KR102027035B1 - 버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 버섯과 효모를 혼합한 후 발효하여 제조된 발효물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법{Composition comprising fermentation product using mushroom for anti-obesity and process for the preparation thereof}
본 발명은 버섯을 효모와 함께 발효하여 제조된 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
버섯은 식물이 아닌 균류에 속하며, 균류 중에서 눈으로 식별할 수 있는 크기의 자실체를 형성하는 무리를 일컫는다. 이러한 버섯은 독특한 향과 맛을 가지고 있어, 식용으로 널리 이용되는 재료이다. 버섯은 전세계적으로 2만여종이 알려져 있으나, 독성이 없어 섭취 가능한 식용버섯은 2천여종에 불과하다. 식용버섯으로는 송이버섯, 표고버섯, 목이버섯, 영지버섯, 상황버섯 등이 있으며, 이들 중에서 영양가 및 약용가치가 높은 버섯을 약용버섯으로 구분할 수 있다.
버섯은 종류에 따라 영양성분 및 그 함량이 상이할 수 있으나, 주로 식이섬유, 다당체, 아미노산, 무기질로 이루어진 고단백 저칼로리 식품이다. 이러한 버섯은 포만감이 크고 열량이 낮아 과식을 억제하고 체중 조절에 도움을 주며, 특히 키토산 성분이 세포내 및 혈액내 과도한 지방이 쌓이는 것을 예방할 뿐만 아니라 베타글루칸 성분이 다량 함유되어 있어 면역 기능을 높이고 혈행을 원활하게 하는 효과도 있다.
다양한 효능을 가지는 버섯은 자연 그대로 이용되거나 가공되어 식품, 음료수, 주류 등으로 이용될 수 있고, 버섯에 의한 효능을 향상시키기 위해 유효성분만을 추출하여 이용될 수도 있다. 이때, 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 버섯의 유효성분을 함유하는 추출물 또는 발효물을 제조할 수 있다.
특허공개공보 제2013-0089439호에는 버섯과 함께 다양한 식재료를 110 내지 130℃, 2 내지 4기압에서 4 내지 6시간 동안 가열하는 단계를 포함하는 버섯 추출물의 제조방법이 개시되어 있다. 이러한 열수 및 가압 추출 방법은 높은 열과 압력을 사용하여 오히려 버섯의 유효성분을 파괴할 수 있고, 열에 약한 유효성분이 변성되어 버섯의 효능을 제대로 발휘하는데 어려울 수 있다.
특허공개공보 제2015-0135644호에는 에탄올을 이용하여 흰손등버섯의 유효성분을 추출한 알코올 추출물을 함유하는 고지혈증 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시되어 있다. 이러한 알코올을 이용한 추출 방법은 추출물에 알코올이 잔류하여 알코올 냄새 때문에 거부감이 들거나 인체에 해로울 수 있으며, 알코올에 의해 버섯의 유효성분이 일부 파괴될 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해서는 버섯의 유효성분을 파괴하지 않으면서 인체에 해롭지 않는 버섯 추출물을 얻기 위한 연구개발이 필요한 실정이다.
특허공개공보 제2013-0089439호 특허공개공보 제2015-0135644호
상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 버섯의 유효성분이 열이나 압력에 의해 손상되지 않고, 잔류하는 유기용매가 없어 인체에 해롭지 않은 버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯; 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모를 혼합한 후 발효하여 제조된 발효물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물을 제공한다. 이때, 항비만용 조성물을 식품 또는 약학 조성물로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯과 용매를 혼합한 후 분쇄하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물과 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모를 혼합한 후 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 항비만용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 버섯을 이용한 발효물은 버섯의 유효성분 추출시 높은 온도 및 압력을 가하지 않고 유기용매를 사용하지 않아 버섯의 유효성분을 손상되지 않은 상태로 얻을 수 있으며, 효모에 의한 발효과정을 통해 버섯의 유효성분뿐만 아니라 인체에 유익한 성분이 더 포함될 수 있어, 버섯의 효능이 향상될 수 있다.
이러한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물은 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있으며, 버섯의 유효성분에 의해 세포내 지방 축적을 억제하여 지방간, 내장비만, 복부비만 등을 예방할 수 있고, 나아가 당뇨병, 고지혈증, 관절염, 심혈관계 질환의 발병 위험을 감소시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 버섯을 이용한 발효물을 함유하는 조성물의 제조방법의 모식도이다.
도 2는 실험예 1에 따라 실시예 1, 비교예 1 내지 7의 발효물 또는 추출물 1% 처리시의 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 3은 실험예 1에 따라 실시예 1, 비교예 1 내지 7의 발효물 또는 추출물 3% 처리시의 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 4는 실험예 1에 따라 실시예 1, 비교예 1 내지 7의 발효물 또는 추출물 3% 처리시의 지방세포 분화를 확인한 이미지이다.
도 5는 실험예 2에 따라 실시예 1 내지 8의 발효물 3% 처리시의 효모 종류에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 6은 실험예 3에 따라 실시예 1, 9 내지 11의 발효물 3% 처리시의 버섯 함량에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 7은 실험예 4에 따라 실시예 9, 12 내지 14의 발효물 3% 처리시의 효모 사용량에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 8은 실험예 5에 따라 실시예 15 및 16의 발효물 3% 처리시의 발효 시간에 따른 지방세포 분화 억제능을 생균수로 확인한 그래프이다.
도 9는 실험예 5에 따라 실시예 15 및 16의 발효물 3% 처리시의 발효 시간에 따른 지방세포 분화 억제능을 pH로 확인한 그래프이다.
도 10은 실험예 5에 따라 실시예 15 및 16의 발효물 3% 처리시의 발효 시간에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 11은 실험예 6에 따라 실시예 17 및 18의 발효물 3% 처리시의 멸균처리에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 12는 실험예 7에 따라 실시예 1, 19 및 20의 발효물 또는 건조물 3% 처리시의 건조에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 13은 실험예 8에 따라 실시예 1, 21 내지 24의 발효물 3% 처리시의 버섯 종류에 따른 지방세포 분화 억제능을 확인한 그래프이다.
도 14는 실험예 9에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 복부지방 감소 효과를 확인한 그래프 및 이미지이다.
도 15는 실험예 10에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 체중 감소 효과를 확인한 이미지이다.
도 16은 실험예 11에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 지방 축적 억제 효과를 간 조직에서 확인한 이미지이다.
도 17은 실험예 11에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 지방 축적 억제 효과를 지방 조직에서 확인한 이미지이다.
도 18은 실험예 12에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 비만 관련 유전자의 발현 조절 효과로 aP2 발현을 확인한 그래프 및 이미지이다.
도 19는 실험예 12에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 비만 관련 유전자의 발현 조절 효과로 UCP2 발현을 확인한 그래프 및 이미지이다.
도 20은 실험예 12에 따라 실시예 1, 비교예 1 및 8의 추출물 또는 발효물을 식이한 비만 동물모델에서 비만 관련 유전자의 발현 조절 효과로 pAMPK 발현을 확인한 그래프 및 이미지이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
< 항비만용 조성물>
본 발명의 일 예에 따른 항비만용 조성물은 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯; 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모를 혼합한 후 발효하여 제조된 발효물을 유효성분으로 함유한다.
상기 버섯은 식용버섯으로 손쉽게 구할 수 있는 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다. 주로 식용 가능한 갓과 줄기를 이용할 수 있다. 이러한 버섯은 날 것 그대로 이용되거나 건조시켜 이용될 수 있다. 특히, 유효성분을 용이하게 추출하기 위해서는 버섯을 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용하여 착즙할 수 있다. 그러나, 버섯을 가열하거나 가압, 초음파 처리할 경우에는 버섯의 유효성분이 파괴되어 버섯의 효능이 제대로 발휘될 수 없고, 알코올 등 유기용매를 사용하여 추출할 경우에는 추출물에 유기용매가 잔류하여 오히려 인체에 해로울 수 있다. 이러한 추출 방법을 보완하기 위해 버섯을 유산균과 발효할 수 있으나, 버섯의 유산균 발효물은 오히려 버섯의 효능이 감소되는 것으로 확인되었다(실험예 1 참조). 따라서, 본 발명에서는 버섯을 가열, 가압, 초음파 처리하거나 유기용매를 사용하여 추출하는 대신 효모와 함께 혼합하여 발효함으로써 인체에 해롭지 않고 버섯의 효능이 향상된 발효물을 얻고자 한다. 이때, 버섯의 유효성분이 효과적으로 추출될 수 있도록 상기 버섯을 용매와 혼합한 후 15 내지 25℃에서 300 내지 1,000 rpm으로 5 내지 300초 동안 분쇄할 수 있다. 상기 용매로는 인체에 해롭지 않은 순수한 물일 수 있다.
상기 효모는 주로 빵, 맥주, 포도주, 치즈 등 발효식품을 제조하는데 사용되는 효모사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 엘립소이데우스, 사카로마이세스 칼스버겐시스, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스, 지고사카로미세스 룩시이 및 데바리오마이세스 한세니이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 이때, 발효 효과가 우수한 사카로마이세스 세레비지아에를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에 (KCTC 7904), 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (KCTC 7243), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (KCTC 7244), 클루이베로마이세스 락티스 (KCTC 7151), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (KCTC 7152), 지고사카로미세스 룩시이 (KCTC 7880) 및 데바리오마이세스 한세니이 (KCTC 17995)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이러한 버섯과 효모를 혼합하여 발효할 경우에는 효모가 버섯의 다당류, 아미노산, 무기질 등 유효성분을 작은 단위로 분해하여 인체에 흡수가 용이하도록 한다. 또한, 발효 과정에서 알코올이나 이산화탄소뿐만 아니라 글리세롤, 아세트산, 숙신산 등의 2차 산물이 생성되어 버섯의 효능을 상승시킬 수 있다. 이러한 효능은 버섯과 효모의 혼합 비율에 따라 상이할 수 있으며, 효능을 최대치로 향상시키기 위해 버섯과 효모를 버섯:효모=1:0.1 내지 5의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 효모의 사용 비율이 0.1 미만일 경우에는 효모가 부족하여 발효가 제대로 일어나지 않을 수 있고, 효모의 사용 비율이 5를 초과할 경우에는 효모의 사용량이 많아 비경제적이며 과발효가 일어날 수 있다.
이와 같이 버섯과 효모를 발효하여 제조된 발효물은 효모에 의해 발효된 버섯의 유효성분을 함유함으로써 체내 복부지방 및 내장지방의 축적을 감소시키는 효과가 향상되어 비만을 효과적으로 예방하는 항비만용 조성물로 이용될 수 있다. 이러한 항비만용 조성물은 식품 및 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 발효물이 계속 발효되거나 유해균에 의해 부패되는 것을 예방하기 위해 멸균시켜 조성물에 이용될 수 있고, 발효물을 상온에서 장기간 보존하기 위해 건조시켜 건조물 형태로 조성물에 이용될 수 있다.
상기 발효물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 식품 조성물은 건강기능식품으로 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료 등의 형태일 수 있고, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조식품 등으로 섭취할 수 있다. 이때, 건강기능식품은 당 업계에 알려진 식품 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 발효물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제; 외용제; 좌제; 주사제 등의 제형일 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물은 당 업계에 알려진 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이때, 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등일 수 있다.
< 항비만용 조성물의 제조방법>
본 발명의 일 예에 따른 항비만용 조성물의 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이, (a) 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯과 용매를 혼합한 후 분쇄하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물과 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모를 혼합한 후 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 버섯과 용매를 혼합한 후 분쇄하여 혼합물을 제조한다.
상기 버섯으로는 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 주로 식용 가능한 갓과 줄기를 이용한다. 이러한 버섯은 날 것이거나 건조, 분쇄, 압착된 상태일 수 있다.
상기 용매로는 유기용매와 같이 인체에 해로운 용매 대신 증류수 또는 순수를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 증류수, 순수와 같은 물은 버섯의 유효성분을 용출시켜 효모에 의한 발효가 잘 일어나도록 돕는다.
이러한 버섯과 용매를 혼합시, 혼합 비율에 따라 제조된 발효물 내 버섯의 유효성분 함량이 상이할 수 있으며, 이로 인해 버섯에 의한 효과가 상이하게 나타날 수 있다. 그러므로, 버섯을 효과적으로 발효하기 위해 버섯의 사용량은 용매 100 중량부를 기준으로 5 내지 80 중량부인 것이 바람직하다. 이때, 버섯의 사용량이 5 중량부 미만일 경우에는 발효하는데 많은 시간이 소요되며 제조된 발효물이 우수한 효과를 발휘할 수 없고, 버섯의 사용량이 80 중량부를 초과할 경우에는 버섯의 사용량이 많아져 제조공정이 비경제적일 수 있으며 용매가 부족하여 버섯의 유효성분이 충분히 용출될 수 없다.
이와 같이 특정 비율로 혼합된 버섯과 용매는 버섯의 유효성분이 파괴되지 않으면서 유효성분이 용이하게 추출될 수 있도록 분쇄 과정을 거쳐 혼합물로 제조될 수 있다. 버섯의 유효성분을 추출하기 위해 버섯 또는 용매와 혼합된 버섯을 가열하거나 가압, 초음파 처리할 경우에는 오히려 버섯의 유효성분이 파괴되거나 손실되어 버섯의 효능이 제대로 발휘될 수 없다. 또한, 버섯을 유산균과 혼합하여 발효하더라도 버섯의 효능이 오히려 감소되는 것을 확인하였다(실험예 1 참조). 그러므로, 본 발명의 일 예에서는 버섯을 가열, 가압, 초음파 처리하거나 유산균 발효하는 대신 분쇄하여 이용한다. 이때, 분쇄하는 방법은 당 업계에 알려진 분쇄 방법 또는 분쇄기를 사용할 수 있으며, 버섯과 용매를 혼합한 후 15 내지 25℃에서 300 내지 1,000 rpm으로 5 내지 300초 동안 분쇄하는 것이 바람직하다. 분쇄 과정을 거쳐 제조된 혼합물은 용매 내 잘게 분쇄된 버섯이 균일하게 분산된 상태이다.
본 단계에서 버섯과 용매를 혼합하거나 혼합된 버섯과 용매를 분쇄할 때, 미생물 또는 유해균이 혼입되어 제2단계에서 발효가 제대로 일어나지 않거나 부패될 수 있다. 그러므로, 혼입된 미생물의 활성을 저해하기 위해서는 혼합물을 멸균하여 사용할 수 있다. 이때, 멸균하는 방법은 당 업계에 알려진 멸균 방법 또는 멸균기를 사용할 수 있으며, 혼합물을 110℃ 이상에서 5 내지 20분 동안 멸균하는 것이 바람직하다.
제2단계: 혼합물과 효모를 혼합한 후 발효하여 발효물을 제조한다.
상기 혼합물은 용매와 분쇄된 버섯이 균일하게 혼합된 상태이다.
상기 효모로는 효모사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 엘립소이데우스, 사카로마이세스 칼스버겐시스, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 지고사카로미세스 룩시이 및 데바리오마이세스 한세니이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으며, 이들 중에서 사카로마이세스 세레비지아에를 이용하는 것이 바람직하다. 특히, 사카로마이세스 세레비지아에 (KCTC 7904), 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (KCTC 7243), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (KCTC 7244), 클루이베로마이세스 락티스 (KCTC 7151), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (KCTC 7152), 지고사카로미세스 룩시이 (KCTC 7880) 및 데바리오마이세스 한세니이 (KCTC 17995)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이러한 혼합물과 효모를 혼합시, 혼합 비율에 따라 발효가 제대로 일어나지 않거나 제조된 발효물 내 버섯의 유효성분 함량이 상이할 수 있으며, 이로 인해 버섯에 의한 효과가 상이하게 나타날 수 있다. 그러므로, 혼합물을 효과적으로 발효하기 위해서는 효모의 사용량이 혼합물 100 중량부를 기준으로 1 내지 30 중량부인 것이 바람직하다. 이때, 효모의 사용량이 1 중량부 미만일 경우에는 효모가 부족하여 발효가 제대로 일어나지 않을 수 있고, 효모의 사용량이 30 중량부를 초과할 경우에는 효모가 버섯에 비해 지나치게 많아 경제적이지 않으며 과발효가 일어날 수 있다.
이와 같이 특정 비율로 혼합된 혼합물과 효모는 제대로 발효될 수 있도록 온도, pH, 시간 등의 조건을 조절할 수 있으며, 20 내지 50℃에서 6 내지 54시간 동안 호기 조건으로 발효하는 것이 바람직하다.
본 단계에서 제조된 발효물은 버섯이 효모에 의해 발효됨으로써 발효되지 않은 버섯 또는 버섯 추출물에 비해 유효성분이 증가하여 버섯의 효능, 특히 체내 지방 축적을 감소시키는 효과가 향상될 수 있다.
따라서, 이러한 방법으로 제조된 발효물은 비만을 예방 또는 치료하는 항비만용 조성물로 이용될 수 있으며, 식품 및 약학에 적용 가능하다. 이러한 발효물은 외부 미생물 또는 유해균이 유입되어 부패될 수 있으므로, 멸균된 상태로 보관될 수 있다. 이때, 멸균하는 방법은 당 업계에 알려진 멸균 방법 또는 멸균기를 사용할 수 있으며, 발효물을 110℃ 이상에서 5 내지 20분 동안 멸균하는 것이 바람직하다. 또한, 발효물을 상온에서 장기간 보존할 수 있도록 건조시켜 건조물 형태로 보관할 수 있다. 이때, 건조하는 방법은 당 업계에 알려진 건조 방법 또는 건조기를 사용할 수 있으며, 발효물을 동결 건조 또는 열풍 건조하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 발효물의 제조
먼저, 팽이버섯을 흐르는 물에 깨끗이 세척한 후 물기를 완전히 제거하여 준비하였다.
팽이버섯 50 g과 물 100 ml을 혼합한 후 믹서기를 이용하여 분쇄하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물에 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 10 중량부(15ml)를 접종하여 혼합한 후 30℃에서 120rpm으로 교반하면서 48시간 동안 호기 조건으로 발효하여 발효물을 제조하였다.
[ 비교예 1] 추출물의 제조
팽이버섯 50 g과 물 100 ml을 혼합한 후 믹서기를 이용하여 분쇄하여 추출물을 제조하였다.
[ 비교예 2] 추출물의 제조
비교예 1에서 제조된 추출물을 끓는 물에서 30 내지 60분 동안 중탕 가열하였다. 이때, 버섯이 충분히 익을 정도로 중탕 가열하였다.
[ 비교예 3] 추출물의 제조
비교예 1에서 제조된 추출물에 초음파 파쇄하여 추출물을 제조하였다. 이때, 초음파 파쇄기(Sonicator)를 이용하여 30A에서 10초 작동, 3초 정지를 2 내지 3분 동안 반복 수행함으로써 버섯의 입자가 작고 균일하며 투명한 콜로이드 상태가 되도록 제조하였다.
[ 비교예 4] 추출물의 제조
비교예 1에서 제조된 추출물을 끓는 물에서 30 내지 60분 동안 중탕 가열한 후 초음파 파쇄하여 추출물을 제조하였다. 이때, 버섯이 충분히 익을 정도로 중탕 가열하였고, 초음파 파쇄기를 이용하여 30A에서 10초 작동, 3초 정지를 2 내지 3분 동안 반복 수행함으로써 버섯의 입자가 작고 균일하며 투명한 콜로이드 상태가 되도록 제조하였다.
[ 비교예 5] 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 발효물를 초음파 파쇄하여 추출물을 제조하였다. 이때, 초음파 파쇄기를 이용하여 30A에서 10초 작동, 3초 정지를 2 내지 3분 동안 반복 수행함으로써 버섯의 입자가 작고 균일하며 투명한 콜로이드 상태가 되도록 제조하였다.
[ 비교예 6] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106 (KCTC 12082BP)을 접종한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 비교예 7] 추출물의 제조
비교예 6에서 제조된 발효물를 초음파 파쇄하여 추출물로 제조하였다. 이때, 초음파 파쇄기를 이용하여 30A에서 10초 작동, 3초 정지를 2 내지 3분 동안 반복 수행함으로써 버섯의 입자가 작고 균일하며 투명한 콜로이드 상태가 되도록 제조하였다.
상기 실시예 1, 비교예 1 내지 7에서 제조된 발효물 또는 추출물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 1] 제조방법에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 1, 비교예 1 내지 7에서 제조된 발효물 또는 추출물에 대하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였다.
상기 지방세포는 쥐에서 유래된 3T3-L1 세포로, 분화배지를 처리하여 전구지방세포(preadipocyte)로 분화시켜 대조군 및 실험군으로 이용하였다. 분화시키지 않은 세포를 정상군으로 사용하였다.
먼저, 배양배지(DMEM+10% 송아지혈청+항생제)에 3T3-L1 세포를 분주하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양한 후 세포가 충분히 자라면(confluent), 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 회수하였다. 회수된 세포를 원심분리하여 모은 후 배양배지를 이용하여 48well-마이크로플레이트에 2x104 cells/well로 분주하였다. 세포가 가득 차면(100% confluent), 48시간 방치 후 1차 분화배지(DMEM+10% FBS+IBMX 23 mg/ml+인슐린 5 mg/ml+1 mM 덱사메타손)를 처리하여 48시간 동안 세포의 분화를 유도하였다. 2일 후 2차 분화배지(DMEM+10% FBS+인슐린 5 mg/ml)로 교체하였고, 이후 무항생제 배양배지(DMEM+10% 송아지혈청)로 교체하면서 5일 동안 배양하여 분화시켰다. 이때, 1차 분화배지, 2차 분화배지, 무항제 배양배지에 실험군으로 실시예 1, 비교예 1 내지 7의 발효물 또는 추출물, 양성대조군으로 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambogia)을 1%씩 처리하였다.
분화된 세포의 지방구를 염색하기 위해, 분화된 세포에서 무항생제 배양배지를 제거한 후 10% 포름알데히드 용액으로 세포를 고정시켰다. 이후 60% 이소프로필 알코올로 세척한 후 오일-레드-오(oil red O) 용액을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 염색하였고, 오일-레드-오 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조하였다. 이후 100% 이소프로필 알코올을 처리하여 염색된 지방구를 용출시켜 분광광도계(spectro photometer)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2와 같이, 실시예 1, 비교예 1 내지 7에서 제조된 발효물 또는 추출물을 1% 처리한 경우에는 실시예 1의 발효물, 비교예 1의 추출물, 비교예 5의 발효물이 지방세포의 분화를 억제한 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1의 발효물이 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 상기와 같은 방법으로 실험군 및 양성대조군을 3%씩 처리한 후 분화된 세포의 지방구를 염색하였고, 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3 및 4와 같이, 실시예 1, 비교예 1 내지 7에서 제조된 발효물 또는 추출물을 3% 처리한 경우에는 모두 지방세포의 분화를 억제한 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1의 발효물, 비교예 5의 발효물이 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
결과적으로, 세포에 발효물 또는 추출물을 3% 처리하는 것이 지방세포의 분화를 억제하는데 효과가 있으며, 버섯을 처리하는 방법에 따라 지방세포의 분화 억제능이 상이한 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 2] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 클루이베로마이세스 마르시아누스 (KCTC 7152)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 3] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 지고사카로미세스 룩시이 (KCTC 7880)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 4] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 데바리오마이세스 한세니이 (KCTC 17995)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 5] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 사카로마이세스 엘립소이데우스 (KCTC 7243)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 6] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 사카로마이세스 칼스버겐시스 (KCTC 7244)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 7] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 사카로마이세스 세레비지아에 (KCTC 7904)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 8] 발효물의 제조
사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 대신 클루이베로마이세스 락티스 (KCTC 7151)를 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 2 내지 8에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 2] 효모 종류에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 1 내지 8에서 제조된 발효물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5와 같이, 실시예 1 내지 8에서 제조된 발효물을 처리한 경우에는 모두 지방세포의 분화를 억제한 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1의 발효물, 실시예 3의 발효물, 실시예 4의 발효물, 실시예 5의 발효물, 실시예 6의 발효물, 실시예 7의 발효물이 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
[ 실시예 9] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 10 g을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 10] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 25 g을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 11] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 75 g을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 9 내지 11에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 3] 버섯 함량에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 1, 9 내지 11에서 제조된 발효물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6과 같이, 실시예 1, 9 내지 11에서 제조된 발효물을 처리한 경우에는 모두 지방세포의 분화를 억제한 것으로 나타났다.
[ 실시예 12] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 10 g을 사용하고, 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 10 중량부 대신 5 중량부를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 13] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 10 g을 사용하고, 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 10 중량부 대신 15 중량부를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 14] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 10 g을 사용하고, 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 10 중량부 대신 20 중량부를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 12 내지 14에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 4] 효모 사용량에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 9, 12 내지 14에서 제조된 발효물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7과 같이, 실시예 9, 12 내지 14에서 제조된 발효물을 처리한 경우에는 오히려 효모 사용량이 증가할수록 지방세포의 분화 억제능이 감소한 것으로 나타났다. 특히, 실시예 12의 발효물에서 지방세포의 분화 억제능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
[ 실시예 15] 발효물의 제조
48시간 대신 96시간 동안 발효한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 16] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 10 g을 사용하고, 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP) 10 중량부 대신 5 중량부를 사용하고, 48시간 대신 96시간 동안 발효한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 15 내지 16에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 5] 발효 시간에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 15 및 16에서 제조된 발효물에 대하여 생균수, pH, 지방세포 분화 억제능을 측정하였다.
(1) 생균수
발효 0, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간째 발효물을 채취한 후 10-6배까지 희석하였다. 이를 YM 한천배지(yeast mold agar)에 도말하여 37℃, CO2 배양기에서 2일 동안 배양하여 세포수를 세었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8과 같이, 실시예 15의 발효물은 12시간째, 실시예 16의 발효물은 24시간째가 최적의 발효시간인 것으로 나타났다. 이때, 각 최적의 배양시간에서 생균수가 유사한 것으로 나타났다.
결과적으로, 실시예 15의 발효물은 시간적인 이점이, 실시예 16의 발효물은 재료의 사용에 따른 경제적인 이점이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
(2) pH
발효 0, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간째 발효물을 채취하여 pH를 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9와 같이, 발효 시간에 따라 실시예 15의 발효물은 pH가 점차 감소하는 반면, 실시예 16의 발효물은 pH 변화가 없는 것으로 나타났다.
(3) 지방세포 분화 억제능
실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10과 같이, 실시예 15 및 16에서 제조된 발효물은 모두 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다. 특히, 실시예 15의 발효물은 발효 48시간째, 실시예 16의 발효물은 발효 96시간째 가장 우수한 효능을 보이는 것으로 나타났다.
결과적으로, 버섯 및 효모의 사용량에 따라 발효물을 제조하는데 소요되는 시간이 상이하며, 시간에 따라 효능도 상이하다는 것을 알 수 있었다.
[ 실시예 17] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 30 g을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 18] 발효물의 제조
팽이버섯 50 g 대신 30 g을 사용하고, 혼합물을 멸균한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 17 및 18에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 6] 멸균처리에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 17 및 18에서 제조된 발효물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11과 같이, 실시예 17 및 18에서 제조된 발효물은 모두 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
결과적으로, 혼합물을 멸균하더라도 발효물의 효능에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
[ 실시예 19] 발효물의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하여 멸균한 후 동결 건조하여 건조물로 제조하였다.
[ 실시예 20] 발효물의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하여 멸균한 후 열풍 건조하여 건조물로 제조하였다.
[ 실험예 7] 건조에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 1, 19 및 20에서 제조된 발효물 또는 건조물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12와 같이, 실시예 1, 19 및 20에서 제조된 발효물 또는 건조물은 모두 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
결과적으로, 버섯 발효물을 그대로 사용하거나 건조시켜 건조물 형태로 사용하더라도 발효물의 효능이 유지되는 것을 알 수 있었다.
[ 실시예 21] 발효물의 제조
팽이버섯 대신 송이버섯을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 22] 발효물의 제조
팽이버섯 대신 양송이버섯을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 23] 발효물의 제조
팽이버섯 대신 표고버섯을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 24] 발효물의 제조
팽이버섯 대신 느타리버섯을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효물을 제조하였다.
상기 실시예 21 내지 24에서 제조된 발효물은 멸균된 후 실험에 사용되었다.
[ 실험예 8] 버섯 종류에 따른 지방세포 분화 억제능
상기 실시예 1, 21 내지 24에서 제조된 발효물에 대하여 실험예 1과 동일한 방법으로 각 발효물을 3% 처리하여 지방세포 분화 억제능을 측정하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13과 같이, 실시예 1, 21 내지 24에서 제조된 발효물은 모두 양성대조군과 유사한 수준으로 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
[ 비교예 8] 효모
배양된 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP)를 사용하였다.
[ 준비예 1] 고지방식이 유도 비만 동물모델
4주령 C57BL/6 수컷 쥐를 정상식이군 및 고지방식이군으로 나누어 준비하였다.
정상식이군에는 지방 10% 함유 식이(Research Diets INC, D12450B), 고지방식이군에는 지방 60% 함유 식이(D12492)를 4주 동안 제공하였다. 이때, 고지방식이군에는 대조군으로 아무것도 투여하지 않았고, 양성대조군 1로 가르시니아 캄보지아를, 양성대조군 2로 오르리스타트(orlistat, 지방흡수를 억제하는 비만 치료제)를, 실험군으로 실시예 1의 발효물, 비교예 1의 추출물, 비교예 8의 발효물을 1회/일 경구 투여하였다.
기존 연구결과에 따르면, 60% 이상의 고지방식이를 제공할 경우에는 렙틴저항(leptin resistance) 등 섭식중추장애와 관련된 인자(aP2, AMPK)의 발현을 확인할 수 있다.
[ 실험예 9] 복부지방 감소 효과
상기 준비예 1의 정상식이군 및 고지방식이군에 대하여 복부지방량을 측정하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 이때, 각 쥐를 12시간 절식하고 마취한 후 복부에서 지방조직을 적출하였다.
도 14와 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 정상식이군에 비해 복부지방량이 증가한 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 양성대조군 1로 가르시니아 캄보지아를 제공한 경우와 유사한 수준으로 복부지방량이 감소한 것으로 나타났다.
결과적으로, 실시예 1의 발효물이 복부지방을 감소시키는데 우수한 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 10] 체중 감소 효과
상기 준비예 1의 정상식이군 및 고지방식이군에 대하여 체중을 측정하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15와 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 정상식이군에 비해 체중이 증가한 것으로 나타났다. 이때, 양성대조군과 실험군은 유사한 수준으로 체중 및 체중 증가량이 감소된 것으로 나타났다.
[ 실험예 11] 지방 축적 억제 효과
상기 준비예 1의 정상식이군 및 고지방식이군에 대하여 간 조직과 지방 조직을 관찰하였다.
(a) 간 조직
각 쥐를 12시간 절식하고 마취한 후 간 조직을 적출하여 10% 포름알데히드에 담갔다. 조직을 1 cm 내외로 절단한 후 차가운 PBS에 담가 4시간 동안 교반하면서 포름알데히드를 제거하였다. 이때, 30분마다 새로운 PBS로 교체하였다. 이후 포름알데히드가 제거된 조직을 30% 수크로스 용액에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 보관하였다. 조직을 동결절편 용액(frozen section compound)으로 고정시킨 후 냉동절편기(microtome)를 이용하여 10 um으로 절편하고, 슬라이드 위에 올려 상온에서 하루동안 건조시켜 준비하였다.
준비된 간 조직을 차가운 10% 포름알데히드에 넣고 5~10분 동안 고정한 후 증류수로 2.5분씩 2회 세척하였다. 상기 조직을 프로필렌 글리콜에 넣고 5분 동안 방치한 후 오일-레드-오 용액에 넣고 60℃ 오븐에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 조직을 꺼내 85% 프로필렌 글리콜에 넣고 1분 동안 방치하고 증류수로 2.5분씩 2회 세척하였다. 상기 조직을 헤마톡실린 용액에 2초 동안 담근 후 흐르는 수돗물에서 3분 동안 세척하고, 증류수로 3분씩 2회 세척하였다. 각 조직에 글리세린 젤리(glycerin jelly)를 올려 실온에서 하룻동안 방치 후 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16과 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 정상식이군에 비해 간 조직에 지방이 축적되어 지방간이 유도된 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 양성대조군 1, 2에 비해 지방 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다.
(b) 지방 조직
각 쥐를 12시간 동안 절식하고 마취한 후 복부에서 지방 조직을 적출하여 카세트에 넣고 10% 포름알데히드에 담갔다. 이후 카세트를 증류수에 담가 세척하였다. 상기 카세트를 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올에 순차적으로 담가 조직을 탈수시킨 후 자일렌에 담가 에탄올을 제거하였다. 상기 조직을 파라핀 용액에 넣고 굳혀서 조직 블록을 제작하였다. 냉동절편기를 이용하여 상기 조직 블록을 3~5 um로 절편하고, 이를 슬라이드 위에 올려 상온에서 건조시켰다. 상기 슬라이드를 60℃ 오븐에 넣고 하룻동안 파라핀을 제거하였고, 이후 자일렌, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올에 순차적으로 담가 조직을 탈수하고 증류수로 세척하였다. 상기 슬라이드를 헤마톡실린 용액에 10분 동안 담근 후 증류수로 3분 동안 세척하였다. 이후 1% HCl-EtOH에 5~10번 담가 증류수로 3분 동안 세척하였고, 에오신 용액에 2분 동안 담갔다. 상기 슬라이드를 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올에 순차적으로 담가 조직을 탈수시킨 후 자일렌에 2회 담갔다. 상기 슬라이드 위 조직에 봉입제(mounting solution)를 올려 커버 글라스를 덮고 실온에서 2일 동안 건조한 후 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17과 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 정상식이군에 비해 지방세포의 크기가 비대해지는 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 양성대조군 1 및 2와 유사한 수준으로 지방세포의 크기가 감소한 것으로 나타났다.
[ 실험예 12] 비만 관련 유전자의 발현 조절 효과
상기 준비예 1의 정상식이군 및 고지방식이군에 대하여 간 조직, 지방 조직, 뇌 시상하부 조직에서 비만 관련 유전자의 발현 정도를 측정하였다.
먼저, 각 조직에서 단백질을 추출하여 브래드포드법으로 정량하였다. 상기 정량된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯법(western blot)으로 단백질 aP2, UCP2, pAMPK의 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 18 내지 20에 나타내었다.
(1) aP2 ( adipocyte fatty acid binding protein)
aP2는 FABP4(fatty acid binding proteins)라고도 하며, 지방세포 내로 지방산 및 지질을 운반하는 단백질이다. 이러한 aP2는 항비만 소재의 체중조절 기능을 확인하는데 바이오마커(biomarker)로 활용될 수 있다.
도 18과 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 aP2의 발현이 급증한 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 정상식이군과 유사한 수준으로 aP2의 발현량이 감소한 것으로 나타났다.
비록 체중 및 체중 증가량에서 양성대조군과 실시예 1의 발효물이 유의적인 차이를 보이지 않았으나(실험예 10 참조), aP2 발현에서는 실시예 1의 발효물이 양성대조군에 비해 유의적으로 우수한 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, 실시예 1의 발효물이 잠재적으로 체중조절 효과가 있으며 지방 축적을 억제하는데도 도움을 줄 것이라고 생각할 수 있다.
(2) UCP2 (uncoupling protein)
UCP2는 미토콘드리아 내막에 존재하는 단백질로, 에너지 대사 과정에서 발생된 수소이온을 ATP 합성 대신 열 생산에 이용하여 에너지를 소모시킨다. 이로 인해, UCP2의 발현량이 증가할수록 많은 에너지가 소모되는 것으로 볼 수 있다.
도 19와 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 UCP2의 발현이 급감한 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 정상식이군과 유사한 수준으로 UCP2P의 발현량이 증가한 것으로 나타났다.
(3) pAMPK ( phosphorylated AMP activated protein kinase )
pAMPK는 뇌에 존재하는 식욕조절 단백질인 AMPK가 활성화된 형태로, pAMPK의 발현량이 감소할수록 식욕이 억제되는 것으로 볼 수 있다.
도 20과 같이, 고지방식이한 경우(대조군)에는 pAMPK의 발현이 급증한 것으로 나타났다. 이때, 실시예 1의 발효물을 제공한 경우에는 양성대조군 2로 오르리스타트를 제공한 경우와 유사한 수준으로 pAMPK의 발현량이 감소한 것으로 나타났다.
결과적으로, 실시예 1의 발효물은 식욕을 감소시키며 세포내 지방산 운반을 억제하고 에너지 소비를 증가시킴으로써 복부나 내장에 지방이 축적되는 것을 억제 또는 예방할 수 있음을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯으로서, 용매와 혼합된 후 15 내지 25℃에서 300 내지 1,000 rpm으로 5 내지 300초 동안 분쇄된 버섯; 및
    사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모
    를 혼합한 후 발효하여 제조된 발효물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에인 항비만용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 (KCTC 7904), 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (KCTC 7243), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (KCTC 7244), 클루이베로마이세스 락티스 (KCTC 7151), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (KCTC 7152), 지고사카로미세스 룩시이 (KCTC 7880) 및 데바리오마이세스 한세니이 (KCTC 17995)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 항비만용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 버섯과 효모를 버섯:효모=1:0.1 내지 5의 중량비로 혼합하는 항비만용 조성물.
  6. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 식품 조성물.
  7. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 약학 조성물.
  8. (a) 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 버섯과 용매를 혼합한 후 15 내지 25℃에서 300 내지 1,000 rpm으로 5 내지 300초 동안 분쇄하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 혼합물과 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효모를 혼합한 후 발효하여 발효물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 제1항의 항비만용 조성물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서, 버섯의 사용량은 용매 100 중량부를 기준으로 5 내지 80 중량부인 항비만용 조성물의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 제조된 혼합물을 110℃ 이상에서 5 내지 20분 동안 멸균하는 단계를 더 포함하는 항비만용 조성물의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에인 항비만용 조성물의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 (KCTC 7904), 사카로마이세스 세레비지아에 MAB Y1 (KCTC 11386BP), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (KCTC 7243), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (KCTC 7244), 클루이베로마이세스 락티스 (KCTC 7151), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (KCTC 7152), 지고사카로미세스 룩시이 (KCTC 7880) 및 데바리오마이세스 한세니이 (KCTC 17995)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 항비만용 조성물의 제조방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 효모의 사용량은 버섯과 용매가 혼합된 혼합물 100 중량부를 기준으로 1 내지 30 중량부인 항비만용 조성물의 제조방법.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 혼합물과 효모를 혼합한 후 20 내지 50℃에서 6 내지 54시간 동안 호기 조건으로 발효하는 것인 항비만용 조성물의 제조방법.
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