulce 2, které budou detekovány v ní uvedenými sondami:
Tabulka 2: Předpokládané produkty vznikající při PCR a jejich detekce u alely divokého typu (WT) (GenBank č.: HF968766), respektive mutované sloupcové alely (Co) (GenBank č.: HF968765) lokusu sloupcového růstu jabloně.
Malus domestica, alela divokého typu (WT) (GenBank č.: HF968766)
F primer R primer Předpokládaná délka PCR produktu Sonda
Forward primer 1 Reverse primer 1 233 bp Sonda 1
Forward primer 2 Reverse primer 1 0 0
Malus domestica, mutovaná sloupcová alela (Co) (GenBank č.: HF968765)
F primer R primer Předpokládaná délka PCR produktu Sonda
Forward primer 1 Reverse primer 1 8 433 bp* 0
Forward primer 2 (v pozici 71296HF968765) Reverse primer 1 6 439 bp* 0
Forward primer 2 (v pozici 77540 HF968765) Reverse primer 1 195 bp Sonda 2
* nepravděpodobný vznik díky krátkému času polymerace při PCR
Příklad 2: Detekce alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně metodou PCR v klasickém uspořádání
Pro detekci přítomnosti alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně byla izolována celková DNA pomocí soupravy Exgene Plant SV mini (GeneAll Biotechnology). Připravená DNA (2 μΐ) byla použita jako templát pro PCR reakci v objemu 20 pl s následujícími reakčními komponentami (uvedeny výsledné koncentrace): Ix TopBio Blue buffer complete (Top-Bio); 200μΜ dNTP každý (Genaxxon); 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 250nM primery Forward primer 1, Forward primer 2, Reverse primer 1 každý, reakce byla doplněna do 20 μΐ vodou. PCR amplifikace probíhala v PCR cyklem Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: úvodní denaturace 98 °C/1 minuta; amplifikace ve 40 cyklech: 40x (98 °C/10 s, 58 °C/10 s, 72 °C/15 s); finální extenze 72 °C/30 s.
Pro PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu jabloně se v reakci použily tyto primery:
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1) a
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3) s očekávaným fragmentem o délce 233 bp.
Pro PCR detekci mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně se v reakci použily tyto primery:
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2) a
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3).
S očekávaným fragmentem o délce 195 bp.
Po ukončení reakce byly vzniklé PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu, výsledky této analýzy jsou zachyceny na Obrázku 3, kde vzniklé fragmenty délkově odpovídají očekávání.
PCR fragmenty získané z kontrolních odrůd (‘Mclntosh’; ‘Mclntosh Wijcik’) byly vyříznuty z gelu, vyizolovány soupravou ExpinTM Combo GP podle doporučení výrobce (GeneAll Biotechnology). Izolované fragmenty byly osekvenovány soupravou BigDye™ Terminátor v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific) za použití amplifikačních primerů a následně analyzovány na genetickém analyzátoru Applied Biosystems 3500 genetic analyzer (ThermoFisher Scientific). Sekvence byly analyzovány metodou Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) a získané výsledky odpovídaly amplifikaci předpokládaných úseků alely divokého typu (WT) (GenBank č.: HF968766), respektive mutované sloupcové alely (Co) (GenBank č.: HF968765).
Příklad 3: Detekce alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně metodou PCR v reálném čase
Pro detekci přítomnosti alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně byla izolována celková DNA pomocí soupravy Exgene Plant SV mini (GeneAll Biotechnology). Připravená DNA (2 μΐ) byla použita jako templát pro PCR reakci v objemu 20 μΐ s následujícími reakčními komponentami (uvedeny výsledné koncentrace): Ix μΐ qPCR Blue Master Mix (Top-Bio); 250nM Forward primer 1, 500nM Forward primer 2, 500nM Reverse primer 1, 200nM Sonda 1, 250nm Sonda 2, reakce byla doplněna do 20 μΐ vodou. PCR amplifíkace probíhala v Rotor-Gene Q (Qiagen) real-time PCR cykleru s následujícím teplotním profilem: úvodní denaturace 94 °C/5 minut; amplifíkace v 50 cyklech: 50x (94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/30 s).
Pro PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu jabloně se v reakci použily následující primery a sonda, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3) a
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO. 4),
-8 CZ 34114 U1 kde byla Sonda 1 fluorescenčně značena HEX fluoroforem, a pro PCR detekci mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně se v reakci použily následující primery a sonda, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3) a
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO. 5), kde byla Sonda 2 fluorescenčně značena FAM fluoroforem.
Výsledky byly analyzovány dodaným softwarem k tomuto zařízení Rotor-Gene Q Series Software, typický výstup je zachycen na Obrázku 4.
Průmyslová využitelnost
Navržená sada primerů a sond pro PCR detekci sloupcového růstu u jabloní je využitelná pro molekulárními markéry asistovanou selekci jabloní křížených pro sloupcový růst, a to již ve stádiu několikatýdenních semenáčů. Takto raná selekce přináší nemalé finanční úspory díky tomu, že šetří práci, materiál i prostor nezbytné pro pěstování semenáčů vzniklých z těchto křížení. Konkrétně jsou detekovány 1) alela divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu jabloně domácí (Medus * domestica Borkh.) a 2) mutovaná sloupcová alela (Co), kde tato mutovaná alela pochází z odrůdy ‘Mclntosh Wijcik’. Ve výhodném provedení probíhá detekce v jediné reakci metodou PCR v reálném čase umožňující velmi rychlou analýzu velkého počtu vzorků. Zároveň tato sada umožňuje rozlišení heterozygotů WT/Co od homozygotů nesoucích pouze mutovanou sloupcovou alelu (Co) v jediné reakci, což je velkým přínosem pro šlechtitele, protože homozygoté Co/Co budou v dalším křížení poskytovat jedince nesoucí vždy alespoň jednu mutovanou sloupcovou alelu (Co). V tomto případě tedy nebude nutné semenáče vůbec testovat a všechny budou mít sloupcový tvar růstu, což přinese další úspory při šlechtění sloupcových j abloní.
Seznam použité literatury
Patentová literatura:
Wolters PJ, Baldi P, Schouten HJ, Velasco R, Si-Ammour A (2013) Co gene MdCo31 of the 'Wijcik' mutant of Malus x domestica Borkh and plants with controlled tree architecture genetically transformed by introduction of this gene - EP2754711A1
Nepatentová literatura:
Baldi P, Wolters PJ, Komjanc M, Viola R VelasCo R Salvi S (2013) Genetic and physical characterisation of the locus controlling columnar hábit in apple (Malus χ domestica Borkh.). Molecular Breeding 31:429-440. https://doi.org/10.1007/sll032-012-9800-l
Blažek J (1992) Segregation and General Evaluation of Spur Type or Compact Growth Habits in Apples. ActaHort 317:71-79. https://doi.Org/10.17660/ActaHortic.1992.317.6
Blažek J, Krelínova J (2011) Tree growth and some other characteristics of new columnar apple cultivars bred in Holovousy, Czech Republic. Hort. Sci. (Prague) 38:11-20. https://doi.org/10.17221/23/2010-HORTSCI
-9 CZ 34114 U1
Conner PJ, Brown SK, Weeden NF (1997) Randomly amplified polymorphic DNA-based genetic linkage map of three apple cultivars. Journal of American Society for Horticultural Science 122:350-359. https://doi.Org/10.21273/JASHS.122.3.350
Fisher DV (1970) Spur strains of Mclntosh discovered in British Colombia. Journal of the American Pomological Society, 24:27-32.
Lapins K (1969) Segregation of compact growth types in certain apple seedling progenies. Can. J. Plant Sci 49:765-768. https://doi.org/10.4141/cjps69-130
Lazar AM, Baciu AA (2015) Growth and fructificationcharacteristic at apple hybrids with columnar port, resulted from various combinations and mutations, as compared to standard descendants. JOURNAL of Horticulture, Forestry and Biotechnology 19:71-76.
Okada K, Wada M, Moriya S et al. (2016) Expression of a putative dioxygenase gene adjacent to an insertion mutation is involved in the short intemodes of columnar apples (Malus χ domestica), Journal of Plant Research 129:1109-1126. https://doi.org/10.1007/sl0265-016-0863-7
Otto D, Petersen R, Brauksiepe B, Braun P, Schmidt ER (2014) The columnar mutation (“Co gene”) of apple (Malus x domestica) is associated with an integration of a Gypsy-like retrotranspozon. Molecular breeding 33:863-880. https://doi.org/10.1007/sll032-013-0001-3
Petersen R, Krost C. (2013) Tracing a key player in the regulation of plant architecture: the columnar growth hábit of apple trees (Malus χ domestica). Planta 238:1-22. https://doi.org/10.1007/s00425-013-1898-9
Sun HY, Dai HY, Zhao GL, Ma Y, Ou CQ, Li H, Li LG, Zhang ZH (2008) Genome-wide characterization of long terminál repeat-retrotranspozons in apple reveals the differences in heterogeneity and copy number between Tyl-copia and Ty3-gypsy retrotranspozons. J Integr Plant Biol. 50:1130-9. https://doi.Org/10.l 111/j. 1744-7909.2008.00717.X.
Wolters PJ, Schouten HJ, Velasco R, Si-Ammour A, Baldi P (2013) Evidence for regulation of columnar hábit in apple by a putative 2OG-Fe(II) oxygenase. New phytologist 200: 993-9. https://doi.0rg/lO.l 111/nph. 12580
Corrigendum for Wolters (2013): New Phytologist 2015, 207:928.
https://doi.org/10.1111/nph. 13412.
Zhang YG, Dai HY (2011). Comparison of photosynthetic and morphological characteristics, and microstructure of roots and shoots, between columnar apple and standard apple trees of hybrid seedlings. Phyton. 80. 119-125.

Claims (5)

NÁROKY NA OCHRANU
1. Sada primerů a sond pro současnou PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) a mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu jabloně domácí (Malus χ domestica Borkh.), vyznačující se tím, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsou
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO.
2)
- 10CZ 34114 U1
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO.
3)
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO.
4)
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO.
5), kde hybridizační sondy jsou vhodně označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci nemutované alely divokého typu (WT) lokusu sloupcového růstu obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 1: ATTCTAAACGCTATTGTCCTTGG (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 1: TGCGTCAAGTCTTATGTTAGCTCTGTTTAT (SEQ ID NO. 4) a pro PCR detekci mutované sloupcové alely (Co) lokusu sloupcového růstu obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 2: GGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGA (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: TGAGAAGGGGTGAGAAGGC (SEQ ID NO. 3)
Sonda 2: ATATGATCCGATCAAGGACTTAAATGTAAT (SEQ ID NO. 5).
CZ2020-37606U 2020-06-02 2020-06-02 Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.) CZ34114U1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-37606U CZ34114U1 (cs) 2020-06-02 2020-06-02 Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-37606U CZ34114U1 (cs) 2020-06-02 2020-06-02 Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ34114U1 true CZ34114U1 (cs) 2020-06-23

Family

ID=71132453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2020-37606U CZ34114U1 (cs) 2020-06-02 2020-06-02 Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.)

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ34114U1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Halász et al. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm
CN106755479B (zh) 一种鉴定嘎拉苹果后代植株的ssr分子标记v及其应用
US20110083234A1 (en) Quantitative Trait Loci Associated With Soybean Cyst Nematode Resistance And Methods Of Their Use
Su et al. Verification and fine-mapping of QTLs conferring days to flowering in soybean using residual heterozygous lines
Gimode et al. Fine-mapping of a major quantitative trait locus Qdff3-1 controlling flowering time in watermelon
JP4892647B1 (ja) 新品種、植物品種の鑑別方法、及びイネ個体を早生化する方法
CN104711254B (zh) 玉米低磷响应基因ZmARF31的INDEL分子标记及其应用
Lee et al. Molecular markers to select for the j-2–mediated jointless pedicel in tomato
US20190241981A1 (en) Plant breeding using next generation sequencing
JP4892648B1 (ja) 新品種、植物品種の鑑別方法、及びイネ個体を早生化する方法
Liu et al. Fine mapping of Pa-6 gene for purple apiculus in rice
CN108504769B (zh) 一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记及其应用
US20160135415A1 (en) Sorghum hybrids with delayed flowering times
CZ34114U1 (cs) Sada pro detekci lokusu sloupcového růstu u jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.)
JP7569528B2 (ja) キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、プライマーセット
Kawamura et al. The identification of the Rosa S-locus provides new insights into the breeding and wild origins of continuous-flowering roses
RU2535985C1 (ru) Способ создания линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням
Truong et al. Conversion of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker UBC# 116 linked to Fusarium crown and root rot resistance gene (Frl) into a co-dominant sequence characterized amplified region (SCAR) marker for marker-assisted selection of tomato
CN107130019B (zh) 水稻地方品种薄稻穗瘟抗性基因的分子标记引物及其应用
Li et al. Identification of a nuclear-recessive gene locus for male sterility on A2 chromosome using the Brassica 60 K SNP array in non-heading Chinese cabbage
JP7493802B2 (ja) ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子及びその利用
WO2012017682A2 (en) Leaf-blade-length-related marker of plant of the genus saccharum and the use thereof
Li et al. Identification of SNP markers linked to the weeping trait in Prunus mume
CN109777883B (zh) 番茄黄化卷叶病毒Ty-2抗性基因的共显性分子标记的特异性引物及其应用
WO2023176983A1 (ja) コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20200623