CN105682480B - 菌丝体化产品与由可可及其他农业底物制备菌丝体化产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于制备菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品的方法。该方法提供可可豆或其他农业底物且将可可豆或其他农业底物灭菌，以提供制备的可可豆或其他农业底物，以及用制备的真菌组分接种制备的可可豆或其他农业底物，并且培养接种物以制备菌丝体化产品的步骤。本发明的方法导致相对于起始可可豆或其他农业底物，制备的可可豆或其他农业底物具有降低水平的不期望的味道组分例如可可碱或2‑甲氧基‑3‑异丙基吡嗪，以及增加水平的菌丝体化产物例如β葡聚糖、吡嗪和多糖。

Description

菌丝体化产品与由可可及其他农业底物制备菌丝体化产品的 方法

相关申请的交叉引用

于2013年3月15日提交且名称为“Myceliated Agricultural Substrates forProduction of Nutraceutical Formulations and Functional Foods”的美国临时申请号61/802,256；于2013年3月15日提交且名称为“A Method for Myceliating Coffee(amended)”的美国专利申请号13/844,685；于2013年4月9日提交且名称为“Method ofMyceliation of Agricultural Substrates for Producing Functional Foods andNutraceuticals”的美国专利申请号13/859,719；于2013年5月1日提交且名称为“Extractof a Myceliated Agricultural Substrate and it's Use as a NutraceuticalComposition”的美国专利申请号13/874,832；于2013年7月10日提交且名称为“Method forManufacturing Coffee by Fermentation”的美国临时申请号61/844,498；于2013年7月23日提交且名称为“Coffee Decafeination Process Including Fungal Components”的美国临时申请号61/396,863；于2013年8月15日提交且名称为“Cocao Beans IncludingMetaboloites of 2-Methoxy-3-Isopropylpyrazine and Method for Metabolizing 2-Methoxy-3-Isopropylpyrazine in Cocao Beans”的美国临时申请号61/866,371；于2013年8月19日提交且名称为“Cocao Beans including Methyl Pyrazines Produced byFermenation，and a Method of Increasing Methyl Pyrazines in Cocao”的美国临时申请号61/867,501；于2013年9月6日提交且名称为“Improved Method for Myceliating RawCoffee Beans Including Removal of Chlorogenic Acids”的美国专利申请号14/020,512；于2013年9月6日提交且名称为“Method for Myceliating Raw Coffee BeansIncluding Removal of Chlorogenic Acids”的美国专利申请号14/020,781；于2013年9月15日提交且名称为“Myceliating Green Coffee Beans to Lessen the Tooth-StainingImpact of Coffee Melanoidins”的美国临时申请号61/878,037；和于2013年10月27日提交且名称为“Cocao Myceliation in an Aqueous Solution”的美国临时申请号61/896,097；所述专利全部整体引入本文作为参考。

技术领域

该方法和产品涉及使用真菌菌株来改善农业底物特别是可可及其他农业底物中的风味。

背景技术

全世界大多数的可可生长于跨越赤道北纬和南纬20度的地带，因为可可树需要潮湿炎热的热带环境，在其中生长且结出含有可可豆的健康的可可豆荚。当成熟时收获，平均可可豆荚产生在粘滑果肉中乳化(emulsed)的20至50粒可可豆。一般地，可可豆荚通过将豆荚发酵四至七天(以去除果肉)制备用于销售，并且使豆干燥另外五至十四天。存在约20个不同的可可品种和数百个杂交种。在这些中，四个主要类型的可可在商业巧克力市场中是常见的。弗拉斯特奥(Forastero)可可占全世界可可市场的大约95％。克里奥罗(Criollo)可可占全球市场的约7％，并且表征为出色的美味可可，其比弗拉斯特罗可可更难以栽培。特立尼达里奥(Trinitario)可可是弗拉斯特奥/克里奥罗杂交种，其在特立尼达良好生长。那斯努(Nacional)可可由于具有低苦味和甜美的花香而珍贵，但难以在商业上栽培。全世界的大多数可可在象牙海岸生产。这个体积代表超过1百万吨/年。加纳、印度尼西亚、喀麦隆、巴西和尼日利亚同样生产大量可可。可可通常以巧克力的形式被全世界消费，所述巧克力是可可与甜味剂及其他组分的混合物。

用过热蒸汽处理可可豆以减轻细菌含量是常见的。认为用饱和蒸汽处理可可豆还去除一些期望的风味组分。将糖及其他甜味剂与可可粉混合，以形成好味道的巧克力。通常添加其他香料。目前虽然确认可可的健康利益，但许多健康倡导者警告过度使用甜味剂包括糖和人工甜味剂的危险。

需要的是制造可可的方法，其实现美味的产品，而无需过度甜化。还需要的是加工可可的方法，其保留期望的风味组分，同时使较不期望的风味组分降到最低。进一步地，期望依赖天然过程来实现美味的产品。

本领域存在关于改善的菌丝体化(myceliated)产品和获得此类产品的方法的需要，相对于可可豆或其他农业底物，所述改善的菌丝体化产品具有降低水平的不期望的味道组分和/或增加水平的风味和/或健康促进组分。

附图说明

图1是依照本发明制备生物可用的菌丝体产物的方法的流程图。

图2是依照本发明制备菌丝体化农产品的提取物的方法的流程图，所述菌丝体化农产品的提取物用于人消费以实现在人中的神经再生和神经保护。

图3是根据本发明从可可豆或其他农业底物中去除咖啡因的方法的流程图。

图4是制备菌丝体化的咖啡产品的方法的流程图。

图5是制备菌丝体化的咖啡产品的方法的流程图。

图6是依照本发明使用的输送机。

图7是依照本发明使用以将容器递送至高压灭菌器的输送机。

图8(A)、8(B)、8(C)显示了具有凹凸不平表面的高压灭菌袋、一叠可高压灭菌袋和成卷高压灭菌材料。

图9是制备菌丝体化的可可产品的方法的流程图。

图10是制备菌丝体化的可可产品的方法的流程图。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备菌丝体化的可可或其他农业底物产品的方法。该方法包括提供制备的可可豆或其他农业底物的步骤，其包括提供可可豆或其他农业底物且将可可豆或其他农业底物灭菌，以提供制备的可可豆或其他农业底物。该方法还包括提供制备的真菌组分的步骤。该方法还包括用制备的真菌组分接种制备的可可豆或其他农业底物，并且培养接种物以制备菌丝体化的可可或其他农业底物产品。

在一个实施方案中，该方法包括降低不期望的味道组分的量。降低不期望的味道组分的量任选包括可可豆或其他农业底物的至少一次或两次水提取。不期望的味道组分包括甲基黄嘌呤例如可可碱和/或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪。

在一个实施方案中，该方法包括将可可豆或其他农业底物任选水合至约60％的步骤。本发明的方法还包括其中制备的真菌组分是灵芝(G.lucidum)任选灵芝菌株806、冬虫夏草(C.sinensis)和/或黑孢块菌(T.melanosporum)。本发明的方法包括筛选多个真菌菌株，并且选择具有增强的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或利用可可豆或其他农业底物的能力的菌株，和/或选择能够增强一种或多种不期望的味道组分从可可豆或其他农业底物中去除、和/或增强咖啡因从可可豆或其他农业底物中去除的菌株。

在另一个实施方案中，制备的真菌组分维持在包含可可豆或其他农业底物水提取物和能量来源的非限定型(undefined)培养基上，或可替代地，培养基包含2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和/或甲基黄嘌呤例如可可碱。真菌菌株的维持促使真菌适应，导致真菌在可可豆或其他农业底物和/或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和/或甲基黄嘌呤例如可可碱上生长、代谢或利用可可豆或其他农业底物和/或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和/或甲基黄嘌呤例如可可碱的能力增强。

本发明方法还包括其中培养步骤是在半厌氧条件下进行的发酵步骤，任选共约7天。

本发明的方法导致菌丝体化的咖啡产品，相对于可可豆或其他农业底物，所述菌丝体化的咖啡产品具有降低水平的不期望的味道组分例如2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和/或甲基黄嘌呤例如可可碱，以及增加水平的菌丝体化产物例如β葡聚糖、吡嗪和多糖。

本发明包括通过本发明的方法制备的菌丝体化产品和可可豆或其他农业底物，以及相对于起始或未经处理的可可豆或其他农业底物，具有降低水平的不期望的味道组分以及增加水平的菌丝体化产物的菌丝体化的可可或其他农业产品。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备菌丝体化的可可(或其他农业底物)产品的方法。该方法包括提供制备的可可或其他农业底物的步骤，其包括提供可可或其他农业底物且将可可或其他农业底物灭菌，以提供制备的可可或其他农业底物。该方法还包括提供制备的真菌组分的步骤。该方法还包括用制备的真菌组分接种制备的可可或其他农业底物，并且培养制备的可可或其他农业底物和制备的真菌组分，以允许菌丝体化以产生菌丝体化的可可或其他农业底物产品。这些步骤可以以任何次序执行。

在一个实施方案中，提供了制备的可可或其他农业底物，其包括提供可可或其他农业底物的步骤。

一种农业底物包括可可豆或其他农业底物。咖啡指其为有花植物属的咖啡属(Coffea)，其种子不同地被称为咖啡豆或绿咖啡豆，用于制备咖啡。它是茜草科(Rubiaceae)的成员。咖啡豆可以选自几个咖啡品种之一，其是通过咖啡植物的选择育种或自然选择衍生的不同栽培品种。在不同地区生长的相同品种的咖啡豆可以具有独特特征，例如风味(风味标准包括术语例如“酸味”、“柑橘样”或“土臭味”)、咖啡因含量、醇度或口感和酸度。用于本发明的可可豆或其他农业底物可以是任何咖啡物种，包括阿拉比卡种咖啡和罗布斯塔种咖啡(也称为卡尼弗拉种咖啡(Coffea conephora))；用于本发明的另外的咖啡物种包括本伽兰西斯种咖啡(Coffea benghalensis)或孟加拉咖啡；康金西斯种咖啡(Coffea congensis)或刚果咖啡；利比里亚种咖啡(Coffea liberica)或利比里亚咖啡；思迪诺菲拉种咖啡(Coffea stenophylla)或窄叶咖啡；艾克赛尔萨种咖啡(Coffeaexcelsia)，另一种利比里亚咖啡；Coffea bonnieri；Coffea gallienii；和Coffeamogeneti。本发明包括上文列出的物种的任何品种或品系。例如，许多阿拉比卡品种以它们在其中占优势地发现或它们在其中起源的国家或地区命名。阿拉比卡咖啡的一些示例性品种包括蒂皮卡、波旁、卡杜拉、卡杜艾、新世界和蓝山。在本发明中还包括的是咖啡的衍生物种，包括任何遗传修饰的(GMO)品系或栽培品种，以及咖啡的任何原生品种(heirloomvariety)(非GMO)品系或栽培品种。

一种农业底物是可可豆。可可(Theobroma cacao)下文“可可(cacao)”或“可可子(cacao)”，属于在锦葵科(Malvaceae)的梧桐亚科(Sterculioidea)下分类的可可属(Theobroma)。存在约20个不同的可可品种和数百个杂交种，并且全部适用于本发明，例如，合适的可可豆是弗拉斯特奥可可、克里奥罗可可、特立尼达里奥可可和那斯努可可。当可可豆荚成熟时，已收获适合于本发明的可可(或可可子)豆。平均可可豆荚产生在粘滑果肉中乳化的20至50粒可可豆。一般地，可可豆荚通过将豆荚发酵四至七天(以去除果肉)制备用于销售，并且使豆干燥另外五至十四天。干燥的豆适合于本发明。

原始可可豆具有大量天然存在的细菌及其他微生物。用过热蒸汽处理可可豆以减轻细菌含量是常见的。认为用饱和蒸汽处理可可豆还去除一些期望的风味组分。过热蒸汽处理的可可豆也适合于本发明。

可以依照本发明菌丝体化的农业底物包括：所有谷物、谷粒、所有种类的小麦、黑麦、糙米、白米、红米、金稻、野生稻、稻、大麦、黑小麦、稻、高粱、燕麦、粟、藜麦、荞麦、福尼奥米、苋菜、埃塞俄比亚画眉草和杜伦麦；苹果和梨、杏、樱桃、杏仁、桃、草莓、葡萄干、木薯、可可、香蕉、茜草属(Rubiaceae sp.)(咖啡)、柠檬、橙和葡萄柚；番茄、马铃薯、辣椒、茄子、多香果、芒果粉、当归属(Angelica)、大茴香(茴香(Pimpinella anisum))、茴香桃金娘(茴香香桃叶(Syzygium anisatum))、胭脂树(红木(Bixa orellana))、苹果薄荷(毛茸薄荷(Mentha suaveolens))、艾(Artemisia vulgaris)、艾属(Mugwort)、阿魏((阿魏(Ferulaassafoetida))、小檗属(Berberis)、香蕉、罗勒属(Basil)(罗勒(Ocimum basilicum))、月桂叶、蓼属(Bistort)(椭圆叶蓼(Persicaria bistorta))、黑豆蔻、黑小茴香、黑醋栗、黑酸橙、墨角藻(墨角藻(Fucus vesiculosus))、蓝升麻、蓝叶马利(桉树(Eucalyptuspolybractea))、沼泽拉布拉多茶(加茶杜香(Rhododendron groenlandicum))、波耳多叶(波耳多树(Peumus boldus))、玻利维亚芫荽(玻利维亚香菜(Porophyllum ruderale))、琉璃苣(琉璃苣(Borago officinalis))、省藤属(Calamus)、金盏花属(Calendula)、非洲防已根(Jateorhiza calumba)、洋甘菊、大麻属(Cannabis)、续随子(刺山柑(Capparisspinosa))、葛缕子、小豆蔻、角豆荚、决明属(Cassia)、木麻黄属(Casuarina)、荆芥属(Catnip)、猫爪草、猫儿菊属(Catsear)、辣椒、灯油藤(Celastrus paniculatus)、紫草、香芹盐、芹菜籽、矢车菊、细叶芹(茴香芹(Anthriscus cerefolium))、繁缕、菊苣、红辣椒、辣椒粉、金鸡纳属(Cinchona)、细香葱(虾夷葱(Allium schoenoprasum))、香芹根(香根芹(Myrrhis odorata))、香菜(见芫荽)(芫荽(Coriandrum sativum))、肉桂(和桂皮)、肉桂桃金娘(Cinnamon Myrtle)(柠檬香桃木(Backhousia myrtifolia))、鼠尾草属(Clary)、猪殃殃、三叶草、丁香、咖啡、款冬属(Coltsfoot)、紫草、普通芸香、牛奶菜属(Condurango)、黄连属(Coptis)、芫荽、艾菊(艾菊(Tanacetum balsamita))、茅草、峨参(峨参(Anthriscussylvestris))、西洋樱草、荚蒾皮(欧洲荚蒾(Viburnum opulus))、水芹、古巴牛至(到手香(Plectranthus amboinicus))、鼠麴草、小茴香、咖喱叶(调料九里香(Murrayakoenigii))、达米阿那(达米阿那(Turnera aphrodisiaca))、蒲公英(西洋蒲公英(Taraxacum officinale))、镇痛(Demulcent)、恶魔之爪(魔鬼爪(Harpagophytumprocumbens))、莳萝籽、莳萝(莳萝(Anethum graveolens))、多里高辣椒(Tasmanniastipitata)、紫锥花属(Echinacea)、刺人参(Echinopanax Elatum)、雪绒花、接骨木果、接骨木花、土木香、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、土荆芥(土荆芥(Chenopodiumambrosioides))、麻黄属(Ephedra)、刺芹(Eryngium foetidum)、桉树属(Eucalyptus)、茴香(茴香(Foeniculum vulgare))、葫芦巴、小白菊、玄参、五香粉(中国)、何首乌(Fo‐ti‐tieng)、延胡索属(Fumitory)、高良姜、葛拉姆马萨拉、独行菜、韭菜、大蒜、生姜(姜(Zingiber officinale))、银杏、人参、人参、西伯利亚(刺五加)、山羊豆(山羊豆(Galegaofficinalis))、Goada马萨拉、一枝黄、金印草、积雪草、天堂之谷(天堂椒(Aframomummelegueta))、Grains of Selim(Xylopia aethiopica)、葡萄籽提取物、绿茶、欧亚活血丹、瓜柯、欧地笋、山楂(辽宁山楂(Crataegus sanguinea))、山楂树、大麻、普罗旺斯香草、木槿鼠(Hibiscus)、冬青、圣蓟、啤酒花、苦薄荷、山葵、马尾(木贼(Equisetum telmateia))、牛膝草(牛膝草(Hyssopus officinalis))、泻根、茉莉、茉莉珍珠(Jasmin pearl)、绞股蓝(绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum))、乔派伊杂草(紫苞佩兰)、药喇叭(John theConqueror)、刺柏属(Juniper)、青柠叶(箭叶橙(Citrus hystrix)、C.papedia)、Kaala马萨拉、紫菀科植物(Knotweed)、柯卡姆、拉布拉多茶、篷子菜(Lady's Bedstraw)、斗篷草、陆生水芹、薰衣草(薰衣草(Lavandula)属)、杜香属(Ledum)、香蜂草(香蜂草(Melissaofficinalis))、柠檬罗勒、柠檬草(香茅(Cymbopogon citratus)、曲序香茅(C.flexuosus)及其他物种)、柠檬铁皮桉(Lemon Ironbark)(尾叶桉(Eucalyptus staigeriana))、柠檬薄荷、柠檬香桃木(柠檬香桃(Backhousia citriodora))、柠檬百里香、柠檬马鞭草(柠檬过江籐(Lippia citriodora))、甘草-红景天、菩提花、紫苏草(Limnophila aromatica)、亚麻子、甘草、荜茇、拉维纪草(欧当归(Levisticum officinale))、罗汉果、肉豆蔻、Mahlab、三条筋树叶、Manchurian Thorn Tree(龙牙楤木(Aralia manchurica))、曼德拉草、马郁兰(墨角兰(Origanum majorana))、欧夏至草、沼泽拉布拉多茶、药属葵、乳香、绣线菊属(Meadowsweet)、Mei Yen、Melegueta辣椒(天堂椒)、薄荷、奶蓟(水飞蓟属(Silybum))、佛手柑(管蜂香草(Monarda didyma))、益母草、山黄芩、毛蕊花属(Mullein)(毛蕊花(Verbascumthapsus))、芥属(Mustard)、芥菜籽、Nashia inaguensis、苦楝、假荆芥属(Nepeta)、荨麻、黑种草、黑色小茴香(Kolanji)、黑葛缕子、诺丽果、肉豆蔻核仁、肉豆蔻、大麻、月见草属(Oenothera)(月见草(Oenothera biennis))、Olida(尤加利(Eucalyptus olida))、牛至(牛至(Origanum vulgare)、O.heracleoticum)、鸢尾根、香根芹属、橄榄叶(在茶叶中使用且用作草药补充物)、花旗参(Panax quinquefolius)、香兰叶、红椒、欧芹(欧芹(Petroselinum crispum))、西番莲、广藿香、薄荷类、辣椒(黑色、白色、绿色)、薄荷、杏仁桉(宽叶桉(Eucalyptus dives))、紫苏属(Perilla)、车前草、石榴、Ponch phoran、罂粟籽、报春花(报春花属(Primula))、冰糖花(candied flower)、干茶混合物、车前草、马齿苋、苦木、四香(Quatre epices)、熊葱、覆盆子、覆盆子(叶)、灵芝、芒柄花属(Restharrow)、红景天(Rhodiola rosea)、番樱桃(小叶番樱桃(Syzygium luehmannii))、芝麻菜/芝麻菜、罗马甘菊、南非茶、玫瑰果、迷迭香(迷迭香(Rosmarinus officinalis))、罗文浆果(RowanBerries)、芸香、红花、番红花、鼠尾草(药鼠尾草(Salvia officinalis))、西贡肉桂、圣约翰草、小地榆(小地榆(Sanguisorba minor)或Poterium sanguisorba)、鼠尾草属(Salvia)、花椒(山椒)、檫木属(Sassafras)、香薄荷(夏香薄荷(Satureja hortensis)、冬香薄荷(S.montana))、五味子属(Schisandra)(五味子(Schisandra chinensis))、哥斯达黎加黄(Scutellaria costaricana)、番泻叶(草药)、钝叶决明(Senna obtusifolia)、芝麻、酸模、荠菜、催涎剂(Sialagogue)、西伯利亚人参(刺五加)、罗汉果(Siraitiagrosvenorii)(罗汉果)、黄芩、黑刺李果、涂抹棒(Smudge Stick)、苦苣菜属(Sonchus)、酸模(酸模属(Rumex)物种)、青蒿、留兰香、婆婆纳、海葱、八角茴香、甜叶菊、草莓叶、巴西人参(巴西人参(Pfaffia paniculata))、漆树、夏香薄荷、纸荚豆(Sutherlandia frutescens)、甜草、香根芹属(香没药(Myrrhis odorata))、香车前草、川椒(川椒(Xanthoxylumpiperitum))、胶杨、罗望子、唐杜里马萨拉(Tandoori masala)、艾菊、龙蒿(龙蒿(Artemisia dracunculus))、茶、狭叶香(Teucrium polium)、泰国罗勒、蓟、百里香、ToorDaIl、直立委陵菜、蒺藜(Tribulus terrestris)、圣罗勒(圣罗勒(Ocimum tenuiflorum))、姜黄(姜黄(Curcuma longa))、熊果(Uva Ursi)也被称为熊果、香草(香荚兰(Vanillaplanifolia))、鸭嘴花、马鞭草、岩兰草、越南香菜(越南香菜(Persicaria odorata))、芥末(山嵛菜(Wasabia japonica))、西洋菜、金合欢籽、野生姜、野莴苣、野生百里香、冬香薄荷、金缕梅、枸杞、水杨梅、水苏、车叶草、苦艾、蓍草、印度薄荷、育亨宾树、育亨宾、Za'atar、蓬莪术、及其在水或半水溶液中的衍生物。

水合和洗涤步骤

在一个实施方案中，可可豆或其他农业底物制备用于本发明的方法中，导致制备的可可豆或其他农业底物。

在一些实施方案中，可可豆或其他农业底物在用于本发明的过程中之前并非干燥的。在该实施方案中，在收获可可豆或其他农业底物后，可可豆或其他农业底物任选已通过本领域已知的任何过程例如发酵去除果肉(分离果肉)，并且随后可可豆或其他农业底物可以用于本发明中，而无需进一步的可可豆或其他农业底物处理例如干燥。果肉还可以被保留。一般地，在发酵(分离果肉)步骤后，可可豆具有约55％至60％的含水量。在该实施方案中，如下所述的水合和/或洗涤步骤是不需要的或通过使用未干燥的可可豆或其他农业底物被避免。在一些实施方案中，如本文描述的，可可豆或其他农业底物可以部分干燥且随后水合。

在一些实施方案中，可可豆或其他农业底物通过使可可豆或其他农业底物水合的步骤进行制备。当可可豆或其他农业底物已干燥时，水合是特别有用的。水合确保底物具有用于培养(菌丝体化)过程的最佳含水量。水合可以通过本领域已知的许多方法来完成。

水合可以通过水介质来完成。水介质包括水和任选的另外赋形剂。水可以是但不限于去离子水、自来水、蒸馏水或矿化水。其他赋形剂可以加入水例如缓冲液中，以维持一定pH，氯化钠、柠檬酸和/或抗坏血酸。pH可以是中性的或调整的。水介质的温度可以是室温，或在温度中是升高的以加速水合过程。

水合可以通过允许可可豆或其他农业底物在水介质中浸泡任何适当的时间长度来完成，所述时间长度范围为数秒或更少至过夜。可可豆例如有较强的吸湿性且需要较少时间水合。用于水合和/或水提取步骤的浸泡步骤可以是小于一秒、至少五秒、至少十秒、至少三十秒、至少一分钟、至少五分钟、至少十分钟、至少二十分钟、至少三十分钟、至少四十分钟、至少五十分钟、至少一小时、至少一个半小时、至少两小时、至少两个半小时、至少三小时、至少四小时、至少五小时、至少六小时、至少七小时、至少八小时、至少十小时、至少十二小时或至少十五小时、至少十八小时、至少二十四小时、至少三十六小时、或至少四十八小时。然而，水合步骤的时间应考虑到下述事实加以选择：可可豆或其他农业底物不是无菌的，且浸泡太长时间可能促进不期望的生物生长。水合时间应选择为优化底物含水量和可可豆或其他农业底物的分子组成成分。

可可豆或其他农业底物可以在允许有效水合的任何温度下水合；在一个实施方案中，水性组分温度的温度是室温。水合温度应考虑到下述事实加以选择：在高温下，期望的风味组分可能改变。

水合可以在正常大气压下进行，或可以在增加压力下进行，以加速水合过程和/或水提取过程，例如1大气压至2大气压，例如在1.5大气压下。

水合可可豆或其他农业底物的含水量任选为约20％至约80％含水量、40％至70％含水量。在一个实施方案中，含水量为至少约30％、至少约50％或至少约60％。在一个实施方案中，对于可可豆，含水量为至少约36％。

水合步骤可以通过本领域已知的任何方法在容器中发生。在一个实施方案中，容器是桶(drum)例如55加仑桶或5加仑水桶。在该实施方案中，允许体积1:1(等体积)比的可可豆或其他农业底物:水性组分静置5分钟–24小时。例如，将55加仑桶或5加仑水桶用可可豆或其他农业底物装到半满，并且加入水介质以淹没可可豆或其他农业底物。在该实施方案中，可可豆或其他农业底物可以吸收全部的水性组分。在另一个实施方案中，容器中容纳的可可豆或其他农业底物可以装满水以完全浸没豆，在一个实施方案中，没有显著过量。

在一个实施方案中，提供制备的可可豆或其他农业底物的步骤任选包括通过洗涤或冲洗可可豆或其他农业底物而去除不期望的味道组分的步骤。洗涤或冲洗可以是如上所述的水介质。在一个实施方案中，可可豆或其他农业底物任选在任选的水合步骤之前、期间或之后进行洗涤或冲洗。洗涤、排水和/或冲洗可可豆或其他农业底物可以通过本领域已知的任何方法来进行。可可豆或其他农业底物可以洗涤一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少十次、至少十五次、至少二十次、至少五十次或更多次。在一个实施方案中，洗涤步骤进行两次。洗涤或冲洗步骤可以包括如本文描述的任选的浸泡时间。

在一个实施方案中，可可豆或其他农业底物通过下述方法进行洗涤：将容纳可可豆或其他农业底物的容器装满水，以淹没可可或其他农业底物，允许水浸泡10秒至4小时，将水排掉且根据需要将步骤重复多次，或使豆提高至所需水分水平。洗涤或冲洗步骤还可以进行直至可可豆或其他农业底物已去除确定量的不期望的味道组分。

可可豆或其他农业底物可以在任何温度下进行洗涤，所述任何温度允许不期望的味道组分的有效提取；在一个实施方案中，水介质温度的温度是室温。洗涤温度应考虑到下述事实加以选择：在高温下，期望的风味组分可以被改变、破坏和/或提取。

在另一个实施方案中，在水合步骤后，从水合的可可豆或其他农业底物中去除和/或分开和/或排出过量的水介质或组分。该步骤还可以被称为水提取步骤。可以进行该步骤以去除不期望的味道组分。

咖啡的主要组分尤其包括咖啡因、矿物质、单宁酸、纤维素、水、脂肪、蛋白质和纤维。咖啡含有甲基黄嘌呤如咖啡因、茶碱和可可碱，以及其他种类的化合物例如黄酮类、酚类、酚酸、挥发性生物碱、非挥发性生物碱和绿原酸。烘焙咖啡同样含有一些不期望的味道组分。这些组分将促成咖啡的涩味和/或苦味感觉。可可豆也是苦味的，起因于化合物例如2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和甲基黄嘌呤例如可可碱。这些不期望的味道组分通常通过添加糖或奶油得到减轻，以掩蔽不期望的味道组分，这对使用者的饮食添加不必要的糖和脂肪。在更优质、昂贵的咖啡品种例如阿拉比卡咖啡中注意到降低的苦味和/或涩味。

水合步骤、水提取步骤、洗涤和/或冲洗步骤个别或组合地可以任选降低和/或去除来自可可豆或其他农业底物的不期望的味道组分，并且可以如本文描述的进行直至所需量的不期望的味道组分已从可可豆或其他农业底物中去除。

在一些实施方案中，不期望的味道组分被去除，并且包括其中5％的不期望的味道组分被去除的实施方案；在其他实施方案中，多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达35％、多达40％、多达45％、多达50％、多达55％、多达60％、多达65％、多达70％、多达75％、多达80％、多达85％、多达90％或多达95％的不期望的味道组分在本发明的过程包括冲洗步骤中被去除。在一些实施方案中，约25％至约80％的不期望的味道组分被去除。在一个实施方案中，约45-50％不期望的味道组分被去除。

在一些实施方案中，至少一种不期望的味道组分的去除程度的测定通过菌丝体化产品的外观、味道和/或化学组成(通过本领域已知的方法)进行测定。可替代地，可可豆或其他农业底物的外观或化学组成可以通过已知方法进行测定。这种测定可以是定量的，例如菌丝体化产品的化学组成可以通过测定方法进行测量，或通过经由技术人员的味道测试进行定性测定。

在一个实施方案中，多达5％的一种或多种不期望的味道组分被去除；在其他实施方案中，多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达35％、多达40％、多达45％、多达50％、多达55％、多达60％、多达65％、多达70％、多达75％、多达80％、多达85％、多达90％或多达95％的一种或多种不期望的味道组分在本发明的过程中被去除。在一个实施方案中，一种或多种不期望的味道组分被定量去除。

在一个实施方案中，期望的风味组分例如挥发性油的降低通过本发明的过程降到最低。在加工可可豆或其他农业底物中，本领域教导在烘焙之前将可可豆或其他农业底物蒸汽处理、蒸汽提取或汽提，其可以去除许多期望的挥发性油。本发明的过程避免蒸汽烘焙步骤，从而帮助保存促成可可风味的期望的挥发性油。

热处理

本发明的方法进一步任选包括热处理例如将可可豆或其他农业底物巴氏灭菌和/或灭菌的方法。在一个实施方案中，将可可豆或其他农业底物灭菌以提供制备的可可豆或其他农业底物。该步骤可以通过本领域已知的任何方法来完成。例如，该步骤可以在大气压或增加的压力下进行。该步骤还可以被称为“预加工”。进行该步骤以降低或去除可可豆或其他农业底物上的不期望的微生物或真菌生物污染物，特别是霉菌孢子。

用于巴氏灭菌和/或灭菌的方法可以如本领域已知的进行。作为巴氏灭菌的例子，可可豆或其他农业底物可以经历在大气压下在145°F至190°F下30至90分钟、可替代地在140°F至210°F下20-100分钟的干热处理。

可可豆或其他农业底物的灭菌可以如本领域已知的进行。例如，可可豆或其他农业底物可以通过下述进行灭菌：在以15磅/in²的压力下在121-122℃下加热20至100分钟，例如90分钟，并且对于超过海平面每1,000英尺增加3/4磅。在另一个实施方案中，将蒸汽过热至250-255°F。在一个实施方案中，将可可豆用略微干燥的饱和蒸汽以22psi在255°F下灭菌80分钟。可可豆或其他农业底物可以在容器中进行灭菌。容器可以任选为与用于水提取和/或水合步骤的容器相同的容器。容器可以任选进行密封，并且可可豆或其他农业底物可以通过对容器外部施加热进行灭菌。在一个实施方案中，热通过将蒸汽施加于容器的外部足够的时间段来提供，以允许内容物的灭菌。

一些实施方案的密封容器可以提供一些优点。例如，密封容器使风味组分和芳香组分从可可豆或其他农业底物的流出降到最低，其可以通过在灭菌过程期间来自高压锅或高压灭菌器的蒸汽缺乏咖啡芳香注意到。密封还阻止水溶性风味和芳香组分逸出可可豆或其他农业底物直接进入蒸汽、热空气或加热的水中。

合适的容器包括本领域已知的用于香菇培养的容器。任选地，容器可以具有用于交换空气或气体的区段，但不允许任何其他组分的经过。此类区段是本领域已知的并且包括过滤带。在一个实施方案中，容器是桶，例如55加仑桶。在一些实施方案中，本发明的容器可以是玻璃、碳和不锈钢桶、大玻璃瓶、或者聚丙烯袋或桶。发酵罐和生物反应器也可以用作本发明的容器。在一些实施方案中，容器具有用于气体交换的工具，其排除污染物的经过，例如过滤区带或阀。在一个实施方案中，容器是袋，例如具有过滤带的高压灭菌聚丙烯袋、以及具有过滤带的γ照射的聚乙烯袋。

上文描述的袋的进一步优点是在密封时，当在灭菌步骤期间进行增压时，它们符合可可豆或其他农业底物的形状。使袋符合可可豆或其他农业底物的形状抑制可可豆或其他农业底物相对于彼此的移动，使豆或底物表面的降解得到防止或降到最低。袋与可可豆或其他农业底物形状的这种符合还改善热传递，因为空气的缺乏防止可可豆或其他农业底物对热的空气绝缘。袋可以具有任何尺寸。在一个实施方案中，袋是细长或扁平的，以促进加热过程，例如长度可以为袋直径的三倍。这种尺寸还可以促进袋的有利堆叠或袋的放置用于灭菌。

待使用的袋的大小可以根据待通过本发明的方法处理的可可豆或其他农业底物的体积或量加以选择。每袋使用的可可豆或其他农业底物的示例性量包括1磅可可豆或其他农业底物至150磅可可豆或其他农业底物，尽管考虑了更大和更小量的可可豆或其他农业底物。

在另一个实施方案中，袋是扁平的，具有每个袋的外周边缘总和1/10或更少的厚度。袋可以是圆形的，具有限定每个袋的外周边缘的周长。可替代地，袋可以是矩形的，使得侧面的总和限定每个袋的外围边缘。袋可以是联合的，使得一系列矩形袋可以在生产环境中容易地进行处理。所有袋均具有可透气贴片(过滤带)，其提供厌氧环境的接近。在另外一个实施方案中，袋是扁平的以容纳小于三粒豆厚的一层豆。相应地，热快速穿透扁平袋至豆，以实现灭菌或巴氏灭菌。在该实施方案中，由于巴氏灭菌，袋符合可可豆或其他农业底物的形状，并且当施加压力时，这将获得在每个袋的外表面上的凹凸不平表面。凹凸不平的袋表面形成间隙空间，其允许热在堆叠的袋之间穿透，以加速灭菌或巴氏灭菌过程。袋的凹凸不平表面还诱导沿袋表面的流体紊流，以改善对可可豆或其他农业底物的热传递。

在另一个实施方案中，可可豆或其他农业底物真空包装在袋中，以消除可以从袋中抽取挥发性风味或芳香组分的空气。

在另一个实施方案中，袋替换为高压灭菌材料例如无BPA塑料片。一个基片沿输送机顶部连续分配，随后将可可豆或其他农业底物放在分配的基片上。将第二块顶片覆盖在可可豆或其他农业底物上且与基片密封。在顶片和底片之间施加真空以排空空气，随后将片在预定距离处密封以形成区段。每个区段容纳预定体积的可可豆或其他农业底物。区段被输送通过高压灭菌器或烘箱，以实现巴氏灭菌或灭菌过程。可以以蒸汽、压力下的热水、在片上的紊流或层流中的热空气或其他加热流体的形式，在增压或非增压环境中施加热。在该实施方案的变化中，将含有可可豆或其他农业底物的区段卷起且置于高压灭菌器中用于增压或灭菌。一个卷可以含有许多区段。

因为可可豆或其他农业底物引起在片外部上的凹凸不平表面，所以在片的外表面上存在间隙空间，以通过允许加热流体在片之间容易地穿透，促进巴氏灭菌或灭菌过程。凹凸不平的片表面还诱导流体紊流，其进一步改善对可可豆或其他农业底物的热传递。凹凸不平的表面抑制豆之间的相对运动，以确保可可豆或其他农业底物不开裂、破裂或摩擦。

真菌组分

与本发明一起使用的真菌组分可以是来自真菌门(Eumycota)的担子菌亚门(Basidiomycotina)的真菌，包括属于多孔菌科(Polyporaceae)和猴头菌科(Hericiaceae)的任何真菌，其中选自真菌门的担子菌亚门的真菌包括真菌门，包括选自担子菌亚门和子囊菌亚门(Ascomycotina)中的至少一种，包括下述菌株：猴头菇(Hericium erinaceus)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、金顶侧耳(Pleurotuscitrinopileatus)、红侧耳(Pleurotus djamor)、变色栓菌(Trametes versicolor)、香菇(Lentinula edodes)、蜜环菌(Armillariella mellea)、松口蘑(Tricholoma matsutake)、毛柄金钱菌(Flammulina velutipes)、草菇(Vovariella volvacea)、四孢蘑菇(Agaricuscampestris)、巴西蘑菇(Agaricus blazei)、灰树花(Grifola frondosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)、纹柄牛肝菌(Boletusornatipes)、灵芝、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)、药用拟层孔菌(Laricifomes officinalis)、Morchellahortensis、黑脉羊肚菌(Morchella angusticeps)、裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)、黑木耳(Auricularia auricula)、银耳(Tremella fuciformis)、桦褐孔菌(Inonotusobliquus)、木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)、硫磺多孔菌(Laetiporus sulphureus)、Bridgeoporus nobillismus、冬虫夏草、蛹虫草(Cordyceps militaris)、黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)、黑孢块菌、大块菌(Tuber magnatum)、猪苓(Polyporusumbellatus)。

一般地，本发明不考虑下述真菌的使用：华根霉(Rhizopus chinensis)、少孢根霉(R.oligosporus)、黄曲霉(Aspergillus flavusoryzae)、溜曲霉(A tamari)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、酱油曲霉(A.sojae)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、少孢酵母(S.exiguus)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、解脂假丝酵母(Saccharomycopisis(Candida)lipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)或热带假丝酵母(C.tropicalis)、Pichia saitoi、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、肋状拟内孢霉(Endomycopsis fibuliger)、子囊菌纲毛壳属(Ascomycete Chaetomium)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、总状毛霉(Mucor racemosus)、白地霉(Geotrichumcandidum)、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)、特异青霉(P.notatum)、灰黄青霉(P.griseofulvuum)、P.grisea、产黄青霉(P.chrysogenum)、娄地青霉(P.roqueforti)、纳地青霉(P.nalgiovense)、中间脉孢霉(Neurospora intermedia)、淀粉丝菌(Amylomycesrouxii)、伯顿拟内孢霉(Endomycopsis burtonii)、Psycilocibin、紫红曲霉(Monascuspurpureus)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、棉铃腐阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)、雪白弯颈霉(Tolypocladium niveum)、多孔木霉(T.inflatum)、链霉菌属(Streptomyces)、Neocosmospora、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、白僵菌属(Beauveria)、顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)、顶头孢霉、弗基克罗赤霉(Gibberella fujikuroi)、绯红色梭链孢菌(Fusidium coccineum)、红色红曲霉(Monascus ruber)、纺锤麦角菌(Claviceps fusiformis)、雀稗麦角菌(C.paspali)、紫麦角菌(C.purpurea)、毒蝇伞(Aminita muscaria)、或毒伞(A.phalloides)。

在本发明中有用的真菌组分可以通过如本文描述的方法进行制备。例如，在一个实施方案中，使用纯真菌菌株。在一些实施方案中，纯真菌菌株能够在制备的可可豆或其他农业底物上有效生长和/或使制备的可可豆或其他农业底物菌丝体化，以制备菌丝体化产品。本文鉴定的能够在制备的可可豆或其他农业底物上有效生长和/或使制备的可可豆或其他农业底物菌丝体化的任何真菌菌株均可用于本发明的方法。

在本发明中有用的真菌组分可以通过如本文描述的方法进行制备。例如，在一个实施方案中，使用纯真菌菌株。本发明的发明人惊讶地发现特定物种的一些真菌菌株具有增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分，和/或更好地耐受培养基中的可可豆或其他农业底物(或提取物)的存在的能力。在一个实施方案中，不期望的味道组分是甲基黄嘌呤例如可可碱和/或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪。在另一个实施方案中，真菌组分降低或去除来自可可豆或其他农业底物的咖啡因。

因此，本发明的方法具有选择真菌组分的方法作为任选的另外步骤，所述真菌组分具有增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分，和/或去除咖啡因，和/或更好地耐受培养基中的可可豆或其他农业底物(或提取物)的存在的能力。该方法包括筛选所需真菌物种的多个菌株，以选择合适的真菌组分(菌株)，其显示出增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分和/或咖啡因的能力，并且在本发明的方法中使用这种选择的菌株。

在一个实施方案中，合适的菌株生成围绕培养板上的菌落周边的咖啡物质的区别性暗环，显示菌株拒绝且主动排除咖啡的某些方面作为食物来源。不受理论束缚，环的暗色显示绿原酸被拒绝作为食物来源，并且从菌株中去除/挥发掉，和/或在真菌过度生长之前被消化。

在一个实施方案中，任何商购可得的灵芝的纯菌株用作真菌组分。虽然所有灵芝菌株均对于本发明有效，但惊讶地发现一些所选菌株具有增强的用于如本文描述的本发明的能力。对于本发明的真菌组分有用的一种此类菌株是由Pennsylvania StateUniversity(The Pennsylvania State University Mushroom Culture Collection，可得自College of Agriculture Sciences，Department of Plant Pathology andEnvironmental Microbiology，117 Buckhout Laboratory，The Pennsylvania StateUniversity，University Park，Pennsylvania，USA 16802.)商购可得的灵芝菌株806,(Alice Chen；Buffalo，NY；4/94)。这些选择的菌株如下文所述保藏于ATCC。

该菌株通过本发明人惊讶地确定为更有效地在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或耐受可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分包括绿原酸，和/或更好地耐受培养基中的可可豆或其他农业底物(或提取物)的存在。在另一个实施方案中，这种菌株可以去除和/或降低可可豆或其他农业底物中的咖啡因量。因此，在一个实施方案中，真菌组分是灵芝菌株806Alice Chen；Buffalo，NY；4/94。这些选择的菌株如下文所述保藏于ATCC。

在一个实施方案中，任何商购可得的冬虫夏草的纯菌株用作真菌组分。虽然所有冬虫夏草菌株均对于本发明有效，但惊讶地发现一些所选菌株具有增强的用于如本文描述的本发明的能力。对于本发明的真菌组分有用的一种此类菌株是由Pennsylvania StateUniversity(The Pennsylvania State University Mushroom Culture Collection，可得自College of Agriculture Sciences，Department of Plant Pathology andEnvironmental Microbiology，117 Buckhout Laboratory，The Pennsylvania StateUniversity，University Park，Pennsylvania，USA 16802.)商购可得的冬虫夏草(菌株1009 Caterpillar Fungus；Colorado Corp，1/2014)。

该菌株通过本发明人惊讶地确定为更有效地在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分包括甲基黄嘌呤例如可可碱和/或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪，和/或更好地耐受培养基中的可可豆或其他农业底物(或提取物)的存在。在另一个实施方案中，这种菌株可以去除和/或降低可可豆或其他农业底物中的咖啡因量。因此，在一个实施方案中，真菌组分是冬虫夏草(菌株1009 Caterpillar Fungus；Colorado Corp，1/2014)。这些选择的菌株如下文所述保藏于ATCC。

例如，对于猴头菇、变色栓菌、香菇、松口蘑、黑脉羊肚菌(M.angusticeps)、黑木耳、银耳、桦褐孔菌、木蹄层孔菌、硫磺多孔菌(或本文提及的任何真菌物种)类似选择的菌株通过筛选每个物种的多个菌株来获得，以选择合适的真菌组分(菌株)，其显示出增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分和/或咖啡因，和/或能够更好地耐受可可豆或其他农业底物的存在的能力，并且在本发明的方法中使用这种选择的菌株。因此，在一些实施方案中，猴头菇、变色栓菌、香菇、松口蘑、黑脉羊肚菌、黑木耳、银耳、桦褐孔菌、木蹄层孔菌、硫磺多孔菌(或本文提及的任何真菌物种)的所选菌株用于本发明的过程中。这些选择的菌株如下文所述保藏于ATCC。

在一个实施方案中，黑孢块菌的纯菌株是商购可得的。在另一个实施方案中，至少一种菌株由野生松露香菇生成，并且在本发明中用作真菌组分。尽管抗生素可以用于培养中，但发现当培养基缺乏抗生素时更旺盛生长的菌株。例如，可以通过在包含橡树叶和橡树枝的非限定型琼脂上培养，来生成包含对原始松露香菇母本的菌株的纯菌株。可以通过在包含橡树叶和橡树枝的非限定型琼脂上培养，来生成包含对原始松露香菇父本的菌株的纯菌株。可以通过在包含橡树叶和橡树枝的非限定型琼脂上培养，来生成包含栽培品种的菌株的纯菌株，所述栽培品种衍生自母本和父本交配型两者的无性遗传重组或菌丝融合。在一些实施方案中，使用的适当分离物(菌株)包括导致在菌丝体化的咖啡中让人联想到鲜花的令人愉快的可口芳香/味道(在一些实施方案中，通过如本文描述的对松露香菇的母本菌株达到)的分离物(菌株)，或导致让人联想到松露的令人愉快的可口芳香/味道(在一些实施方案中，如本文描述的，通过衍生自母本和父本交配型两者的无性遗传重组或菌丝融合的栽培品种实现)的分离物(菌株)。这些选择的菌株如下文所述保藏于ATCC。

在一个实施方案中，本发明的方法包括筛选如上所述产生的黑孢块菌的多个菌株，以选择合适的真菌组分，其显示出增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分和/或咖啡因，和/或能够更好地耐受可可豆或其他农业底物的存在的能力，并且在本发明的方法中使用这种选择的菌株。这些选择的菌株如本文所述保藏于ATCC。

本文提及的菌株由The Pennsylvania State University Mushroom CultureCollection，可得自College of Agriculture Sciences，Department of PlantPathology and Environmental Microbiology，117Buckhout Laboratory，ThePennsylvania State University，University Park，Pennsylvania，USA 16802.和FungiPerfecti，PO Box 7634，Olympia，WA 98507，USA可公开获得。

本文提及的所有菌株均根据布达佩斯条约的规定，保藏于在10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209USA的ATCC。保藏物将在专利颁发后不可撤销地且无限制地或无条件地提供给公众，并且根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约条款进行维持。这些保藏物仅为了方便本领域技术人员而进行，并非承认保藏物是根据35 U.S.C.§112所需的。然而，应当理解保藏物的可用性不构成许可实践本发明而减损由政府行为授予的专利权。保藏物将无限制地维持在ATCC保藏处，其是公共保藏处，时期为30年或最近请求后5年或专利的强行执行寿命，无论哪个更长，并且如果在该时期过程中曾经变得无法生存，则将被替换。

真菌组分的维持和适应

在本发明中有用的真菌组分可以通过如本文描述的方法进行制备。例如，在一个实施方案中，在用于接种可可豆或其他农业底物之前，真菌组分任选在包含可可豆或其他农业底物提取物的非限定型培养基上生长、维持和/或繁殖。在一个实施方案中，真菌组分以各种体积的固态、漂浮和淹没形态无限期地维持在包含可可豆或其他农业底物提取物的非限定型培养基上。

当农业底物是可可豆时，可可豆的提取物可以通过可可豆的风味组分替换或掺料，所述风味组分期望降到最低、进行代谢、得到降低或去除。例如，可以使用可可风味组分，例如2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和甲基黄嘌呤例如可可碱，其作为化学化合物商购获得，通过内嵌过滤注射器作为0.1M缓冲溶液加入培养基中。风味组分的相对比例可以在培养基中进行调整或平衡，以实现特异性风味谱目标。这种训练还可以用于训练真菌组分，使真菌组分适应，以产生期望组分例如吡嗪例如甲基吡嗪。

不受理论束缚，本发明人认为真菌组分在包含可可豆或其他农业底物的非限定型培养基上的维持在真菌组分的长期活力和健康中起重要作用。认为当使用包含可可豆或其他农业底物的非限定型培养基时，在琼脂和液体培养基的分批之间制备的永久和微妙的变化有效避免不期望的遗传漂变现象，所述遗传漂变现象随着时间过去对维持在相同(成分确定的)培养基上的真菌组分发生。

包含可可豆或其他农业底物提取物的非限定型培养基可以通过许多方法进行制备。在一个实施方案中，非限定型培养基包含纯的可可豆或其他农业底物水提取物。任选地，可以加入另外的能量来源。材料任选是有机的，并且水至少是RO过滤的。本发明人已惊讶地发现培养基可以包含可可或其他农业底物水提取物，而无需任何另外添加的赋形剂，例如另外的能量来源用于使本发明的真菌生长。

固体培养基包含含有可可豆或其他农业底物提取物的非限定型培养基。在一个实施方案中，包含可可豆或其他农业底物提取物琼脂培养基的非限定型培养基可以包含可可豆或其他农业底物的滤液，以使真菌生长用于使灭菌的可可豆或其他农业底物菌丝体化的最终目的。在一个实施方案中，0.1-100磅的可可豆或其他农业底物在0.1-100L水中分别为1分钟至12小时。滤液通过混合物的1-3次过滤进行收集，并且加入14-17g/L琼脂。基础提取溶液可以单独使用，或与植物提取物和/或另外的糖源例如果汁共混合。

这种基础溶液可以任选与非限定型植物(任何类型，但理想上是有机的)水提取物例如麦芽提取物、酵母提取物、马铃薯等的滤液混合。在一个实施方案中，植物是马铃薯。马铃薯水提取物可以通过下述进行制备：使1–300g马铃薯团块在沸水或增压水中软化，捣碎且通过1-3次过滤收集滤液。任选地，不添加糖的果汁也可以加入基础可可豆或其他农业底物琼脂培养基中。在一个实施方案中，培养基包含按重量计0.1-10％的麦芽提取物、按重量计0.1-10％的具有可可豆精华的非限定型植物提取物、按重量计0.1-10％的酵母提取物、按重量计0.1-10％的蛋白胨、按重量计0.1-10％的葡萄糖、按重量计20-80％的水、以及按重量计1-90％的完整可可豆或其他农业底物或者绿咖啡豆提取物。

作为培养基的非限制性例子，例如，粉末状或完整的2磅可可豆或其他农业底物可以在室温下与1/4加仑水混合。混合物可以是掺和的。随后允许混合物伴随振动提取20分钟，随后通过细网孔过滤三次。这种溶液可以单独使用，或与下述混合：将约5个有机马铃薯置于10L水中，并且高压灭菌20分钟以使马铃薯软化。随后将马铃薯用马铃薯捣碎机粉碎，并且随后通过细网孔过滤三次。可以加入1L商业不加糖的果汁。将马铃薯提取物加入可可提取物中且高压灭菌。

在另一个实施方案中，培养基可以包含巧克力浆，其可以通过本领域已知的方法进行制备，例如获得其为液体的细渣。浆可以使用纯的，或可以根据需要进行稀释。巧克力浆培养基应进行搅动。

一旦制备，培养基就可以通过本领域已知的任何方法进行灭菌。一旦培养基冷却，就可以将它倾入培养板内，并且如本领域已知的，在无菌操作从板到板繁殖真菌培养物。通过这种方法可以制备用于试管和烧瓶的斜面培养。培养板可以用漂浮和浸没(submerged)液体组织培养物、以及菌丝体化底物进行接种。

液体培养基非限定型培养基包含可可豆或其他农业底物提取物。可可豆或其他农业底物提取物和非限定型植物提取物如对于固体培养基所述的进行制备，除了不加入琼脂之外。如果准备制备漂浮培养物，则将1–10汤匙面粉加入混合物中，在一个实施方案中，加入约1汤匙/10-15L培养物。培养基可以通过本领域已知的方法进行灭菌。一旦冷却，就可以在无菌操作中用建群区段的培养板，从其他液体组织培养物或菌丝体化的底物样品接种器皿。

在一个实施方案中，用于接种到可可豆或其他农业底物内的真菌组分可以通过浸没液体组织培养进行制备，使用如本文描述的包含可可豆或其他农业底物提取物液体培养基的非限定型培养基，并且在振动台上搅动。在一个实施方案中，搅动速率为50-240rpm或85-95RPM，并且温育4-90天。在一个实施方案中，温育温度为87-89°F。

在一个实施方案中，真菌组分在其有效地在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修改可可豆或其他农业底物的能力方面进行训练和/或适应和/或维持。在一个实施方案中，真菌组分在其去除或降低来自可可豆或其他农业底物的一种或多种不期望的味道组分，或者去除或降低咖啡因量的能力方面进行选择和/或训练和/或适应和/或维持。测定不期望的味道组分和/或咖啡因是否已被降低或去除的方法已在本文中得到公开，并且也在本领域中发现。

在一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由消毒的野生和健康的真菌进行制备。通过这些方法发展选择或未选择的，相对于起始菌株具有改变、改善和适应特性的此类真菌。这些适应菌株如本文其他地方描述的保藏于ATCC。在一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由灵芝进行制备。在一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由灵芝菌株806 Alice Chen；Buffalo，NY；4/94进行制备。在另一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由冬虫夏草(菌株1009Caterpillar Fungus；Colorado Corp，1/2014)进行制备。在一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由猴头菇、变色栓菌、香菇、松口蘑、黑脉羊肚菌、黑木耳、银耳、桦褐孔菌、木蹄层孔菌、硫磺多孔菌进行制备。在一个实施方案中，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分由黑孢块菌的纯菌株进行制备，通过经由本文描述的方法培养松露香菇来获得。相对于起始菌株具有改变、改善和适应特性的这些菌株如本文描述的保藏于ATCC。

如本文描述的训练和/或适应和/或维持步骤可以任选在如本文定义的包含可可豆或其他农业底物提取物液体培养基或固体培养基的非限定型培养基上进行。在一个实施方案中，真菌可以在本领域已知用于培养真菌的任何温度例如87–89°F下培养4–90天。如本文描述的培养的真菌组分再接种到新鲜培养基内可以在如本领域技术人员确定的适当时间下进行，取决于生长率、生长周期和真菌组分的外观。在一些实施方案中，真菌组分生长和再接种到新鲜培养基内的循环进行超过一次、超过两次、超过三次、超过四次、超过五次、超过十次、超过十五次、超过二十次、超过二十五次、超过三十次、超过四十次、超过五十次、超过七十五次、或一百次或更多次。通过这些方法的真菌组分可以例如更好地识别作为能量来源的可可豆或其他农业底物或可可豆或其他农业底物的任何特定组分，更好地耐受培养基中的可可豆或其他农业底物提取物的存在(例如，如通过增强的生长率测量的)，更好地去除不期望的味道组分，或更好地去除咖啡因。在一个实施方案中，待去除和/或降低的不期望的味道组分是甲基黄嘌呤例如可可碱或2-甲氧基-3-异丙基吡嗪。

因此，本发明的方法具有制备被训练和/或适应和/或维持的真菌组分的方法作为任选的另外步骤，所述被训练和/或适应和/或维持的真菌组分包括具有增强和/或增加的在可可豆或其他农业底物上生长、代谢或以其他方式利用和/或修饰可可豆或其他农业底物，和/或从可可豆或其他农业底物中去除一种或多种不期望的味道组分，和/或去除咖啡因的能力的真菌组分。因此，被训练和/或适应和/或维持的真菌组分考虑用于本发明。本发明的方法进一步包括在本发明的方法中使用如本文描述的被训练、适应和/或维持的真菌组分中的任一种。

用于接种可可豆或其他农业底物的真菌组分的制备

在一个实施方案中，用于制备真菌组分以接种制备的可可豆或其他农业底物的方法包括在液体培养中按比例扩大如本文定义的真菌组分。准备用于接种制备的可可豆或其他农业底物的此类真菌组分被称为“制备的真菌组分”。

在一个实施方案中，制备的真菌组分在固体培养物中。在另一个实施方案中，制备的真菌组分在液体培养物中。在另一个实施方案中，制备的真菌组分是固体和液体培养物的混合物。液体培养物可以通过本领域已知的任何方法完成，并且包括生物反应器的使用。例如，当使用生物反应器制备真菌组分时，生物反应器可以通过用过滤的/RO水将包含可可豆或其他农业底物提取物液体培养基的非限定型培养基稀释多达1000x进行制备。在一个实施方案中，生物反应器的夹套可以是吹蒸汽的，以使培养基灭菌，或可替代地，培养基可以通过将蒸汽注入到器皿内的方式进行灭菌。

在制备真菌组分用于接种制备的可可豆或其他农业底物中使用的培养基可以是本领域已知的任何合适的培养基，或可以通过本文公开的方法进行制备。培养基可以进一步包含微量元素和有机物质例如水、核酸和矿物质。培养基可以用过滤的/RO水稀释多达1000x。稀释可以是1x、约2x、约3x、约4x、约5x、约6x、约7x、约8x、约9x、约10x、约15x、约20x、约25x、约30x、约35x、约40x、约45x、约50x、约55x、约60x、约65x、约70x、约80x、约90x、约100x、约150x、约200x、约250x、约300x、约350x、约400x、约450x、约500x、约550x、约600x、约650x、约700x、约750x、约800x、约850x、约900x、约950x或约1000x。在一些实施方案中，稀释是约5x至约100x。对于100L生物反应器，例如，培养基可以稀释约10x。

在一个实施方案中，为了接种反应器，可以通过灭菌的线用管道泵、或通过用空气压缩机将空气鼓泡到反应器内产生正压，从另一个反应器抽泵培养基，所述空气压缩机运行空气通过内嵌0.2/0.5微米囊式过滤器，并且随后通过具有特定开启压力例如2-3psi的止回阀。

接种生物反应器以制备真菌组分的方法包括使用无菌操作，或通过将漂浮或浸没液体组织培养物经由喷嘴倾入生物反应器内，用培养板的切除的建群区段和/或液体培养物的样品接种生物反应器。

任选地，真菌组分可以在培养期间通过本领域已知的方法进行搅动。例如，在生物反应器中，搅动可以通过鼓泡的空气和电动桨的组合来完成，其允许紊流环境和机械剪切力两者。非限制性地，本发明人已发现组合优于个别地运行任一方法，因为鼓泡的空气在培养物的顶部一半中产生最大紊流，而对底部影响较小，所述底部可以通过电动桨保持搅动，而桨无需以本领域通常使用的此类高RPM运行。组合产生恰当的小菌丝球体大小，而不损害菌丝体。

液态发酵搅动和旋流技术是本领域已知的，并且包括使用磁性搅拌棒的机械剪切、不锈钢叶轮、注入无菌高压的环境空气、在无菌培养基的高压下注入、和或使用振动台。与空气和培养基注入结合的更高的搅动和旋流速率产生小菌丝体球体。

真菌组分可以生长直至准备用于接种制备的可可豆或其他农业底物，如通过本领域技术人员测定的。在一些实施方案中，在用于接种可可豆或其他农业底物之前，真菌组分可以生长48小时。包含真菌组分的真菌培养物是否适合于接种制备的可可豆或其他农业底物的测定可以通过本领域技术人员进行测定。例如，在一个实施方案中，当在液体培养基中时，真菌培养物在处于早期或晚期指数生长期时适合于接种。衰老培养物和具有较少量的菌丝体/mL处于较早生长期中的培养物可以使用，但不是优选的。制备的真菌组分任选看起来在培养基中良好生长穿过，其中可见的菌丝体通过显微镜和无辅助察看生长穿过每mL可见。

为了实现可可豆或其他农业底物的最有效菌丝体化，真菌组分具有确定的菌丝球体大小，其允许在真菌菌株培养物的球形聚集物周围的三维中的菌丝生长。在一个实施方案中，菌丝球体大小为直径小于10mm、直径小于2mm、直径小于1mm、直径小于100微米、直径小于10微米、直径小于5微米、直径小于2微米、或直径小于1微米。在另一个实施方案中，菌丝球形聚集物具有直径5微米至1毫米的大小范围、或直径10-50微米的大小范围。

这些方法导致用于接种制备的可可豆或其他农业底物的制备的真菌组分。

制备的可可豆或其他农业底物的接种和菌丝体化

用制备的真菌组分接种制备的可可豆或其他农业底物。待使用的制备的真菌组分可以是如本发明中定义的任何真菌组分。制备的真菌组分接种到制备的可可豆或其他农业底物上可以通过本领域已知的任何方法进行。这个步骤可以不同地被称为培养步骤、发酵步骤和/或菌丝体化步骤。

菌丝体化可以在如本文描述的容器中发生。在一个实施方案中，菌丝体化在如本文描述的55加仑桶中发生。在该实施方案中，55加仑桶具有含有两个口的盖，并且一个口可以用作接种口，而另一个可以用于将滤过空气鼓泡到培养物的底部，并且同时充当通风孔。在一些实施方案中，接种口是快速断开插座，其在接种期间在收获线结束时附着至快速断开插头。任选地，在多个桶中的制备的可可豆或其他农业底物可以在一个循环中经由与生物反应器收获线连接的灭菌歧管进行菌丝体化，其中包括的下部构造立刻靶向单个或一起的任何桶。在一个实施方案中，使用用于体积一致的接种物分配/培养物的系统。

在一个实施方案中，培养物可以气动注入到包含制备的可可豆或其他农业底物的容器中。水分可以任选注入到袋内以优化菌丝体生长。在另一个实施方案中，通过手动或通过构建到发酵罐或生物反应器内的阀，将来自任何种类的液体组织培养物的培养物倾入容纳灭菌的可可豆或其他农业底物的容器内，来接种制备的可可豆或其他农业底物。

在一个实施方案中，在用制备的真菌组分接种之前，将制备的可可豆或其他农业底物冷却至80-100°F的温度。冷却可以通过冷藏或在室温下完成。使制备的可可豆或其他农业底物菌丝体化的步骤可以发生4至90天、约七天至二十一天，并且在一个实施方案中，约七天，并且在任何温度下例如在87–89°F下。真菌菌丝体通过发酵的菌丝体化通过有效控制环境光来进行，例如通过40％照明和60％黑暗的控制模型，以及通过扩增无菌气流和温度在86-88或87–89°F、或12至35℃、或24℃至32℃下。

该培养、菌丝体化和/或发酵步骤的相对湿度为20％-80％，在一些实施方案中，约60％。在一些实施方案中，相对湿度为至少约36-40％。

在一个可替代实施方案中，在添加真菌组分之前，制备可可豆用于液体菌丝体化(发酵)培养。将可可豆磨成细颗粒，优选地，直径小于1mm作为适当的粒度。在一个实施方案中，颗粒大小为20-50微米。随后将可可豆置于水溶液内，所述水溶液具有调节或调整的粘度以悬浮可可颗粒。优选地，水溶液具有适合可可粒度的粘度，以允许当搅动时可可颗粒悬浮于水溶液中。含有真菌组分和可可颗粒的水介质可以放置于任何大小的生物反应器中。优选地，生物反应器具有容纳至少10升水介质的大小。更优选地，生物反应器具有容纳几千升或更多的大小。

在一个实施方案中，搅动液体菌丝体化培养物。搅动工具进行调节以优化水溶液，以使真菌菌丝体的团块维持于小颗粒。优选地，真菌菌丝体具有大为直径1‐100微米的菌丝球体或聚集物。在另一个实施方案中，菌丝聚集物小于可可的粒度。

在液体菌丝体化培养物中，生物反应器维持在合适的温度和压力下，以允许菌丝体在兼性厌氧环境中消化可可的组分。在菌丝体已消化可可的组分以去除苦味风味组分后，将可可与水溶液分开。这可以通过中止搅动且允许可可沉淀来完成。这还可以通过从水溶液中过滤可可来完成。在可可从水溶液中取出后，它可以为加工作准备(包括使可可干燥成粉末)。任选进行第二步以在可可取出后提取水溶液。这种提取可以用于回收可可的水溶液风味组分。这些水溶性风味组分可以进行加工，并且可以作为粉末或水性喷雾或浴加回到可可中。可可粉是结果。根据需要添加补充风味，以进一步改善可可的风味。例如，甜味剂或可可风味提取物可以在过程中的这个关键时刻时加入。

相应地，可可准备成形为任何可可产品，即巧克力。

使制备的可可豆或其他农业底物菌丝体化的步骤优选在厌氧或半厌氧环境中完成。本领域已知的方法可以用于诱导和/或维持如通过巴斯德效应描述的，制备的真菌组分的兼性厌氧代谢活性。在一个可替代实施方案中，可可豆或其他农业底物从片中取出并且放置到无菌环境中的大不锈钢缸中。缸调节氧水平和温度，并且允许在制备的可可豆或其他农业底物上的兼性厌氧活性和菌丝体生长。兼性厌氧活性每单位时间代谢更多的纤维素，意指咖啡底物以比好氧环境中更快的速率被消耗。在一些情况下，菌丝体生长比好氧环境中快九倍(即，多九倍的纤维素分子被代谢为ATP)。另一个利益是厌氧环境抑制子实体生长。厌氧环境还确保不需要的细菌生长以及其他不需要的微生物生长的降低。

真菌菌丝体的扩增通过显微镜检查进行监控，并且通过摄影术记录生长时间表。

温育期越长，可可豆或其他农业底物的菌丝体干重生产越大且风味增强越大。一些菌株到30天时形成原基组织和子实体(猴头菇在培养中时特别易于具有子实体，灵芝和毛柄金钱菌也一样)。在一些实施方案中，在培养子实体组织之前进行菌丝体化的可可豆或其他农业底物的收获。然而，特定真菌的温育期延长不保证代谢产物的高生产或菌丝体和/或菌丝体化产物的累积。

何时收获菌丝体化产品的测定可以通过许多方法进行测定。收获一般伴随定时进行，以根据所需味道谱优化菌丝体化产品的味道谱。例如，菌丝体化培养物的气味谱可以通过受过训练的人员用于测定培养物何时准备好。培养物外观的测定也可以通过受过训练的人员完成。在一些实施方案中，每8磅可可豆或其他农业底物，当培养中的菌丝体量处于2-3块完全生长的(标准大小)培养板的近似量时(对于灵芝)，或当菌丝体的量处于10-12块完全生长标准培养板的近似量时(对于冬虫夏草)，可以完成收获。分析方法包括高效液相层析(HPLC)可以用于进行总生物分子的测量，以便测定最佳组成和培养条件以及用于收获真菌的适当时间。

在本发明的非限制性例子中，在如本文描述的密封容器中，用约25ml如本文描述的制备的真菌组分接种约8磅根据本发明的过程制备的可可豆或其他农业底物。获得降低的氧环境。允许菌丝体化或培养在87–89oF下进行七天，尽管少至四天或长达十六或更多天也是合适的。当观察者测定已获得关于菌丝体化产品的适当味道谱时，进行收获。

在菌丝体化期间不期望的味道组分的降低

可可豆及其他农业底物可以含有不期望的味道组分。此类不期望的味道组分可以是确定或不确定的。一种此类不期望的味道组分包括2-甲氧基-3-异丙基吡嗪。这种组分通过真菌组分代谢成多糖例如β1,3-葡聚糖和β1,6-葡聚糖。其他不期望的味道组分包括苦味组分。一种此类苦味组分是甲基黄嘌呤例如可可碱。使原料可可菌丝体化获得比未菌丝体化的原料可可更少苦味的可可豆。

可可的菌丝体化还促使豆的壳更容易筛掉用于加工可可豆中的优点。

培养或菌丝体化步骤还可以促使如本文描述的不期望的味道组分和/或咖啡因的降低和/或去除。在一些实施方案中，至少一种不期望的味道组分的去除程度的测定通过菌丝体化产品的外观、味道和/或化学组成进行测定，如本领域已知的。这种测定可以是定量的，例如菌丝体化产品的化学组成可以通过如本领域已知的测定方法，通过对于不期望的味道组分中的一种或多种的测定方法进行测量，或通过经由技术人员的味道测试进行定性测定。

在一个实施方案中，多达5％的一种或多种不期望的味道组分被去除；在其他实施方案中，多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达35％、多达40％、多达45％、多达50％、多达55％、多达60％、多达65％、多达70％、多达75％、多达80％、多达85％、多达90％或多达95％的一种或多种不期望的味道组分在本发明的过程中被去除。在一个实施方案中，一种或多种不期望的味道组分被定量去除。本发明还涉及如本文所述具有降低水平的不期望的味道组分的菌丝体化产品。

在一个实施方案中，不期望的味道组分是绿原酸，并且多达5％的绿原酸被去除；在其他实施方案中，多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达35％、多达40％、多达45％、多达50％、多达55％、多达60％、多达65％、多达70％、多达75％、多达80％、多达85％、多达90％或多达95％的绿原酸在本发明的过程中被去除。本发明还涉及如本文所述具有降低水平的绿原酸的菌丝体化的咖啡产品。

在一个实施方案中，咖啡因在培养或菌丝体化步骤期间从可可豆或其他农业底物中被去除。在一个实施方案中，多达5％的咖啡因被去除；在其他实施方案中，多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达35％、多达40％、多达45％、多达50％、多达55％、多达60％、多达65％、多达70％、多达75％、多达80％、多达85％、多达90％或多达95％的咖啡因在本发明的过程中被去除。本发明还涉及如本文所述具有降低水平的咖啡因的菌丝体化产品。

不期望的味道组分的去除可以允许增加质量更差的可可豆或其他农业底物的价值和/或致使其更可食用。通过这种方法产生的菌丝体化产品可以用于与更便宜的可可豆或其他农业底物掺和，导致具有改善的味道特性的成本更低的产品。可以降低待加入菌丝体化产品中的糖、乳及其替代品的量。由于察觉到菌丝体化产品提供更浓厚、更顺滑和/或更甘甜的食物，伴随更少的苦味、涩味和/或酸味，本文方法导致菌丝体化产品的增强风味谱。

风味和/或健康促进组分的添加

在一些实施方案中，本发明的培养或菌丝体化过程提供了具有添加的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品。例如，菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品可以含有外源添加的抗肿瘤和免疫调节的健康促进组分。

真菌在代谢上类似于动物，但在结构上类似于植物，因为它们具有主要由与膜结合蛋白质结合的长糖分子链形成的刚性细胞壁，所述长糖分子链通过略微难以消化的β(b‐)键和程度较小的更容易消化的α(a‐)键连接。相比之下，植物细胞壁(例如可可豆或其他农业底物)由纤维素多糖制备，其1‐>4葡萄糖糖苷键对于人同样难以消化，但可通过真菌消化。真菌细胞壁主要由1‐>3糖苷键组成，具有1‐>6连接的侧链，并且因此它们通过使用水、热和机械处理的最低限度加工分解成更小、更容易消化、免疫活性的具有可变微粒大小的多糖分子，称为β葡聚糖，以及相关糖蛋白化合物。针对β葡聚糖的免疫应答取决于a‐或b‐葡聚糖结构，其具有一级、二级和手性三级结构，解释了针对每种真菌的独特a‐和或b‐葡萄糖谱的免疫应答中的差异。因此，菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品具有添加的健康促进组分，包括上文描述的分子。菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品中存在的其他健康促进组分可以是具有不同特性的组分，所述不同特性例如免疫调节、抗老化、壮阳、抗肿瘤、抗病毒、抗菌和或抗真菌特性，并且包括化合物例如a‐和b‐葡聚糖、糖、蛋白质、麦角固醇、固醇、三萜类、和脂肪酸、葡甘露聚糖、riboglucan、sterpuric acid、甘露醇、核糖醇、鸟苷和腺苷。

在可可中天然发展的甲基吡嗪是可可中发现的最重要的期望的风味化合物。在热例如烘焙的存在下，它们通过即在糖和氨基酸或肽之间的美拉德反应产生。不受理论束缚，认为甲基吡嗪也通过发酵和/或菌丝体化产生，其导致在菌丝体化的可可豆及其他农产品中增加的和/或改变的甲基吡嗪。使用这种可可制造方法，单个真菌菌株分解灭菌的原料可可豆中含有的纤维素、生物碱、脂肪和蛋白质含量，其给予可可苦味且改变可可豆的物质结构和浓度。另一方面，通过本发明的用于加工原料可可豆的发酵方法获得均匀和一致的可可质量。通过利用经由这种干净的发酵过程诱导的本文公开的方法，原料可可豆的风味得到增强，使得所得到的可可更浓厚、更顺滑和/或更甘甜且独特(与由未菌丝体化的豆制备的纯可可相比较)。

糖的反应性羰基与氨基酸的亲核氨基反应，并且形成负责一系列气味和风味的弱表征的分子的复杂混合物。该过程在碱性环境中得到加速(例如应用于使椒盐卷饼变黑的碱液)，因为氨基是脱质子的，并且因此具有增加的亲核性。氨基酸类型决定所得到的风味。这种反应是调味料工业的基础。在高温下，可以形成丙烯酰胺。

巴西蘑菇可以用于将独特的a‐和b连接的葡聚糖加入菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品内，所述葡聚糖称为葡甘露聚糖和riboglucan，其是抗病毒的。其他巴西蘑菇多糖提取物可以具有抗癌效应，并且可以与本文列出的真菌的其他菌丝体提取物共同治疗。已报道了优化生物量和细胞外多糖生产的方法。因此，如本文描述的用巴西蘑菇的菌丝体化以及含有衍生自巴西蘑菇的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

冬虫夏草产生虫草酸、腺苷、D-甘露醇和虫草素腺苷，其为免疫调节和抗病毒的。冬虫夏草提取物已显示是抗老化和壮阳的。从冬虫夏草中分离的菌丝体固醇已显示抑制众多癌症细胞系的增殖。冬虫夏草菌丝体多糖提取物已显示诱导低血糖症。因此，如本文描述的用冬虫夏草的菌丝体化以及含有衍生自冬虫夏草的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

毛柄金钱菌菌丝体已显示具有其为免疫调节的多糖谱。毛柄金钱菌菌丝体组成独特的麦角固醇和氨基酸谱、sterpuric acid、甘露醇、核糖醇、以及核苷类鸟苷和腺苷，从毛柄金钱菌菌丝体中提取的Enokipodins A‐D是广谱抗微生物萜类。蛋白质火菇菌素和毡毛美洲茶素显示出抗HIV和抗HPV活性。因此，如本文描述的用毛柄金钱菌的菌丝体化以及含有衍生自毛柄金钱菌的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

灵芝的多糖谱已显示在人细胞系以及临床研究中是免疫调节的。灵芝菌丝体提取物具有抗过氧化、抗炎和抗诱变特性。灵芝提取物已显示是抗老化和壮阳的。灵芝的三萜类谱已得到测定且显示为抗肝毒性和肝保护性、抗肿瘤、抗血管生成、抗高血压、血胆固醇过少、抗组胺和抗HIV的。除产生多糖和糖蛋白之外，灵芝同样产生三萜类，例如灵芝酸和赤芝酸、酚类化合物和固醇，其也具有高生物学活性和治疗特性，并且在经口消耗后，单独为抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗癌、抗炎、抗组胺、降血压、镇静和冥想的。因此，如本文描述的用灵芝的菌丝体化以及含有衍生自灵芝的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

灰树花的多糖谱已显示为免疫调节和抗氧化的，灰树花产生麦角固醇和脂肪酸的抗氧化谱。灰树花提取物对体外癌细胞系的抗肿瘤效应已得到研究，并且显示对于是血糖过低的糖尿病患者的希望。因此，如本文描述的用灰树花的菌丝体化以及含有衍生自灰树花的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

猴头菇菌丝体和子实体提取物已显示跨越各种细胞系是抗诱变和免疫调节的。猴头菇独特地在子实体中产生猴头菇酮并且在菌丝体中产生猴头菇素，结构上确定的化合物，其可以通过血脑屏障且促进神经生长因子(NGF)在某些脑区中的分泌。猴头菇素已显示为比猴头菇酮更大的NGF表达增强剂。因此，如本文描述的用猴头菇的菌丝体化以及含有衍生自猴头菇的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

香菇多糖谱的方面已得到测定且显示为免疫调节和抗病毒的。香菇多糖及其他代谢产物已就其众多卫生保健利益进行研究。在一些国家，香菇多糖分类为“抗肿瘤多糖”，并且可用于临床使用。香菇多糖对标准癌症疗法的添加已显示导致对于肝细胞癌增加的肿瘤坏死，以及在患有食管癌的患者中改善的生活质量。

因此，如本文描述的用香菇的菌丝体化以及含有衍生自香菇的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

裂蹄木层孔菌提取物已显示为展示抗肿瘤活性。裂蹄木层孔菌多糖提取物已得到研究且显示为抗癌、免疫调节、抗疟疾和肝保护性的。桦褐孔菌菌丝体多糖提取物已证实抗肿瘤、降血糖和抗氧化特性。糙皮侧耳菌丝体和子实体组成已显示为非常相似的，仅在氨基酸含量中不同。菌丝体多糖谱主要由海带多糖组成，其提取物已显示是免疫调节的。从糙皮侧耳的菌丝体肉汤中分离的洛伐他汀显示出抗癌活性，抑制细菌和真菌的生长，并且降低胆固醇。变色栓菌产生具有a‐(1‐4)‐和b‐(1‐3)糖苷键的杂葡聚糖(heteroglycan)，其中在PSK(云芝多糖)中的岩藻糖以及PSP中的鼠李糖和阿拉伯糖已显示为抗肿瘤和免疫调节的。PSK，获得批准的药物，是菌丝体提取物，其显示出免疫调节、抗病毒和胆固醇调节特性。银耳的菌丝体多糖提取物已显示对于各种循环障碍是治疗性的，是神经学健康、抗癌、抗肿瘤和抗老化的。

因此，如本文描述的用裂蹄木层孔菌、猪苓、桦褐孔菌、糙皮侧耳、变色栓菌和/或银耳(以及本文描述的任何其他真菌物种)的菌丝体化以及含有衍生自裂蹄木层孔菌、猪苓、桦褐孔菌、糙皮侧耳、变色栓菌和/或银耳(或本文描述的任何其他真菌物种)的风味和/或健康促进组分的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品也包括在本发明中。

通过如本文描述的真菌组分添加的风味组分或健康促进组分的量可以通过本领域技术人员进行估计，并且包括多达1ng组分/单位菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品，或者多达5ng、多达10ng、多达50ng、多达100ng、多达500ng、多达1μg、多达5μg、多达10μg、多达50μg、多达100μg、多达500ug、多达1mg、多达2mg、多达5mg、多达10mg、多达20mg、多达50mg、多达100mg或多达500mg/单位菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品。菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品的单位可以不同定义为1g、1磅、1kg等等。

菌丝体化产品的深加工

在一些实施方案中，一旦完全菌丝体化，菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品就任选在菌丝体化后进行冲洗。可以进行冲洗以去除菌丝体和/或其他非可可豆或其他农业底物物质的一些或所有部分。

在一些实施方案中，一旦完全菌丝体化，菌丝体化产品就任选进行干燥。干燥可以通过本领域已知用于干燥可可豆或其他农业底物的方式来完成。例如，菌丝体化产品可以铺在干表面上以干燥。在一个实施方案中，菌丝体化产品干燥至约11至13％含水量。

任选地，干燥或未干燥的菌丝体化产品可以通过本领域已知的常规方法进行烘焙和/或烘烤。任选的烘焙步骤提供用于使真菌灭活，其可能是降低真菌病危险所期望的。

可以对菌丝体化的可可实施用于非菌丝体化的可可的已知加工步骤。相应地，本发明可以用于制备菌丝体化的可可块、菌丝体化的可可脂、菌丝体化的巧克力浆，以及其衍生的所有形式的巧克力，如通过调温和本领域已知的其他方法完成的。此类食物加工的附加利益涉及通过菌丝体化灌输进这些食物的独特营养谱(主要是多糖和代谢产物谱)。

在一个实施方案中，菌丝体化的可可豆提取物以提取物形式或由提取物脱水实现的粉末形式用于营养制品中。在另一个实施方案中，菌丝体化的可可豆提取物用作功能性食物中的添加剂，以支持风味和营养素含量。这种提取物可以为例如在醇基底或植物甘油中灌注的水性形式。粉末形式可以通过使提取物脱水来实现。粉末形式可以加入任何包装食物中。功能性食物的例子包括瓶装饮料、零食条或用于制备蛋白质奶昔的高蛋白粉混合物。粉末形式也可以用于冰激淋中。

菌丝体化产品可以任选进行提取，以制备用于食物和/或饮料产品中的提取物。例如，1000g菌丝体化的烘焙的可可豆或其他农业底物可以完全提取，伴随搅动；使用10-1000ml的121‐122℃增压水作为缓冲液，含有0.01％-10％柠檬酸和0.01-10％抗坏血酸。所得到的水提取物可以使用常规方法进一步纯化且浓缩。菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品提取物可以通过本领域已知的方法给予延长的贮存期限，例如在18％-24％乙醇、45％-60％甘油中配制，或添加2.5X体积的蜂蜜或类似糖，例如枫糖浆或蒸发的蔗糖。

不期望的味道组分和/或咖啡因的去除，和/或增加风味和/或促进健康的菌丝体化产物的添加，导致菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品，并且可以增加质量更差的可可豆或其他农业底物的价值和/或致使其更可食用。通过这种方法产生的菌丝体化的可可豆或其他农业底物产品可以用于与更便宜的可可豆或其他农业底物掺和，导致具有改善的味道特性(例如更浓厚、更顺滑和/或更甘甜的食物，伴随更少的苦味、涩味和/或酸味)的成本更低的产品。

菌丝体化的可可豆味道比天然可可更甜，因为菌丝体化去除来自豆的苦味组分。相应地，在功能性食物中使用菌丝体化的可可的一个利益是：与具有更多甜味剂(即糖、甜菊糖或合成甜味剂)的天然可可相比较，可以制备味道同样好的低糖(或低甜味剂)形式的包括可可的任何功能性食物。

实施方案

图1显示了制备用于人消费的菌丝体化的农产品(例如菌丝体化的咖啡产品)提取物的方法的一个实施方案的流程图。步骤10提供了农业底物，步骤12通过包含衍生自液态发酵的培养物等分试样的液体培养基接种底物，步骤14允许菌丝体生长，并且步骤16使底物上的菌丝体生长，步骤18包括在底物上的菌丝体生长达到所需阶段后，使底物在水中煮沸且将水-底物混合物分成水性和非水性组分，步骤20将小分子组分的混合物加入水性组分中，由此水性组分与促进提取物的水溶性的小分子组分在生物可用的组合中混合。

在一个实施方案中，步骤24利用担子菌纲(Basidiomycota)真菌的培养物来进行步骤12。在一个可替代实施方案中，步骤26利用子囊菌纲(Ascomycota)真菌来进行步骤12。

图2显示了依照本发明制备菌丝体化的农产品的方法，所述菌丝体化的农产品用于人消费以实现在人中的神经再生和神经保护。

该方法包括步骤30提供农业底物，步骤32通过包含衍生自液态发酵的培养物等分试样的液体培养基接种底物，步骤34允许菌丝体生长且使底物上的菌丝体生长，步骤36使底物在水中煮沸且将水-底物混合物分成水性和非水性组分。步骤36在底物上的菌丝体生长达到所需阶段后发生。步骤38将小分子组分的混合物加入水性组分中，以增加提取物的水溶性，以增强在人中的被动吸收和摄取。

步骤32接种包括步骤40用本发明的真菌组分接种。

步骤34允许菌丝体生长且使底物上的菌丝体生长包括调节无菌环境中的温度和湿度。菌丝体随后自动生长。菌丝体在容器中生长，所述容器仅允许少量无菌空气进入容器。无菌空气的体积通过给容器封盖进行调节。这调节容器中的环境氧。

步骤34使菌丝体生长至所需阶段，例如其中子实体开始在底物表面上出现。

步骤36使底物在水中煮沸以分开在水中悬浮的菌丝体中的多糖及其他有益组分，使水性组分与残留底物固体分开。非水性组分包括底物固体。使水性组分与非水性组分分开可以通过过滤或虹吸来完成。可以理解可以利用本领域已知的其他方法。

步骤38将小分子组分的混合物加入水性组分中。这允许水性组分在体内更生物可用。

图3显示了本发明的方法10。方法10包括步骤12提供在液体组织培养基中的真菌组分，步骤14将包括咖啡因的混合物(例如含有绿咖啡豆提取物的非限定型培养基)加入液体组织培养基中，以训练真菌组分消耗咖啡因，步骤16将可可豆或其他农业底物巴氏灭菌或灭菌，步骤18将可可豆或其他农业底物水合至10-80％含水量，步骤20用真菌组分接种可可豆或其他农业底物，步骤22提供最佳温度、氧含量和湿度，以允许真菌生长，以及步骤24将可可豆或其他农业底物干燥且烘焙。

图4显示了依照本发明制造咖啡的方法48。方法48包括步骤50提供在容器中的咖啡豆。优选地，容器是高压灭菌袋。

步骤22包括降低氧水平，以促进在可可豆或其他农业底物上的兼性厌氧菌丝体生长，以使通过真菌组分的菌丝体的咖啡因消耗速率达到最大。在步骤50中，将容器密封，仅允许最低限度泄露。

步骤52将咖啡豆水合至最佳含水量。在一个实施方案中，步骤52使咖啡豆水合包括使咖啡豆在水中浸泡两小时，并且在巴氏灭菌的灭菌之前，将咖啡豆排水两小时。这是重要步骤，因为咖啡豆的水合加速菌丝体生长。使咖啡豆水合的步骤还去除不需要的残渣，并且可以从咖啡豆中去除一些不期望的水溶性组分。在一个可替代实施方案中，使用除水外的流体。例如，在步骤54灭菌之前，注入酶的水可以消除来自咖啡的不期望的组分。水的pH可以进行调节，以优化水合步骤52。蒸馏水或矿化水可以用于步骤52的水合52。

步骤54用蒸汽将可可豆或其他农业底物灭菌，并且步骤56使容器加压。步骤56使容器加压通常与灭菌步骤54一起包括。相应地，灭菌步骤54用范围为5-25磅/平方英寸的压力来完成。优选地，压力为10-20磅/平方英寸。在一个实施方案中，压力为15磅/平方英寸。

在步骤54下的灭菌可以在以15磅/in2的121-122℃；以10/in2的115-116℃；和以5磅/in2的108-109℃的条件下完成20至100分钟的时间段，或在以140℃-210℃的干热处理的条件下20至100分钟时期的巴氏灭菌。这些参数可以改变。

步骤58用真菌组分接种袋。在一个实施方案中，步骤58用液体组织培养物来完成，所述液体组织培养物具有直径为5-100微米的真菌菌丝球体大小，以确保一致接种。在另一个实施方案中，将固态组织培养物加入咖啡中，且以一致方式与咖啡混合。在另外一个实施方案中，将液体组织培养物和固态组织培养物两者均加入容器中的咖啡豆中，以降低如步骤60中所述，使灭菌的咖啡豆上的真菌菌丝体繁殖所需的时间。

在一个实施方案中，步骤58通过在步骤54和56后使容器冷却至80-100°F，并且将真菌液体组织培养物直接注入到容器内来完成。步骤60使相同容器内的真菌菌丝体繁殖。容器可以进行搅动或旋转，以确保真菌液体组织培养物的一致分布。在一个可替代实施方案中，咖啡豆从容器转移到缸内用于步骤58接种。

在另一个实施方案中，步骤58用衍生自液态发酵的液体组织培养物完成。液体组织培养物获得真菌菌株的纯培养物，所述真菌菌株包含具有直径小于2毫米的大小的球形聚集物，其允许在真菌菌株培养物的球形聚集物周围的三维中的菌丝生长。在该实施方案的变化中，由于在液体培养基的搅动或搅拌过程期间的菌丝结构的剪切，液态发酵获得包含大小范围为直径5微米至1毫米的球形聚集物的真菌菌株的纯培养物。搅动和/或旋流过程可以包括但不限于例如使用磁性搅拌棒的机械剪切、不锈钢叶轮、注入无菌高压的环境空气、在无菌培养基的高压下注入、和/或使用振动台。与空气和培养基注入结合的更高的搅动和旋流速率产生小菌丝体球体，其等分试样用于接种固态农业底物，用于后续半厌氧发酵。最佳地，菌丝体球形聚集物为直径小于100微米，并且更优选地，在直径10-50微米的范围内。

步骤58接种袋包括使用漂浮或浸没液态培养物、菌丝体化的底物例如谷物或咖啡或培养板培养物，来接种由灭菌或巴氏灭菌的可可豆或其他农业底物组成的固态培养基。特别注意显示出增强的发酵咖啡的能力的次代株。这些菌株可以进行选择且繁殖，在培养板和由以浸没或漂浮液态的一定浓度的绿咖啡豆提取物(如，将四至五粒可可豆或其他农业底物加入液体组织培养基制剂中)组成的液体培养基上培养，并且随后用于以比未条件化至发酵咖啡的菌株和次代株更快的速率接种灭菌的可可豆或其他农业底物。

步骤60使灭菌的咖啡豆上的真菌菌丝体繁殖优选在厌氧环境中完成。相应地，一旦底物(咖啡豆)已进行灭菌或巴氏灭菌，如通过巴斯德效应描述的，真菌的后续兼性厌氧代谢活性就可以在步骤58接种后进行诱导。

图5显示了本发明的方法10。方法10包括步骤12提供在容器中的可可豆或其他农业底物，步骤14通过去除绿原酸制备可可豆或其他农业底物用于真菌菌丝体化。在一个实施方案中，步骤14包括冲洗水溶液中的豆。

方法10进一步包括步骤16使可可豆或其他农业底物巴氏灭菌或灭菌，步骤18使可可豆或其他农业底物水合至10％‐80％含水量，步骤20用真菌组分接种可可豆或其他农业底物，步骤22调节容器中的温度、氧和湿度，以使可可豆或其他农业底物菌丝体化。该步骤22优化菌丝体化的速率。

步骤24冲洗菌丝体化的咖啡豆，以消除通过菌丝体化步骤22引起的菌丝体代谢产物及其他不需要材料的表面积累。

图6显示了输送机10、高压灭菌材料的第一片12、高压灭菌材料的第二片14、以及在片12和14之间分配咖啡豆的漏斗16。第一片12从高压灭菌材料的卷24延伸且放在输送机10上。漏斗16将咖啡豆释放到第一片12上。第二片14最初在卷26中成卷，并且随后放在咖啡豆和第一片12上。第一片12具有边缘22a和22b。第二片14具有边缘20a和20b，其针对第一片12的边缘22a和22b密封，以形成大高压灭菌袋，其可以如图8c成卷，并且设计为容纳超过150磅咖啡豆。

可以任选施加真空，以从片24a和24b之间抽取空气，其优化当咖啡豆18递送至灭菌室时，对咖啡豆18的热传递。真空还抑制咖啡豆18之间的相对运动。输送机10将咖啡豆18递送到灭菌室内。

图7显示了输送机10。漏斗16将咖啡豆递送至高压灭菌袋30。随后将高压灭菌袋30密封且放在输送机10上。输送机10将众多高压灭菌袋30、32、34、36、38和40运输至高压灭菌器42。在一个实施方案中，高压灭菌器42对高压灭菌袋30、32、34、36、38和40施加加热流体例如蒸汽和压力，以实现咖啡豆18的灭菌或巴氏灭菌。

图8a显示了装满咖啡豆的高压灭菌袋30。高压灭菌袋30在压力下引起凹凸不平的表面44。可替代地，将高压灭菌袋30真空密封以引起凹凸不平的表面44。

图8b显示了堆叠用于在高压灭菌器中的灭菌或巴氏灭菌的高压灭菌袋30、32、34、36和38。凹凸不平的表面44改善对袋30中封入的绿咖啡豆的热传递。高压灭菌袋30包括附着至袋30的凹凸不平表面的至少一种透气贴片45。优选地，透气贴片45包括具有0.2微米直径的通风孔，以允许最低限度量的空气流通袋30，并且确保在袋30内繁殖的菌丝体半厌氧繁殖。可以理解，透气贴片可以具有直径为2-100微米的孔。优选地，透气贴片45通风孔具有5微米或更少的通风孔直径。超过一个透气贴片45可以附着至袋30的凹凸不平表面，并且可以依照本发明用于除袋外的容器上。

图8c显示了封入咖啡豆的高压灭菌材料的连续袋46。将连续袋46密封，以允许袋46在高压灭菌器中被灭菌或巴氏灭菌。在一个可替代实施方案中，袋46在区段中密封，使得连续袋46具有多个区段，其彼此分离以抑制空气和咖啡在区段之间的移动。用经过袋46且在其表面周围的箭头显示在灭菌期间的紊气流。

图9显示了一般用参考数字10指定的本发明的方法。方法10包括步骤12提供在液体组织培养基中的真菌组分，步骤14将包括可可提取物的混合物加入液体组织培养基中，以训练真菌组分消耗不期望的可可味道组分，步骤16将原料可可豆巴氏灭菌或灭菌，步骤18将原料可可豆水合至10-80％含水量，步骤20用真菌组分接种原料可可豆，步骤22提供最佳温度、氧含量和湿度，以允许真菌生长，以及步骤24将原料可可豆干燥且烘焙。

步骤22包括降低氧水平，以促进在原料可可豆上的兼性厌氧菌丝体生长，以使2-甲氧基-3-异丙基吡嗪和可可碱通过真菌组分的菌丝体的消耗速率达到最大。

图10显示了可可在水溶液中的水性菌丝体化的方法26。方法26包括步骤28提供原料或烘烤的可可，步骤30将可可磨成直径小于1mm的小颗粒，步骤32提供在生物反应器中的水溶液，该溶液具有当搅动时对于悬浮可可的小颗粒适当的粘度，步骤34添加真菌组分的液体组织培养物例如纯真菌菌株的菌丝体，步骤36通过调节温度、搅动活动和氧水平来确保菌丝体的兼性厌氧生长，而允许可可在水溶液中的真菌菌丝体化，步骤38使可可与水溶液分开且使分开的可可干燥，以及步骤40从水溶液中选择且提取所选择的水溶性可可风味组分，并且将所选择的水溶性可可风味组分的至少一部分加回到分开的可可中，以获得美味的可可粉或液体。

下述实施例仅为了举例说明性目的而提供，并且不预期限制本发明的范围。

实施例

实施例1

得自所提及的保藏中心的真菌的特异性和纯菌株在无菌环境中在1加仑至10加仑塑料袋、1夸脱至1加仑玻璃罐中、或在10cm至15cm培养板上进行操作，使用包括绿咖啡豆提取物或者可可豆或其他农业底物提取物与1.5％琼脂(w/v)的非限定型基于有机水果和植物的培养基，以便监控且确保菌株的一般活力和健康。

菌丝体样品在温和的环境无菌气流中生长2至4周，随后从培养板中切除，并且随后用于接种到液态发酵内，采用类似的非限定型基于有机水果和植物的培养基(但不含琼脂)，使用环境空气，在1夸脱至1加仑玻璃罐中。在环境空气中在设计用于商业啤酒酿造和/或发酵的不锈钢槽中，一些样品在搅动培养中生长，并且一些样品在未搅动培养中生长。

未搅动的液态发酵形成菌丝的漂浮团块，其显示出在液体和空气界面处的连续生长。搅动和/或旋流培养物的菌丝体非常快速地生长为菌丝球体，其是水合的，保持淹没，并且具有以小直径的凝胶状珠的外观。水合的菌丝球体在干燥后崩溃，在其中它们用于接种培养板用于菌株繁殖和质量控制。

发现液态发酵中的球体直径与搅动强度和体积成反比。菌丝剪切在更高的搅动和旋流强度下变得更有效，并且一旦剪切，菌丝形成最小可能直径的新球体，在大小中增长直至它们再次被剪切。当用于连续液态发酵中时，存在球体直径的恒定比，并且因此产生以微米级别的球体的连续供应。

因此，该实施例证实利用菌丝体球体直径用于更有效接种，其中接种效率与球体直径成反比。

实施例2

来自未搅动的液态发酵的菌丝体培养物(生长期2至4周)形成菌丝的漂浮团块，在用于接种之前，所述菌丝的漂浮团块与锋利的无菌切割装置轻轻掺和。轻轻掺和通过在商业混合器中以短期爆发以低速混合或低匀浆化来实现。掺和的液态培养物的等分试样用于接种灭菌的未加工的果实和或植物、谷物谷粒和/或烹饪种子、或巴氏灭菌的烹饪香料、药用草药、天然调味料、茶混合物、生香草豆、生可可豆和咖啡豆或其他农业底物。

实施例3

关于罐或袋中的菌丝体化(含有底物和接种的菌丝体培养物两者)的底物每几天轻轻混合，直至它们控制底物且变得略微对混合或振动抗性，通常为2至4周，取决于菌株。产物随后采取豆豉(tempeh)形式。将菌丝体化的生香草豆蒸煮或焙烤；将菌丝体化的生可可豆焙烤或烘烤；并且将菌丝体化的可可豆或其他农业底物烘烤或烘焙。在消耗前的某一点时，以豆豉形式或作为食物包括汤、炒菜、面包和肉类替代品中的成分存在的菌丝体化的谷粒，通过在低至中热145°F至165°F下蒸煮10分钟至60分钟，制备为安心食用和生物可用的。在罐或袋中的其他培养物例如草药和香料在100°F至145°F下干燥1小时至24小时，照常规包装且使用。

将菌丝体化的蜂蜜制剂在100°F至125°F下搅拌10分钟至90分钟，随后倾入小玻璃瓶内。此外，将菌丝体化的农产品再配制成附加值产品，例如鸡蛋面条、肉类替代品、专门调味料、烹饪酱料、汤配料等。

实施例4

对于大分批液态和固态操作，使纯培养物好氧生长，并且接种到连续且半厌氧操作的大型工业液态和大型固态商业处理器内，用于食物产品的大规模发酵。在培养物的培养基完全变成白色或其关于特定物种的代表性颜色，并且已完全过度生长且控制培养基且对轻轻混合抗性时，将内容物收获，取出至塑料袋且在40°F下冷藏用于快速使用，或在-20°F下冷冻用于长期贮存和以后利用。将发酵的培养基制备成美味的人类食物，包括：“豆豉风格”肉类替代品、鸡蛋面条、专门调味料、面包、提取物和烹饪酱料，或作为新鲜配料直接用于汤和/或炒菜菜谱中，或包装。

实施例5

在收获前1小时至24小时，通过用选自下述的真菌菌株的纯培养物接种而完全菌丝体化的农业底物经历在145°F至195°F下1分钟至2小时的热处理：巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、猴头菇、灰树花、刺芹侧耳、糙皮侧耳、金顶侧耳、红侧耳、变色栓菌、香菇、毛柄金钱菌、草菇、斑玉蕈、光帽鳞伞、黑孢块菌、M.hortensis、猪苓和银耳，随后为在室温下45分钟至48小时的回收。这个过程显示RNA水平中的显著减少，并且配制成不同的营养药物组合物。

实施例6

将71磅可可豆在等体积的水中浸泡5分钟，这之后将水过滤掉，并且将可可同样地分配到10个具有0.2微米透气贴片的聚丙烯袋内。将袋的顶部在袋上折叠，并且具有在袋的每个侧面周围缠绕的橡皮圈。将袋用略微干燥的饱和蒸汽以22psi在255°F下灭菌80分钟。袋随后在无菌环境中冷却8小时，并且随后用灵芝、冬虫夏草、黑孢块菌或黑脉羊肚菌的浸没液体组织培养物接种，使用无菌工具且在层流通风橱内的无菌操作中。接种物在4L烧瓶中的1.5L培养基中生长，所述培养基由具有10L有机马铃薯提取物、2L原料可可豆提取物和1L有机芒果汁的混合物制备，并且在接种物已在60RPM的1英寸半径搅动下生长7天后，将50mL接种物用于每袋可可。使培养物菌丝体化两周，其后将它们干燥且烘烤。注意到黑孢块菌可可赋予最少的苦味(改善最多的味道)。

实施例7

大麦、糙米、荞麦、小麦片(碎小麦)、亚麻籽、Grano、粟、燕麦、燕麦面包(OatBreat)、燕麦谷物、燕麦片、爆米花、全麦谷物片、牛奶什锦早餐(Muesli)、燕麦片、藜麦、黑麦、高粱、斯佩耳特小麦、黑小麦、全谷物大麦、小麦粒的粉质胚乳(Wheat Berries)、全谷物玉米面、全黑麦、全麦面包、全麦蒸粗麦粉和野生稻的样品，在适当制备的夸脱球罐或具有透气贴片高压灭菌袋中个别地与其一半体积的水混合，并且在15psi下灭菌90分钟或在22psi下灭菌80分钟。一旦冷却，谷粒罐就用选自下述之一的菌株的漂浮或浸没真菌培养物的一半至整个菌落进行接种：灵芝、冬虫夏草、黑孢块菌、猴头菇、巴西蘑菇、灰树花、糙皮侧耳、变色栓菌、硫磺多孔菌、毛柄金钱菌、香菇、黑脉羊肚菌、皱柄羊肚菌(Morchellacrassipes)、Morchella hesculenta、银耳和桦褐孔菌，其中漂浮培养物在夸脱或半加仑球罐中的非限定型有机培养基上生长，并且其中浸没培养物在4L烧瓶中的1.5L非限定型培养基中生长。在菌丝体化两周后，罐各处被充分生长，并且在蒸煮且作为豆豉消费，或进一步配制成营养制品(即，配制成与小分子抗坏血酸(1g)和柠檬酸(10g)以及8mL橙和红桔精油结合的2加仑蜂蜜)前，在双层蒸锅中在212°F下巴氏灭菌7分钟。这个配制步骤通过将巴氏灭菌的培养物与2升水掺和或不掺和开始，并且随后将抗坏血酸和柠檬酸加入掺和物中，随后加入精油，随后加入蜂蜜，制剂随后在双层蒸锅中进行加热，装瓶且在装瓶后立即进行巴氏灭菌，以确保安全密封。

实施例8

小分批工作-咖啡

将48磅咖啡在具有盖的干净的夸脱球罐中分成48等份，所述球罐构造为允许经过套环的气体扩散。这48个1磅重量的咖啡用3/4夸脱水浸泡两小时。过滤掉混合物中的水。随后对咖啡罐实施在15psi下的灭菌温度90分钟，并且置于无菌层流气流中以冷却8小时。一旦冷却，咖啡豆就用选自下述之一的菌株的一半至整个菌落进行接种：灵芝、冬虫夏草、黑孢块菌、猴头菇、巴西蘑菇、灰树花、糙皮侧耳、变色栓菌、硫磺多孔菌、毛柄金钱菌、香菇、黑脉羊肚菌、皱柄羊肚菌(Morchella crassipes)、Morchella hesculenta、银耳和桦褐孔菌，各自进行三次，在含有绿咖啡提取物的非限定型植物和果汁琼脂培养基上生长，如实施例8中所述，使用无菌工具且在层流通风橱内的无菌操作中。使培养物菌丝体化7至21天，其中在第7、14和21天时，将每种的样品抽出用于干燥且烘焙。在第7天时培养物的气味和咖啡的味道指示培养完成，尽管更长的菌丝体化时期获得更大的细胞群。

大分批工作-咖啡

将528磅可可豆或其他农业底物在两个不同程序中进行浸泡。在第一个程序中，将豆浸泡三次，每次浸泡20分钟，在第二个程序中，通过过滤水的恒流将豆浸泡20分钟。随后将豆包装到具有0.2微米透气贴片的聚丙烯袋内，其中袋的顶部向上折叠，用橡皮圈在袋侧面周围缠绕，使得蒸汽和气体扩散可以通过透气贴片和袋的折叠侧面发生。袋在液体循环下以22psi灭菌80分钟，并且随后允许冷却8小时。将袋用来自下述物种的真菌进行接种：灵芝、冬虫夏草、黑孢块菌和黑脉羊肚菌。灵芝培养物在生物反应器中生长，使用10L有机马铃薯提取物、2L绿咖啡提取物和1L有机芒果汁，用RO水稀释至100升。生物反应器用通过两个内嵌0.2微米疏水囊式过滤器过滤的压缩空气进行鼓泡，并且通过使用在空气供给上的止回阀和具有2-3psi额定开启压力的排气管线，使反应器保持在2-3psi下。接种物在48小时内容易地生长，并且通过位于反应器底部处的隔膜阀进行收获，其导致收获线对蒸汽线和蒸汽阱具有T接和阀门关闭的接近，具有内嵌止回阀，穿过柔性不锈钢外壳六英尺至与定时器和脚踏开关连接的电磁阀，随后为以肘形卫生装置连接的流量计量阀。在吹蒸汽的同时，肘形卫生装置连接至球阀，所述球阀连接至蒸汽排气歧管。球阀在给线吹蒸汽后关闭，并且一旦进入层流通风橱，球阀就与收获线脱离，以便保持整条线无菌。冬虫夏草、黑孢块菌和黑脉羊肚菌培养物在4L烧瓶中，在生物反应器预稀释中使用的1.5L相同培养基中生长。使这些培养物生长六天，并且用于接种灭菌的可可豆或其他农业底物的袋。使袋菌丝体化7天，其中它们的气味赋予由烘焙的菌丝体化豆制备的饮料所需的味道谱，于是它们在第8天时干燥至13％含水量。

实施例9

用于本发明的方法中的合适真菌通过下述方法进行制备。下述灵芝菌株商业购自美国宾夕法尼亚州立大学(Pennsylvania State University)食用菌菌种保藏中心：496Ling ZHI；Singapore commercial line；7/85；502IFO#8436；IFO-Japan；7/30/85；510Red oak，State College，PA；D.J.Royse；9/85；549 Y.H.Park，ASI-Korea；12/5/85；550Y.H.Park，ASI-Korea；12/5/85；551 Y.H.Park，ASI-Korea；12/5/85；580 Y.H.Park，ASI-Korea；2/10/85；607 Y.H.Park，ASI-Korea；2/19/85；617 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；618 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；619 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；620 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；621 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；622 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；623 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；624 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；625Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；626 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；627 Y.H.Park，ASI-Korea；2/25/85；665 Quimio；Philippines；3/6/86；669 Y.H.Park，ASI-Korea；3/25/86；686 B.W.Yoo；4/28/86；724 T.Mitchel，Lawn PSU Forestry Bldg.9/16/90；806 AliceChen；Buffalo，NY；4/94；807 Alice Chen；North Carolina；4/94；841 White Oak；PSUCampus；J.Peplinski；8/99。上述菌株使用本文描述的包含可可豆或其他农业底物提取物的培养基进行培养(参见实施例(10)。许多菌株不能在培养基上生长和/或死亡。令人惊讶的是，本发明人发现灵芝菌株806 Alice Chen；Buffalo，NY能够在包含绿咖啡豆提取物的培养基上生长，并且选择用于依照本发明的进一步使用。

实施例10

真菌(包括如本文描述的灵芝菌株806、冬虫夏草和黑孢块菌，以及猴头菇、变色栓菌、香菇、松口蘑、毛柄金钱菌、巴西蘑菇、灰树花、光帽鳞伞、L.officinalis、M.hortensis、黑脉羊肚菌、黑木耳、银耳、桦褐孔菌、木蹄层孔菌、硫磺多孔菌)维持在包含非限定型培养基的培养上，所述非限定型培养基包括可可豆的提取物。实验显示对培养物使用包括可可豆提取物的培养基维持真菌耐受、生长、代谢、去除或降低咖啡因或不期望的风味组分的能力。还发现如上定义的真菌的相继繁殖引起真菌耐受、生长、代谢、去除或降低咖啡因或减少不期望的风味组分的能力的增强和/或改善，导致使真菌训练或适应包括可可豆的提取物的非限定型培养基。发展选择或未选择的，相对于起始菌株具有改变、改善和适应特性的此类真菌。这些适应菌株如本文其他地方描述的保藏于ATCC。

如下制备包括可可豆的提取物的非限定型培养基：将2磅粉末状的可可豆或其他农业底物在室温下与1/4加仑水混合。允许混合物伴随振动提取20分钟，随后通过细网孔过滤三次。分开地，将5个有机马铃薯置于10L水中，并且高压灭菌20分钟以使马铃薯软化。随后将马铃薯用马铃薯捣碎机粉碎，并且随后通过细网孔过滤三次。可以加入1L商业不加糖的果汁。将这些溶液合并且高压灭菌。该配方可以根据需要按比例扩大或缩小。

将洗涤的可可豆在水中洗涤，并且使含水量提高至约30％。在其他时间，使含水量提高至约60％。

液体培养：包含用于接种制备的可可豆或其他农业底物的真菌的培养物用鼓泡的空气和电动桨进行搅动，以产生紊流环境且用纯机械力剪切菌丝。双重搅动方法优于个别的任一方法，因为鼓泡的空气在培养物的顶部一半中产生最大紊流，而对底部影响较小，所述底部通过电动桨保持搅动。依次地，桨可以以更低RPM运行，并且仍获得在不存在鼓泡的情况下通过更快速RPM获得的菌丝球体大小。菌丝大小为直径约2-5微米)。制备的真菌中完整无损的菌丝体和适当形态通过该方法进行制备，且用于培养和/或菌丝体化。

实施例11

黑色的意大利冬季佩里戈尔松露(Black Italian Winter Perigord Truffles)[松露1(T1)和松露2(T2)]在真菌学实验室环境中进行无菌操作，以通过下述4种方法获得许多新的松露栽培品种用于商业工作，包括相反的交配型分离物。

方法1：将新鲜的(不到一周的时间)完整的T1整片(大小为大约10mm×20mm的松露产孢组织块)置于50块培养板中的橡树琼脂(基于橡树叶和橡树枝的一般的非限定型琼脂培养基)内，所述培养板用石蜡膜密封以允许培养物在室温下(23℃)温育5周。在5周后，可见T1小片再生成通过下述栽培品种描述的菌丝体：(a)在6块培养板上具有紫色色调的旺盛生长的白色菌丝体，(b)在3块板上具有紫色色调的旺盛生长的金黄色菌丝体，(c)在6块板上的旺盛生长的白色和金色菌丝体，(d)在2块板上非旺盛生长的稀疏的紫色和金色菌丝体，以及(e)在2块板上非旺盛生长的稀疏的白色和金色菌丝体。剩余培养板(37块板)在通过(细菌和真菌)污染变得过度生长后弃去。分离物(a)、(b)和(c)测定为具有商业潜力。(a)旺盛生长的白色分离物是对于原始松露香菇母本的交配型菌丝体，而分离物(b)是对于原始松露香菇父本的交配型菌丝体，并且(c)是衍生自(a)和(b)交配型两者的无性遗传重组或菌丝融合的栽培品种。在橡树琼脂上生长5至6周后，(c)旺盛生长的白色和金色菌丝体的培养物开始产生微小的(0.1mm至2.0mm)松露果实。在结构培养至新鲜的培养板和在相似的农业培养基上之后，这些培养物产生不断增长的黑松露香菇。

方法2：将新鲜的(不到一周的时间)完整的T1孢子(大小为大约0.1mm×0.1mm团块的0.01g至0.1g孢子块)置于培养板(40块板)中的四季橡树琼脂培养基内，所述培养板用石蜡膜密封5周，以允许孢子在室温下(23摄氏度)萌发。在5周后，可见孢子在10块板上萌发成菌丝体；然而，由孢子萌发的所有菌丝体尽管有活力，但是极端稀疏且生长缓慢的。

方法3：将新鲜的(不到一周的时间)完整的T1整片(大小为大约10mm×20mm的40g产孢组织块)置于2个瓶中，所述瓶各自含有400ml无菌水和各50ug/ml的下述抗生素：氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、红霉素、新霉素、链霉素，伴随关闭但不关紧，其中允许它们在室温下(23℃)不受打扰地温育5周，伴随偶然的轻轻振动。在5周后，将完整小片从抗生素缓冲液中取出且投入50块培养板内，基于橡树叶和枝，一般的非限定型琼脂培养基(含有相同水平的抗生素)内，所述培养板随后用石蜡膜密封以允许培养物在室温下(23℃)温育2周。在琼脂中的2周再生后，可见T1小片再生成下述菌丝体栽培品种：(a)在12块培养板上的白色菌丝体，(b)在4块板上的金黄色菌丝体，(c)在2块板上的白色和金色菌丝体。剩余培养板(32块板)在显示无生长或通过真菌污染变得过度生长后弃去。经由方法3获得的分离物尽管非常类似于来自方法1的分离物，但活力要少得多。

来自方法1的分离物(a)、(b)和(c)如本文所述进行制备且用于底物的菌丝体化。底物是制备的可可豆。制备的可可豆的菌丝体化允许进行直至达到所得的烘焙可可豆和所得的巧克力的所需咖啡风味，约7天。所得的菌丝体化的可可豆进行烘焙且转变成巧克力，并且由受过训练的品尝者进行品尝。发现当使用对于方法1描述的分离物，分离物(a)时，达到菌丝体化的巧克力中的令人愉快的可口芳香/味道，让人联想到鲜花。当使用对于方法1描述的分离物，分离物(c)时，达到令人愉快的可口芳香/味道，让人联想到松露。

实施例12

通过本发明的方法产生的咖啡豆和渣含有添加的多糖和β葡聚糖。分析显示通过本发明的方法产生的罗布斯塔咖啡渣具有30.54mg右旋糖/克咖啡渣。基于经修饰的酚硫酸方法，这个结果提供了通过分光光度法在底物中的总多糖量。分析还显示通过本发明的方法产生的罗布斯塔咖啡渣具有以0.432％的β葡聚糖，如通过MYBG方法测量的，利用强水解条件以水解β葡聚糖，伴随通过分光光度法的定量。这代表超过消费来自灵芝香菇的β葡聚糖的优点，因为出于苦味、木质和硬度的原因，这些香菇是非烹调用香菇，或采取丸剂形式。

实施例13

味道比较1，苏门答腊、秘鲁和洪都拉斯阿拉比卡豆

咖啡专业人员和咖啡烘焙企业主的业主(品尝者)和受过训练的味道测试的雇员，在双盲试验中，比较使用苏门答腊、秘鲁和洪都拉斯阿拉比卡豆(对照豆)的标准优质咖啡豆与通过本发明的方法产生的咖啡豆(菌丝体化的豆)。菌丝体化的豆和对照豆均在试验当天时进行烘焙。这些与对照一起装杯，使用标准咖啡品尝技术。

证实菌丝体化的风味增强效应。品尝者在该不知情味道测试中取样每个品种的菌丝体化的和正常酿造。记录笔记。在品尝结束时，鉴定用于每杯的咖啡豆。

首先评论菌丝体化的苏门答腊，它描述为具有比对照苏门答腊更浓厚的醇度、更丰富和更少的苦味风味。品尝者陈述这是他们意识到实际上去除味道缺陷和实际上增强风味的唯一方法。

菌丝体化的秘鲁同样显示当菌丝体化时值得注意的风味增强，更少苦味、更甘甜和显著“更透亮的”杯。尽管是高质量豆，但对照秘鲁通过比较尝起来“很单调”。

在两个品尝者中，一个品尝者能够品尝出洪都拉斯酿造中的差异。本发明的方法导致去除咖啡中发现的苦味化合物，导致味道更佳的一杯咖啡。

味道比较2阿拉比卡豆

菌丝体化的咖啡味道测试在咖啡厅举行。咖啡师/焙烧师(品尝者)递送其内部苏拉威西阿拉比卡咖啡(印尼起源)的正式装杯。豆选自目录，并且菌丝体化的豆和对照豆两者(阿拉比卡)均在装杯当天进行烘焙。结果显示菌丝体化的咖啡(通过本发明的方法产生)具有改善的风味谱。

品尝者将菌丝体化的咖啡描述为比原始豆更少酸度、更甘甜、醇度更浓厚、更丰富和总体更佳的味道。味道测试中的几个其他参与者也注意到菌丝体化的咖啡中发现的风味增强。

味道比较3罗巴斯塔豆

咖啡专业人员和咖啡烘焙企业主的业主(品尝者)和受过训练的味道测试的雇员，在双盲试验中，比较对照罗巴斯塔咖啡豆与通过本发明的方法产生的罗巴斯塔咖啡豆。由于罗巴斯塔的高酸度和苦味，由100％罗巴斯塔豆制备的咖啡一般视为不能饮用的。因此，罗巴斯塔咖啡豆通常不单独使用，相反，罗巴斯塔豆通常进行预加工(例如清蒸)，随后与更昂贵的豆掺和以使得它可口。

由于它的苦味，这种质量较低的豆被一些人视为不能饮用的，但罗巴斯塔在商业上用于咖啡掺和物中，以降低价格。罗巴斯塔在其用途中不断增长，并且咖啡市场的罗巴斯塔分割已从2008年市场的39％增长到2013年市场的41％。

品尝者同意菌丝体化的罗巴斯塔“无疑”是比非菌丝体化的更好的一杯咖啡。一位品尝者评论“你们已经毫无疑问地证明了你们的技术起作用”；另一位品尝者评论他是自称的咖啡专家，并且“我将每天都喝这种菌丝体化的罗巴斯塔”，同时述及非菌丝体化的咖啡是不可口的。更具体而言，他注意到杯中苦味和酸度的显著缺乏，伴随味道中的更浓厚醇度。品尝者述及非专业性的咖啡品尝者将能够品尝且体会到差异，并且菌丝体化的罗巴斯塔拥有很大的市场价值。烘焙公司的其他雇员也注意到差异。

味道测试结果明确证实本文过程增强咖啡的味道。结果显示本发明的过程从阿拉比卡和罗布斯塔咖啡豆两者中去除味道缺陷如苦味，并且增强其风味和价值。过程导致对于罗布斯塔或阿拉比卡豆更甘甜、醇度更浓厚和更丰富味道的咖啡。

味道比较4可可豆

将通过实施例6的方法制备的可可豆加工成巧克力且进行品尝，以与通过未经历实施例6中的过程的豆制备的巧克力比较。品尝者陈述与由未经处理的可可豆制备的巧克力相比较，来自菌丝体化的巧克力的巧克力具有更浓厚、更顺滑和更甘甜的芳香和味道，伴随更少的苦味、涩味和/或酸味。品尝者陈述与由未经处理的可可豆制备的巧克力相比较，需要更少的糖和/或其他甜味剂例如乳制品来制备非常可口的巧克力。

Claims (8)

1.一种用于制备菌丝体化的可可产品的方法，其包括：

a)提供制备的可可豆，其包括下述步骤：

i.提供可可豆；

ii.将所述可可豆灭菌；

b)提供作为浸没真菌液体组织培养物的制备的真菌组分，其中所述真菌组分选自以下之一：灵芝(G.lucidum)、猴头菇(H.erinaceus)和桦褐孔菌(I.obliquus)；

c)用所述制备的真菌组分接种所述制备的可可豆；和

d)培养所述制备的可可豆和制备的真菌组分以允许菌丝体化来制备所述菌丝体化的可可产品，其中所述菌丝体化的可可产品相比于非菌丝体化的可可豆制备的可可产品具有更少的苦味且所述菌丝体化的可可产品缺乏真菌味道。

2.权利要求1的方法，其中所述方法降低至少一种不期望有的味道组分的量。

3.权利要求1的方法，其中所述提供制备的可可豆的步骤进一步包括使所述可可豆水合。

4.权利要求3的方法，其中所述可可豆水合至60％水分水平或30％水分水平。

5.权利要求1的方法，其中所述制备的真菌组分是灵芝。

6.权利要求1的方法，其中所述制备的真菌组分通过包括在非限定型培养基上维持真菌菌株的方法进行制备，所述非限定型培养基包含可可豆水提取物和能量来源。

7.权利要求1的方法，其中所述培养步骤进行7天。

8.一种通过权利要求1的方法制备的菌丝体化产品。