KR101003473B1

KR101003473B1 - 고추 웅성 불임 회복 예측용 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101003473B1
Application number: KR1020080109168A
Authority: KR
Inventors: 강병철; 조영득
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2008-11-05
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2010-12-29
Also published as: KR20100050062A

Abstract

본 발명은 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 특이 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추 웅성 불임 회복을 예측하는 방법에 관한 것이다.

고추, 웅성불임, 회복, 예측, 올리고뉴클레오티드, 프라이머

Description

고추 웅성 불임 회복 예측용 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for predicting fertility restoration in pepper, and uses thereof}

본 발명은 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 특이 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 분자 표지들은 고추의 웅성 불임 회복 특성을 올바르게 예측할 수 있게 함으로써, 웅성불임 유도를 억제하여 임성을 회복시키는 역할을 하는 웅성불임 회복 유전자들을 F₁식물체의 과실을 농업적으로 이용하는 각종 식량 작물과 원예 작물의 F₁잡종 종자 생산에 유용하게 활용될 수 있게 한다.

세포질적 웅성불임(CMS)는 미토콘드리아 유전체 상의 돌연변이로 인해 정상적인 생식 능력을 갖는 화분을 만들어내지 못하는 현상을 말한다. 현재까지 150여 종의 식물에서 보고된 이 특성은 F₁ 잡종 종자를 생산함에 있어서 제웅의 과정을 생략할 수 있게 하여 잡종 종자 생산에 유용하게 활용되어 오고 있다(Schnable PS, Wise RP, 1998. Trends Plant Sci 3:175-180). CMS와 더불어 웅성불임 유도를 억제하여 임성을 회복시키는 역할을 하는 웅성불임 회복 유전자들 또한 F₁식물체의 과 실을 농업적으로 이용하는 각종 식량 작물과 원예 작물의 F₁ 잡종 종자 생산에 유용하게 활용되고 있다. 농업적인 가치에 더하여 웅성불임 및 웅성불임 회복 현상은 분자 수준에서 미토콘드리아와 핵 유전체 간의 상호작용을 연구하기 위한 좋은 모델이라고 할 수 있다(Hanson MR, Bentolila S, 2004. Plant Cell 16 Suppl:S154-169).

웅성불임은 미토콘드리아 유전체 내의 유전자와 알려지지 않은 서열 간의 상동재배열을 통해 이루어진 키메라 유전자에 의해 유도된다(Hanson MR, Bentolila S, 2004. Plant Cell 16 Suppl:S154-169). 이 웅성불임 유전자들이 어떻게 웅성불임을 유도하는지에 대해서는 미토콘드리아 막의 교란(Sabar et al., 2000. Plant Physiol 124:1239-1250), ATP 합성 단백질의 기능 저하(Bergman et al., 2000. Plant Mol Biol 42:531-544), 개화 관련 유전자들의 발현 양상 변화(Carlsson et al, 2008. Mitochondrion 8:74-86) 등 여러 가지 기작들이 제시되어 왔지만 직접적인 근거는 아직 제시되지 못하였다.

웅성불임 회복에 있어서는 핵 내 존재하는 회복 유전자들이 옥수수(Cui et al., 1996. Science 272:1334-1336), 페튜니아 (Bentolila et al., 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99:10887-10892), 무 (Brown et al., 2003. Plant J 35:262-272), 벼 (Komori et al., 2004. Plant J 37:315-325)에서 동정되었다. 알데히드 디히드로게나제(Aldehyde dehydroganase)를 암호화하며 웅성불임 회복에 간접적인 기능을 하는 옥수수의 Rf2 유전자를 제외하고(Lui et al., 2001. Plant Cell 13:1063-1078) 나머지 웅성불임 회복 유전자들은 모두 펜타트리코펩티드 리피트(pentatricopeptide repeat, PPR) 단백질을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. PPR 단백질들은 35개의 아미노산이 반복적 양상을 띠며 나열되어 구성되며 지니고 있는 수퍼 헬릭스(super helix) 구조를 통해 RNA에 결합할 것으로 예측된다(Small and Peeters, 2000. Trends Biochem Sci 25:46-47). 이와 같은 예측을 뒷받침하는 근거로 애기장대에서 PPR 단백질들이 엽록체 mRNA의 에디팅(editing)에 관여함이 밝혀졌다(Kotera et al., 2005. Nature 433:326-330). 또한 벼에서는 Rf1a, Rf1b로 명명된 두 개의 회복 유전자들의 산물이 CMS 유도 유전자들의 mRNA 산물을 자르거나 분해하는 역할을 한다는 것이 밝혀진 바 있다(Wang et al., 2006. Plant Cell 18:676-687).

애기장대에서는 PPR 유전자들이 441개로 존재하며 큰 유전자군을 이루는 것으로 밝혀졌다 (Lurin et al., 2004. Plant Cell 16:2089-2103). 이 유전자들의 대부분이 애기장대 5개의 염색체 상에 거의 균등하게 분포되어 있지만 1번 염색체의 1Mb 정도 되는 구역 내에는 19개의 PPR 유전자들 또는 PPR 관련 유사 유전자(pseudo gene)들이 모여서 존재한다. 이 구역의 유전자들은 웅성불임 회복 유전자와 가장 높은 유사성을 지니는 유전자들이 포함되어 있으며 소속 유전자들 간의 유사성 또한 매우 높게 나타난다. 페튜니아, 무, 벼의 웅성불임 유전자들 또한 군락을 이루며 존재하므로(Bentolila, 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99:10887-10892) Geddy와 Brown은 웅성불임 회복 유전자들이 동일한 조상 유전자에서 유래하였을 것이라는 분석을 한 바 있다(Geddy and Brown, 2007. BMC Genomics 8:130). 고추에서 세포질 웅성불임은 PI164835라는 인도 계통에서 처음 발견되었으며 이 세포질이 지금까지 유일한 웅성불임 유전자원으로 이용되어 오고 있다(Shifriss C, 1997. Euphytica 93:83-88). 이 웅성불임 세포질에 대한 회복 유전자의 유전에 대해서는 하나의 우성 유전자가 관여한다는 보고(Peterson, 1958. Amer Nat 92:111-119), 두 개의 보족 유전자가 관여한다는 보고(Novak et al., 1971. Z Pflanzenzucht 65:129-140) 그리고 QTL이 관여한다는 보고(Wang et al., 2004. Theor Appl Genet 109:1058-1063)가 있었다. 이 외에도 부분적인 임성 회복이 관찰되기도 하였다(Lee DH, 2001. Studies on unstable fertility of CGMS (cytoplasmic-genic male sterility) in Capsicum annuum L. Dissertation, Seoul National University).

분자 수준에서 볼 때 고추의 웅성불임 유전자는 클로닝 되었고 (Kim et al., 2007. Plant Mol Biol 63:519-532) 회복 유전자에 대해서는 연관 분자표지들이 개발되어 왔다 (Zhang et al., 2000. Euphytica 113:155-161). 고추의 웅성불임 유전자는 orf456으로 명명된 것으로서 이 유전자를 애기장대에 형질전환 하였을 때 애기장대의 웅성불임이 유도되는 것이 확인되었다(Kim et al., 2007. Plant Mol Biol 63:519-532). 웅성불임 회복 유전자와 연관되어 있는 분자표지들은 OPP13-CAPS (1.1cM), AFRF8-CAPS (1.8cM), PR-CAPS (1.8cM), CRF-SCAR (5.3cM) (Kim, 2005. Thesis, Seoul National University) 등이 있다. 그러나 이 분자표지들은 일부 고추 계통들에서는 PCR 산물이 증폭되지 않는다는 점, 회복 유전자 유무와 관계없는 세 번째 분자표지 유전형이 존재한다는 점, 분자표지 유전형과 웅성불임 회복 관련 표현형이 일치하지 않는 경우들이 존재한다는 점 등의 한계점을 나타내었다(Min et al., 2008. Mol Cells 25:20-29).

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 고추 웅성 불임 회복 유전자와 연관되어 있는 기존의 분자표지들의 한계점을 극복하고자, 페튜니아 웅성 불임 회복 유전자와 높은 유사성을 보이는 고추 EST 서열과 기존 웅성불임 회복 관련 분자표지들이 적용되지 않는 웅성불임 회복 F₂분리집단을 재료로 하여 새로운 분자표지들을 개발하고자 하였고, 회복 유전자 연관 분자표지들은 그 활용성을 검정하기 위해 55개 고추 계통들에 적용하여 그 유용성을 확인하고자 하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추 웅성 불임 회복을 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명은 비교적 쉽지만 많은 노동력과 시간을 필요로 하고 종종 반복 서열에서 분자표지가 개발된다는 단점이 있는 AFLP나 RAPD 방법이 아닌, 기존의 타작물에서 동정된 회복 유전자를 후보로 이용하여 새로운 분자표지들을 개발할 수 있는 새로운 방법적 가능성을 확인하였다. 본 발명의 분자 표지들은 고추의 웅성 불임 회복 특성을 올바르게 예측할 수 있게 함으로써, 웅성불임 유도를 억제하여 임성을 회복시키는 역할을 하는 웅성불임 회복 유전자들을 F₁식물체의 과실을 농업적으로 이용하는 각종 식량 작물과 원예 작물의 F₁잡종 종자 생산에 유용하게 활용될 수 있고, 또한, 더 넓은 범위의 고추 계통들의 회복 관련 특성을 판별하는 데 유용하게 활용될 수 있는 가능성을 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번 호 12의 서열 내의 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 12의 프라이머는 서열번호 12의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트이다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하면 고추 웅성 불임 회복의 예측율을 더욱 높일 수 있다.

본 발명에서는 페튜니아 웅성 불임 회복 유전자를 후보로서 이용하여 고추 회복 유전자 분자 표지를 개발하였는데 먼저 페튜니아의 회복 유전자와 높은 유사성을 갖는 고추 EST를 탐침으로 이용하여 고추의 BAC 라이브러리를 탐색하였다. 비록 회복 유전자 산물에 의한 웅성불임 유전자 억제 기작은 작물 별로 다르지만 회 복 유전자 좌 부근의 유전체 구성은 작물 간 유사한 양상을 나타낸다(Brown et al., 2003 Plant J 35:262-272).

선별된 BAC 클론 중 52개를 세 개의 그룹으로 분류하였으며, 분류된 세 개의 BAC 클론 그룹 각각에서 유래한 BAC 말단 서열을 AC99 유전자 지도(Livingstone et al., 1999. Genetics 152:1183-1202)에 맵핑한 결과, BAC 말단 서열로부터 설계한 세 개의 분자 표지(BAC2T7; 개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 7 및 8, BAC15SP6; 개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 9 및 10, BAC54SP6; 개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 11 및 12)는 모두 6번 염색체의 상단부에 위치되었음을 확인할 수 있었다.

청양 F₂분리 집단을 재료로 EST와 BAC 말단 서열로부터 회복 유전자 연관 분자표지들을 개발한 결과, 하나의 SCAR 분자 표지 (BAC13T7 SCAR; 개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 1 및 2)는 첫 번째 그룹에 포함되어 있는 13번 BAC 클론의 T7 말단서열로부터 개발되었고, 두 번째 그룹에 속하는 17번 BAC 클론의 T7 말단 서열로부터는 BAC17T7 HRM 분자 표지(개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 3 및 4)가 개발되었고, 마지막으로 세 번째 그룹에 속하는 PePPR1으로부터 AS-PCR 분자 표지(개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 5 및 6)가 개발되었다. 세 개의 그룹 모두 고추 염색체 6번에 위치되었으며 회복 유전자와 각각 1.4cM,(BAC13T7 SCAR) 3.2cM(BAC17T7 SCAR), 14cM(PePPR1 AS-PCR)의 거리를 두고 있는 분자 표지들이 개발되었다.

육종적으로 한국에서 많이 활용되는 55개의 고추 계통에 본 발명의 BAC13T7 SCAR(개발된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 1 및 2)를 적용한 결과 28계통(51%)에서 웅성불임 회복 특성을 올바르게 판별해 낼 수 있었다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 웅성 불임 회복을 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계 수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료

회복 유전자에 대해서 분리되는 두 개의 서로 다른 F₂ 집단이 분자표지 유전 분석에 사용되었다. 먼저 분자표지를 개발하는데 있어서는 청양 F₁의 자가수정을 통해 육성한 F₂ 집단이 이용되었다. 또 다른 F₂ 집단은 Kim(Kim et al., 2006. Mol Cells 21:135-140) 등에 의해 육성된 것으로서 청양 집단에 적용되지 않는 기존 분자표지들을 포함한 유전 분석을 하기 위해 활용되었다. 또한 회복 유전자 연관 분자표지들을 고추 유전자 지도 상에 위치시키기 위해서는 C.annuum과 C.chinense 간 종간 교잡을 통해 육성한 AC99 집단을 이용하였다(Livingstone et al., 1999. Genetics 152:1183-1202). 웅성불임 회복 연관 분자표지들의 활용성을 검정하기 위해서는 몬산토 코리아(Monsanto Korea)에서 55개 고추 계통들의 잎 조직을 분양 받아 사용하였다.

표현형 검정

총 901개의 청양 F₂개체들을 서울대학교 부속 농장의 온실에서 4달 동안 재 배한 후 임성을 검정하였다. 약에 화분이 존재하는지의 여부를 총 3번 이상 주의 깊게 관찰함으로써 임성을 결정하였다. 55개 고추 계통의 임성은 몬산토 코리아(Monsanto Korea)에서 검정하였다.

웅성불임 회복유전자와 유사성을 갖는 고추 서열의 확인과 분석

Plant Diversity Research Center (PDRC)에서 공개한 고추 EST 중에서 (http://210.218.199.240/SOL/index.php?menu=search&species) 페튜니아의 회복 유전자와 높은 유사성을 갖는 EST를 탐색하였다. 그 중 가장 높은 유사성을 나타내는 EST(ID : KS26037G12)의 전체 유전자 서열을 SMART RACE cDNA amplification kit를 이용하여 청양 부계의 cDNA로부터 확보하였다. PePPR1으로 명명한 이 유전자의 세포 내에서의 위치는 iPSORT(Bannai et al., 2002. Bioinformatics 18:298-305) 프로그램을 이용하여 예측하였다. PPR 모티프를 예측하기 위해서는 MEME 소프트웨어가 이용되었으며(Bentolila et al., 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99:10887-10892) PePPR1과 타작물의 회복 유전자 서열을 비교 분석하기 위해서는 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)가 이용되었다. PPR 단백질들을 탐색하고 단백질 간 상동성을 확인하기 위해서는 BLAST를 활용하였다. 애기장대의 PPR 단백질들의 서열과 해당 유전자의 위치 확인은 Arabidopsis Information Resource (TAIR) (www.arabidopsis.org)를 이용하였다. 계통분석은 Mega3.1 프로그램(The biodesign Institute, Tempe, USA)의 neighbor-joining algorithm을 통하여 수행하였다.

BAC 라이브러리 탐색과 BAC 클론의 분류

PePPR3로 명명한 EST 서열(ID : KS11010C08)을 증폭하여 얻은 PCR 산물(301bp)를 탐침으로 사용하여 BAC 라이브러리를 탐색하였다. BAC 라이브러리 탐색은 Yoo 등(Yoo et al., 2003 Theor Appl Genet 107:540-543)의 방법을 따랐다. 신호를 나타낸 총 74개의 클론 중 임의로 선택한 10개 BAC 클론의 양 말단 서열을 얻었고 총 20개의 말단 서열 중 반복서열을 포함하는 것들을 제외한 17개의 BAC 클론을 이용하여 탐색된 BAC 클론들을 분류하였다. 17개의 각 말단 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하여 74개 각 클론들에 대해 PCR을 수행한 후 같은 프라이머로 PCR을 하였을 때 증폭이 되는 클론들은 같은 그룹에 속하는 것으로 분류하였다.

HRM과 AS-PCR을 이용한 분자 표지 개발

High resolution melting (HRM) 분석 방법을 이용하여 각 그룹에 속해있는 BAC 말단 서열로부터 분자표지를 개발하여 고추 유전자 지도에 위치시켰다. HRM 분석에 이용된 프라이머의 서열은 표 4에 표기하였다. PCR 반응은 총 20㎕를 반응액 전체 부피로 하여 주형 DNA 50ng, 10X Taq DNA 중합효소 버퍼 2㎕, 각 프라이머 5pmol, dNTP 200μM, SYTO 9 dye 1.25μM, Taq DNA 중합효소 1 unit을 포함하도록 하였다. 분석은 Rotor-gene 6000 (Corbette, 오스트레일리아)을 이용하여 94℃ 10분에 이어 94℃ 15초, 53℃ 15초, 72℃ 30초의 과정을 45번 반복하는 실시간 PCR(real-time PCR)과 72℃에서 90℃까지 온도를 1분마다 0.1℃ 씩 올리는 HRM 분석을 수행하였다. 형광은 최고점을 100으로 하여 온도의 변화에 따라 그래프로 나타내었다. PePPR1을 청양 F₂ 집단에서 맵핑(mapping)하기 위해서는 allele-specific PCR(AS-PCR) 방법을 이용하였다. 이 때 한 쪽의 프라이머는 청양 양친 계통 간 SNP 부분에서 회복친의 서열에 해당하는 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단 서열이 되도록 설계하였으며 다른 한 쪽의 프라이머는 청양 양친 계통의 공통적인 서열에서 설계하였다. AS-PCR은 50ng의 DNA를 주형으로 하여 94℃ 5분; 94℃ 30초-51℃ 30초-72℃ 1분 35 반복; 72℃ 10분의 과정을 통해 이루어졌다.

연관 분석

유전적 연관 분석은 AC99 F₂89 개체, 청양 F₂244 개체, TS502 X HK6T F₂138 개체 (Kim et al., 2006. Mol Cells 21:135-140)을 재료로 하여 이루어졌다. CarthaGene software (Givry et al., 2005. Bioinformatics 21: 1703-1704)가 분석에 이용되었는데 LOD 값의 한계치는 4.0, 최대 유전적 거리는 30cM으로 하였다.

회복 유전자 연관 분자 표지의 적용

회복 특성을 나타내거나 (RfRf) 나타내지 않는 (rfrf) 계통들을 포함하는 고추 55개 계통에서 DNA를 추출하여 회복 유전자 연관 분자표지를 이용한 분석에 활용하였다. BAC13T7 SCAR 분자 표지를 이용한 분석은 50ng의 DNA를 주형으로 하여 94℃ 5분; 94℃ 30초-53℃ 30초-72℃ 1분 35 반복; 72℃ 10분의 과정을 통해 이루어졌다. OPP13-CAPS, PR-CAPS, CRF-SCAR를 이용한 분석에는 Lee 등(Lee et al., 2008 Theor Appl Genet 117:383-389)의 방법을 그대로 적용하였다.

<실시예 1. 기존의 분자 표지를 이용한 분석과 새로운 분자 표지 개발을 위 한 F ₂ 집단 작성>

기존의 분자 표지 중 유전적 거리 3cM 이하를 나타내며 회복 유전자에 연관되어 있는 것으로 알려져 있는 OPP13-CAPS (Kim DS, 2005. Thesis, Seoul National University), AFRF8-CAPS (Kim et al., 2006. Mol Cells 21:135-140), PR-CAPS (Lee et al., 2008. Theor Appl Genet 117:383-389)을 이용하여 청양 양친을 분석하여 본 결과 회복 유전자가 없을 경우에 나타나는 것으로 알려져 있는 분자표지의 유전형 (Kim et al., 2006. Mol Cells 21:135-140; Lee et al., 2008 Theor Appl Genet 117:383-389)이 청양의 회복친과 불임친 모두에서 나타나는 것으로 확인되었다. 새로운 분자표지를 개발하기 위해 청양을 자가수정하여 청양 F₂집단을 육성하였다. 각 F₂ 개체들의 임성은 화분의 유무와 약의 크기에 의해 결정되었다.

식물체의 표현형은 가임 또는 불임으로 명확하게 분류되었는데 가임 식물체는 큰 약과 많은 화분을 지니는 반면 불임 식물체는 작은 약을 지니고 화분을 생성하지 못하였다. 총 901개의 개체 중 681개의 식물체는 가임이었고 220개의 식물체는 불임이었다. 3:1 분리비에 대한 χ² 검정을 수행한 결과(표 1) 청양 집단에서의 웅성불임 회복은 단일 우성유전자에 의해 조절되는 것으로 드러났다.

표 1. 청양 F₂집단에서의 가임 개체와 불임 개체의 분리 양상.

<실시예 2. 페튜니아 회복 유전자와 상동성을 나타내는 고추 유전자에 대한 계통 분석>

페튜니아의 웅성불임 회복 유전자와 아미노산 서열 상에서 높은 상동성을 나타내는 고추의 EST를 122,503개의 고추 EST 중에서 선별하였다. 가장 높은 유사성을 나타낸 5개가 회복 유전자에 대한 후보로서 선택되었다(표 2). 아미노산 서열, DNA 서열 모두에서 페튜니아 회복 유전자와 가장 높은 유사성(단백질 서열에서 65%의 일치, DNA 서열에서 78%의 일치)을 나타내는 EST 서열이 PePPR1으로 명명되고 이후 분석에 이용되었다. PePPR1의 유전자 전체 염기 서열은 5'RACE와 3'RACE를 통해 확보되었으며 1,734bp를 갖는 것으로 나타났다. 이 유전자의 단백질 산물은 N 말단 서열과 C 말단 서열 사이에 반복적인 PPR 모티프의 배열을 포함하는 것으로 확인되었다. N 말단 서열은 PePPR1을 미토콘드리아로 보내기 위한 신호서열일 것으로 예측되었다. 이 신호서열 뒤에는 35개의 아미노산이 14번 반복적인 양상으로 배열되는 PPR 서열이 위치하였다(도 1a). 이와 같은 PPR 모티프의 연속적인 배열은 Lurin 등(Lurin et al., 2004. Plant Cell 16:2089-2103)의 정의에 따라 PePPR1이 PPR 단백질들의 P subfamily에 분류됨을 나타내었다. 페튜니아의 웅성불임 회복 유 전자와 마찬가지로 PePPR1도 사이의 한 개의 아미노산을 기준으로 하여 두 부분으로 나누어 볼 수 있었다. 즉 75~144번째 아미노산을 포함하는 한 부분, 146~565번째 아미노산을 포함하는 다른 부분이 존재한다.

표 2. 페튜니아 회복 유전자와 유사성을 갖는 고추 EST들의 특징.

지금까지 동정된 세 작물의 회복 유전자 산물과 PePPR1을 배열하여 비교한 결과 PPR을 포함하는 부분은 N 또는 C 말단 부분에 비해 작물 간 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었다(도 1b). 또한 PePPR1과 페튜니아의 회복 유전자 산물은 다른 작물의 회복 유전자 산물과 뚜렷하게 구별되었는데 PePPR1과 페튜니아 회복 유전자 산물은 다른 작물의 회복 유전자 산물에는 존재하지 않는 결실을 여섯 군데에서 공통적으로 지니고 있었다. 이 밖에 PePPR1은 폐튜니아 회복 유전자 산물과 비교하였을 때 N 말단 부분에 7개와 3개 아미노산의 결실을 지니고 있었으며 C 말단 부분에는 5개 아미노산의 결실을 추가적으로 가지고 있었다.

PePPR1이나 타 작물의 회복 유전자 산물들과 유사성을 나타내는 애기장대의 단백질들을 BLAST를 이용하여 검색해 보았을 때 높은 유사성을 나타내는 단백질들은 애기장대 1번 염색체의 23Mb 부근이나 4.1~4.3Mb에 포함되는 부위에 위치하는 유전자들에 의해서 암호화 됨이 나타났다. PePPR1은 애기장대 1번 염색체의 23Mb 부분 또는 4.1~4.3Mb 부분에 위치하는 유전자가 암호화하는 단백질들과 32~39%의 일치성, 56~63%의 유사성을 보였다. 그러나 이 외의 유전체 부분에 존재하는 P 서브패밀리(subfamily)의 다른 PPR 유전자들의 산물을 임의로 선택하여 PePPR1과 비교하였을 때 일치성과 유사성은 각각 19~28%, 39~51%로 크게 떨어졌다. 회복 유전자와 상동성을 나타내는 유전자들이 애기장대의 특정 부위에 집중되어 있다는 사실은 계통 분석을 통해서도 확인되었다 (도 1c). 애기장대 1번 염색체의 23Mb 부근이나 4.1~4.3Mb에 위치하는 유전자들의 단백질 산물은 애기장대 유전체의 다른 부분에 존재하는 P 서브 패밀리 PPR 유전자들의 산물보다 PePPR1 또는 타 작물의 회복 유전자 산물들과 더 높은 유사성을 나타내었다.

<실시예 3. 페튜니아 회복 유전자와 상동성을 갖는 고추 서열 맵핑>

위에서 선별한 회복 유전자 유사 서열 5개를 맵핑하기 위해 AC99을 이용한 유전 분석이 이루어졌다. 고추 유전자 지도에서 회복 유전자의 위치가 아직까지 정해지지 않았기 때문에 회복 유전자 연관 분자 표지인 OPP13을 맵핑하였다. 그 결과 고추 염색체 6번 상단부에 위치함을 확인하였다. HRM 분석을 통하여 회복 유전자와 상동성을 갖는 고추 EST 서열들을 맵핑하였는데 PePPR1, PePPR2, PePPR3의 경우에 는 AC99 집단의 양친 간 다형성이 확인되었지만 PePPR4, PePPR5 서열에서는 다형성이 나타나지 않아 맵핑을 할 수 없었다. PePPR1과 PePPR3는 염색체 6번 상단부에 함께 위치하였다. 한편 PePPR2는 PePPR1과 PePPR3와는 27.6cM 떨어진 염색체 6번 말단에 위치하였으며 OPP13-CAPS와 매우 가까운 것으로 확인되었다.

<실시예 4. BAC 라이브러리 탐색과 클론 분류>

페튜니아 회복 유전자와 중간 정도의 유사성을 갖는 고추 EST 서열인 PePPR3을 탐침으로 이용하여 BAC 라이브러리를 탐색하였다. 그 결과 총 74개의 BAC 클론이 선별되었다. 선별된 클론들이 PePPR3 서열을 실제로 지니고 있는지 PePPR3를 증폭하는데 이용하였던 프라이머로 선별된 클론들에 대해 PCR을 수행하였는데 대부분의 클론들에서 밴드가 확인되었다. 그러나 PCR 산물들의 서열은 클론에 따라 PePPR3 서열 뿐 아니라 이와 상동성을 갖는 다른 서열들 또한 포함하는 것으로 나타났다. 클론들을 분류하기 위해 임의로 선택한 10개의 BAC 클론들의 말단 서열을 분석하여 이로부터 총 17개의 프라이머를 제작하였다. 이들 프라이머를 이용한 분석 결과 총 52개의 클론들이 3개의 그룹으로 분류되었다(표 3). PCR 산물이 증폭되지 않은 22개의 BAC 클론들은 어떤 그룹으로도 분류되지 않았다.

표 3. PePPR3 탐침을 이용하여 선별한 BAC 클론의 분류와 각 분류 그룹으로부터 개발된 분자 표지.

<실시예 5. 세 개의 BAC 클론 그룹을 이용한 맵핑>

위에서 분류된 세 개의 BAC 클론 그룹 각각에서 유래한 BAC 말단 서열을 AC99 유전자 지도 (Livingstone et al., 1999. Genetics 152:1183-1202; 도 3)에 맵핑하였다. BAC 말단 서열로부터 설계한 세 개의 분자 표지 (BAC2T7, BAC15SP6, BAC54SP6; 표 3)는 모두 6번 염색체의 상단부에 위치되었다. 세 번째 그룹에서 유래한 분자 표지인 BAC54SP6는 PePPR1, PePPR3와 각각 함께 위치한 반면 두 번째 그룹에서 유래한 분자표지인 BAC15SP6는 PePPR2와 함께 위치하였다. 마지막으로 첫 번째 그룹에서 유래한 분자 표지인 BAC2T7은 BAC54SP6와 BAC15SP6 사이에 위치하였는데 BAC15SP6와 더 가까운 것으로 나타났다.

<실시예 6. 회복 유전자와 연관되어 있는 분자 표지 개발>

청양 F₂분리 집단을 재료로 EST와 BAC 말단 서열로부터 회복 유전자 연관 분자표지들을 개발하였다(표 3과 4). 하나의 SCAR 분자 표지(BAC13T7 SCAR)는 첫 번재 그룹에 포함되어 있는 13번 BAC 클론의 T7 말단서열로부터 개발되었다(도 2a). 이 분자 표지를 적용하였을 때 회복 유전자를 갖는 계통에서는 PCR을 통해 572bp의 절편이 증폭되었지만 불임 계통에서는 증폭되지 않았다. 맵핑에 이용된 244개의 F₂개체들 중에서 네 개체를 제외하고는 분자 표지의 유전형과 식물체의 표현형이 일치하였다. 두 번째 그룹에 속하는 17번 BAC 클론의 T7 말단 서열로부터는 BAC17T7 HRM 분자 표지가 개발되었다(도 2b). HRM 분석을 F₂개체들에 대하여 수행하였을 때 서로 다른 DNA 해리 곡선을 통해 회복 유전자 관련 3개의 유전형을 분류할 수 있었다. 총 8개체를 제외한 F₂ 개체에서 분자 표지의 유전형과 식물체의 표현형이 일치하는 것이 확인되었다. 마지막으로 세 번째 그룹에 속하는 PePPR1으로부터 AS-PCR 분자 표지가 개발되었다. PePPR1의 EST 서열에서는 청양 양 친 계통 간 다형성이 확인되지 않았다. 그러나 PePPR1 유전자 전체 서열을 양 친 계통 간 비교 분석한 결과 유전자의 5' 말단으로부터 54bp 떨어진 곳에서 SNP가 확인되었다. SNP 부위의 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 마지막 서열의 위치하며 그 서열이 청양 양친 계통 중 회복친의 서열을 따르도록 한 쪽 프라이머를 설계하였으며 다른 쪽 프라이머는 청양 양친 계통에서 공통적으로 PePPR1 내부 나타나는 서열로 설계하였다. 그 결과 PePPR1 SNP에 대해 청양 회복친과 같은 유전형을 갖는 F₂개체들에서만 밴드가 증폭되었다. 총 32개의 F₂개체들에서 회복 유전자와 PePPR1 간의 교차가 확인되었는데 이를 통해 PePPR1과 고추 회복 유전자 간 상당한 유전적 거리 차이가 있음을 알 수 있다.

표 4. 본 발명에서 개발된 분자 표지들.

<실시예 7. 회복 유전자 연관 분자 표지 간 상대적인 위치>

본 연구를 통해 새롭게 개발된 분자 표지들과 기존에 개발된 CRF-SCAR 분자 표지(Gulyas et al., 2006. Breed Sci 56:331-334; Lee et al., 2008. Theor Appl Genet 117:383-389) 간의 상대적인 유전적 위치가 청양 F₂244 개체를 이용하여 정해졌다(도 3). CRF-SCAR 분자 표지는 회복 유전자로부터 0.4cM 떨어져 가장 가깝게 위치하였으며 그 뒤로 BAC13T7 SCAR 분자 표지가 회복 유전자와 1.4cM의 거리를 나타내며 위치하였다. PePPR1 AS-PCR 분자 표지는 회복 유전자로부터 14cM 떨어져 분자 표지 중 가장 먼 유전적 거리를 나타내었다. 회복 유전자를 기준으로 이 세 개의 분자 표지들과 반대쪽에 BAC17T7 HRM 분자 표지가 맵핑 되었는데 이 분자 표지는 회복 유전자로부터 3.2cM 떨어져 있는 것으로 나타났다. Kim 등(Kim et al., 2006. Mol Cells 21:135-140)에 의해 작성된 F₂집단 또한 회복 유전자 연관 분자 표지들의 연관 분석에 활용되었다. 적용 결과 OPP13-CAPS와 CRF-SCAR는 이 집단에서 분리 양상을 보이는 반면 BAC13T7 SCAR는 분리되지 않았다. OPP13CAPS와 CRF-SCAR를 이 집단에서 맵핑 되었던 기존의 회복 유전자 연관 분자 표지와 함께 맵핑해 보았을 때 CRF-SCAR는 OPP13-CAPS의 반대쪽에 위치되었다. CRF-SCAR와 회복 유전자 간의 유전적 거리는 1.4cM으로 계산되었다.

<실시예 8. 회복 유전자 연관 분자 표지들을 이용한 고추 계통들의 웅성불임 회복 특성 검정>

고추의 웅성불임 회복 유전자와 가깝게 연관되어 있는 4개의 분자 표지들을 육종적으로 한국에서 많이 활용되는 55개의 고추 계통에 적용하여 보았다(표 5). OPP13-CAPS을 적용하여 보았을 때 대부분의 가임 계통들 (RfRf)에서는 OPP13-CAPS의 첫 번째 유전자형이, 불임 계통들 (rfrf)에서는 두 번째 유전자형이 확인되었다. OPP13-CAPS는 이 두 가지 유전자형 외에도 세 번째 유전자형을 나타내었는데 이 유전자형을 갖는 고추 계통들에는 불임 계통 및 회복 계통들이 섞여 존재하였다. 따라서 OPP13-CAPS 적용시 세 번째 유전형이 나타나는 경우들에 있어서는 계통들의 웅성불임 회복 관련 표현형을 성공적으로 예측해 낼 수 없었다. 전체 55 계통 중 40 계통에서 OPP13-CAPS를 이용하여서는 회복 유전자 보유 여부를 판단할 수 없었다. PR-CAPS나 BAC17T7 SCAR를 적용하였을 때에는 많은 경우에 식물체의 표현형 이 분자 표지의 표현형과 반대로 나타났다. PR-CAPS를 이용한 경우에는 55 계통 중 18 계통 (33%)에서 표현형을 올바르게 예측할 수 있었으며 BAC13T7 SCAR의 경우에는 55 계통 중 28계통 (51%)에서 적용 가능하였다. 반면 CRF-SCAR를 이용하였을 때에는 49계통 (89%)에서 표현형을 판별해 낼 수 있었다.

표 5. 네 종류의 분자 표지를 55개 고추 계통에 적용한 결과.

도 1은 PePPR1 단백질 서열 분석을 나타내는 그림으로, (a) PePPR1에 존재하는 14개의 PPR 서열을 비교 배열한 결과. 보존되어 있는 아미노산은 색으로 표현하였고, (b) PePPR1 서열을 다른 3작물의 회복 유전자 산물과 비교 배열한 결과이고 (c) PePPR1과 3개의 회복 유전자 산물을 애기장대의 28개의 PPR 단백질 서열과 함께 계통분석한 결과를 나타낸다(애기장대의 유전자 ID 중 'at' 다음에 오는 숫자는 해당 PPR 단백질의 유전자가 위치하는 염색체 번호를 뜻하며 염색체 상에서의 위치는 유전자 ID 오른쪽에 표기되었다).

도 2는 청양 F₂집단에 분자 표지들을 적용한 결과를 나타내는 그림으로, (a) PCR 기반 분자 표지들을 청양 양친 계통과 F₂개체들에 적용한 결과이고, (b) HRM 기반 분자 표지인 BAC17T7-HRM을 F₂개체들에 적용한 결과이다(F와 S는 각각 가임, 불임 표현형을 의미한다).

도 3은 회복 유전자 연관 분자 표지들에 대한 연관 지도이고, 세 개의 지도는 각각 AC99 (a), 청양 (b), TS502 X HK6T F₂집단 (c)을 재료로 작성한 것이다. 본 발명을 통해 새로 개발된 분자 표지들은 사각형으로 표시되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Specific primers for predicting fertility restoration in pepper, and uses thereof <130> PN08200 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaagtaggcc aaaacttatc acg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cactaagccc gatgtatgaa tc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggtttacat tgttgaacag g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagatcacca ggttaaaact agg 23 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caaatgctat tattcccttt ctctct 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtccaagaca actgcatctg tgac 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtatcagag catggtttgg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gatggactga tggaaatcgg c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcagctagtt gacgcacaca tg 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcaaccttct tggcaacttt c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtcgtgaagg gttgtttgat g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctacctcctc tataagcctg c 21

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 프라이머 세트.
제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 웅성 불임 회복을 예측하기 위한 키트.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 웅성 불임 회복을 예측하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.