KR101786644B1 - 균사체화된 산물 및 카카오와 다른 농작물 유래의 균사체화된 산물의 제조방법 - Google Patents

균사체화된 산물 및 카카오와 다른 농작물 유래의 균사체화된 산물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농산품의 제조방법을 제공한다. 이 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하고, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 살균하여 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하고, 및, 제조된 곰팡이 성분을 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에 접종하고 균사체화된 산물을 제조하기 위해 접종물을 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 출발 카카오 콩 또는 다른 농작물과 비교하여 제조된 카카오 콩 또는 다른 농작물이 바람직하지 않은 맛 성분, 예컨대, 테오브로민 또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진의 감소된 수준과 균사체화 산물, 예컨대, 베타 글루칸, 피라진 및 다당류의 증가된 수준을 제공한다.

Description

균사체화된 산물 및 카카오와 다른 농작물 유래의 균사체화된 산물의 제조방법{Myceliated products and methods for making myceliated products from cacao and other agricultural substrates}
2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/802,256호, 발명의 명칭 "기능 식품 제형 및 기능성 식품 생산용 균사체화된 농작물"; 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 특허출원 제13/844,685호, 발명의 명칭 "커피의 균사체화 방법"(보정); 2013년 4월 9일자로 출원된 미국 특허출원 제13/859,719호, 발명의 명칭 "기능성 식품 및 기능 식품 생산용 농작물의 균사체화 방법"; 2013년 5월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제13/874,832호, 발명의 명칭 "균사체화된 농작물의 추출물 및 기능 식품 조성물로서의 그것의 용도"; 2013년 7월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/844,498호, 발명의 명칭 "발효에 의한 커피의 제조방법"; 2013년 7월 23일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/396,863호, 발명의 명칭 "곰팡이 성분을 포함하는 커피의 카페인 제거 공정"; 2013년 8월 15일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/866,371호, 발명의 명칭 "2-메톡시-3-이소프로필피라진의 대사체를 포함하는 카카오 콩 및 카카오 콩에서 2-메톡시-3-이소프로필피라진의 대사 방법"; 2013년 8월 19일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/867,501호, 발명의 명칭 "발효에 의해 생산된 메틸 피라진을 포함하는 카카오 콩 및 카카오에서 메틸 피라진의 증가 방법"; 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 특허출원 제14/020,512호, 발명의 명칭 "클로로겐산의 제거를 포함하는 생 커피콩의 개선된 균사체화 방법"; 2013년 9월 15일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/878,037호, 발명의 명칭 "커피 멜라노이딘의 치아-염색 영향을 줄이기 위한 커피 생두의 균사체화"; 및 2013년 10월 27일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/896,097호, 발명의 명칭 "수용액에서 카카오 균사체화"; 그들 전체가 참고로 여기에 포함되어 있다.
본 발명의 방법과 산물은 농작물, 특히, 카카오 및 다른 농작물에서 향미(flavor)를 개선하기 위한 곰팡이 균주의 이용에 관한 것이다.
카카오나무는 카카오 콩을 포함한 건강한 카카오 꼬투리를 키우고 열매 맺게 하기 위해 습하고 더운 열대 환경을 필요로 하기 때문에, 지구상의 카카오 대부분은 적도를 기준으로 북위 및 남위 20도 지역에 걸쳐 자라고 있다. 잘 익었을 때 수확된 보통의 카카오 꼬투리는 점액질의 속질에 유화되어 있는 20 내지 50개의 카카오 콩을 생산한다. 일반적으로, 카카오 꼬투리는 4일 내지 7일 동안 꼬투리를 발효하여(속질을 제거하기 위해) 시중에 판매되고, 콩은 따로 5일 내지 14일 동안 건조된다. 약 20개의 카카오 품종과 수백 개의 잡종이 있다. 이들 중 4종의 주요 카카오가 상업적인 초콜릿 시장에 유통되고 있다. 포라스테레오 카카오(Forastero cacao)는 세계 카카오 시장의 대략 95%를 점유하고 있다. 크리올로 카카오(Criollo cacao)는 세계 시장의 약 7%를 점유하고 있고, 포라스테레오보다 훨씬 자라기 어려운 고품질의 고급 카카오로 불린다. 트리니타리오 카카오(Trinitario cacao)는 트리니다드에서 잘 자라는 포라스테레오/그리올로 잡종이다. 나시오날 카카오(Nacional cacao)는 쓴맛이 적고 달콤한 꽃향기를 가지는 것으로 평가되나, 상업적으로 키우기는 어렵다. 지구상의 대부분의 카카오는 아이보리 코스트(Ivory Coast)에서 생산된다. 생산량은 연간 백만 톤 이상을 나타낸다. 가나, 인도네시아, 카메룬, 브라질 및 나이지리아 역시 대량의 카카오를 생산한다. 카카오는 보통 감미료 및 다른 성분들과 카카오의 혼합물인 초콜릿의 형태로 전 세계적으로 소비된다.
카카오 콩은 세균 함량을 줄이기 위해 보통 과열 증기를 처리한다. 증기가 흠뻑 스며들도록 카카오 콩을 처리함으로써 바람직한 향미 성분들이 일부 제거되는 것으로 보인다. 맛이 좋은 초콜릿을 제조하기 위해 설탕과 다른 감미료들을 카카오 분말과 혼합한다. 종종 다른 향미들이 첨가된다. 현재 많은 건강 지지자들은 카카오의 건강상의 이점을 알리면서, 설탕과 인공 감미료를 포함하는 감미료의 과다한 사용에 따른 위험을 경고하고 있다.
고려해야 할 것은 과도한 감미료 없이도 좋은 맛을 내는 산물을 얻기 위한 카카오의 제조 방식이다. 또한, 고려해야 할 것은 덜 바람직한 향미 성분들을 최소화하면서 바람직한 향미 성분들을 보유한 카카오의 가공 방식이다. 더욱이, 좋은 맛을 내는 산물을 얻기 위해서는 자연 가공에 의지하는 것이 좋다.
따라서, 카카오 콩 또는 다른 농작물에 비해 바람직하지 않은 맛 성분들의 감소된 수준 및/또는 향미 및/또는 건강 촉진 성분들의 증가된 수준을 갖는 개선된 균사체화된 산물, 및 그러한 산물을 얻는 방법에 대한 기술적 요구가 남아 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 균사체화된 카카오 또는 다른 농작물 산물의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하고, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하기 위해 카카오 콩 또는 다른 농작물을 살균하는 것을 포함하는 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 제조된 곰팡이 성분을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에 제조된 곰팡이 성분을 접종하고, 균사체화된 카카오 또는 다른 농작물 산물을 제조하기 위해 접종물을 배양하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 바람직하지 않은 맛 성분들의 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 바람직하지 않은 맛 성분들의 함량을 감소시키는 것은 선택적으로 적어도 하나 또는 두 개의 카카오 콩 또는 다른 농작물의 수용성 추출물을 포함하는 것이다. 바람직하지 않은 맛 성분은 메틸잔틴, 예를 들어, 테오브로민 및/또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 선택적으로 약 60%로 수화하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 제조된 곰팡이 성분이 가노데르마 루시덤(G. lucidum), 선택적으로, 가노데르마 루시덤(G. lucidum) 균주 806, 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 및/또는 튜버 멜라노스포럼(T. melanosporum)인 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 다수의 곰팡이 균주를 스크리닝하고, 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사 또는 이용하는 향상된 능력을 갖춘 균주를 선별하고, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들의 제거, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 카페인의 제거를 향상시킬 수 있는 균주를 선별하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 제조된 곰팡이 성분은 수용성 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물 및 에너지원을 포함하는 명시되지 않은 배지, 또는 교대로, 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및/또는 메틸잔틴, 예컨대 테오브로민을 포함하는 배지에서 유지된다. 곰팡이 균주의 유지는 곰팡이의 적응을 통해 카카오 콩 또는 다른 농작물, 및/또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및/또는 메틸잔틴, 예컨대 테오브로민에서 성장, 대사 또는 이용하는 곰팡이의 능력을 향상시킨다.
본 발명의 방법은 또한 배양 단계가 반-혐기적 조건에서 선택적으로 약 7일 동안 수행하는 발효 단계인 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물에 비해 균사체화된 커피 산물이 바람직하지 않은 맛 성분들, 예컨대, 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및/또는 메틸잔틴, 예컨대 테오브로민의 감소된 수준과, 균사체화 산물, 예컨대, 베타 글루칸, 피라진, 및 다당류의 증가된 수준을 갖게 한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 균사체화 산물 및 카카오 콩 또는 다른 농작물, 및 초기 또는 미처리된 카카오 콩 또는 다른 농작물에 비해 바람직하지 않은 맛 성분들의 감소된 수준과 균사체화 산물의 증가된 수준을 갖춘 균사체화된 카카오 또는 다른 농산품을 포함한다.
도 1은 본 발명에 따른 생체-이용가능한 균사체 산물의 제조방법의 작업 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 사람에서 신경-재생 및 신경-보호를 이루기 위한 생식용 균사체화된 농산품의 추출물을 제조하는 방법의 작업 공정도이다.
도 3은 본 발명에 따른 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 카페인을 제거하는 방법의 작업 공정도이다.
도 4는 균사체화된 커피 산물을 제조하는 방법의 작업 공정도이다.
도 5는 균사체화된 커피 산물을 제조하는 방법의 작업 공정도이다.
도 6은 본 발명에 따라 사용된 컨베이어이다.
도 7은 오토클레이브에 컨테이너를 전달하기 위해 본 발명에 따라 사용된 컨베이어이다.
도 8(A), 8(B) 및 8(C)는 자갈무늬 표면(pebbled surface), 다수의 멸균용 백(autoclavable bags) 및 멸균재 롤(rolled autoclavable material)을 갖춘 멸균용 백을 보여준다.
도 9는 균사체화된 카카오 산물을 제조하는 방법의 작업 공정도이다.
도 10은 균사체화된 카카오 산물을 제조하는 방법의 작업 공정도이다.
일 구체예에서, 본 발명은 균사체화된 카카오(또는 다른 농작물) 산물의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 카카오 또는 다른 농작물을 제공하고, 준비된 카카오 또는 다른 농작물을 제공하기 위해 카카오 또는 다른 농작물을 멸균하는 것을 포함하는 준비된 카카오 또는 다른 농작물을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 제조된 곰팡이 성분을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 제조된 곰팡이 성분을 준비된 카카오 또는 다른 농작물에 접종하고, 균사체화된 카카오 또는 다른 농작물 산물을 생산하기 위해 균사체화 되도록 준비된 카카오 또는 다른 농작물 및 제조된 곰팡이 성분을 배양하는 것을 포함한다. 이들 단계는 임의의 순서로 수행될 것이다.
일 구체예에서, 준비된 카카오 또는 다른 농작물이 제공되므로 카카오 또는 다른 농작물을 제공하는 단계를 포함한다.
상기 농작물은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함한다. 커피는 씨앗을 갖는 현화식물 속인 코페아(Coffea) 속을 의미하며, 커피콩 또는 커피 생두로 다양하게 불리며 커피를 제조하는데 사용된다. 그것은 꼭두서니과(Rubiaceae)의 일원이다. 커피콩은 커피나무의 선별적 육종 또는 자연도태를 통해 유래된 다양한 품종들인 몇몇 커피 변종 중 하나로부터 선택될 것이다. 다른 장소에서 자란 같은 변종의 커피콩은 향미("신맛", "감귤-같은" 또는 "흑내 나는" 같은 용어를 포함하는 향미 기준), 카페인 함량, 구감(body or mouthfeel), 및 산도 같은 뚜렷한 특성들을 가질 것이다. 본 발명에 유용한 카카오 콩 또는 다른 농작물은 코페아 아라비카(Coffea arabica) 및 코페아 로부스타(Coffea robusta)(또한, 코페아 코네포라(Coffea conephora)로 알려져 있음)를 포함하는 임의의 커피 종일 것이다; 본 발명에 유용한 추가적인 커피 종으로 코페아 벵갈렌시스(Coffea benghalensis) 또는 벵골 커피(Bengal coffee); 코페아 콘젠시스(Coffea congensis) 또는 콩고 커피(Congo coffee); 코페아 리베리카(Coffea liberica) 또는 리베리안 커피(Liberian coffee); 코페아 스테노필라(Coffea stenophylla) 또는 시에라리온 커피(Sierra Leonian coffee); 코페아 엑셀시아(Coffea excelsia), 또는 다른 리베리안 커피; 코페아 보니에리(Coffea bonnieri); 코페아 갈리엔니(Coffea gallienii); 및 코페아 모게네티(Coffea mogeneti)를 포함한다.
본 발명에 유용한 카카오 콩 또는 다른 농작물은 코페아 아라비카(Coffea arabica) 및 코페아 로부스타(Coffea robusta)(또한, 코페아 코네포라(Coffea conephora)로 알려져 있음)를 포함하는 임의의 커피 종일 수 있다; 본 발명에 유용한 추가적인 커피 종으로 코페아 벵갈렌시스(Coffea benghalensis) 또는 벵골 커피(Bengal coffee); 코페아 콘젠시스(Coffea congensis) 또는 콩고 커피(Congo coffee); 코페아 리베리카(Coffea liberica) 또는 리베리안 커피(Liberian coffee); 코페아 스테노필라(Coffea stenophylla) 또는 시에라리온 커피(Sierra Leonian coffee); 코페아 엑셀시아(Coffea excelsia), 또는 다른 리베리안 커피; 코페아 보니에리(Coffea bonnieri); 코페아 갈리엔니(Coffea gallienii); 및 코페아 모게네티(Coffea mogeneti)가 포함된다.
본 발명은 상기 나열된 종들의 임의의 변종 또는 균주를 포함한다. 예를 들어, 많은 아라비카 변종들은 그들이 주로 발견되거나, 그들이 발생한 나라 또는 지역의 이름을 따서 명명되었다. 아라비카 커피의 예시적인 임의의 변종들은 티피카, 버본, 카투라, 카투아이, 문도 노바, 및 블루 마운틴을 포함한다. 또한, 임의의 유전자 변형 균주 또는 품종들을 포함하는 파생 종들 및 커피의 임의의 전래 변종(non-GMO) 균주 또는 품종들이 본 발명에 포함된다.
상기 농작물은 카카오 콩이다. 테오브로마 카카오(Theobroma cacao), 이후 "카카오"는 아욱과 말바세애(mallow family Malvaceae)의 아과(subfamily) 스테르쿨리오이데아(Sterculioidea)에서 분류된 테오브로마(Theobroma) 속에 속한다. 약 20개의 다른 카카오 변종 및 수백 개의 잡종이 있고, 이들 모두 본 발명에서 이용하기에 적당하다. 예를 들어, 적당한 카카오 콩으로 포라스테로 카카오, 크리올로 카카오, 트리니타리오 카카오 및 나시오날 카카오가 있다. 본 발명에 적당한 카카오는 카카오 꼬투리가 익을 때 수확하였다. 평균 카카오 꼬투리는 끈적거리는 속질에 유화되어 있는 20 내지 50개의 카카오 콩을 생산한다. 일반적으로, 카카오 꼬투리는 시장 판매를 위해 4일 내지 7일 동안 꼬투리를 발효시켜(속질을 제거하기 위해) 제조하고, 콩은 별도로 5일 내지 14일 동안 건조한다. 건조된 콩이 본 발명에 적합하다.
생(raw) 카카오 콩은 자연적으로 발생하는 세균 및 다른 미생물을 풍부하게 가지고 있다. 일반적으로 세균 함량을 줄이기 위해 카카오 콩에 과열 증기를 처리한다. 증기가 흠뻑 스며들도록 카카오 콩에 처리함으로 인해 바람직한 향미 성분들이 일부 제거되는 것으로 보인다. 과열 증기-처리된 카카오 콩이 또한 본 발명에 적합하다.
본 발명에 따른 균사체화 될 농작물로, 모든 곡물, 낟알, 모든 밀 종류, 호밀, 현미, 백미, 적미, 황금쌀, 와일드 라이스, 쌀, 보리, 트리티케일, 라이스, 수수, 귀리, 기장, 키노아, 메밀, 포니오, 아마란스, 테프 및 듀럼밀; 사과 및 배, 살구, 체리, 아몬드, 복숭아, 딸기, 건포도, 카사바, 카카오, 바나나, 꼭두서니속(Rubiaceae sp.)(커피), 망고 분말, 안젤리카, 아니스(Pimpinella anisum), 아니시드 머틀(Syzygium anisatum), 안나토(Bixa orellana), 애플 민트(Mentha suaveolens), 아르테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 쑥, 아사포에티다(Ferula assafoetida), 매자나무, 바나나, 바질(Ocimum basilicum), 월계수, 범꼬리(Persicaria bistorta), 블랙 카르다몸, 블랙 커민, 블랙커런트, 블랙 라임, 블랙 더랙(Fucus vesiculosus), 꿩의다리아재비, 블루 맬리(Blue-leaved Mallee, Eucalyptus polybractea), 습지 래브라도 차(Bog Labrador Tea, Rhododendron groenlandicum), 볼도(Peumus boldus), 볼리비안 코리안더(Porophyllum ruderale), 보리지(Borago officinalis), 창포, 금잔화, 칼룸바( Jateorhiza calumba), 카밀레, 칸나비스, 케이퍼(Capparis spinosa), 캐러웨이, 카더몬, 구주콩나무 꼬투리, 카시아, 카주아리나, 캣닢, 고양이 발톱, 금혼초, 청양고추, 셀라스트루스 파니쿨라투스(Celastrus paniculatus), 컴프리, 셀러리 솔트, 셀러리의 씨, 센토리, 처빌(Anthriscus cerefolium), 별꽃, 치커리, 칠레 고추, 칠리 분말, 기나나무, 차이브스(Allium schoenoprasum), 시슬리(Myrrhis odorata), 고수(see Coriander) (Coriandrum sativum), 계피(and Cassia), 시나몬 머틀(Backhousia myrtifolia), 샐비아, 갈퀴덩굴, 클로버, 정향, 커피, 머위, 컴프리, 루(Common Rue), 콘두란고, 황련, 고수(Coriander), 코스트마리(Tanacetum balsamita), 개밀, 카우 파슬리(Anthriscus sylvestris), 카우슬립 앵초, 크램프 바크(Cramp Bark)(Viburnum opulus), 크레스, 장미허브(Plectranthus amboinicus), 떡쑥, 커민, 커리 리프(Murraya koenigii), 다미아나(Turnera aphrodisiaca), 민들레(Taraxacum officinale), 데멀센트(Demulcent), 악마의 발톱(Harpagophytum procumbens), 딜씨드, 딜(Anethum graveolens), 도리고 페퍼(Tasmannia stipitata), 에키네시아, 땅두릅나무, 에델바이스, 앨더베리, 엘더플라워, 얼리캠페인, 가시오갈피(Eleutherococcus senticosus), 에파조트(Chenopodium ambrosioides), 이페드라, 에린지움 포에티둠(Eryngium foetidum), 유칼립투스, 회향(Foeniculum vulgare), 호로파, 피버퓨, 현삼, 중국 오향분, 포-티-티엘(Fo-ti-tieng), 서양현호색, 갈랑갈, 가람 마살라, 큰다닥냉이, 부추(Garlic chives), 마늘, 생강(Zingiber officinale), 은행나무(Ginkgo biloba), 인삼, 가시오갈피나무(Eleutherococcus senticosus), 고트스루(Galega officinalis), 고아다 마살라(Goada masala), 미역취, 히드라스티스, 고투 콜라, 아나미르타의 씨(Aframomum melegueta), 셀림의 씨(Xylopia aethiopica), 포도씨 추출물, 녹차, 그라운드 아이비, 과코, 쉽사리(Gypsywort), 산사나무(Crataegus sanguinea), 산사나무(Hawthorne Tree), 삼, 프로방스 허브들(Herbes de Provence), 히비스커스, 감탕나무, 홀리 티슬, 호프, 허하운드, 서양고추냉이, 쇠뜨기(Equisetum telmateia), 히솝(Hyssopus officinalis), 얄라파, 자스민, 자스민 펄, 지아오굴란(Gynostemma pentaphyllum), 등골나물(Gravelroot), 존 더 퀀커러(John the Conqueror), 향나무, 카피르 라임 잎(Citrus hystrix , C. papedia), 카알라 마살라(Kaala masala), 마디풀, 코캄, 래브라도 차, 흰솔나물, 레이디스 맨틀, 랜드 크레스(Land cress), 라벤더(Lavandula spp.), 레듐, 레몬 밤(Melissa officinalis), 레몬 바질, 레몬그라스(Cymbopogon citratus, C. flexuosus, 및 다른 종), 레몬 아이언바크(Eucalyptus staigeriana), 레몬 민트, 레몬 머틀(Backhousia citriodora), 레몬 타임, 레몬 버베나(Lippia citriodora), 감초-아답토겐(Licorice-adaptogen), 라임 플라워, 림노필라 아로마티카(Limnophila aromatica), 아마인, 감초, 필발(Long pepper), 러비지(Levisticum officinale), 개여주(Luohanguo), 메이스, 말라브, 말라바트룸, 만추리안 톤 트리(Manchurian Thorn Tree(Aralia manchurica), 합한채, 마요라나(Origanum majorana), 흰꽃광대나물(Marrubium vulgare), 마쉬 래브라도 티(Marsh Labrador Tea), 마시멜로, 유향, 터리풀, 메이 옌, 말리구에타 후추(Aframomum melegueta), 민트, 밀크 시슬(Silybum), 베르가모트(Monarda didyma), 익모초, 마운틴 스컬캡(Mountain Skullcap), 멀런(Verbascum thapsus), 겨자, 겨자씨, 나쉬아 이나구엔시스(Nashia inaguensis), 콜란지(Kolanji), 님(Neem), 개박하, 니겔라 사티바(Nigella sativa), 콜란지(Kolanji), 블랙 카라웨이(Black caraway), 노니(Noni), 육두구, 메이스(Mace), 마리화나(Marijuana), 달맞이꽃(Oenothera biennis), 올리다(Eucalyptus olida), 오레가노(Origanum vulgare, O. heracleoticum), 오리스 뿌리, 긴사상자(Osmorhiza), 올리브 잎(차 및 생약 보충제로 사용), 미국삼(Panax quinquefolius), 판단 잎, 파프리카, 파슬리(Petroselinum crispum), 시계꽃, 패츌리, 페니로얄, 고추(블랙, 화이트 및 그린), 페퍼민트, 페퍼민트 검(Eucalyptus dives), 소엽, 플랜틴, 석류, 폰크 포란(Ponch phoran), 양귀비 씨, 앵초(Primula), 캔디드 꽃(candied flowers), 드라이 티 믹스( dry tea mixes), 차전자, 쇠비름, 콰시아, 콰트레 에피스(Quatre epices), 램슨(Ramson), 나무딸기(잎), 레이시(Reishi), 레스타로우(Restharrow), 홍경천(Rhodiola rosea), 리베리(Syzygium luehmannii), 루콜라(Rocket/Arugula), 로만 카모마일, 루이보스, 로즈힙, 로즈마리(Rosmarinus officinalis), 마가목(Rowan Berries), 운향(Rue), 잇꽃(Safflower), 사프란, 살비아(Salvia officinalis), 사이공 시나몬, 세인트 존스 워트(St John's Wort), 샐러드 버넷(Sanguisorba minor 또는 Poterium sanguisorba), 살비아, 초피나무(산초), 사사프라스, 세이보리(Satureja hortensis , S. montana), 오미자 (Schisandra chinensis), 슈텔라리아 코스타리카나(Scutellaria costaricana), 센나(허브), 결명자(Senna obtusifolia), 참깨 씨, 애기수영(Sheep Sorrel), 냉이(Shepherd's Purse), 시알라고귀(Sialagogue), 가시오갈피나무(Eleutherococcus senticosus), 나한과(Siraitia grosvenorii), 스컬캡(Skullcap), 야생자두, 스머지 스틱(Smudge Stick), 방가지똥(Sonchus), 소렐(Rumex spp.), 서던우드, 스피어민트, 꼬리풀, 무릇류(Squill), 스타 아니스(Star anise), 스테비아, 딸기 잎, 스마(Pfaffia paniculata), 옻나무류, 섬머 세이보리, 서덜랜디아 프루테스센스(Sutherlandia frutescens), 스위트 그라스, 스위트 시슬리(Myrrhis odorata), 스위트 우드라프, 사천 후추(Xanthoxylum piperitum), 타카마학(Tacamahac), 타마린드(Tamarind), 탄두리 마살라, 탄시(Tansy), 타라공(Artemisia dracunculus), 티(tea), 테우크리움 폴리움(Teucrium polium), 타이 바질, 엉겅퀴, 백리향, 투르 달(Toor DaIl), 양지꽃(Tormentil), 남가새(Tribulus terrestris), 툴시(Ocimum tenuiflorum), 투머릭(Curcuma longa), 베어베리로 알려진 우바 우르시, 바닐라(Vanilla planifolia), 웨삭(Vasaka), 버베인, 베티베리, 월남고수(Persicaria odorata), 고추냉이(Wasabia japonica), 물냉이, 와틀씨(Wattleseed), 족도리풀류(Wild ginger), 와일드 레터스(Wild Lettuce), 야생 타임(Wild thyme), 윈터 세이보리, 위치하젤(Witch Hazel), 울프베리(Wolfberry), 우드 아벤스(Wood Avens), 우드 베토니(Wood Betony), 선갈퀴(Woodruff), 쑥류(Wormwood), 톱풀류(Yarrow), 예르바 부에나(Yerba Buena), 예르바 메이트(Yerbe mate), 요힘베(Yohimbe), 자아타르(Za'atar), 인도산 생강(Zedoary root), 또는 그것의 수용액 또는 반-수용성 용액 유도체를 포함한다.
(수화 및 세척 단계)
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 카카오 콩 또는 다른 농작물을 준비하여 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제조한다.
어떤 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 본 발명의 공정에 사용하기 전에 건조하지 않는다. 이 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 수확한 후, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 선택적으로 종래기술로 알려진 임의의 공정(디뮤실지드(demucilaged)), 예컨대, 발효를 통해 속질을 제거하고 나서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 추가적인 카카오 콩 또는 다른 농작물 처리, 예컨대 건조 없이 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 속질은 남아있게 될 것이다. 일반적으로, 발효(디뮤실지드) 단계 후, 카카오 콩은 약 55% 내지 60%의 수분 함량을 가진다. 이 구체예에서, 아래 설명된 대로 수화 및/또는 세척 단계가 꼭 필요한 것은 아니며, 건조되지 않은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 이용하므로 필요가 없다. 어떤 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 부분적으로 건조되고 여기에 설명된 대로 이후에 수화될 것이다.
어떤 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 수화하는 단계에 의해 준비된다. 수화는 특히 카카오 콩 또는 다른 농작물이 건조된 곳에서 유용하다. 수화는 농작물이 배양 공정(균사체화)을 위한 최적의 수분 함량을 갖도록 한다. 수화는 종래기술로 알려진 다수의 방법에 의해 달성될 것이다.
수화는 수용성 배지에서 수행될 것이다. 수용성 배지는 물 및 선택적으로, 추가적인 부형제들을 포함한다. 물은 이온화하거나, 수도에서 나오게 하거나, 증류 또는 미네랄을 함유하게 될 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다. 다른 부형제들, 예컨대, 특정 pH를 유지하기 위한 완충용액, 소듐 클로라이드, 시트르산 및/또는 아스코르브산이 물에 첨가될 수 있다. pH는 중성이거나 조절될 수 있다. 수용성 배지의 온도는 실온이거나, 수화 과정을 촉진하기 위해 온도를 높일 수도 있다.
수화는 카카오 콩 또는 다른 농작물을 임의의 적당한 시간 범위, 몇 초 미만에서 오버나이트 범위 동안 수용성 배지에 소킹(soaking)하여 수행될 것이다. 예를 들어, 카카오 콩은 상당히 흡습성이어서 수화하는데 시간을 거의 요구하지 않을 것이다. 수화 및/또는 수용성 추출 단계를 위한 소킹 단계는 2초, 적어도 5초, 적어도 10초, 적어도 30초, 적어도 1분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 1시간, 적어도 1시간 30분, 적어도 2시간, 적어도 2시간 30분, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 또는 적어도 14시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 또는 적어도 48시간 미만일 것이다. 그러나, 수화 단계를 위한 시간은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 살균하지 않는다는 사실의 관점에서 선택되어야 하며, 너무 긴 시간 동안 소킹하는 것은 바람직하지 않은 생물체의 성장을 촉진할 것이다. 수화 시간은 농작물의 수분 함량과, 카카오 콩 또는 다른 농작물의 분자 구성을 최적화하도록 선택되어야 한다.
카카오 콩 또는 다른 농작물은 효과적인 수화를 허용하는 임의의 온도에서 수화될 것이다. 일 구체예에서, 수용성 성분 온도의 온도는 실온이다. 수화 온도는 고온에서 바람직한 향미 성분들이 변화될 것이라는 사실의 관점에서 선택되어야 한다.
수화는 정상 대기압하에서 수행되거나, 수화 과정 및/또는 수용성 추출 과정을 촉진하기 위해 증가된 압력, 예를 들어, 1 대기압 내지 2 대기압, 예를 들어 1.5 대기압하에서 수행될 것이다.
수화된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 수분 함량은 선택적으로 약 20% 내지 약 80%, 40% 내지 70%이다. 일 구체예에서, 수분 함량은 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%이다. 일 구체예에서, 카카오 콩의 수분 함량은 적어도 약 36%이다.
수화 단계는 종래기술로 알려진 임의의 방법에 의해 용기 내에서 일어날 것이다. 일 구체예에서, 용기는 55 갤런 드럼, 또는 5-갤런 버켓 같은 드럼이다. 이 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물:수용성 성분=1:1의 부피비(동량의 부피)를 5분 내지 24시간 동안 유지하도록 한다. 예를 들어, 55 갤런 드럼 또는 5 갤런 버켓을 카카오 콩 또는 다른 농작물로 절반 채우고, 카카오 콩 또는 다른 농작물에 수용성 배지를 부가하여 카카오 콩 또는 다른 농작물이 잠기게 한다. 이 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 전체 수용성 성분을 흡수할 것이다. 다른 구체예에서, 용기 내에 포함된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 물로 채워 일 구체예에서 상당한 초과 없이 카카오 콩이 완전히 잠기도록 할 것이다.
일 구체예에서, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하는 단계는 선택적으로 카카오 콩 또는 다른 농작물을 세척하거나 헹궈 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거하는 단계를 포함한다. 세척 또는 헹굼은 상기 설명된 대로 수용성 배지일 것이다. 일 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 선택적인 수화단계 전, 동안 또는 후에 선택적으로 세척되거나 헹궈진다. 카카오 콩 또는 다른 농작물을 세척, 배수 및/또는 헹굼은 종래에 알려진 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다. 카카오 콩 또는 다른 농작물은 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 50회 이상 세척될 것이다. 일 구체예에서, 세척 단계는 2회 수행된다. 세척 또는 헹굼 단계는 여기에 설명된 대로 선택적 소킹 시간을 포함할 것이다.
일 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 카카오 콩 또는 다른 농작물이 포함된 용기에 카카오 콩 또는 다른 농작물이 잠기게 하거나, 10초 내지 4시간 동안 소킹하고, 물을 배수하고 원하는 만큼 여러 번 이 단계를 반복하면서, 콩을 바람직한 수분 수준으로 올리기 위해 물을 채우는 방법에 의해 세척된다. 세척 또는 헹굼 단계는 또한 카카오 콩 또는 다른 농작물이 바람직하지 않은 맛 성분들의 일정 함량이 제거될 때까지 수행될 것이다.
카카오 콩 또는 다른 농작물은 바람직하지 않은 맛 성분들의 효과적인 추출을 허락하는 임의의 온도에서 세척될 것이다. 일 구체예에서, 수용성 배지 온도는 실온이다. 세척 온도는 고온에서 바람직한 향미 성분들이 변하고, 파괴되고 및/또는 추출될 수 있다는 사실의 측면에서 선택되어야 한다.
다른 구체예에서, 과량의 수용성 배지 또는 성분은 수화 단계 후 수화된 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 제거 및/또는 분리 및/또는 배출된다. 또한, 이 단계는 수용성 추출 단계로 불릴 것이다. 이 단계는 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거하기 위해 수행될 것이다.
커피의 주요 성분들은 카페인, 미네랄, 탄닌산, 셀룰로스, 물, 지방, 단백질 및 섬유소를 포함한다. 커피는 카페인, 테오필린 및 테오브로민 같은 메틸잔틴, 및 특히, 플라보노이드, 페놀, 페놀산, 휘발성 알칼로이드, 비-휘발성 알칼로이드 및 클로로겐산 같은 다른 종류의 화합물을 포함한다. 또한, 로스팅 된 커피(roasted coffee)는 어떤 바람직하지 않은 맛 성분들을 포함한다. 이들 성분들은 커피에 불쾌한 및/또는 쓴맛을 인식하는 데 기여할 것이다. 카카오 콩 역시 예를 들어, 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및 테오브로민 같은 메틸잔틴 같은 성분들로 인해 쓰다. 이들 바람직하지 않은 맛 성분들은 바람직하지 않은 맛 성분들을 감추기 위해 보통 설탕 또는 크림을 추가함으로써 완화되므로, 사용자의 식이에 원치않은 설탕과 지방을 첨가한다. 감소된 쓴맛 및/또는 불쾌함은 아라비카 커피 같은 훨씬 상급의 비싼 커피 변종들에서 보인다.
수화 단계, 수용성 추출 단계, 세척 및/또는 헹굼 단계는 개별적으로 또는 조합하여 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 바람직하지 않은 맛 성분들을 선택적으로 감소 및/또는 제거하고, 일정 함량의 바람직하지 않은 맛 성분들이 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 제거될 때까지 여기에 설명된 대로 수행될 것이다.
어떤 구체예에서, 바람직하지 않은 맛 성분들이 제거되며, 5%의 바람직하지 않은 맛 성분들이 제거되는 구체예를 포함한다; 다른 구체예에서, 헹굼 단계를 포함하는 본 발명의 공정에서 바람직하지 않은 맛 성분들의 10%까지, 15%까지, 20%까지, 30%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지, 85%까지, 90%까지, 또는 95%까지 제거된다. 어떤 구체예에서, 바람직하지 않은 맛 성분들의 약 25% 내지 약 80%가 제거된다. 일 구체예에서, 바람직하지 않은 맛 성분들의 약 45-50%가 제거된다.
어떤 구체예에서, 적어도 하나의 바람직하지 않은 맛 성분의 제거 정도의 측정은 균사체화된 산물의 외양, 맛 및/또는 화학적 조성(종래에 알려진 방법에 의해)에 의해 측정된다. 양자택일로, 카카오 콩 또는 다른 농작물의 외양 또는 화학적 조성은 알려진 방법들에 의해 측정될 것이다. 이 측정은 당업자에 의한 맛 시험에 의해 정성적으로 측정되거나, 분석 방법들에 의해 측정된 균사체화된 산물의 정량적, 즉, 화학적 조성일 것이다.
일 구체예에서, 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들의 5%까지 제거된다; 다른 구체예에서, 본 발명의 공정에서 바람직하지 않은 향미 성분들의 10%까지, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지 85%까지, 90%까지, 또는 95%까지 제거된다. 일 구체예에서, 하나 이상의 바람직하지 않은 향미 성분들이 정량적으로 제거된다.
일 구체예에서, 휘발성 오일 같은 바람직한 향미 성분들의 감소는 본 발명의 공정에 의해 최소화된다. 카카오 콩 또는 다른 농작물의 가공 시, 종래기술은 로스팅 전에 카카오 콩 또는 다른 농작물을 증기 처리, 증기 추출, 또는 증기 기류를 통해 많은 바람직한 휘발성 오일을 제거할 수 있음을 개시하고 있다. 본 발명의 공정은 증기 로스팅 단계를 피하여 카카오 향미를 제공하는 바람직한 휘발성 오일이 보존되도록 한다.
(열 처리)
본 발명의 방법은 또한 선택적으로 카카오 콩 또는 다른 농작물을 저온살균(pasteurizing) 및/또는 살균(sterilizing) 등의 열 처리하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하기 위해 살균된다. 이 단계는 종래에 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 것이다. 예를 들어, 이 단계는 대기압하 또는 증가된 압력하에서 수행될 것이다. 이 단계는 또한 "전-처리"로 불릴 수 있다. 이 단계는 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 바람직하지 않은 미생물 또는 곰팡이 생물체 오염원들, 특히 곰팡이 포자를 줄이거나 제거하기 위해 수행된다.
저온살균 및/또는 살균 방법은 종래 알려진 방법대로 수행될 것이다. 저온살균의 예시로, 카카오 콩 또는 다른 농작물이 대기압하에서, 145℉ 내지 190℉, 30분 내지 90분, 또는 140℉ 내지 210℉에서 20-100분간 건열 처리를 받도록 하는 것일 것이다.
카카오 콩 또는 다른 농작물의 살균은 종래 알려진 대로 수행될 것이다. 예를 들어, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 15 lb/in2의 압력에서 121-122℃에서 20 내지 100분 동안, 가령 90분 동안 열처리하고, 해수면 1,000 ft 마다 3/4 lb를 추가하여 살균될 것이다. 다른 구체예에서, 증기는 251-255℉로 과열된다. 일 구체예에서, 카카오 콩은 80분 동안 22psi에서 약간 건조 포화된 증기로 255℉에서 살균된다. 카카오 콩 또는 다른 농작물은 용기에서 살균될 것이다. 용기는 선택적으로 수용성 추출 및/또는 수화 단계에 사용된 용기와 같은 용기일 수 있다. 용기는 선택적으로 밀봉될 수 있고, 용기의 외부에 열이 가함으로써 카카오 콩 또는 다른 농작물이 살균될 것이다. 일 구체예에서, 열은 내용물이 살균될 정도의 충분한 시간 용기의 외부에 증기를 가함으로써 제공된다.
어떤 구체예의 밀봉된 용기는 어떤 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 용기를 밀봉함으로써 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 향미 성분들 및 방향성 성분들의 유출을 최소화하는데, 이는 살균 과정 동안 압력솥 또는 오토클레이브의 증기에서 나오는 카카오 콩 또는 다른 농작물 향기의 부족을 통해 알 수 있다. 밀봉은 또한 카카오 콩 또는 다른 농작물 콩으로부터 물-용해성 향미 및 방향성 성분들이 직접적으로 증기, 열기, 또는 가열된 물로 새어 나오는 것을 방지한다.
적당한 용기는 버섯 배양을 위해 종래기술에서 알려진 용기를 포함한다. 선택적으로, 용기는 공기 또는 가스를 교환하는 섹션이 있으나, 임의의 다른 성분의 통과를 허용하지는 않는다. 그러한 섹션은 종래기술로 알려져 있고, 필터 스트립을 포함한다. 일 구체예에서, 용기는 드럼, 예를 들어, 55 갤런 드럼이다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 용기는 유리, 탄소 및 스테인리스 스틸 드럼, 카보이(carboy), 또는 폴리프로필렌 백 또는 드럼일 수 있다. 발효조(Fermentor) 및 생물반응기(bioreactor) 역시 본 발명의 용기로 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 용기는 필터 존 또는 밸브 같은 오염원의 통과를 막는 가스 교환용 수단을 가지고 있다. 일 구체예에서, 용기는 백, 예를 들어, 멸균할 수 있는, 필터 스트립이 있는 폴리프로필렌 백, 및 필터 존이 있는 감마-조사된 폴리에틸렌 백이다.
상기 기재된 백의 또 다른 이점은 밀봉될 때, 살균 단계 동안 가압될 때 용기는 카카오 콩 또는 다른 농작물 콩의 형태를 따르게 된다는 것이다. 백이 카카오 콩 또는 다른 농작물의 형태를 따르게 됨으로써 카카오 콩 또는 농작물의 분해를 억제하거나 최소화하면서 서로 상대적으로 카카오 콩 또는 다른 농작물의 이동을 억제한다. 또한, 공기의 부족은 열로부터 카카오 콩 또는 다른 농작물의 공기 분리를 억제하므로 백이 카카오 콩 또는 다른 농작물의 형태를 따르게 됨으로써 열 전달을 개선한다. 백은 임의의 크기일 수 있다. 일 구체예에서, 백은 가열 공정을 촉진하기 위해 길게 늘이거나 평평하게 한다. 예를 들어, 길이는 백의 직경의 3배일 것이다. 또한, 이 크기는 살균을 위한 백의 유리한 스태킹 또는 백의 위치 선정을 촉진할 것이다.
사용된 백의 크기는 본 발명의 방법에 의해 처리하기 위한 카카오 콩 또는 다른 농작물의 부피 및 함량에 따라 선택될 수 있다. 비록 더 크거나 작은 카카오 콩 또는 다른 농작물의 함량을 고려하더라도, 백 당 사용하는 카카오 콩 또는 다른 농작물의 예시함량은 1 1b 내지 150 1bs의 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함한다.
다른 구체예에서, 백은 각 백의 끝 가장자리(peripheral edge)의 총합에 비해 1/10 이하의 두께를 가지면서 편평하다. 백은 각 백의 끝 가장자리를 규정하는 둘레를 갖는 둥근 형태일 수 있다. 양자택일로, 백은 사면이 각 백의 끝 가장자리를 규정하는 직사각형일 수 있다. 백은 일련의 직사각형 백이 생산 환경에서 쉽게 다뤄질 수 있도록 연결되어 있을 수 있다. 모든 백은 혐기적 환경의 유사성을 제공하는 통기성 패치(필터 스트립)을 가지고 있다. 또 다른 구체예에서, 백은 세 개미만의 콩 두께의 콩 한 층을 확보하도록 납작하게 되어 있다. 따라서, 열은 빠르게 납작한 백에 침투하여 콩이 살균 또는 저온살균되게 한다. 이 구체예에서, 저온살균으로 인해, 백은 카카오 콩 또는 다른 농작물의 형태를 따르게 될 것이므로 압력이 가해질 때 각 백의 바깥 표면에 자갈무늬 표면이 만들어질 것이다. 자갈무늬 백 표면은 격자 공간을 형성하여 살균 또는 저온살균 과정을 촉진하기 위해 쌓여 있는 백 사이를 열이 침투하도록 한다. 또한, 백의 자갈무늬 표면은 카카오 콩 또는 다른 농작물로의 열 전달을 개선하기 위해 백 표면을 따라 흐르는 격렬한 유체 흐름을 포함한다.
다른 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 휘발성 향미 또는 방향성 성분들이 백에서 나올 수 있게 하는 공기를 제거하기 위해 백에서 진공 포장된다.
다른 구체예에서, 백은 멸균용 물질, 예를 들어, BPA 없는 플라스틱 시트로 대체될 수 있다. 하나의 베이스 시트는 컨베이어의 상단을 따라 연속적으로 분배되어 있고, 그리고 나서 카카오 콩 또는 다른 농작물은 분배되어 있는 베이스 시트 상에 놓인다. 두 번째 상단 시트를 카카오 콩 또는 다른 농작물 위에 덮고, 베이스 시트에 밀봉한다. 상단과 하단 시트 사이에 진공을 가하여 공기를 뽑아 내고 나서, 일정 거리에서 시트를 밀봉하여 섹션을 형성한다. 각 섹션은 일정 부피의 카카오 콩 또는 다른 농작물을 확보하고 있다. 섹션들은 저온살균 또는 살균 과정을 시행하기 위해 오토클레이브, 또는 오븐을 통해 이동된다. 열은 증기, 압력하에서 열수, 시트 위 난류 또는 층류에서 열기, 또는 다른 가열된 유체의 형태로 가압 또는 비-가압 환경에서 가해질 것이다. 이 구체예의 변형에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함하는 섹션들은 가압 또는 살균을 위해 오토클레이브에서 회전 및 정치된다. 상기 회전은 많은 섹션을 포함할 수 있다.
카카오 콩 또는 다른 농작물은 시트 외부에 자갈무늬 표면을 유발하기 때문에, 틈새 공간이 시트의 바깥 표면에 존재하여 가열된 유체가 시트 사이에 점차 침투하도록 하여 저온살균 또는 살균 과정을 촉진한다. 자갈무늬 시트 표면은 또한 격렬한 유체 흐름을 유도하여 카카오 콩 또는 다른 농작물로의 열 전달을 추가로 개선한다. 자갈무늬 표면은 콩 간의 상대적인 이동을 억제하여 카카오 콩 또는 다른 농작물이 갈라지고, 깨지거나 스치지 않도록 한다.
(곰팡이 성분)
본 발명에 사용하기 위한 곰팡이 성분은 구멍장이버섯과(Polyporaceae) 및 산호침버섯과(Hericiaceae)에 속하는 임의의 곰팡이를 포함하는 진균아계(Eumycota)의 담자균아문(Basidiomycotina) 유래의 곰팡이일 수 있고, 여기서, 곰팡이는 헤리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 플레우로투스 시트리노필레아투스(Pleurotus citrinopileatus), 플레우로투스 드자모르(Pleurotus djamor), 트라메테스 버시칼라(Trametes versicolor), 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes), 아르밀라리엘라 멜레아(Armillariella mellea), 트리콜로마 마쮸타케(Tricholoma matsutake), 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes), 보바리엘라 볼바세아(Vovariella volvacea), 아가리쿠스 캠페스트리스(Agaricus campestris), 아가리쿠스 블라제이(Agaricus blazei), 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa), 폴리오타 나메코(Pholiota nameko), 아그로사이베 실린드라세아(Agrocybe cylindracea), 볼레투스 오르나티페스(Boletus ornatipes), 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum), 가노데르마 애플란툼(Ganoderma applanatum), 가노데르마 쮸가에(Ganoderma tsugae), 힙시자이거스 마모레우스(Hypsizygus marmoreus), 라리시포메스 오피시날리스(Laricifomes officinalis), 모르첼라 호르텐시스(Morchella hortensis), 모르첼라 안거스티세스(Morchella angusticeps), 페리누스 린테우스(Phellinus linteus), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(Auricularia auricula), 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(Inonotus obliquus), 포메스 포멘타리우스(Fomes fomentarius), 래티포루스 술푸레우스(Laetiporus sulphureus), 브리제포러스 노빌리스무스(Bridgeoporus nobillismus), 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 자일라리아 니그리페스(Xylaria nigripes), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 튜버 마그나툼(Tuber magnatum), 폴리포루스 엄벨라투스(Polyporus umbellatus) 균주를 포함하는 담자균아문(Basidiomycotina) 및 자낭균아문(Ascomycotina)로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 진균아계를 포함하는 진균아계의 담자균아문으로부터 선택된다.
일반적으로, 본 발명은 하기 곰팡이의 이용을 고려하지 않는다: 리조퍼스 쉬넨시스(Rhizopus chinensis), 리조퍼스 올리고스포러스(R. oligosporus), 아스러질러스 플라버소리재(Aspergillus flavusoryzae), 아스퍼질러스 타마리(A. tamari), 아스퍼질러스 나이거(A. niger), 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans), 아스퍼질러스 소재(A. sojae), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엑시구스(S. exiguus), 사카로마이세스 폼베(S. pombe), 사카로마이코피시스 리폴리티카(Saccharomycopisis (캔디다) lipolytica), 캔디다 우틸리스(Candida utilis), 캔디다 크루세이(C. krusei) 또는 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 피치아 사이토이(Pichia saitoi), 클루베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 덴도마이코프시스 피불리거(Endomycopsis fibuliger), 아스코마이세테 채토마움(Ascomycete Chaetomium), 자이고사카로마이세스 로우시이(Zygosaccharomyces rouxii), 무코르 라세모서스(Mucor racemosus), 게오트리춤 캔디둠(Geotrichum candidum), 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실리움 노타툼(P. notatum ), 페니실리움 그리세오풀붐(P. griseofulvuum), 페니실리움 그리세아(P. grisea), 페니실리움 크리소게눔(P. chrysogenum), 페니실리움 로퀘포르티(P. roqueforti), 페니실리움 날기오벤세(P. nalgiovense), 뉴로스포라 인테르메디아(Neurospora intermedia), 아밀로마이세스 로우시이(Amylomyces rouxii), 엔도마이코프시스 부르토니이(Endomycopsis burtonii), 사이실로시빈(Psycilocibin), 모나스커스 푸퍼레우스(Monascus purpureus), 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 애쉬비아 고십피이(Ashbya gossypii), 블라케스레아 트리스포라(Blakeslea trispora), 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum), 톨리포클라디움 인플라툼(T. inflatum), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 네오코스모스포라(Neocosmospora), 스타키보트리스(Stachybotrys), 뷰베리아(Beauveria), 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium), 세팔로스포리움 아크레모니움(C. acremonium), 깁베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi), 푸시디움 코시네움(Fusidium coccineum), 모나스커스 루버(Monascus ruber), 클라비셉스 푸시포미스(Claviceps fusiformis), 클라비셉스 파스팔리(C. paspali), 클라비셉스 퍼푸레아(C. purpurea), 아미니타 무스카리아(Aminita muscaria) 또는 아미니타 팔로이데스(A. phalloides).
본 발명에 사용할 수 있는 곰팡이 성분은 여기에 기재된 방법에 의해 준비될 것이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 곰팡이 순수 균주가 이용된다. 어떤 구체예에서, 곰팡이 순수 균주는 균사체화된 산물을 제조하기 위해 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 효과적으로 성장 및/또는 균사체화할 수 있다. 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 효과적으로 성장 및/또는 균사체화할 수 있는 여기에 인정된 곰팡이의 임의의 균주가 본 발명의 방법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 곰팡이 성분들은 여기에 기재된 방법에 의해 준비될 것이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 곰팡이 순수 균주가 이용된다. 놀랍게도 본 발명자들은 특정 종의 어떤 곰팡이 균주가 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형할 수 있거나, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거, 및/또는 배지에서 카카오 콩 또는 다른 농작물(또는 추출물)의 존재에 더 내성을 가질 수 있는 향상된 및/또는 증가된 능력을 갖추고 있음을 발견하였다. 일 구체예에서, 바람직하지 않은 맛 성분은 메틸잔틴, 예컨대 테오브로민 및/또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진이다. 다른 구체예에서, 곰팡이 성분은 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 카페인을 줄이거나 감소한다.
그러므로, 본 발명의 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형할 수 있거나, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거, 및/또는 배지에서 카카오 콩 또는 다른 농작물(또는 추출물)의 존재로부터 카페인을 제거 및/또는 더 내성을 가질 수 있는 향상된 및/또는 증가된 능력을 갖춘 곰팡이 성분을 선별하는 방법을 선택적인 추가 단계로 가진다. 이 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들 및/또는 카페인을 제거하는 향상된 및/또는 증가된 능력을 나타내는 적당한 곰팡이 성분(균주)을 선별하기 위해 바람직한 곰팡이 종의 다수의 균주를 스크리닝하고, 이들 선별된 균주를 본 발명의 방법에 사용하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 적당한 균주는 페트리 플레이트에서 콜로니의 가장자리 주변에 커피 재료의 특징적으로 어두운 고리를 생성함으로써, 이 균주가 식품 원으로서 커피의 어떤 측면을 부인하고 적극적으로 제외함을 보여준다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 링의 어두운 색은 클로로겐산이 식품원으로서 부인되고, 균주로부터 제거/휘발되며, 및/또는 곰팡이가 지나치게 자라기 전에 소화됨을 보여주는 것이다.
일 구체예에서, 상업적으로 이용 가능한 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum)이 곰팡이 성분으로 사용된다. 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum)의 모든 균주들은 본 발명에 효과적이나, 놀랍게도 어떤 선별된 균주들은 여기에 기재된 대로 본 발명에 유용한 향상된 능력들을 가지고 있었다. 본 발명의 곰팡이 성분에 유용한 그러한 균주는 펜실바니아 주립대학교 버섯 균주 은행(The Pennsylvania State University Mushroom Culture Collection, available from the College of Agriculture Sciences, Department of Plant Pathology and Environmental Microbiology, 117 Buckhout Laboratory, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, USA 16802)에서 상업적으로 이용할 수 있는 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 806(Alice Chen; Buffalo, NY; 4/94)이다. 이들 선별된 균주(들)은 아래에 기재된 ATCC에 기탁되어 있다.
이 균주는 놀랍게도 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 보다 효과적으로 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하고, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 클로로겐산을 포함하는 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거하며, 및/또는 배지에서 카카오 콩 또는 다른 농작물(또는 추출물)의 존재에 더 내성이 있는 것이 본 발명자들에 의해 측정되었다. 다른 구체예에서, 이 균주는 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 카페인의 함량을 제거 및/또는 줄일 수 있다. 그러므로, 일 구체예에서, 곰팡이 성분은 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum ) strain 806 Alice Chen; NY; 4/94이다. 이들 선별된 균주(들)은 아래 기재된 대로 ATCC에 기탁되어 있다.
일 구체예에서, 임의의 상업적으로 이용 가능한 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)의 순수 균주가 곰팡이 성분으로 이용된다. 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)의 모든 균주들은 본 발명에 효과적이나, 놀랍게도 어떤 선별된 균주들은 여기에 기재된 대로 본 발명에 유용한 향상된 능력을 갖추고 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 곰팡이 성분으로 유용한 그러한 균주로 펜실바니아 주립대학교 버섯 균주 은행(The Pennsylvania State University Mushroom Culture Collection, available from the College of Agriculture Sciences, Department of Plant Pathology and Environmental Microbiology, 117 Buckhout Laboratory, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, USA 16802)에서 상업적으로 이용 가능한 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)(Strain 1009 Caterpillar Fungus; Colorado Corp, 1/2014)가 있다.
이 균주는 놀랍게도 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 더 효과적으로 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하고, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 테오브로민 및/또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진 같은 메틸잔틴을 포함하는 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거하며, 및/또는 배지에서 카카오 콩 또는 다른 농작물(또는 추출물)의 존재에 더 내성을 가짐이 본 발명자들에 의해 측정되었다. 다른 구체예에서, 이 균주는 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 카페인의 함량을 제거 및/또는 줄일 수 있다. 그러므로, 일 구체예에서, 곰팡이 성분은 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis (Strain 1009 Caterpillar Fungus; Colorado Corp, 1/2014)이다. 이들 선별된 균주(들)는 아래 기재된 대로 ATCC에 기탁되어 있다.
헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 트라메테스 버시칼라(T. versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 트리콜로마 마쮸타케(T. matsutake), 플람물리나 벨루티페스(F. velutipes), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 폴리오타 나메코(P. nameko), 라리시포메스 오피시날리스(L. officinalis), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(A. auricula), 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(I. obliquus), 포메스 포멘타리우스(F. fomentarius), 엘 설푸레우스(L. sulfureus)에 대해 유사하게 선별된 균주들, 예를 들어(또는 여기에 언급된 곰팡이의 임의의 종에 대해)은 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하고, 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들 및/또는 카페인을 제거하며, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물의 존재에 더 내성을 가질 수 있는 향상된 및/또는 증가된 능력을 나타내는 적당한 곰팡이 성분(균주)을 선별하기 위해 각종의 다수의 균주를 스크리닝하고, 이 선별된 균주(들)를 본 발명의 방법에 이용하여 얻었다. 그러므로, 어떤 구체예에서, 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 트라메테스 베르시콜로르(T. versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 트리콜로마 마쮸타케(T. matsutake), 플람물리나 벨루티페스(F. velutipes), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 폴리오타 나메코(P. nameko), 라리시포메스 오피시날리스(L. officinalis), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(A. auricula), 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(I. obliquus), 포메스 포멘타리우스(F. fomentarius), 엘 설푸레우스(L. sulfureus)의 선별된 균주(들)는 본 발명의 공정에 이용된다. 이들 선별된 균주(들)은 아래 기재된 대로 ATCC에 기탁되었다.
일 구체예에서, 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum)의 순수 균주는 상업적으로 얻는다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 균주는 야생 트러플 버섯에서 생성되며, 곰팡이 성분으로서 본 발명에 사용된다. 항생물질이 배양에 사용될 것이나, 항생물질이 없는 배양 배지에서 더욱 잘 자라는 균주들이 발견되었다. 예를 들어, 원래 트러플 버섯에 대해 모계 균주를 포함하는 순수 균주는 참나무 잎과 어린 가지를 포함하는 명시되지 않은 아가에서 배양하여 생산할 수 있다. 원래 트러플 버섯에 대해 부계 균주를 포함하는 순수 균주는 참나무 잎과 어린 가지를 포함하는 명시되지 않은 아가에서 배양하여 생산할 수 있다. 비-유성적 유전자 재조합 또는 모계 및 부계 교배형 둘 다의 교차(anastomosis)에서 유래된 품종을 함유하는 균주를 포함하는 순수 균주는 참나무 잎과 어린 가지를 포함하는 명시되지 않은 아가에서 배양하여 생산할 수 있다. 어떤 구체예에서, 이용하기에 적당한 분리물(균주)은 꽃을 연상하는 균사체화된 커피에서 좋은 맛있는 향기/맛을 내는 분리물(어떤 구체예에서, 여기에 기재된 대로 트러플 버섯에 대한 모계 균주에 의해 달성됨), 또는 트러플을 연상하는 좋은 맛있는 향기/맛을 내는 분리물(균주)(어떤 구체예에서, 여기에 기재된 대로, 비-유성적 유전자 재조합 또는 모계 및 부계 교배형 둘 다의 교차에서 유래된 품종에 의해 달성됨)을 포함한다. 이들 선별된 균주(들)은 여기 기재된 대로 ATCC에 기탁되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하고, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들 및/또는 카페인을 제거할 수 있는 향상된 및/또는 증가된 능력을 나타내며, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물의 존재에 더 내성을 가질 수 있는 적당한 곰팡이 성분을 위해 선별하는, 상기 기재된 대로 생산된 튜버 멜라노스포럼(T. melanosporum)의 다수의 균주를 스크리닝하는 것과 본 발명의 방법에 이 선별된 균주(들)을 이용하는 것을 포함한다. 이들 선별된 균주(들)은 여기 기재된 대로 ATCC에 기탁되어 있다.
여기에 언급된 균주들은 펜실바니아 주립대학교 버섯 균주 은행(available from the College of Agriculture Sciences, Department of Plant Pathology and Environmental Microbiology, 117 Buckhout Laboratory, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, USA 16802, and from Fungi Perfecti, PO Box 7634, Olympia, WA 98507, USA)에서 공중이 이용할 수 있다.
여기에 언급된 모든 균주들은 ATCC(10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 USA under the Budapest Treaty provisions)에 기탁되어 있다. 기탁은 취소할 수 없으며, 특허 등록 시 제한 또는 조건 없이 공중이 이용할 수 있고, 특허절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 기간 하에서 유지될 것이다. 이들 기탁은 단지 당업자의 편리를 위해 만들어진 것으로, 기탁은 35 USC §112 하에서 요구되는 승인은 아니다. 그러나, 기탁의 이용가능성은 정부 결정에 의해 등록된 특허권의 일탈 시 본 발명을 실행하기 위한 허가로 간주되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 기탁은 공공 기탁기관인 ATCC 기탁기관에서 30년 동안, 또는 가장 최근 신청 후 5년 동안, 또는 특허 집행 기간 중 더 긴 기간 동안 제한 없이 유지될 것이며, 그 기간에 결코 생존할 수 없게 된다면 대체될 것이다.
(곰팡이 성분의 유지 및 적응)
본 발명에 유용한 곰팡이 성분들은 여기에 기재된 방법들에 의해 제조될 것이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종을 위해 사용하기 전에 곰팡이 성분은 선택적으로 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지에서 성장, 유지 및/또는 증식된다. 일 구체예에서, 곰팡이 성분은 고체-상, 부유 및 다양한 부피의 심부(submerged) 형태로 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지에서 무한으로 유지된다.
농작물이 카카오 콩인 경우, 카카오 콩의 추출물은 카카오 콩의 향미 성분에 의해 대체되거나, 고정(spiked)될 것이다. 예를 들어, 카카오 향미 성분들, 예컨대, 화학적 화합물로서 상업적으로 얻은 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및 테오브로민 같은 메틸잔틴이 이용될 것이며, 직렬식(in-line) 필터가 부착된 시린지를 통해 0.1M 완충용액으로서 배지에 첨가된다. 향미 성분들의 상대적 비율은 특이 향미 프로파일 목표를 달성하기 위해 배지에서 조정되거나 균형을 유지시킬 수 있다. 또한, 이 트레이닝은 피라진, 예를 들어, 메틸 피라진 같은 바람직한 성분들을 생산하기 위해 곰팡이 성분을 트레이닝하고 적응시키는데 사용될 수 있다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함하는 명시되지 않은 배지에서 곰팡이 성분을 유지시키는 것은 곰팡이 성분의 장기간 생존 및 건강에 중요한 역할을 담당하리라 믿는다. 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함하는 명시되지 않은 배지를 이용하여 동일한(한정된) 배지에서 유지될 때 시간이 지나면서 곰팡이 성분에 일어날 바람직하지 않은 유전적 표류 현상을 효과적으로 피하고자 할 때, 회분에서 아가 및 액체 배지의 회분에까지 영구적이고 민감한 변화가 생기는 것으로 보인다.
카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지는 다수의 방법에 의해 만들어질 것이다. 일 구체예에서, 명시되지 않은 배지는 순수 수용성 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함한다. 선택적으로, 추가적인 에너지원이 첨가될 수 있다. 물질은 선택적으로 유기물질 및 적어도 RO 여과된 물이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 배지가 임의의 추가적인 부형제, 예컨대, 본 발명의 곰팡이를 키우기 위한 부가적인 에너지원의 첨가 없이 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함할 것임을 발견하였다.
고체 배지는 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지를 포함한다. 일 구체예에서, 살균된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 균사체화할 궁극적인 목적을 위해 곰팡이를 키우기 위한 카카오 콩 또는 다른 농작물 아가 배지를 포함하는 명시되지 않은 배지는 카카오 콩 또는 다른 농작물의 여과물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 0.1-100 lbs.의 카카오 콩 또는 다른 농작물이 0.1-100L의 물에 각각 1분 내지 12시간 동안 포함된다. 혼합물을 1-3회 여과하여 여과물을 수집하고, 14-17 g/L의 아가를 첨가한다. 베이스 추출물 용액은 단독 또는 식물 추출물 및/또는 추가적인 당원, 예컨대 과일 주스와 혼합하여 이용될 수 있다.
베이스 용액은 선택적으로 엿기름 추출물, 효모 추출물, 감자 등의 명시되지 않은 식물(임의의 형태이나 이상적으로는 유기성) 수용성 추출물의 여과물과 혼합될 수 있다. 일 구체예에서, 식물은 감자이다. 수용성 감자 혼합물은 끓이거나 가압된 물에서 1-300g 무게의 감자를 연화시키고, 삶아 으깨고, 1-3회 여과하여 여과물을 수집하여 제조될 수 있다. 선택적으로, 또한 무과당 과일 주스를 베이스 카카오 콩 또는 다른 농작물 아가 배지에 첨가할 수 있다. 일 구체예에서, 배지는 0.1-10 중량%의 엿기름 추출물, 카카오 콩의 정유와 함께 0.1-10 중량%의 명시되지 않은 식물 추출물, 0.1-10 중량%의 효모 추출물, 0.1-10 중량%의 펩톤, 0.1-10 중량%의 글루코스, 20-80 중량%의 물 및 1-90 중량%의 전체 카카오 콩 또는 다른 농작물 또는 커피 생두 추출물을 포함한다.
배지의 비제한적 예시로서, 예를 들어, 분쇄되거나 전체 어느 것으로든 2 1bs의 카카오 콩 또는 다른 농작물을 1/4 갤런의 물과 함께 실온에서 혼합할 수 있다. 혼합물을 섞을 것이다. 그리고 나서, 20분 동안 교반하여 혼합물이 추출되도록 하고, 미세한 메쉬를 통해 3회 여과하였다. 이 용액은 단독 또는 다음과 혼합하여 사용할 수 있다: 약 5개의 유기농 감자를 10L의 물에 넣고, 20분 동안 멸균하여 감자를 연화시킨다. 그리고 나서 감자 으깨는 기구로 으깨고 나서, 미세한 메쉬로 3회 여과하였다. 1L의 상업용 무과당 과일 주스를 첨가할 수 있다. 감자 추출물을 코코아 추출물과 혼합하여 멸균하였다.
다른 구체예에서, 배지는 종래기술로 알려진 방법들, 예를 들어 미세한 가루를 얻는 것에 의해 제조될 수 있는 액체 상태의 초콜릿 원액을 포함한다. 원액은 물을 타지 않는 상태로 이용되거나, 바람직하게는 희석될 수 있다. 초콜릿 원액 배지는 교반되어야 한다.
제조된 배지는 종래기술로 알려진 임의의 방법에 따라 살균될 수 있다. 배지를 식히고, 페트리 플레이트에 부을 수 있으며, 곰팡이 배양은 종래기술로 알려진 대로, 살균 작업으로 플레이트에서 플레이트로 증식되었다. 시험관 및 플라스크를 위한 경사는 이 방법에 의해 준비될 수 있다. 페트리 플레이트는 부유 및 심부 액체 조직 배양, 및 균사체화된 작물로 접종될 수 있다.
액체 배지는 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지이다. 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물, 및 명시되지 않은 식물 추출물은 아가가 첨가되지 않은 점을 제외하고는 고체 배지를 위해 설명된 대로 제조되었다. 만약 부유 배양을 만들기 위해 제조하는 경우, 일 구체예에서, 1-10 테이블스푼의 분말을 혼합물에 10-15L의 배양액 당 약 1 테이블스푼으로 첨가하였다. 배지는 종래기술로 알려진 방법들에 따라 살균될 수 있다. 냉각 후, 용기(vessel)는 다른 액체 조직 배양, 또는 균사체화된 산물의 샘플로부터 콜로니화된 섹션 페트리 플레이트를 가지고 살균 작업에서 접종될 수 있다.
일 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물에 접종하기 위한 곰팡이 성분은 여기에 설명된 대로 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물 액체 배지를 포함하는 명시되지 않은 배지를 이용한 심부 액체 조직 배양(submerged liquid tissue culture)에 의해 제조되고, 진탕기 테이블에서 교반될 수 있다. 일 구체예에서, 교반 속도는 50-240 rpm 또는 85-95 rpm이며, 4-90일 동안 배양된다. 일 구체예에서, 배양 온도는 87-89℉이다.
일 구체예에서, 곰팡이 성분은 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 효과적으로 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하기 위한 그것의 능력 면에서 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된다. 일 구체예에서, 곰팡이 성분은 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거 또는 줄이고, 카페인의 함량을 제거 또는 줄이기 위한 그것의 능력 면에서 선별 및/또는 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된다. 바람직하지 않은 맛 성분 및/또는 카페인이 감소 또는 제거되는지를 측정하는 방법은 여기 기재된 바 있으며, 종래기술에서도 밝혀져 있다.
일 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 소독된 야생의 건강한 곰팡이로부터 제조된다. 선별되거나 그렇지 않거나 출발 균주에 비해 여기에 기재된 대로 변화, 개선 및 적응된 특성들이 있는 그러한 곰팡이는 이들 방법들에 의해 개발되었다. 이들 적응된 균주들은 여기 외에 기재된 대로 ATCC에 기탁되어 있다. 일 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum)으로부터 제조된다. 일 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균주 806 Alice Chen; Buffalo, NY; 4/94로부터 제조된다. 다른 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis (Strain 1009 Caterpillar Fungus; Colorado Corp, 1/2014))로부터 제조된다. 다른 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 트라메테스 베르시콜로르(T. versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 트리콜로마 마쮸타케(T. matsutake), 플람물리나 벨루티페스(F. velutipes), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 폴리오타 나메코(P. nameko), 라리시포메스 오피시날리스(L. officinalis), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(A. auricula), 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(I. obliquus), 포메스 포멘타리우스(F. fomentarius), 엘 설푸레우스(L. sulfureus)로부터 제조된다. 일 구체예에서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분은 여기에 기재된 방법들에 의해 트러플 버섯을 배양하여 얻은 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum)의 순수 균주로부터 제조된다. 출발 균주들에 비해 변화, 개선 및 적응된 특성들이 있는 이들 곰팡이들은 여기 기재된 ATCC에 기탁되어 있다.
여기 기재된 대로 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지 단계는 여기에 한정된 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물 액체 배지 또는 고체 배지를 포함하는 명시되지 않은 배지에서 선택적으로 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 곰팡이는 곰팡이 배양을 위해 종래기술로 알려진 임의의 온도, 예를 들어, 87-89℉에서 4-90일 동안 배양될 것이다. 배양된 곰팡이 성분을 신선한 배지에 재-접종하는 것은 여기에 기재된 대로 성장율, 성장 주기, 및 곰팡이 성분의 외양에 의존하여 당업자가 결정한 대로 적당한 시간에 수행될 수 있다. 성장 주기 및 신선 배지로의 곰팡이 성분의 재-접종은 어떤 구체예에서, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 10회 이상, 15회 이상, 20회 이상, 25회 이상, 30회 이상, 40회 이상, 50회 이상, 75회 이상, 또는 100회 이상 수행된다. 이들 방법들에 의한 곰팡이 성분은, 예를 들어, 카카오 콩 또는 다른 농작물 또는 에너지원으로서 카카오 콩 또는 다른 농작물의 임의의 특이 성분을 더 잘 인식하거나, 배지에서 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물의 존재에 더 내성이 있고, 바람직하지 않은 맛 성분들을 더 잘 제거하거나, 카페인을 더 잘 제거한다. 일 구체예에서, 제거 및/또는 감소되는 바람직하지 않은 맛 성분은 메틸잔틴, 예컨대, 테오브로민 또는 2-메톡시-3-이소프로필피라진이다.
그러므로, 본 발명의 방법은 선택적 추가 단계로, 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 성장, 대사, 또는 이외에 이용 및/또는 변형하고, 및/또는 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분들을 제거하며, 및/또는 카페인을 제거하는 향상된 및/또는 증가된 능력을 갖춘 곰팡이 성분을 포함하는 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분을 제조하는 방법을 갖는다. 따라서, 트레이닝 및/또는 적응 및/또는 유지된 곰팡이 성분이 본 발명을 위해 고려된다. 본 발명의 방법은 여기에 기재된 대로 본 발명의 방법에서 임의의 트레이닝, 적응, 및/또는 유지된 곰팡이 성분(들)의 이용을 추가로 포함한다.
(카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종을 위한 곰팡이 성분의 준비)
일 구체예에서, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 접종하기 위한 곰팡이 성분을 준비하는 방법은 액체 배양에서 여기에 명시한 대로 곰팡이 성분을 대량생산(scaling up)하는 것을 포함한다. 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종을위해 준비된 그러한 곰팡이 성분을 "제조된 곰팡이 성분"이라 부른다.
일 구체예에서, 제조된 곰팡이 성분은 고체 배양에서 존재한다. 다른 구체예에서, 제조된 곰팡이 성분은 액체 배양에서 존재한다. 다른 구체예에서, 제조된 곰팡이 성분은 고체 및 액체 배양의 혼합물이다. 액체 배양은 종래기술로 알려진 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있고, 생물반응기의 이용을 포함한다. 예를 들어, 생물반응기를 이용하여 곰팡이 성분을 준비할 때, 생물반응기는 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물 액체 배지를 포함하는 명시되지 않은 배지를 여과/RO된 물로 1000×까지 희석하여 준비될 수 있다. 생물반응기의 덮개는 일 구체예에서 배지를 살균하기 위해 증기에 쐬게 될 것이며, 또는 양자택일로, 배지는 용기(vessel)에 증기를 주입하는 방식으로 살균될 수 있다.
준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 접종하는데 사용하기 위한 곰팡이 성분의 준비에 이용하는 배지는 종래기술로 알려진 임의의 적당한 배지이거나, 여기에 기재된 방법에 따라 제조될 것이다. 배지는 추가로 미량 원소들 및 유기 물질, 예컨대, 물, 핵산 및 미네랄을 포함한다. 배지는 여과/RO된 물로 1000×로 희석될 것이다. 희석은 1×, 약 2×, 약 3×, 약 4×, 약 5×, 약 6×, 약 7×, 약 8×, 약 9×, 약 10×, 약 15×, 약 20×, 약 25×, 약 30×, 약 35×, 약 40×, 약 45×, 약 50×, 약 55×, 약 60×, 약 65×, 약 70×, 약 80×, 약 90×, 약 100×, 약 150×, 약 200×, 약 250×, 약 300×, 약 400×, 약 450×, 약 500×, 약 550×, 약 600×, 약 650×, 약 700×, 약 750×, 약 800×, 약 850×, 약 900×, 약 950×, 약 1000×로 희석될 것이다. 어떤 구체예에서, 희석은 약 5× 내지 약 100×이다. 100L 생물반응기를 위해, 예를 들어, 배지는 약 10×로 희석될 수 있다.
일 구체예에서, 반응기를 접종하기 위해, 배지는 인라인 펌프가 있는 살균된 라인을 통해, 또는 인라인 0.2/0.5 마이크론 캡슐 필터를 통과하고 나서 특정 크래킹 압력, 예를 들어 2-3psi으로 체크 밸브를 통해 공기를 흐르게 하는 공기 압축기가 있는 반응기로 공기를 주입하여 정압을 형성하여 다른 반응기로부터 내보내질 것이다.
곰팡이 성분을 준비하기 위해 생물반응기를 접종하는 방법들은 페트리 플레이트의 절개된 콜로니화된 섹션(excised colonized section) 및/또는 살균 과정을 이용한 액체 배양의 샘플로 생물반응기를 접종하거나, 노즐을 통해 생물반응기로 부유 또는 심부 액체 조직 배양을 붓는 것을 포함한다.
선택적으로, 곰팡이 성분은 종래기술로 알려진 방법들에 의해 배양 동안 교반될 것이다. 예를 들어, 생물반응기에서, 교반은 주입된 공기 및 격렬한 환경과 전단기계력 둘 다를 허용하는 동력장비가 설치된 패들의 조합에 의해 이루어질 것이다. 본 발명자들은 제한 없이, 주입된 공기는 배양 중간에 가장 격렬함을 생성하나, 바닥에는 거의 영향을 주지 않아 동력장비가 설치된 패들에 의해 계속 교반될 수 있는 반면, 패들은 종래에 정상적으로 이용된 것과 같은 높은 RPM에서 진행하지 않으므로 상기 조합은 둘 중 어느 하나의 방법을 개별적으로 진행하는 것보다 나을 수 있음을 발견하였다. 상기 조합은 균사체를 손상시키지 않으면서 적당한 작은 균사 공 크기를 만들어 낸다.
액체상 발효 교반 및 스월링 기술은 종래기술로 알려져 있으며, 마그네틱 스터러 바, 스테인리스 스틸 임펠러, 살균 고압 외기, 살균 배지의 고압에서 주입, 및/또는 진탕기 테이블의 사용을 이용한 기계적 전단을 포함한다. 공기 및 배지 주입과 함께, 더 높은 교반 및 스월링 속도는 작은 균사체 공을 생산한다.
곰팡이 성분은 당업자에 의해 결정되는 대로 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종을 위해 준비될 때까지 자랄 수 있다. 어떤 구체예에서, 곰팡이 성분은 카카오 콩 또는 다른 농작물 접종에 이용하기 전에 48시간 동안 성장될 수 있다. 곰팡이 성분을 포함하는 곰팡이 배양이 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종에 적당한지를 결정하는 것은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 액체 배지에서일 때, 곰팡이 배양은 지수성장기에서, 더 일찍 또는 더 늦거나 어느 것이나 접종에 적당하다. 노화 배양과 mL당 균사체 함량이 더 낮은 더 이른 성장기에서의 배양이 이용될 수 있으나, 바람직하지는 않다. 제조된 곰팡이 성분은 선택적으로 배지에서 현미경 및 육안으로 mL당 성장한 균사체를 통해 잘 자란 것이 보인다.
카카오 콩 또는 다른 농작물의 가장 효과적인 균사체화를 달성하기 위해, 곰팡이 성분은 곰팡이 균주의 배양의 구형 응집 주변 3차원에서 균사가 자랄 수 있는 제한된 균사 공 크기를 가진다. 일 구체예에서, 균사 공 크기는 직경이 10 mm 미만, 2 mm 미만, 1 mm 미만, 100 마이크론 미만, 10 마이크론 미만, 5 마이크론 미만, 2 마이크론 미만, 1 마이크론 미만이다. 다른 구체예에서, 균사의 구형 응집은 5 마이크론 내지 1 mm의 직경 크기 범위 또는 10-50 마이크론의 직경 크기 범위를 갖는다.
이들 방법들로부터 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종을 위한 제조된 곰팡이 성분을 얻는다.
(준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 접종 및 균사체화)
준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물은 제조된 곰팡이 성분으로 접종된다. 사용된 제조된 곰팡이 성분은 본 발명에 명시된 대로 임의의 곰팡이 성분일 수 있다. 제조된 곰팡이 성분의 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물로의 접종은 종래에 알려진 임의의 방법에 따라 수행될 것이다. 이 단계는 배양 단계, 발효 단계, 및/또는 균사체화 단계로 다양하게 언급될 것이다.
균사체화는 여기에 기재된 대로 용기 내에서 일어날 것이다. 일 구체예에서, 균사체화는 여기에 기재된 대로 55 갤런 드럼에서 일어난다. 이 구체예에서, 55 갤런 드럼은 두 개의 포트를 포함하는 뚜껑을 가지고 있으며, 한 개의 포트는 접종 포트로 이용될 수 있으나, 다른 포트는 여과된 공기를 배양 바닥에 살포하면서 동시에 배출구로 제공하는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 접종 포트는 퀵 디스커넥트 소켓(quick disconnect socket)으로서 접종 동안 하베스팅 라인의 말단에서 퀵 디스커넥트 플러그에 부착되어 있다. 선택적으로, 복수의 드럼 내 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물은 즉시 개별적으로 또는 동시에 임의의 드럼을 표적으로 하기 위해 포함된 하부 구조와 함께, 생물반응기 하베스팅 라인에 연결된 살균된 매니폴드에 의해 한 주기에서 균사체화될 수 있다. 일 구체예에서, 배양마다 접종물을 일정한 부피로 분배하기 위한 시스템이 사용된다.
일 구체예에서, 배양은 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함하는 용기에 공기로 주입될 것이다. 습도는 선택적으로 백에 주입되어 균사체 생장을 최적화할 것이다. 다른 구체예에서 카카오 콩 또는 다른 농작물은 수동으로 또는 발효조 또는 생물반응기로 밸브 빌트(valve built)를 통하든지 어느 것으로든 살균된 카카오 콩 또는 다른 농작물이 포함된 용기에 임의의 다양한 액체 조직 배양의 배양물을 주입함으로써 접종된다.
일 구체예에서, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물은 제조된 곰팡이 성분으로 접종하기 전에 80-100℉의 온도로 냉각된다. 냉각은 냉장 또는 실온에서 이루어질 수 있다. 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 균사체화하는 단계는 4 내지 90일 동안, 약 7일 내지 21일 동안, 및 일 구체예에서 약 7일 동안 임의의 온도, 예를 들어 87-89℉에서 일어날 수 있다. 발효에 의한 곰팡이 균사체의 증식은 효율적으로 환경 광, 예컨대 40% 광 및 60% 암의 조절 모델에 의해 조절되고, 또한, 살균 기류 및 86-88 또는 87-89℉, 또는 12 내지 35℃ 또는 24 내지 32℃의 온도를 조절하여 수행된다.
이러한 배양, 균사체화 및/또는 발효의 상대 습도는 20% 내지 80%, 어떤 구체예에서, 적어도 약 60%이다. 어떤 구체예에서, 상대 습도는 적어도 약 36-40%이다.
다른 구체예에서, 곰팡이 성분을 추가하기 전에, 액체 균사체화(발효) 배양을 위해 카카오 콩을 준비한다. 카카오 콩은 미세 입자, 대략적인 입자 크기로 바람직하게는 1 mm 미만의 직경으로 분쇄한다. 일 구체예에서, 입자는 크기가 20-50 마이크론이다. 그리고 나서, 카카오 입자를 현탁하기 위해 점도가 조절 또는 조정된 수용액에 카카오 콩을 넣는다. 바람직하게는, 수용액은 교반 시 카카오 입자가 수용액에 현탁될 수 있도록 카카오 입자 크기에 맞게 조정된 점도를 갖는다. 곰팡이 성분과 카카오 입자를 포함하는 수용성 배지는 임의의 크기를 갖는 생물-반응기 내에 놓일 수 있다. 바람직하게는, 생물-반응기는 수용성 배지의 적어도 10L를 유지하기 위한 크기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 생물-반응기는 수천 L 이상을 유지하기 위한 크기를 갖는다.
일 구체예에서, 액체 균사체화 배양은 교반된다. 교반 수단은 곰팡이 균사체 집단이 작은 입자들로 유지되도록 하기 위해 수용액을 최적화하도록 조절된다. 바람직하게는, 곰팡이 균사체는 1-100 마이크론 직경의 크기를 갖는 균사 공, 또는 응집을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 균사 응집은 카카오의 입자 크기보다 작다.
액체 균사체화 배양에서, 생물-반응기는 임의의 혐기적 환경에서 균사체가 카카오의 성분들을 소화할 수 있도록 적당한 온도와 압력에서 유지된다. 균사체가 카카오의 성분들을 소화하여 쓴맛 성분들을 제거한 후, 카카오는 수용액에서 분리된다. 이는 교반을 중지하고 카카오를 침전시켜 수행될 수 있다. 이는 또한 수용액으로부터 카카오를 여과하여 이루어질 수 있다. 수용액에서 카카오를 제거한 후, 가공과정(카카오를 분말로 건조하는 것을 포함)을 위해 준비될 것이다. 두 번째 단계는 선택적으로 카카오 제거 후 수용액을 추출하기 위해 수행된다. 이 추출물은 카카오의 물-용해성 향미 성분들을 회수하는데 이용될 수 있다. 이들 물-용해성 향미 성분들은 가공될 것이며, 분말 또는 수용성 스프레이 또는 용액 어느 것으로든 카카오에 다시 첨가될 것이다. 카카오 분말이 최종 산물이다. 카카오의 향미를 개선하기 위해 필요에 따라 추가로 보충의 향미가 첨가된다. 예를 들어, 감미료 또는 카카오 향미 추출물이 가공과정에서 이 시기에 첨가될 것이다.
따라서, 카카오는 임의의 카카오 산물, 즉, 초콜릿으로 만들 준비가 된다.
준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 균사체화하는 단계는 바람직하게는 혐기적 또는 반-혐기적 환경에서 이루어진다. 파스퇴르 효과에 의해 기재된 대로 제조된 곰팡이 성분의 임의의 혐기적 대사 활성을 유도 및/또는 유지하기 위해 종래기술로 알려진 방법들이 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물은 시트에서 제거되고, 살균 환경에서 큰 스테인리스 스틸 통(vat)에 예치된다. 통은 산소 수준 및 온도를 조절하고, 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 임의의 혐기적 활성 및 균사체 성장을 조절할 수 있다. 임의의 혐기적 활성은 시간 단위 당 더 많은 셀룰로스를 대사하는 것이며, 이는 카카오 콩 또는 다른 농작물 기질이 호기성 환경에서보다 더 빠른 속도로 소비됨을 의미한다. 어떤 경우에, 균사체 성장은 호기성 환경에서보다 9배 더 빠르다(즉, 9배 더 많은 셀룰로스 분자들이 ATP로 대사된다). 다른 이점은 혐기적 환경이 자실체 성장을 억제한다는 것이다. 혐기적 환경은 또한 원치 않은 세균 성장, 및 다른 원치 않는 미생물 성장의 감소를 보증한다.
곰팡이 균사체의 확장은 현미경에서 측정되고, 성장 일지는 사진으로 기록된다.
배양 주기가 길수록, 균사체 건중량의 생산이 더 커지며, 카카오 콩 또는 다른 농작물의 향미 향상이 더 커진다. 어떤 균주들은 원시 조직 및 자실체를 30일 동안 형성할 것이다(헤리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus)는 가노데르마 루시디움(Ganoderma lucidum) 및 플라물리나 벨루티페스(Flamulina velutipes)와 같이 특히 배양 시 자실체를 형성하는 경향이 있다). 어떤 구체예에서, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 수확하는 것은 배양 자실체 조직 전에 수행된다. 그러나, 특정 곰팡이의 긴 배양 주기가 대사체물의 높은 생산 또는 균사 및/또는 균사체화 산물의 축적을 보장하지는 않는다.
균사체화된 산물을 수확하는 시기의 결정은 다수의 방법에 의해 결정될 것이다. 수확은 일반적으로 바람직한 맛 프로파일에 따라 균사체화된 산물의 맛 프로파일을 최적화하는 타이밍에 따라 수행된다. 예를 들어, 배양을 준비할 때를 결정하기 위해 훈련을 받은 사람은 균사체화 배양의 향기 프로파일을 이용할 수 있다. 배양의 외관은 훈련을 받은 사람에 의해 측정될 것이다. 어떤 구체예에서, 카카오 콩 또는 다른 농작물의 8 1bs 당 페트리 플레이트(G. lucidum의 경우)에서 배양 내 균사체 함량이 대략 2-3배 함량(표준 크기)으로 완전히 자랐을 때, 또는 표준 페트리 플레이트(C. sinensis의 경우)에서 균사체 함량이 대략 10-12배의 함량으로 완전히 자랐을 때 수확할 수 있다. 최적 조성 및 배양 조건 및 곰팡이를 수확하기 위한 적당한 시기를 결정하기 위해 총 생체물질의 측정을 수행하기 위해 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함하는 분석의 분석적 방법들이 사용될 것이다.
본 발명의 비제한적 예시에서, 여기에 기재된 대로 밀봉된 용기에서, 여기에 기재된 대로 제조된 곰팡이 성분의 약 25mL을 본 발명의 공정에 따른 약 8 1bs의 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물에 접종한다. 낮아진 산소 환경이 얻어졌다. 균사체화 또는 배양은 4일 만큼 작게 또는 60일 이상 길게 하는 것이 적당하나 87-89℉에서 7일 동안 진행되도록 하였다. 관찰자가 균사체화된 산물에 대한 적당한 맛 프로파일이 얻어졌다고 측정하였을 때 수확을 수행한다.
(균사체화 동안 바람직하지 않은 맛 성분들의 감소)
카카오 콩 또는 다른 농작물은 바람직하지 않은 맛 성분들을 포함할 것이다. 그러한 바람직하지 않은 맛 성분들은 명시되거나 명시되지 않을 것이다. 그러한 비우호적인 맛 성분 중 하나로 2-메톡시-3-이소프로필피라진을 포함한다. 이 성분은 곰팡이 성분에 의해 다당류, 예컨대, 1,3-글루칸 및 베타 1,6-글루칸으로 대사된다. 다른 바람직하지 않은 맛 성분들로 쓴맛 성분들이 포함된다. 그러한 쓴맛 성분 중 하나로 테오브로민 같은 메틸잔틴이 있다. 생 카카오를 균사체화함으로써 균사체화되지 않은 생 카카오 보다 덜 쓴 카카오 콩을 생산한다.
카카오의 균사체화는 카카오 콩을 가공함에 있어 콩의 껍질이 더 쉽게 까불러 날리도록 하는 이점을 유발한다.
배양 또는 균사체화 단계는 또한 여기에 기재된 대로 바람직하지 않은 맛 성분들 및/또는 카페인의 감소 및/또는 제거를 유발할 것이다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 바람직하지 않은 맛 성분의 제거 정도의 측정은 종래기술로 알려진 대로 균사체화된 산물의 외양, 맛 및/또는 화학 조성에 의해 측정된다. 이 측정은 정량적일 것이다, 예컨대 균사체화된 산물의 화학 조성을 종래기술로 알려진 분석 방법들에 의해 하나 이상의 바람직하지 않은 맛 성분에 대한 분석방법에 의해 측정되거나, 당업자에 의한 맛 실험에 의해 정성적으로 측정될 것이다.
일 구체예에서, 하나 이상의 바람직한 맛 성분들의 5%까지 제거된다; 다른 구체예에서, 하나 이상의 바람직하지 않은 향미 성분들의 10%까지, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지, 85%까지, 90% 또는 95%까지 본 발명의 공정에서 제거된다. 일 구체예에서, 하나 이상의 바람직하지 않은 향미 성분들은 정량적으로 제거된다. 또한, 본 발명은 여기에 기재된 대로 바람직하지 않은 맛 성분들의 감소된 수준을 갖는 균사체화된 산물에 관한 것이다.
일 구체예에서, 바람직하지 않은 맛 성분은 클로로겐산이며, 클로로겐산의 5%까지 제거된다; 다른 구체예에서, 클로로겐산의 10%까지, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지, 85%까지, 90% 또는 95%까지 본 발명의 과정에서 제거된다. 본 발명은 또한 여기에 기재된 대로 클로로겐산의 감소된 수준을 갖는 균사체화된 커피 산물에 관한 것이다.
일 구체예에서, 카페인은 배양 또는 균사체화 단계 동안 카카오 콩 또는 다른 농작물로부터 제거된다. 일 구체예에서, 카페인의 5%까지 제거된다; 다른 구체예에서, 카페인의 10%까지, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지, 85%까지, 90% 또는 95%까지 본 발명의 과정에서 제거된다. 본 발명은 또한 여기에 기재된 대로 카페인의 감소된 수준을 갖는 균사체화된 산물에 관한 것이다.
바람직하지 않은 맛 성분들의 제거는 품질이 나쁜 카카오 또는 다른 농산품의 가치를 높이고, 및/또는 그것을 더 먹음직스럽게 할 것이다. 이 방법에 의해 생산된 균사체화된 산물은 덜 비싼 카카오 콩 또는 다른 농작물과 섞기 위해 사용되어 개선된 맛 특성들이 있는 저가의 산물을 제조하도록 한다. 균사체화된 산물에 첨가되는 당, 우유 및 대용물의 함량은 감소될 것이다. 본 발명은 균사체화된 산물이 덜 쓰고, 덜 불쾌하고 및/또는 신맛이 덜한 더 풍부하고, 더 부드럽고 및/또는 더 달콤한 식품을 제공한다는 인식으로 인해 균사체화된 산물의 향상된 향미 프로파일을 유도한다.
(향미 및/또는 건강 촉진 성분들의 첨가)
어떤 구체예에서, 본 발명의 배양 또는 균사체화 과정은 균사체화된 카카오 콩 또는 농작물이 첨가된 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 갖도록 한다. 예를 들어, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물은 외부에서 첨가된 항-종양 및 면역조절 건강 촉진 성분들을 포함할 것이다.
곰팡이는 대사적으로 동물과 유사하지만, 다소 소화하기 어려운 베타(b-) 결합에 의해 연결된 긴 당분자 사슬로 주로 형성되고, 멤브레인에 결합된 단백질과 연결되어 훨씬 쉽게 소화할 수 있는 알파(a-) 결합이 소수로 형성된 견고한 세포벽이 있다는 점에서 구조적으로 식물과 유사하다. 대조적으로, 식물 세포벽(카카오 콩 또는 다른 농작물과 같이)은 마찬가지로 1->4 글리코시딕 글루코스 결합을 가진 셀룰로스 다당류로 만들어져 사람이 소화하기 어렵지만, 곰팡이에 의해서는 소화가능하다. 곰팡이 세포벽은 1->6 결합된 측쇄와 1->3 글리코시딕 결합으로 주로 구성되므로 물, 열 및 기계적 처리를 이용한 최소한의 공공을 통해 더 작고 더 쉽게 소화할 수 있고, 다양한 미세입자화된 크기, 소위 베타 글루칸이라 불리는 면역학적으로 활성이 있는 다당류 분자들 및 관련된 당단백질 화합물로 분해될 것이다. 베타 글루칸에 대한 면역 반응은 1차, 2차 및 키랄성 3차 구조를 갖는 a- 또는 b-글루칸 구조에 달려있어 각 곰팡이의 독특한 a- 및 b-글루칸 프로파일에 대한 면역 반응에서의 차이를 설명한다. 따라서, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물은 상기 기재된 분자들을 포함한 건강 촉진 성분들을 포함하고 있다. 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물에서 존재하는 다른 건강 촉진 성분들은 면역조절, 항-노화, 미약(aphrodisiac), 항-종양, 항-바이러스, 항-세균, 및/또는 항-곰팡이 특성 등 다양한 특성들이 있는 성분들일 수 있고, a- 및 b-글루칸, 당단백질, 단백질, 에르고스테롤, 스테롤, 트리테르펜, 및 지방산, 글루코만난, 리보글루칸, 스테르퓨르산, 만니톨, 리비톨, 구아노신 및 아데노신 같은 화합물을 포함한다.
카카오에서 자연적으로 생기는 메틸 피라진은 카카오에서 발견된 가장 중요한 바람직한 향미 화합물 중 하나이다. 로스팅 같은 열의 존재에서, 그들은 마이야르(Maillard) 반응, 즉, 당과 아미노산 또는 펩타이드 간의 반응을 통해 생산된다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 메틸 피라진은 또한 발효 및/또는 균사체화를 통해 생산되어, 균사체화된 카카오 콩 및 다른 농산품에서 증가된 및/또는 바뀐 메틸 피라진을 유발하는 것으로 사료된다. 카카오의 이 제조방법을 이용하여, 곰팡이의 단일 균주는 카카오 쓴맛을 제공하고, 기질 구조 및 카카오 콩의 농도를 변화시키는 살균된 생 카카오 콩에 포함된 셀룰로스, 알칼로이드, 지방 및 단백질 내용물을 분해한다. 반면, 카카오의 균일하고 일정한 품질은 생 카카오 콩을 가공하기 위한 본 발명의 발효 방법에 의해 얻어진다. 이 순수 발효 공정에 의해 유도된 여기에 기재된 방법들을 이용하여, 카카오를 훨씬 더 풍부하고, 부드럽고, 달콤하고 독특하게 만들면서(균사체화되지 않은 콩으로 제조된 보통 카카오와 비교하여), 생 카카오 콩의 향미가 향상된다.
당의 반응성 카보닐기는 아미노산의 친핵성 아미노기와 반응하여 냄새 및 향미의 범위에 책임이 있는 특성규명이 잘 안된 분자들의 복잡한 혼합물을 형성한다. 아미노기가 탈양성화되어 증가된 친핵성을 가지므로 이 과정은 알칼리성 환경(즉, 프레첼을 어둡게 하기 위해 처리되는 가성 알칼리 용액)에서 촉진된다. 아미노산의 타입은 최종 향미를 결정한다. 이 반응은 향미료 산업(flavoring industry)의 기본이다. 고온에서 아크릴아마이드가 형성될 수 있다.
균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물에 항바이러스제인 독특한 a- 및 b-연결된 글루칸, 소위 글루코만난 및 리보글루칸을 첨가하기 위해 아가리쿠스 블라제이(Agaricus blazei)를 이용할 것이다. 다른 아가리쿠스 블라제이(A. blazei)의 다당류 추출물은 항-암 효과를 가질 것이며, 여기에 나열된 곰팡이의 다른 균사체 추출물과 함께 치료에 도움이 될 것이다. 바이오매스 및 세포외 다당류 생산을 최적화하기 위한 방법은 보고되어 있다. 따라서, 아가리쿠스 블라제이(A. blazei)를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 아가리쿠스 블라제이(A. blazei)에서 유래된 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis (C. sinensis))는 면역조절 및 항-바이럿제인 코디세프산, 아데노신, D-만니톨, 및 코디세핀아데노신을 생산한다. 코디셉스 시넨시스(C. sinensis) 추출물은 항-노화제 및 미약임을 보여준 바 있다. 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)에서 분리된 균사체 스테롤은 수많은 암세포주의 증식을 억제함을 보여준 바 있다. 코디셉스 시넨시스(C. sinensis) 균사체 다당류 추출물은 저혈당증을 유도함을 보여준 바 있다. 따라서, 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)에서 유래된 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
플라뮬리나 벨루티페스(Flammulina velutipes) 균사체는 면역조절이 있는 다당류 프로파일을 가짐을 보여준 바 있다. 플라뮬리나 벨루티페스(F. velutipes) 균사체는 독특한 에르고스테롤 및 아미노산 프로파일, 스테르퓨르산, 만니톨, 리비톨 및 뉴클레오사이드 구아노신과 아데노산을 포함한다. 플라뮬리나 벨루티페스(F. velutipes) 에서 추출된 에노키포딘스 A-D은 광범위한 스펙트럼의 항미생물 테르펜이다. 단백질 플라뮬린 및 벨루틴은 항-HIV 및 항-HPV 활성을 나타낸다. 따라서, 플라뮬리나 벨루티페스(F. velutipes) 를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 플라뮬리나 벨루티페스(F. velutipes) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum)의 다당류 프로파일은 사람 세포주에서 면역조절능이 있음을 보여준 바 있으며, 또한, 임상 연구들에서, 가노데르마 루시덤(G. lucidum) 균사체 추출물은 항-과산화, 항-염증 및 항-돌연변이 특성들을 가진다. 가노데르마 루시덤(G. lucidum) 추출물은 항-노화 및 미약임을 보여준 바 있다. 가노데르마 루시덤(G. lucidum)의 트리테르페노이드 프로파일이 측정된 바 있고, 항-간독성 및 간보호, 항-종양, 항-혈관생성, 항-고혈압, 콜레스테롤저하, 항-히스타민 및 항-HIV임을 보여준 바 있다. 다당류 및 당단백질을 생산하는 것뿐만 아니라, 가노데르마 루시덤(G. lucidum)은 마찬가지로 높은 생리활성 및 치료적 특성들을 가지고 있는 트리테르펜, 예컨대, 가노데르산 및 루시덴산, 페놀 화합물 및 스테롤을 생산하며, 자체적으로, 항-산화, 항-종양, 항-세균, 항-암, 항-염증, 항-히스타민, 저혈압, 진정제, 및 구강 소비 후 묵상적(meditative)이다. 따라서, 가노데르마 루시덤(G. lucidum)을 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 가노데르마 루시덤(G. lucidum) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
그리폴라 프론도사(Grifola frondosa)의 다당류 프로파일은 면역조절 및 항-산화적임을 보여준 바 있다. 그리폴라 프론도사(G. frondosa)는 에르고스테롤 및 지방산의 항-산화 프로파일을 생산한다. 인 비트로 암세포주에서 그리폴라 프론도사(G. frondosa) 추출물의 항-종양 효과가 조사된 바 있고, 저혈당증 당뇨 환자들을 위해 전도유망함을 보여준다. 따라서, 그리폴라 프론도사(G. frondosa)를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 그리폴라 프론도사(G. frondosa) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
헤리시움 에리나세우스(Hericium erinaceus) 균사체 및 자실체 추출물은 다양한 세포주에서 항-돌연변이 및 면역조절 능이 있음을 보여준 바 있다. 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus)는 독특하게 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과하고 뇌의 어떤 영역에서 신경성장인자(Nerve Growth Factor (NGF))의 분비를 촉진할 수 있는 구조적으로 측정된 화합물들인, 자실체에서 헤리세논 및 균사체에서 에리나신을 생산한다. 에리나센은 헤리세논보다 NGF 발현의 더 큰 강화제인 것으로 보여준 바 있다. 따라서, 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus)를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)의 다당류 프로파일의 양상이 측정된 바 있고, 면역조절 및 항바이러스능이 있음을 보여주었다. 렌티난 및 다른 대사물질이 그들의 수많은 건강관리 이점을 위해 연구되었다. 어떤 국가들에서, 렌티난은 "항신생물의 다당류"로 분류되며, 임상 이용을 위해 이용할 수 있다. 렌티난을 표준 암 치료에 추가하는 것은 증가된 종양 괴사를 유발하고, 간세포성 암종과 함께 식도 암종 환자들에서 개선된 삶의 질을 유발함을 보여준 바 있다. 따라서 렌티눌라 에도데스(L. edodes)를 이용한 균사체화 및 여기에 기재된 대로 렌티눌라 에도데스(L. edodes) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
펠레니스 린테우스(Phellenis linteus) 추출물은 항종양 활성을 나타냄을 보여준 바 있다. 폴리포러스 엄벨라투스(Polyporus umbellatus) 다당류 추출물이 연구된 바 있고, 항-암, 면역조절, 항-말라리아 및 간보호 효과가 있음을 보여준 바 있다. 이노노투스 오블리퀴스(Inonotus obliquus) 균사체 다당류 추출물은 항-종양, 저혈당, 및 항-산화 특성들이 있음이 입증되어 있다. 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus) 균사체 및 자실체 조성이 매우 유사하고, 단지 아미노산 내용에서 차이가 있다. 균사체의 다당류 프로파일은 주로 면역조절능이 있는 것으로 알려진 추출물인, 라미나린으로 구성되어 있다. 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus)의 균사체 배양액에서 분리된 로바스타틴은 항-암종 활성을 나타내고, 세균 및 곰팡이의 성장을 억제하고 콜레스테롤을 낮춘다. PSK (Krestin)에서 푸코스와 a-(1-4)- 및 b-(1-3) 글리코시딕 결합을 하는 헤테로글루칸 및 PSP에서 람노스 및 아라비노스를 생산하는 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor)는 항-종양 및 면역조절능이 있는 것으로 알려져 있다. 승인받은 약물인 PSK는 면역조절, 항-바이러스 및 콜레스테롤 조절 특성들을 나타내는 균사체 추출물이다. 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis)의 균사체 다당류 추출물은 다양한 순환계 장애를 위한 치료제, 신경학적으로 건강, 항-암종, 항-종양 및 항-노화능이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 펠레니스 린테우스(Phellenis linteus), 폴리포러스 엄벨라투스(Polyporus umbellatus), 이노노투스 오블리쿼스(Inonotus obliquus), 플레우로토스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 및/또는 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis)(및 여기에 기재된 임의의 다른 곰팡이 종)를 이용한 균사체화 및 펠레니스 린테우스(Phellenis linteus), 폴리포러스 엄벨라투스(Polyporus umbellatus), 이노노투스 오블리쿼스(Inonotus obliquus), 플레우로토스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 및/또는 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis)(및 여기에 기재된 임의의 다른 곰팡이 종) 유래의 향미 및/또는 건강 촉진 성분들을 포함하는 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 역시 본 발명에 포함된다.
여기에 기재된 대로 곰팡이 성분에 의해 추가된 향미 성분들 또는 건강 촉진 성분들의 함량은 종래기술 중 하나에 의해 측정될 수 있고, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물 유닛당 1 ng의 성분까지, 또는 5 ng까지, 10 ng까지, 50 ng까지, 100 ng까지, 500 ng까지, 1 ㎍까지, 5 ㎍까지, 10 ㎍까지, 50 ㎍까지, 100 ㎍까지, 500 ㎍까지, 1 mg까지, 2 mg까지, 5 mg까지, 10 mg까지, 20 mg까지, 50 mg까지, 100 mg까지, 또는 500 mg까지 포함한다. 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물의 1 유닛은 1g, 1 1b, 1 kg 등으로 다양하게 정의될 수 있다.
(균사체화된 산물의 추가 공정)
어떤 구체예에서, 완전히 균사체화되면, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물은 선택적으로 균사체화 후 헹궈진다. 헹굼은 균사체의 어떤 또는 모든 부분 및/또는 다른 비-카카오 콩 또는 다른 비-농작물 성분을 제거하기 위해 수행될 것이다.
어떤 구체예에서, 완전히 균사체화되면, 균사체화된 산물은 선택적으로 건조된다. 건조는 카카오 콩 또는 다른 농작물을 건조하기 이하 종래기술로 알려진 수단에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 균사체화된 산물은 건조를 위해 건조 표면에 펼쳐질 것이다. 일 구체예에서, 균사체화된 산물은 약 11-13%의 수분 함량으로 건조된다.
선택적으로, 건조 또는 건조되지 않은 균사체화된 산물은 종래기술로 알려진 전통적인 방법들에 의해 로스팅 및/또는 노르스름하게 구워질 수 있다. 선택적 로스팅 단계는 곰팡이를 불활성화시키기 위해 제공하며, 진균증의 위험을 바람직하게 줄일 것이다.
균사체화된 카카오는 비-균사체화된 카카오의 알려진 가공 단계를 거칠 수 있다. 따라서, 본 발명은 뜨임(tempering) 및 종래기술로 알려진 다른 방법들에 의해 수행되어 균사체화된 카카오 매스, 균사체화된 카카오 버터, 균사체화된 초콜릿 원액, 및 그것에서 유래된 초콜릿의 모든 형태를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 그러한 식품 가공의 추가된 이점은 균사체화에 의한 이들 식품에 포함된 독특한 영양 프로파일(주로 다당류 및 대사체 프로파일)과 관련된다.
본 발명의 일 구체예에서, 균사체화된 카카오 콩 추출물은 추출물 형태, 또는 추출물을 탈수하여 얻은 분말 형태로 기능 식품을 위해 사용된다. 다른 구체예에서, 균사체화된 카카오 콩 추출물은 기능성 식품에서 향미 및 영양 성분을 보강하기 위한 첨가제로서 이용된다. 이 추출물은 예를 들어, 알코올 베이스 또는 식물성 글리세린에 주입된 수용성 형태로 존재할 수 있다. 분말화된 형태는 추출물을 탈수하여 달성될 수 있다. 분말화된 형태는 임의의 포장 식품에 첨가될 수 있다. 기능성 식품의 예시로, 병에 든 음료, 스낵바, 또는 단백질 쉐이크를 만들기 위해 사용되는 고-단백질 분말혼합물이 포함된다. 분말화된 형태는 또한 아이스크림에서 사용될 수 있다.
균사체화된 산물은 식품 및/또는 음료 제품으로 이용하기 위한 추출물을 제조하기 위해 선택적으로 추출될 것이다. 예를 들어, 1000g의 균사체화된 로스팅된 카카오 콩 또는 다른 농작물은 0.01-10%의 시트르산 및 0.01-10%의 아스코르브산을 포함하는 완충용액으로서, 10-1000mL의 121-122℃의 가압수를 이용하여 교반을 통해 완전히 추출될 것이다. 최종 수용성 추출물은 전통적인 방법들을 사용하여 추가로 정제 및 농축될 것이다. 균사체화된 카카오 콩 또는 농작물 산물 추출물은 18-24%의 알코올, 45-60%의 글리세롤, 또는 2.5× 부피의 꿀 또는 메이플 시럽 또는 건조 사탕수수 당(evaporated cane sugar) 등의 유사한 당이 추가된 제형 등 종래기술로 알려진 방법들에 의해 확대된 보관 수명(extended shelf life)이 제공될 것이다.
바람직하지 않은 맛 성분들 및/또는 카페인의 제거, 및/또는 향미 증가 및/또는 건강을 촉진하는 균사체화 산물의 첨가는, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물 산물을 야기할 것이며, 저품질의 카카오 콩 또는 다른 농작물의 가치를 높이고, 및/또는 그것을 더 먹음직스럽게 할 것이다. 이 방법에 의해 생산된 균사체화된 카카오 콩 또는 농작물 산물은 덜 비싼 카카오 콩 또는 농작물과 섞는데 이용되어 더 풍부하고, 더 부드럽고 및/또는 쓰고, 불쾌하고 및/또는 신맛이 덜한 더 달콤한 식품 같은 개선된 맛 특성들이 있는 저가의 산물으로 이어진다.
균사체가 콩으로부터 쓴 성분들을 제거하기 때문에 균사체화된 카카오는 천연 카카오에 비해 더 달콤하다. 따라서, 기능성 식품에서 균사체화된 카카오를 이용하는 한 가지 이점은 더 많은 감미료(즉, 당, 스테비아, 또는 합성 감미료)를 갖는 천연 카카오와 비교할 수 있을 만큼 좋은 맛을 내는 카카오를 포함하는 임의의 기능성 식품의 저당 버전(또는 적은 감미료)이 만들어질 수 있다는 점이다.
<구체예>
도 1은 생식용 균사체화된 농산품(예컨대, 균사체화된 커피 산물)의 추출물을 제조하는 방법의 일 구체예의 작업 공정도를 보여준다. 단계 10은 농작물을 제공하고, 단계 12는 액체상 발효에서 유래된 배양 원액을 포함하는 액체 배지에 의해 농작물을 접종하고, 단계 14는 균사체를 성장할 수 있고, 단계 16은 농작물에서 균사체를 성장하며, 단계 18은 농작물에서 균사체 성장이 바람직한 시기에 도달한 후 물에서 농작물을 끓이고, 물-농작물 혼합물을 수용성 및 비-수용성 성분으로 분리하는 것을 포함하고, 단계 20은 소분자 성분들의 혼합물을 수용성 성분들에 추가하여 수용성 성분들을 소분자 성분들과 생체-이용 가능한 혼합으로 혼합함으로써 추출물의 물 용해성을 촉진한다.
일 구체예에서, 단계 24는 단계 12를 수행하기 위해 담자담자균문균문(Basidiomycota) 곰팡이의 배양을 이용한다. 다른 구체예에서, 단계 26은 단계 12를 수행하기 위해 자낭균문(Ascomycota) 곰팡이를 이용한다.
도 2는 본 발명에 따른 사람의 신경재생 및 신경-보호를 이루기 위해 생식용 균사체화된 농산품의 추출물을 제조하는 방법을 보여준다.
본 발명은 농작물을 제공하는 단계 30, 액체상 발효에서 유래된 배양 원액을 포함하는 액체 배지에 의해 농작물을 접종하는 단계 32, 균사체를 성장시키고 농작물에서 균사체를 자라게 하는 단계 34, 물에서 농작물을 끓이고, 물-농작물의 혼합물을 수용성 및 비수용성 성분들로 분리하는 단계 36을 포함한다. 단계 36은 농작물에서 균사체 성장이 바람직한 시기에 도달한 후 일어난다. 단계 38은 사람에서 능동적 흡수 및 섭취를 향상시키기 위해 추출물의 물 용해성을 증가시키기 위해 소분자 성분들의 혼합물을 수용성 성분들에 첨가한다.
접종 단계 32는 본 발명의 곰팡이 성분을 접종하는 단계 40을 포함한다.
농작물에서 균사체를 자라게 할 수 있는 단계 34는 살균 환경에서 온도 및 습도를 조절하는 것을 포함한다. 그리고 나서, 균사체는 자동적으로 성장한다. 균사체는 소량의 살균 공기만이 용기에 들어갈 수 있는 용기에서 성장된다. 살균 공기의 부피는 용기에 뚜껑을 씌움으로써 조절된다. 이것은 용기에서 주변 산소를 조절한다.
단계 34는 균사체가 바람직한 시기, 예를 들어, 자실체가 농작물의 표면에 보이기 시작하는 시기까지 자라게 한다.
단계 36은 물에서 농작물을 끓여 남아있는 농작물 고형분으로부터 수용성 성분을 분리하면서 물에 현탁된 균사체의 다당류 및 다른 유익한 성분들을 분리한다. 비-수용성 성분은 농작물 고형분을 포함한다. 비-수용성 성분으로부터 수용성 성분을 분리하는 것은 여과 또는 사이포닝(siphoning)에 의해 이루어질 수 있다. 종래기술로 알려진 다른 방법들이 이용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
단계 38은 소분자 성분들의 혼합물을 수용성 성분에 첨가한다. 이는 수용성 성분들이 인 비보에서 훨씬 더 생체-이용가능할 수 있도록 한다.
도 3은 본 발명의 방법 10을 보여준다. 방법 10은 액체 조직 배양 배지에서 곰팡이 성분을 제공하는 단계 12, 곰팡이 성분이 카페인을 소비하도록 트레이닝하기 위해 커피 생두 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지 같은, 카페인을 포함하는 혼합물을 액체 조직 배양 배지에 첨가하는 단계 14, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 저온살균 또는 살균하는 단계 16, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 10-80% 수분 함량으로 수화시키는 단계 18, 곰팡이 성분을 카카오 콩 또는 다른 농작물에 접종하는 단계 20, 곰팡이가 성장할 수 있는 적당한 온도, 산소 함량 및 습도를 제공하는 단계 22, 및 카카오 콩 또는 다른 농작물을 건조 및 로스팅하는 단계 24를 포함한다.
도 4는 본 발명에 따른 커피 제조방법 48을 보여준다. 방법 48은 용기에서 커피콩을 제공하는 단계 50을 포함한다. 바람직하게는, 용기는 멸균가능한 백이다.
단계 22는 곰팡이 성분의 균사체에 의한 카페인의 소비율을 최대화하기 위해 카카오 콩 또는 다른 농작물에서 임의의 혐기적 균사체 성장을 촉진하기 위해 산소 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 단계 50에서, 용기는 밀봉되어 단지 최소한의 누출만 허락하도록 한다.
단계 52는 최적 수분 함량으로 커피콩을 수화시킨다. 일 구체예에서, 커피콩을 수화하는 단계 52는 2시간 동안 물에서 커피콩을 소킹(soaking)하고, 저온살균의 살균 전 2시간 동안 커피콩을 배수(draining)하는 것을 포함한다. 이는 커피콩의 수화가 균사체 성장을 촉진하기 때문에 중요한 단계이다. 커피콩의 수화 단계는 또한 원치않는 잔류물을 제거하고, 커피콩으로부터 바람직하지 않은 어떤 물-용해성 성분들을 제거할 수 있다. 다른 구체예에서, 물과 다른 액체가 이용된다. 예를 들어, 효소가 주입된 물은 단계 54의 살균 전에 커피에서 바람직하지 않은 성분들을 제거할 수 있다. 물의 pH는 단계 52의 수화를 최적화하기 위해 조절될 수 있다. 단계 52의 수화를 위해 증류수 또는 미네랄을 함유한 물이 사용될 수 있다.
단계 54는 증기로 카카오 콩 또는 다른 농작물을 살균하며, 단계 56은 용기를 가압한다. 용기 가압의 단계 56은 전형적으로 살균 단계 54와 함께 포함된다. 따라서, 살균 단계 54는 제곱 인치당 5-25 1bs 범위의 압력으로 이루어진다. 바람직하게는 압력은 제곱 인치당 10-20 1bs이다. 일 구체예에서, 압력은 제곱 인치당 15 1bs이다.
단계 54 하에서 살균은 121-122℃, 15 1b/in2; 115-116℃, 10 1b/in2; 및 108-109℃, 5 1b/in2의 조건하에서 20-100분의 시간 주기 동안, 또는 140-210℃에서 20-100분의 주기 동안 건열 처리 조건 하에서의 저온살균으로 이루어질 것이다. 이들 파라미터는 바뀔 수 있다.
단계 58은 곰팡이 성분을 백에 접종한다. 일 구체예에서, 단계 58은 일정한 접종을 보장하기 위해 5-100 마이크론의 직경의 곰팡이 균사 공 크기를 갖는 액체 조직 배양에 의해 달성된다. 다른 구체예에서, 고체상 조직 배양은 일정한 방식으로 커피에 첨가되고 커피와 혼합된다. 또 다른 구체예에서, 단계 60에서 기재된 대로 살균된 커피콩에서 곰팡이 균사체를 증식시키는데 필요한 시간을 줄이기 위해 용기 내 커피콩에 액체 조직 배양과 고체상 조직 배양 둘 다 첨가한다.
일 구체예에서, 단계 58은 단계 54 및 56 후 80-100℉로 용기를 냉각시키고, 곰팡이 액체 조직 배양을 직접적으로 용기에 주입하여 이루어진다. 단계 60은 같은 용기 내에서 곰팡이 균사체를 증식시킨다. 용기는 곰팡이 액체 조직 배양의 일정한 분배를 보장하기 위해 교반되거나 회전될 것이다. 다른 구체예에서, 커피콩은 단계 58의 접종을 위해 용기에서 통으로 전달된다.
다른 구체예에서, 단계 58은 액체상 발효에서 유래된 액체 조직 배양에 의해 달성된다. 액체 조직 배양은 직경이 2 mm 미만의 크기를 갖는 구형 응집을 포함하는 곰팡이 균주의 순수 배양을 산출하여, 곰팡이 균주의 배양의 구형 응집 주변에 3차원으로 균사 성장이 일어나게 한다. 이 구체예의 변형으로, 액체상 발효는 액체 배지의 교반 또는 스터링(stirring)의 과정 동안 균사 구조의 전단(shearing)으로 인해 직경이 5 마이크론 내지 1 mm 범위의 크기를 갖는 구형 응집을 포함하는 곰팡이 균주의 순수 배양을 산출한다. 교반 및/또는 스월링(swirling) 과정은 예를 들어, 마그네틱 스터러 바를 이용한 기계적 전단, 스테인리스 스틸 임펠러, 살균 고압 외기의 주입, 살균 배지의 고압에서 주입, 및/또는 진탕기 테이블의 이용을 포함할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다. 공기 및 배지 주입과 함께, 교반과 스월링 속도를 높일수록 작은 균사체 공을 생산하며, 상기의 앨리쿼트가 이후 반-혐기적 발효를 위해 고체-상 농작물을 접종하는데 이용된다. 최상으로 균사체 구형 응집은 직경이 100 마이크론 미만이고, 더 바람직하게는 직경이 10-50 마이크론의 범위이다.
백을 접종하는 단계 58은 부유 또는 심부 액체상 배양을 이용하는 것을 포함하고, 곡물 또는 커피 같은 균사체화된 농작물, 또는 페트리 플레이트 배양은 살균 또는 저온살균된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 포함하는 고체상 배양 배지를 접종한다. 특별히 주의할 것은 커피를 발효하기 위한 향상된 능력을 나타내는 서브-균주에 돈이 지급된다는 것이다. 이들 균주들은 선별되어 증식될 수 있고, 어떤 농도의 커피 생두 추출물(4-5개의 카카오 콩 또는 다른 농작물이 액체 조직 배양 배지 제조에 첨가됨)로 구성된 페트리-플레이트 및 액체 배지에서 심부 또는 부유 액체상으로 배양되고 나서, 커피를 발효하지 않도록 길들여진 균주 및 서브-균주들보다 더 빠른 속도로 살균된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 접종시키기 위해 이용된다.
살균된 커피콩에서 곰팡이 균사체를 증식시키는 단계 60은 바람직하게는 혐기적 환경에서 이루어진다. 따라서, 농작물(커피콩)이 살균 또는 저온살균될 때, 파스퇴르 효과에 의해 기재된 대로 곰팡이의 차후 임의의 혐기적 대사 활성이 단계 58의 접종 후 유도될 수 있다.
도 5는 본 발명의 방법 10을 보여준다. 방법 10은 용기에 카카오 콩 또는 다른 농작물을 제공하는 단계 12, 클로로겐산을 제거하여 곰팡이 균사체화를 위한 카카오 콩 또는 다른 농작물을 준비하는 단계 14를 포함한다. 일 구체예에서, 단계 14는 수용액에서 콩을 헹구는 것을 포함한다.
방법 10은 카카오 콩 또는 다른 농작물을 저온살균 또는 살균하는 단계 16, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 10-80%의 수분 함량으로 수화시키는 단계 18, 곰팡이 성분을 카카오 콩 또는 다른 농작물에 접종하는 단계 20, 카카오 콩 또는 다른 농작물을 균사체화하기 위해 용기 내 온도, 산소 및 습도를 조절하는 단계 22를 추가로 포함한다. 단계 22는 균사체화의 비율을 최적화한다.
단계 24는 단계 22의 균사체화에 의해 유발되는 균사체 대사물질 및 다른 바람직하지 않은 물질의 표면 생성을 제거하기 위해 균사체화된 커피콩을 헹구는 것이다.
도 6은 컨베이어 10, 멸균용 소재의 1차 시트 12, 멸균용 소재의 2차 시트 14, 및 시트 12 및 14 사이에 커피콩을 분배하는 호퍼 16을 보여준다. 1차 시트 12는 멸균용 소재의 롤 24로부터 전개되며, 컨베이어 10에 놓여있다. 호퍼 16은 1차 시트 12에 커피콩을 방출한다. 2차 시트 14는 초기에 롤 26 내에 말려져 있고 나서, 커피콩 및 1차 시트에 놓이게 된다. 1차 시트 12는 가장자리 22a 및 22b를 가진다. 2차 시트 14는 가장자리 20a 및 20b를 가지며, 1차 시트 12의 가장자리 22a 및 22b와 반대로 밀봉되어 큰 멸균용 백을 형성하고, 도 8c에 도시된 바와 같이 말려져 있을 수 있고, 커피콩의 150 1bs 이상을 확보하도록 설계되어 있다.
진공은 선택적으로 시트 24a 및 24b 사이에 공기를 추출하기 위해 제공될 것이며, 커피콩 18이 살균 챔버에 전달될 때 커피콩 18에 열 전달을 최적화한다. 또한, 진공은 커피콩 18 간의 상대적인 움직임을 억제한다. 컨베이어 10은 커피콩 18을 살균 챔버로 전달한다.
도 7은 컨베이어 10을 보여준다. 호퍼 16은 멸균용 백 30에 커피콩을 전달한다. 멸균용 백 30은 그리고 나서 밀봉되고 컨베이어 10에 놓이게 된다. 컨베이어 10은 많은 멸균용 백 30, 32, 34, 36 및 40을 오토클레이브 42에 전달한다. 오토클레이브 42는 일 구체예에서, 멸균용 백 30, 32, 34, 36, 38 및 40에 증기 같은 가열된 유체(heated fluid)와 압력을 가하여 커피콩 18의 살균 또는 저온살균이 가능케 한다.
도 8a는 커피콩이 충진된 멸균용 백 30을 보여준다. 멸균용 백 30은 자갈무늬 표면 44를 유발하는 압력하에 있다. 양자택일적으로, 멸균용 백 30은 진공 밀봉되어 자갈무늬 표면 44를 유발한다.
도 8b는 오토클레이브에서 살균 또는 저온살균을 위해 쌓여 있는 멸균용 백 30, 32, 34, 36 및 38을 보여준다. 자갈무늬 표면 44는 백 30에 둘러싸인 커피 생두로의 열 전달을 개선한다. 멸균용 백 30은 백 30의 주름무늬 표면에 부착된 적어도 하나의 브리더 패치(breather patch) 45를 포함한다. 바람직하게는, 브리더 패치 45는 0.2 마이크론 직경을 갖는 배출구를 포함하여 백 30을 통한 최소한의 기류를 가능케 하고, 백 30 내 증식된 균사체가 반-혐기적으로 증식하도록 보장한다. 브리더 패치는 직경이 2-100 마이크론인 기공을 가질 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 브리더 패치 45는 5 마이크론 미만의 배출구 직경을 가져 백 30을 통해 최소한의 기류를 배출할 수 있게 하고, 백 30 내 증식된 균사체가 반-혐기적으로 증식하는 것을 보장한다. 브리더 패치는 직경이 2-100 마이크론인 기공을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 브리퍼 패치 45는 5 마이크론 이하의 직경을 가지는 배출구를 가진다. 하나 이상의 브리더 패치 45가 백 30의 주름무늬 표면에 부착될 수 있고, 본 발명에 따른 백과는 다른 용기에서 이용될 수 있다.
도 8c는 커피콩을 둘러싸는 멸균용 소재의 연속적인 백(continuous bag) 46을 보여준다. 연속적인 백 46은 백 46이 오토클레이브에서 살균 또는 저온살균되도록 하기 위해 밀봉된다. 다른 구체예에서, 백 46은 섹션 내에 밀봉되므로 연속적인 백 46은 다수의 섹션을 가지며, 섹션 사이에서 공기와 커피의 이동을 억제하기 위해 서로 분리되어 있다. 백 46과 그것의 표면 주변을 통과하는 화살표로 살균 동안 격렬한 기류를 보여준다.
도 9는 일반적으로 참조부호 10으로 표기된 본 발명의 방법을 보여준다. 방법 10은 액체 조직 배양 배지에서 곰팡이 성분을 제공하는 단계 12, 곰팡이 성분이 바람직하지 않은 카카오 향미 성분들을 소비하도록 트레이닝하기 위해 액체 조직 배양 배지에 카카오의 추출물을 포함하는 혼합물을 추가하는 단계 14, 생 카카오 콩을 저온살균 또는 살균하는 단계 16, 생 카카오 콩을 10-80%의 수분 함량으로 수화시키는 단계 18, 생 코코아 콩에 곰팡이 성분을 접종하는 단계 20, 곰팡이가 성장할 수 있도록 최적 온도, 산소 함량 및 습도를 제공하는 단계 22, 및 생 카카오 콩을 건조 및 로스팅하는 단계 24를 포함한다.
단계 22는 곰팡이 성분의 균사체에 의한 2-메톡시-3-이소프로필피라진 및 테오브로민의 소비율을 최대화하기 위해 생 카카오 콩에서 임의의 혐기적 균사체 성장을 촉진하도록 산소 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
도 10은 수용액에서 카카오의 수용성 균사체화 방법 26을 보여준다. 방법 26은 생 카카오 또는 노르스름하게 구운 카카오를 제공하는 단계 28, 직경이 1 mm 미만인 소입자로 카카오를 분쇄하는 단계 30, 생물-반응기에서 수용액을 제공하고, 상기 용액이 교반될 때 카카오의 소입자를 현탁하기 위해 적당한 점도를 갖는 단계 32, 순수 곰팡이 균주의 균사체와 같이 곰팡이 성분의 액체 조직 배양을 추가하는 단계 34, 균사체의 임의의 혐기적 성장을 보장하기 위해 온도, 교반 활성, 및 산소 수준을 조절하여 수용액에서 카카오의 곰팡이 균사체화가 가능하도록 하는 단계 36, 수용액에서 카카오를 분리하고, 분리된 카카오를 건조하는 단계 38, 및 수용액에서 물 용해성 카카오 향미 성분들을 선별하고 이를 추출하며, 선별된 물 용해성 카카오 향미 성분들의 적어도 한 부분을 분리된 카카오에 추가하여 풍미 있는 카카오 분말 또는 액체를 산출하는 단계 40을 포함한다.
하기 실시예들은 단지 본 발명을 설명할 목적으로 제공되므로 본 발명의 범위가 이에 제한되어서는 안된다.
<실시예>
실시예 1
균주의 일반적인 활력 및 건강을 모니터하고 보장하기 위해, 언급된 균주 은행(referenced collection)에서 얻은 특이하고 순수한 곰팡이 균주들을 1.5%의 아가(w/v)와 함께 커피 생두의 추출물 또는 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 명시되지 않은 유기농 과일 및 식물성-기반 배지를 사용하여 1 gal 내지 10 gal 플라스틱 백, 1 qt 내지 1 gal 유리병(glass jar), 또는 10 cm 내지 15 cm 페트리 플레이트에서 살균 환경에서 취급하였다.
균사체 샘플은 온화한 살균 외기류에서 2 내지 4주간 성장되고 나서, 페트리 플레이트로부터 잘려 차후에 외기를 이용하여 1 qt 내지 1 gal 유리병에서 유사한 명시되지 않은 과일 및 식물성-기반 배지(아가는 미포함)를 사용한 액체-상 발효에서 접종을 위해 사용된다. 어떤 샘플은 교반하면서 성장되며 어떤 것은 상업용 맥주 제조 및/또는 발효를 위해 설계된 스테인리스 스틸 탱크에서 외기에서 교반되지 않은 배양에서 성장된다.
교반되지 않은 액체상 발효는 액체와 공기의 접촉면에서 연속적인 성장을 나타낸 균사의 부유 덩어리(floating mass)를 형성하였다. 교반 및/또는 스월링 배양의 균사체는 균사 공으로 매우 빠르게 자라고, 수화되고, 심부에 남아있게 되며, 직경이 작은 젤라틴 비드의 외양을 가진다. 수화된 균사 공은 건조 시 붕괴되며, 여기서 그들은 균주 증식 및 품질 조절을 위해 페트리-플레이트에 접종하는데 사용되었다.
액체-상 발효에서 구의 직경은 교반 강도 및 부피에 반비례하는 것으로 밝혀졌다. 균사 절단(Hyphael shear)은 교반 및 스월링 강도가 클수록 더 효과적이며, 절단 시, 균사는 그들이 다시 절단될 때까지 크기로 성장하면서, 가능한 한 가장 작은 직경의 새로운 공을 형성하였다. 연속 액체-상 발효에 사용될 때, 일정 비율의 구 직경을 나타내므로, 마이크론의 순서로 구의 일정한 공급이 생산되었다.
따라서, 이 예시는 더 효과적인 접종을 위해 구 직경에 반비례한 접종 효율을 가지도록 균사체 구 직경이 솜씨있게 처리되었음을 입증하였다.
실시예 2
교반되지 않은 액체상 발효(성장 주기는 2 내지 4주임)로부터 균사체 배양은 균사의 부유 덩어리를 형성하며, 접종에 이용하기 전에 날카롭고, 살균된 커팅 장치를 사용하여 부드럽게 섞었다. 부드러운 섞는 것은 상업용 블렌더에서 느린 속도에서 짧은 버스트로 혼합하거나 낮은 균질화에 의해 수행된다. 섞인 액체-상 배양의 앨리쿼트는 살균된 가공되지 않은 과일 및/또는 채소, 곡물, 및/또는 요리용 씨앗(culinary seed), 또는 저온살균된 요리용 스파이스, 약초, 천연 향미료, 차 혼합물, 그린 바닐라 콩, 카카오 생두, 및 카카오 콩 또는 다른 농작물을 접종하는데 사용하였다.
실시예 3
병(jar) 또는 백에서 균사체화를 위한 농작물(농작물과 접종된 균사체 배양 둘 다를 포함)은 그들이 농작물을 점령하여 혼합 또는 진탕(shaking)에 어느 정도 내성이 있게 될 때까지 균주 의존적으로 보통 2 내지 4주 동안 며칠마다 부드럽게 혼합되었다. 그리고 나면, 생산물은 템페(tempeh) 형태가 된다. 균사체화된 바닐라 생두는 요리하거나 구워졌다; 균사체화된 카카오 생두는 굽거나 노르스름하게 구워졌다; 그리고, 균사체화된 카카오 콩 또는 다른 농작물은 노르스름하게 굽거나 로스팅되었다. 템페 형태, 또는 수프, 볶음요리(stir fries), 빵, 및 육류-대용을 포함하여 식품의 성분으로 소개된 균사체화된 곡물은 소비 전에 어떤 시점에서 약불 내지 중불, 145-165℉에서 10분 내지 60분 동안 요리되어 먹기에 안전하고 생체-이용가능하게 만들어졌다. 병(jar) 또는 백에서 다른 배양들은, 허브 및 스파이스처럼 100-145℉에서 1 내지 24시간 동안 건조되고, 포장되고 그리고, 편리하게 이용되었다.
균사체화된 벌꿀 제형은 100-125℉에서 10분 내지 90분 동안 교반되고 나서, 작은 유리병에 주입하였다. 더욱이, 균사체화된 농산품은 누들, 육류 대용, 특히 향미료, 쿠킹 소스, 수프 성분 등의 부가가치생산품으로 다시 가공되었다.
실시예 4
액체-상 및 고체-상 대량 생산 작업을 위해, 순수 배양은 호기적으로 자라게 하고, 식료품의 대용량 발효를 위해 연속적으로 및 반-혐기적으로 작업되는 큰 산업용 액체-상 및 큰 고체-상 상업용 처리기(processor)에 접종하였다.
배지의 배양이 완전히 흰색 또는 특정 종에 대해서는 그것의 대표 색으로 바뀌고, 완전히 과성장하고, 배지를 점령하고 부드러운 혼합에 내성이 있게 된 후, 내용물을 수확하고, 플라스틱 백으로 옮기고 빠른 이용을 위해서 40℉에서 냉장하거나, 장기 저장을 위해 및 이후 이용을 위해 -20℉에서 냉동하였다. 발효된 배지는 "템페 스타일" 육류 대용, 에그-누들, 전문 향미료(specialty flavoring), 빵, 추출물 및 쿠킹-소스, 또는 수프 및/또는 볶음요리 레시피에서 신선한 성분으로 직접적으로 이용되거나, 포장되는 것을 포함하여 미식가를 위한 사람이 먹는 음식으로 제조되었다.
실시예 5
아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum), 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 플레우로토스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 플레우로투스 시트리노필레아투스(Pleurotus citrinopileatus), 플레우로투스 드자모르(Pleurotus djamor), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes), 보바리엘라 볼바세아(Vovariella volvacea), 힙시자이거스 마모레우스(Hypsizygus marmoreus), 폴리오타 나메코(P. nameko), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 폴리포러스 엄벨라투스(Polyporus umbellatus) 및 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis)에서 선별된 곰팡이 균주의 순수 배양을 접종하여 완전히 균사체화된 농작물은 1시간 내지 24시간 동안 열처리하고, 145-195℉에서 1분 내지 2시간 동안 수확한 다음, 실온에서 45분 내지 48시간 동안 회복되었다. 이 과정은 RNA 수준의 현저한 감소를 보여주며, 다른 기능식품 조성으로 제형화되었다.
실시예 6
71 1bs의 카카오 콩을 물과 동량의 부피로 5분 동안 소킹하고, 물을 여과하여 버린 후 0.2 마이크론 브리더 패치를 사용하여 카카오를 10 폴리프로필렌 백에 동량으로 분배하였다. 백의 상단은 가로로 접고 백의 각 면 주위를 고무 밴드로 쌌다. 약간 건조 포화된 증기로 255℉에서 22psi에서 80분 동안 백을 살균하였다. 그리고 나서, 살균 환경에서 8시간 동안 백을 냉각하고, 이후, 살균 도구를 사용하여 살균 층류식 후드 내 살균 작업으로 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 또는 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps)의 심부 액체 조직 배양을 접종하였다. 접종물은 4L 플라스크에서, 10L의 유기농 감자 추출물, 2L의 생 카카오 콩 추출물 및 1L의 유기농 망고 주스의 혼합물로부터 제조된 1.5L의 배지에서 성장되고, 접종물을 1 in. 방사상 교반의 60 RPM 하에서 7일 동안 키운 후 50mL의 접종물을 카카오의 각 백을 위해 사용하였다. 배양물을 2주 동안 균사체화하고 나서 건조하고 시식하였다. 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum) 카카오는 가장 적은 쓴맛(가장 개선된 맛)을 제공하는 것으로 나타났다.
실시예 7
보리, 현미, 메밀, 불거(빻은 밀), 아마씨, 낟알(Grano), 기장, 귀리, 귀리 브리트(Oat Breat), 귀리 시리얼(Oat Cereal), 오트밀, 팝콘, 통밀 시리얼 조각(Whole Wheat Cereal Flakes), 뮤즐리, 롤드오트(Rolled Oats), 퀴노아, 호밀, 수수, 스펠트밀(Spelt), 라이밀(Triticale), 통보리(Whole Grain Barley), 밀알, 통 옥수수가루(Whole Grain Cornmeal), 통호밀, 통밀빵, 통밀쿠스쿠스(Whole Wheat Couscous) 및 줄(Wild Rice)의 샘플을 대략적으로 준비된 쿼트 볼 병(jar) 또는 브리더 패치가 있는 멸균용 백에 물 부피의 절반의 부피로 각각 혼합하고, 15psi에서 90분 또는 22psi에서 80분 동안 살균하였다. 냉각 시, 곡물병(grain jar)에 다음 중 하나로부터 선별된 부유 또는 심부 곰팡이 배양의 전체 콜로니의 절반을 접종하였다: 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 플레우로토스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 래티포루스 술푸레우스(Laetiporus sulphureus), 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 모첼라 크라시페스(Morchella crassipes), 모첼라 헤스쿨렌타(Morchella hesculenta), 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis) 및 이노노투스 오블리쿼스(Inonotus obliquus), 여기서 부유 배양은 1/4 또는 1/2 갤런 유리병에서 유기적인 명시되지 않은 배지에서 성장하고, 심부 배양은 1.5L의 명시되지 않은 배지에서 4L 플라스크에서 성장되었다. 2주 동안 균사체화 후, 유리병에 완전히 두루두루 자라게 되고, 템페 또는 기능식품(즉, 소분자, 아스코르브산(1g) 및 시트르산(10g)과 8m의 오렌지 및 귤 에센스 오일이 혼합된 2 갤런 벌꿀로 제형화됨)으로 추가로 제형화되기 전에 이중 보일러에서 212℉에서 7분 동안 저온살균되었다. 이 제형화 단계는 2L의 물과 저온살균된 배양을 섞거나 그렇지 않고 시작하고 나서 아스코르브산과 시트르산을 상기 혼합물에 첨가하고, 에센셜 오일, 그 다음에 벌꿀을 첨가하고 나면, 제형을 이중 보일러에서 가열하여, 병에 담고, 병에 담을 때 저온살균하여 완전한 밀봉을 보장하였다.
실시예 8
소량 생산 작업(Small Batch Work)-커피
배기구 입구로 가스 확산이 빠르게 일어나도록 구성된 뚜껑이 있는 클린 쿼트 볼 병(jar)에서 48 lbs.의 커피를 48개의 동일한 비율로 나누었다. 이들 48개, lbs.중량의 커피를 물의 3/4 쿼트로 2시간 동안 소킹하였다. 혼합물에서 물을 여과하여 버렸다. 그리고 나서, 커피 병(jar)은 15psi에서 살균 온도에서 90분 동안 노출시키고, 냉각시키기 위해 살균 층류식 기류(laminar air flow)에서 8시간 동안 정치하였다. 냉각 시 커피콩에 다음 중 하나로부터 선별된 곰팡이의 전체 콜로니의 1/2를 접종하였다: 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 플레우로토스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 래티포루스 술푸레우스(Laetiporus sulphureus), 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 모첼라 크라시페스(Morchella crassipes), 모첼라 헤스쿨렌타(Morchella hesculenta), 트레멜라 푸시포미스(Tremella fuciformis) 및 이노노투스 오블리쿼스(Inonotus obliquus). 각각의 3개를 수행하면서, 실시예 8에 기재된 대로 살균 도구를 사용하여, 층류식 후드 내 살균 작업으로 커피 생두 추출물을 포함하는 명시되지 않은 식물성 및 과일 주스 아가 배지에서 키웠다. 배양은 7일째, 14일째 및 21일째에서 건조 및 로스팅을 위해 수확된 각각의 샘플을 사용하여 7일 내지 21일 동안 균사체화 하였다. 균사체화 주기가 길수록 세포량은 더 많아지나, 7일째에 배양물의 냄새 및 커피의 맛은 배양이 완성되었음을 시사한다.
대량 생산 작업(Large Batch Work)-커피
528 lbs.의 카카오 콩 또는 다른 농작물을 두 개의 다른 과정으로 소킹하였다. 첫 번째 과정에서, 콩은 각 소킹마다 20분씩 3회 소킹하였다. 두 번째 과정에서, 콩은 여과수의 일정한 흐름을 통해 20분 동안 소킹하였다. 그리고 나서, 0.2 마이크론 브리더 패치가 있고, 백의 상단은 가로로 접혀 백의 모든 면들을 고무 밴드로 둘러싸는 폴리프로필렌 백에 콩을 채움으로써, 증기(steam) 및 가스 확산이 브리더 패치 및 백의 접힌 면들을 통해 일어날 수 있게 한다. 백은 22psi에서 80분 동안 액체 주기하에서 살균되고 나서, 8시간 동안 냉각되었다. 백은 하기 종들 유래의 곰팡이로 접종되었다: 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum) 및 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps). 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum). RO 물로 100L에 희석된 10L의 유기농 감자 추출물, 2L의 커피 생두 추출물 및 1L의 유기농 망고 주스를 포함한 생물반응기에서 배양을 수행하였다. 생물반응기는 2개의 인라인 0.2 마이크론 소수성 캡슐 필터를 통해 여과된 압착 공기가 분사되었고, 반응기는 공기 공급 시 체크 밸브 및 2-3psi 크랙킹 압력 등급을 갖는 벤팅 라인을 이용하여 2-3psi에서 유지되었다. 접종물은 48시간 내에 점차 성장되고, 반응기의 바닥에 위치한 다이어프램 밸브를 통해 수확되어 밸브가 열려있는 하베스팅 라인(harvesting line)으로 이동하고, 인라인 체크 밸브를 이용하여 6피트의 유연한 스테인리스 스틸 호스팅을 통해 스팀 라인 및 스팀 트랩에 접근하고, 타이머 및 풋 스위치에 연결된 솔레노이드 밸브에 접근한 다음 유량계 밸브(flow metering valve)에 의해 엘보우드 새니터리 피팅(elbowed sanitary fitting)에 접근하였다. 증기를 쐬는 동안, 엘보우드 새니터리 피팅은 증기 배기 매니폴드에 연결된 볼 밸브(ball valve)에 연결되어 있다. 볼 밸브는 라인에 증기를 쏘인 후 닫히며, 전체 라인을 살균 상태로 유지하기 위해 볼 밸브는 층류식 후드로 들어갈 때 하베스팅 라인에서 분리되었다. 코디셉스 시넨시스(C. sinensis), 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum) 및 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps) 배양은 4L 플라스크에서, 1.5L의 생물반응기 전-희석에서 사용된 동일한 배지에서 성장되었다. 이들 배양은 6일 동안 성장되었고, 살균된 카카오 콩 또는 다른 농작물의 백을 접종하는데 사용되었다. 콩은 7일 동안 균사체화 되었고, 음료의 바람직한 맛 프로파일을 주는 그들의 냄새는 로스팅된 균사체화된 콩으로부터 만들어지며, 그들은 8일째에서 13%의 수분 함량으로 건조되었다.
실시예 9
본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 곰팡이는 다음의 방법들에 의해 제조되었다. 하기 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균주들은 펜실바니아 주립대학교 버섯 균주 은행에서 상업적으로 구입하였다: 496 Ling ZHI; Singapore commercial line; 7/85; 502 IFO #8436; IFO-Japan; 7/30/85; 510 Red oak, State College, PA; D.J. Royse; 9/85; 549 Y.H. Park, ASI-Korea; 12/5/85; 550 Y.H. Park, ASI-Korea; 12/5/85; 551 Y.H. Park, ASI-Korea; 12/5/85; 580 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/10/85; 607 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/19/85; 617 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 618 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 619 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 620 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 621 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 622 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 623 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 624 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 625 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 626 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 627 Y.H. Park, ASI-Korea; 2/25/85; 665 Quimio; Philippines; 3/6/86; 669 Y.H. Park, ASI-Korea; 3/25/86; 686 B. W. Yoo; 4/28/86; 724 T. Mitchel, Lawn PSU Forestry Bldg. 9/16/90; 806 Alice Chen; Buffalo, NY; 4/94; 807 Alice Chen; North Carolina; 4/94; 841 White Oak; PSU Campus; J. Peplinski; 8/99. 상기 균주들은 카카오 콩 또는 다른 농작물 추출물을 포함하는 여기에 기재된 배지를 이용하여 배양되었다(실시예 10 참조). 많은 균주들은 배지에서 자라거나 및/또는 죽을 수 없다. 놀랍게도, 본 발명자들은 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균주 806 Alice Chen(Buffalo, NY)이 커피 생두 추출물을 포함하는 배지에서 성장할 수 있고, 본 발명에 따라 추가적인 이용을 위해 선별될 수 있음을 밝혔다.
실시예 10
곰팡이(여기에 기재된 대로, 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균주 806, 코디셉스 시넨시스(C. sinensis) 및 튜버 멜라노스포럼(Tuber melanosporum), 또한, 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 트리콜로마 마쮸타케(T. matsutake), 플람물리나 벨루티페스(F. velutipes), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 폴리오타 나메코(P. nameko), 라리시포메스 오피시날리스(L. officinalis), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(A. auricula), 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(I. obliquus), 포메스 포멘타리우스(F. fomentarius), 엘 설푸레우스(L. sulfureus)를 포함)는 카카오 콩의 추출물을 함유하는 명시되지 않은 배지를 포함하는 배양에서 유지되었다. 상기 실험은 배양을 위해 사용된 카카오 콩의 추출물을 포함하는 배지는 내성을 가지고, 성장하고, 대사하고, 카페인 또는 바람직하지 않은 향미 성분들을 제거하거나 줄일 수 있는 곰팡이의 능력을 유지함을 보여주었다. 또한, 상기에서 정의한 대로 곰팡이의 연속적인 증식은 내성을 가지고, 성장하고, 대사하고, 카페인 또는 바람직하지 않은 향미 성분들을 제거하거나 줄일 수 있는 곰팡이의 능력의 향상 및/또는 개선을 유발하여, 카카오 콩의 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지에 대해 곰팡이를 트레이닝하거나 적응시킬 수 있음이 밝혀졌다. 선별되거나 선별되지 않은 출발 균주와 비교하여, 여기에 기재된 대로 변화, 개선 및 적응된 특성들이 있는 그러한 곰팡이들이 개발되었다. 이들 적응된 균주들은 여기에서 다른 곳에 기술된 바와 같이 ATCC에 기탁되어 있다.
카카오 콩의 추출물을 포함하는 명시되지 않은 배지는 다음과 같이 제조하였다: 2 lbs의 분쇄된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 실온에서 1/4 갤런의 물과 혼합하였다. 20분 동안 진탕하여 혼합물이 추출되도록 하고 나서, 미세한 메쉬를 통해 3회 여과하였다. 별도로, 5개의 유기농 감자를 10L의 물에 넣고, 감자를 연화시키기 위해 20분 동안 멸균하였다. 그리고 나서 감자 으깨는 기구를 이용하여 감자를 분쇄하고 나서, 미세한 메쉬를 통해 3회 여과하였다. 1L의 상업용 무과당 과일 주스를 첨가하였다. 이들 용액을 혼합하고 멸균하였다. 또한, 이 레시피는 필요에 따라 규모를 확대하거나 축소하였다.
세척된 카카오 콩을 물에서 세척하여 수분 함량을 약 30%로 올렸다. 다른 때에는 수분 함량을 약 60%로 올렸다.
액체 배양: 준비된 카카오 콩 또는 다른 농작물을 접종하는데 사용하기 위한 곰팡이를 포함하는 배양은 격동하는 환경을 불러일으키고, 순수 기계력을 이용하여 균사를 절단하기 위해 분사되는 공기 및 동력장비가 설치된 패들을 사용하여 교반하였다. 이중 교반(dual agitation) 방법은 개별적으로 어느 쪽의 방법보다 훨씬 낫다. 왜냐하면, 분사되는 공기는 배양의 상단의 중간 정도에서 심한 격동을 일으키나, 바닥에는 거의 영향을 주지 않아 동력장비가 설치된 패들에 의해 교반되었다. 대신, 패들은 더 낮은 RPM으로 진행될 수 있고, 여전히 분사 없이 더 빠른 RPM에 의해 얻어지는 균사 공 크기를 얻을 수 있다. 균사 크기는 직경이 약 2-5 마이크론이다. 준비된 곰팡이에서 손상을 받지 않은 균사체 및 적당한 형태는 이 방법에 의해 제조되며, 배양 및/또는 균사체화를 위해 사용되었다.
실시예 11
블랙 이탈리안 윈터 페리고드 트러플(Black Italian Winter Perigord Truffles)[트러플 1(T1) 및 트러플 2(T2)]은 균류학 실험실 환경에서 무균 상태로 취급하였고, 하기의 4개의 방법에 의한 반대쪽 교배형 분리물을 포함하여 상업용 작업을 위해 다수의 새로운 트러플 품종을 얻었다.
방법 1: T1의 신선(1주 미만)한 온전한 전체 조각들(크기가 대략 10mm×20mm의 트러플 글레바 덩어리)를 50 페트리 플레이트 내 참나무-아가(참나무 잎 및 어린 가지에 기반을 둔 일반적인 명시되지 않은 아가 배지)에 놓고, 파라필름으로 밀봉하여 실온(23℃)에서 5주 동안 배양을 인큐베이션 하였다. 5주 후, T1의 조각이 하기 품종들에 의해 기재된 균사체로 재생하는지를 관찰하였다: (a) 6개의 페트리 플레이트 상에서 자주색을 갖는 잘 자란 흰색 균사체, (b) 3개의 플레이트 상에서 자주색을 갖는 잘 자란 금색 균사체, (c) 6개의 플레이트 상에 잘 자란 흰색 및 금색 균사체, (d) 2개의 플레이트 상에 잘 자라지 않은 성긴 자주색과 금색 균사체, (e) 2개의 플레이트 상에 잘 자라지 않은 성긴 흰색과 금색 균사체. 남아있는 페트리 플레이트(37 플레이트)는 (세균 및 곰팡이) 오염에 의해 무성하게 된 후 버렸다. 분리물 (a), (b) 및 (c)가 상업성을 갖고 있는지 측정하였다. (a) 잘 자란 흰색 분리물은 오리지널 트러플 버섯에 대해 모계 교배형 균사체이나, 분리물 (b)는 오리지널 트러플 버섯에 대해 부계 교배형 균사체이며, (c)는 (a) 및 (b) 교배형 둘 다의 비-생식적 유전자 재조합 또는 융합(anastomosis)에서 유래된 품종이다. 참나무-아가에서 5 내지 6주 후 성장 후, (c) 잘 자란 흰색 및 금색 균사체의 배양은 조그마한(0.1mm 내지 2.0 mm) 트러플 자실체(truffle fruits)를 생산하기 시작한다. 구조물들이 신선한 페트리 플레이트에서 배양되고, 유사한 농작물 배지에서 배양된 후, 이들 배양은 끊임없이 블랙 트러플 버섯을 생산하였다.
방법 2: T1의 신선한(1주 미만) 온전한 포자(크기가 대략 0.1 mm×0.1 mm인 0.01g 내지 0.1g의 포자 덩어리 무게)를 페트리 플레이트(40개 플레이트)에서 잘 건조된 참나무-아가 배지에 놓고, 5주 동안 파라필름으로 밀봉하여 실온(23℃)에서 포자가 자라도록 하였다. 5주 후, 포자는 10개의 플레이트에서 균사체로 자라는 것이 보였다. 그러나, 포자로부터 자란 모든 균사체는 비록 눈에 보이긴 하나, 극도로 성기고 천천히 자랐다.
방법 3: T1의 신선한(1주 미만) 온전한 전체 조각(크기가 대략 10 mm×20 mm인 40g의 글레바 덩어리)을 400mL의 살균수 및 50㎍/mL의 각각의 하기 항생물질을 포함하는 2개의 병 각각에 넣었다: 앰피실린, 페니실린, 클로람페니콜, 에리쓰로마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신. 꽉 조여 있지는 않으나 닫혀 있으며, 실온(23℃)에서 5주 동안 간간이 부드럽게 진탕하면서 방해받지 않은 채 인큐베이션 하였다. 5주 후, 온전한 조각들을 항생물질 완충용액으로부터 제거하고, 참나무 잎과 어린 가지를 기반으로 한 일반적인 명시되지 않은 아가 배지(같은 수준의 항생물질을 포함)가 포함된 50개의 페트리 플레이트에 넣은 후 파라필름으로 밀봉하여 실온(23℃)에서 2주 동안 배양을 인큐베이션 하였다. 아가에서 재생 2주 후, T1 조각은 하기 균사체 품종으로 재생하였다: (a) 12개의 페트리 플레이트에서 백색 균사체, (b) 4개의 플레이트에서 금색 균사체, (c) 2개의 플레이트에서 흰색과 금색 균사체. 페트리 플레이트(32개의 플레이트)의 나머지들은 곰팡이 오염에 의해 무성하게 된 후 또는 더 이상의 성장이 없게 된 후에는 버렸다. 방법 3에 의해 얻은 분리물은 방법 1의 분리물과 매우 유사하게 보이긴 하나, 훨씬 덜 왕성하였다.
방법 1의 분리물 (a), (b) 및 (c)은 여기에 기재된 대로 제조하였고, 농작물의 균사체화를 위해 사용하였다. 농작물로 카카오 콩을 준비하였다. 결과물인 로스팅된 카카오 콩 및 결과물인 초콜릿을 위한 바람직한 커피 향미가 달성될 때까지 약 7일 동안 준비된 카카오 콩의 균사체화를 진행하였다. 결과물인 균사체화된 코코아 콩을 로스팅하여 초콜릿이 되게 하였고, 훈련된 테이스터에게 시식시켰다. 방법 1에 대해 기재된 분리물인, 분리물(a)가 이용될 때, 균사체화된 초콜릿에서 꽃을 연상하는 기분 좋은 풍미 있는 향기/맛이 달성되었음으로 발견하였다. 방법 1에 대해 기재된 분리물인, 분리물(c)가 이용될 때, 트러플을 연상하는 기분 좋은 풍미 있는 향기/맛이 달성되었다.
실시예 12
본 발명의 방법에 의해 생산된 커피콩 및 가루는 첨가된 다당류 및 베타 글루칸을 포함하고 있다. 분석 결과, 본 발명의 방법에 의해 생산된 로부스타 커피 가루는 커피 가루 1g당 30.54 mg의 덱스트란이 있었다. 이 결과는 변형된 페놀-황산 접근에 기반을 둔 분광광도법을 통해 농작물 내 전체 다당류 함량을 제공하였다. 또한, 분석 결과, 본 발명의 방법에 의해 생산된 로부스타 커피 가루는 분광광도법에 의한 정량화와 함께 베타 글루칸을 가수분해하기 위한 강력한 가수분해 조건을 이용한 MYBG 방법에 따라 측정되었을 때, 0.432%의 베타 글루칸이 있었다. 이는 레이시 버섯(Reishi mushrooms)은 쓰고, 목질이 많고 및 단단하여 요리할 수 없는 버섯이므로 이 버섯으로부터 베타-글루칸을 과도하게 소비하거나, 알약 형태로 소비하는데 있어 이점을 제공한다.
실시예 13
맛 비교 1, 수마트라, 페루, 및 온두라스 아라비카 콩
이중 블라인드 실험에서, 커피 로스팅 사업 소유주의 커피 전문가이자 소유주(테이스터) 및 훈련받은 직원은 수마트라, 페루 및 온두라스 아라비카 콩(대조군 콩)을 이용한 표준 프리미엄 커피콩과 본 발명의 방법에 따라 생산된 커피콩(균사체화된 콩)의 비교를 통해 맛-테스트를 받았다. 균사체화된 콩과 대조군 콩 둘 다 실험 동안 로스팅 하였다. 이들은 표준 커피 시음 기술을 이용하여 대조군과 나란히 찻잔에 담았다.
균사체화의 향미-향상 효과를 확인하였다. 이 블라인드 맛 테스트에서 테이스터는 각 종류의 균사체화된 음료 및 정상적인 뜨거운 음료를 샘플로 사용하였다. 노트에 기록하였다. 맛 테스트 결과, 각 컵에 사용된 커피콩이 동정되었다.
균사체화된 수마트라 콩에 대해 우선 의견을 말하자면, 대조군 수마트라 콩에 비해 더 감칠맛이 나고, 더 복합적이고, 쓴맛이 덜 나는 것으로 묘사되었다. 테이스터는 이것은 그들이 실제로 맛 결함을 제거하고 실제로 향미를 향상시킴을 알아차린 유일한 공정이었다고 분명히 말하였다.
균사체화된 페루 콩은 균사체화될 때 덜 쓰고, 더 감미롭고, 및 현저하게 "밝아진" 찻잔일 뿐만 아니라 뚜렷한 향미-향상을 보여주었다. 고-품질의 콩임에도, 대조군 페루 콩은 비교 시 "밋밋한" 맛으로 느껴졌다.
두 명의 테이스터 중 한 명은 온두라스 음료에서 차이를 감별할 수 있었다. 본 발명의 방법은 커피에서 발견되는 쓴 화합물을 제거함으로써 더 나은 커피 맛을 냈다.
맛 비교 2 아라비카 콩
균사체화된 커피 맛 테스트는 커피 하우스에서 수행하였다. 바리스타/로스터(테이스터)는 그들의 인-하우스 술라웨시 아라비카 커피(원산지가 인도네시아임)의 공식적인 커핑(formal cupping)을 전달하였다. 콩은 재고품에서 선별하였고, 균사체화된 콩과 대조군 콩(아라비카) 둘 다 커핑하는 날에 로스팅하였다. 결과적으로, 균사체화된 커피(본 발명의 방법에 의해 생산됨)는 개선된 향미 프로파일을 가지고 있었다.
테이스터는 균사체화된 커피가 오리지널 콩에 비해 덜 시고, 더 달콤하고, 더 감칠맛이 나고, 더 복합적이고 및 전체적으로 더 나은 맛을 내는 것으로 묘사하였다.
맛 비교 3 로부스타 콩
이중 블라인드 실험에서, 커피 로스팅 사업 소유주의 커피 전문가이자 소유주(테이스터) 및 훈련받은 직원은 대조군 로부스타 커피콩과 본 발명의 방법에 따라 생산된 로부스타 커피콩의 비교를 통해 맛-테스트를 받았다. 100% 로부스타 콩으로 제조된 커피는 로부스타의 신맛과 쓴맛이 크기 때문에 일반적으로 마실 수 없는 것으로 간주된다. 따라서, 로부스타 커피콩은 보통 혼자 사용되지는 않고, 대신에 로부스타 콩은 보통 전-가공(즉, 증기 처리) 되고 나서, 더 비싼 콩과 섞어 맛좋게 바꾼다.
이 품질이 좋지 않은 콩은 그것의 쓴맛으로 인해 일부 마실 수 없는 것으로 간주되나, 로부스타는 커피 블렌드에 상업적으로 이용되어 가격을 낮춘다. 로부스타는 그것의 이용 시 성장이 빠르고, 커피 시장의 로부스타 부문은 2008년 시장의 39%에서 2013년 시장의 41%로 성장하였다.
테이스터는 균사체화된 로부스타가 균사체화되지 않은 것에 비해 "의심의 여지가 없는" 더 나은 커피 음료임에 동의하였다. 한 명의 테이스터는 "당신은 의심할 여지 없이 당신의 기술이 유효하게 작용함을 입증하였다"라고 논평하였다; 다른 테이스터는 자기는 자칭 커피 스놉이며, 균사체화되지 않은 커피는 맛이 없다고 촌평하면서, 동시에 "나는 매일 이 균사체화된 로부스타를 마실 것이다"라고 논평하였다. 보다 상세하게는, 그는 찻잔에서 쓴맛과 신맛이 눈에 띄게 부족하면서 맛에서 감칠맛이 있음을 알아차렸다. 테이스터는 비전문가 커피 테이스터가 맛을 보더라도 차이를 분간할 수 있으며, 균사체화된 로부스타는 시장에서 높은 가치를 보유하고 있다고 촌평하였다. 로스팅 회사의 다른 직원들 역시 차이를 알아차렸다.
맛 테스트 결과는 명확하게 본 발명의 공정이 커피의 맛을 향상시킴을 입증하는 것이다. 상기 결과는 본 발명의 공정이 아라비카 및 로부스타 커피콩으로부터 쓴맛 같은 맛의 결함을 제거하고, 그들의 향미와 가치를 향상시킴을 보여준다. 본 발명의 공정은 로부스타 또는 아라비카 콩 중 어느 하나를 사용하여 더 달콤하고, 더 감칠맛이 나고 더 복합적인 맛을 내는 커피를 유발한다.
맛 비교 4 카카오 콩
실시예 6의 방법에 의해 제조된 카카오 콩은 초콜릿으로 가공되고 실시예 6의 공정에 따르지 않은 콩으로 만든 초콜릿과 비교하여 맛보았다. 테이스터는 균사체화된 콩으로 제조된 초콜릿이 미처리된 카카오 콩으로 제조된 초콜릿과 비교하여 덜 쓰고, 덜 불쾌하고, 및/또는 신맛과 향기뿐 아니라 풍부하고, 부드럽고, 및 달콤한 향기와 맛을 가지고 있다고 말하였다. 테이스터는 미처리된 카카오 콩으로 제조된 초콜릿과 비교하여 매우 맛이 좋은 초콜릿을 만들기 위해서는 유제품과 같이 적은 설탕 및/또는 다른 감미료가 불가피하다고 말하였다.

Claims (28)

  1. a) 살균된 카카오 콩을 제공하고,
    b) 심부 액체 조직 배양으로 제조된 곰팡이 균주 배양액을 제공하며,
    c) 상기 곰팡이 균주 배양액을 살균된 카카오 콩에 접종하고, 및
    d) 살균된 카카오 콩과 상기 곰팡이 균주 배양액을 배양하고, 균사체가 형성되어(myceliation) 균사체화된 카카오 산물을 형성하도록 하는 것을 포함하며,
    상기 균사체화된 카카오 산물은 사람 소비를 위한 카카오 산물을 제조하는데 사용될 수 있고,
    상기 곰팡이 균주 배양액의 제조에 사용하는 곰팡이 균주는 가노데르마 루시덤(G. lucidum), 헤리시움 에리나세우스(H. erinaceus), 트라메테스 베르시콜로르(T. versicolor), 렌티눌라 에도데스(L. edodes), 트리콜로마 마쮸타케(T. matsutake), 플람물리나 벨루티페스(F. velutipes), 아가리쿠스 블라제이(A. blazei), 그리폴라 프론도사(G. frondosa), 폴리오타 나메코(P. nameko), 라리시포메스 오피시날리스(L. officinalis), 모첼라 호르텐시스(M. hortensis), 모첼라 안구스티셉스(M. angusticeps), 아우리쿨라리아 아우리쿨라(A. auricula), 투레멜라 푸시포미스(T. fuciformis), 이노노투스 오블리쿠스(I. obliquus), 포메스 포멘타리우스(F. fomentarius), 엘 설푸레우스(L. sulfureus), 코디셉스 시넨시스(C. sinensis) 및 그것의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는, 균사체화된 카카오 산물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    살균된 카카오 콩을 제공하는 단계는 카카오 콩을 수화시키는 것을 더 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    카카오 콩은 60% 수분 수준 또는 30% 수분 수준으로 수화되는, 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    곰팡이 균주는 가노데르마 루시덤(G. lucidum)인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    곰팡이 균주는 가노데르마 루시덤(G. lucidum) 균주 806인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    곰팡이 균주는 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)인, 방법.
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  15. 제1항에 있어서,
    곰팡이 균주는 수용성 카카오 콩 추출물 및 에너지원을 함유하는 배양 배지에서 곰팡이 균주를 유지하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되어 사용되는, 방법.
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  17. 삭제
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  19. 제1항에 있어서,
    배양 단계는 7일 동안 수행하는, 방법.
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  23. 제1항의 방법에 따라 제조된 균사체화된 카카오 산물.
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