KR20200006529A - 조질의 아스코마이신을 정제된 피메크롤리무스로 전환하는 방법 - Google Patents

조질의 아스코마이신을 정제된 피메크롤리무스로 전환하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시사항은 아스코마이신을 피메크롤리무스로 전환하는 개선된 방법에 관한 것이다. 기술용 아스코마이신이 트리페닐포스핀 및 N-클로로숙신이미드(NCS)로 염소화되어 조질의 피메크롤리무스를 수득하고, 이는 그 후, HPLC 및 후속적인 결정화로 추가로 정제된다. 본 개시사항의 방법은 아스코마이신 출발물질의 사전 정제없이 고압 액체 크로마토그래피에 의해 피메크롤리무스의 가까운 동족체를 제거할 수 있게 한다. 이 개선은 산업적으로 적용가능할 수 있게 그리고 저렴하게 아스코마이신을 피메크롤리무스로 전환할 수 있게 한다.

Description

조질의 아스코마이신을 정제된 피메크롤리무스로 전환하는 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2017년 5월 1일자로 출원된 미국 가출원 제62/492,394호를 우선권 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시사항은 하기 화핫긱 I의 피메크롤리무스로도 알려진 33-에피-클로로-33-데스옥시아스코마이신의 제조 방법을 기술한다:
Figure pct00001
(I).
피메크롤리무스(화학식 I)는 EP 0427680에 개시된 공지된 매크롤라이드(macrolide) 화합물이며, 항-염증성, 항-증식성 및 면역억제성을 갖는다. 피메크롤리무스는 면역학적-매개 질환, 예를 들어 건선, 아토피성 피부염과 같은 피부 질환을 포함하는, 예를 들어, 염증성, 자가-면역성 및 과증식성 질환의 치료 및 예방; 예를 들어 포도막염, 각막형성술 및 만성 각막염을 포함하는 자가-면역 질환과 같은 눈의 면역-매개 상태; 알레르기 상태, 예를 들어 춘분 결막염, 염증성 상태, 각막 이식의 치료에 유용하다. 이는 아토피성 피부염의 국소 치료에 대한 Elidel®의 약학적 활성 성분으로 승인되었다.
보호기를 사용하거나 사용하지 않는, 다른 공정 단계를 사용하는 몇몇 다른 절차가 33-에피클로로-33-데스옥시아스코마이신을 생산하는 것으로 공지되어 있다.
EP 0427680은 중간체로서 3개의 다른 실릴화 화합물을 사용하는 4개의 화학적 단계에서의 아스코마이신(화학식 ASC)으로부터 피메크롤리무스의 합성을 기술한다. 전체 수율은 16%이다.
Figure pct00002
WO 2010/134027A는 비닐 아세테이트, Novozym 435, tert-부틸디메틸실릴 트리플루오르메탄설포네이트, 2,6-루티딘, 디클로로트리페닐포스포란 등과 같은 시약 및 효소를 사용하고 중간체로서 4 가지 다른 화합물을 사용하는 5개의 화학적 및 효소적 단계에서의 아스코마이신으로부터 피메크롤리무스의 합성을 기술한다. 전체 수율은 30.8%이다. 아스코마이신 디아세테이트를 통한 합성은 4 개의 화학적 및 효소적 단계를 필요로 하고, 3 가지 중간체 및 발암성 및 독성 시약, 예컨대 카본테트라클로라이드 및 디메틸아미노피리딘을 포함한다. 전체 수율은 이론치의 약 13.9%로 저조하다.
WO 2006/060614는 C24 하이드록시기를 보호하지 않지만 C32 하이드록시기를 이탈기 트리플루오로메탄설포네이트로 전환하여 아스코마이신을 피메크롤리무스로 전환하는 방법을 기술한다. 95.75 면적%의 HPLC 순도가 달성된다.
US 2009/0082386은 아스코마이신을 정제하고 이러한 정제된 아스코마이신을 피메크롤리무스로 전환하는 방법을 기술한다. 아스코마이신은 먼저 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 출발 물질을 정제하기 위해 다중 결정화되며, 이로부터 피메크롤리무스가 형성된다. 이 공정에서 계산된 전체 수율은 이론치의 17.6%이다.
WO 2005/010015는 수착 수지(sorption resin)를 사용하여 매크롤라이드를 정제하는 방법을 기술한다. 용리율(elution rate) 및 분획의 수로부터, 이러한 정제는 시간이 많이 소요되는 것으로 계산되고 따라서 산업적으로 적용되지 않는다.
WO 2006/040111에는 트리페닐포스핀 및 N-클로로숙신이미드(NCS)에 의한 아스코마이신의 염소화에 의한 피메크롤리무스의 합성이 기술되어 있다. 혼합물을 실리카 겔 상에서 추출 및 크로마토그래피로 워크업(work up) 한 후 에탄올 및 물로 결정화하여 순도 98%의 피메크롤리무스를 수득한다. 원료인 아스코마이신이 매우 고가이므로 수율이 만족스럽지 않다. 실제로, CH 692 839, US 6,620,325 및 US 7,148,346에 기술된 바와 같이 복잡한 역류 추출에 의해서만 수득될 수 있는, 고순도 아스코마이신이 사용되어야 한다. 상업적으로 이용가능한, 저렴한 기술-등급의 아스코마이신이 사용되면, 결과물인 피메크롤리무스는 기술 등급의 아스코마이신 및 기타 관련 물질로부터의 에틸 및 데스메틸렌(desmethylene) 동족체를 함유한다. 이러한 기술 등급의 피메크롤리무스는 약학적 성분으로 사용될 수 없다.
또한, 피메크롤리무스와 같은 약학적 활성 물질에 대한 98%의 순도는 최신 기술이 아니다. 99% 이상의 순도가 보다 일반적이다. 이러한 고순도는 WO 2006/040111에 기술된 바와 같이 실리카 겔상에서 크로마토그래피 정제만으로는 달성될 수 없다. 99%의 순도를 달성하기 위해, 조질의 피메크롤리무스는 US 7,148,346에 기술된 바와 같이 정교한 역류 추출에 의해 그리고 이어서 크로마토그래피 정제 및 결정화에 의해 처리되어야 하며, 이로 인해 추가 수율 손실 및 추가 제조 비용이 발생한다. 이와 같이, 정제된 피메크롤리무스를 생성하는 조질의 또는 기술-등급의 아스코마이신의 종래의 광범위한 정제 없이 조질의 또는 기술-등급의 아스코마이신으로부터 정제된 피메크롤리무스를 제조하는 방법을 당해 분야에서 여전히 필요로 한다.
다음은 이러한 견지의 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 개시사항의 하나 이상의 견지의 단순한 요약을 제공한다. 이 요약은 모든 고려된 견지에 대한 포괄적인 개요가 아니며 모든 견지의 핵심 또는 중요한 요소를 나타내거나 임의의 또는 모든 견지의 범위를 설명하기 위한 것이 아니다. 그 목적은 하나 이상의 견지의 일부 개념을 이후에 제시되는 보다 상세한 설명의 서두로서 단순화된 형태로 제시하는 것이다.
일 구현예에서, 본 개시사항은
a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계; 및
b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
를 포함하는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 견지에서, 상기 염소화하는 단계는 조질의 아스코마이신을 유기 용매 중에서 디클로로트리페닐포스포란으로 염소화하는 단계를 포함한다. 다른 추가의 견지에서, 염소화하는 단계는 트리페닐포스핀과 염소화 알칸 또는 N-클로로숙신이미드의 반응으로부터 원위치(in situ)에서 염소화제를 발생시키는 단계를 포함한다. 추가의 견지에서, 염소화제는 디클로로트리페닐포스포란이다.
다른 견지에서, 본 방법에 사용된 조질의 아스코마이신은 90% 이상의 아스코마이신을 함유한다. 다른 견지에서, 본 방법에 사용된 조질의 아스코마이신은 최대 2% (w/w) 21-데스메틸렌 아스코마이신, 최대 1.5% (w/w) 17-에틸아스코마이신, 및/또는 최대 4% (w/w) 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신을 함유한다. 일 견지에서, 조질의 아스코마이신은 기술-등급의 아스코마이신이다. 일 견지에서, 조질의 아스코마이신은 염소화하는 단계 전에 정제되지 않는다.
다른 견지에서, 정제된 피메크롤리무스는 조질의 피메클로리무스에 비하여 위치 C19, C17, C11에 존재하거나 위치 C21에 존재하지 않는 1개의 메틸렌기만 다른, 피메크롤리무스의 하나 이상의 동족체, 또는 피메크롤리무스의 C21 에피머를 감소된 농도로 함유한다.
본 방법의 일 견지에서, 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계는 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하며, 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 견지에서, 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계는 다음 단계를 포함하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성한다:
i) 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 제공하는 단계;
ii) 상기 메인 분획을 농축한 후, 희석하는 단계;
iii) 상기 메인 분획을 고압 액체 크로마토그래피를 통해 재순환시키는 단계; 및
iv) 선택적으로 단계 ii) 및 iii)을 반복하는 단계.
추가의 견지에서, 정제된 피메크롤리무스는 추가 정제 단계를 거치지 않는다.
본 발명의 일 견지에서, 고압 액체 크로마토그래피는 알킬화 실리카, 디올 실리카, 또는 시아노 실리카로 구성되는 군으로부터 선택된 정지상을 사용한다. 다른 견지에서, 고압 액체 크로마토그래피는
비극성 용매, 극성 양성자성 용매 및 선택적인 극성 비양성자성 용매;
하나 이상의 C5-C8 알칸, 에테르 및 아이소프로판올;
하나 이상의 C5-C8 사이클로알칸, 에테르 및 아이소프로판올;
하나 이상의 C5-C8 알칸, 에테르 및 에탄올;
하나 이상의 C5-C8 사이클로알칸, 에테르 및 에탄올;
헵탄 81.1 ± 0.5%:메틸-tert-부틸에테르 14.4 ± 0.5%:아이소프로판올 4.5 (4.2-4.9)%;
C1-C3 알코올 또는 아세토니트릴, 선택적으로 에테르, 및 선택적으로 산; 또는
물, 수 혼화성 용매, 선택적으로 에테르 및 선택적으로 산으로 구성되는 군으로부터 선택된 이동상을 사용한다.
다른 견지에서, 정제하는 단계는 30% 물:70% 메탄올 이동상을 사용하여 옥타데실 실리카 정지상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 조질의 피메크롤리무스를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 견지에서, 본 방법은 순도 98% 초과, 보다 바람직하게는 99% 초과, 보다 더 바람직하게는 99.5% 초과의 순수한 정제된 피메크롤리무스를 생성한다.
본 발명의 다른 구현예는
a) 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계로서, 상기 조질의 피메크롤리무스는 조질의 아스코마이신의 추가 정제없이 조질의 아스코마이신의 염소화에 의해 제조되는 단계;
b) 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
를 포함하는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법을 포함한다.
추가의 견지에서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과, 보다 더 바람직하게는 99.5% 초과의 순수한 것이다.
다른 견지에서, 본 방법에 사용된 조질의 아스코마이신은 90% 이상의 아스코마이신을 함유한다. 또 다른 견지에서, 조질의 아스코마이신은 최대 2% (w/w) 21-데스메틸렌 아스코마이신, 최대 1.5% (w/w) 17-에틸아스코마이신, 및/또는 최대 4% (w/w) 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신을 함유한다. 조질의 아스코마이신은 기술-등급의 아스코마이신일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음의 단계로 구성되는 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법을 포함한다:
a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계;
b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계;
c) 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계.
본 발명의 추가의 견지에서, 정제하는 단계 b)는 다음의 정제하는 단계를 포함하여 피메크롤리무스를 함유하는 상기 목표 분획을 생성한다:
i) 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 제공하는 단계;
ii) 상기 메인 분획을 농축한 후, 희석하는 단계;
iii) 상기 메인 분획을 고압 액체 크로마토그래피를 통해 재순환시키는 단계; 및
iv) 선택적으로 단계 ii) 및 iii)을 반복하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음 단계로 필수적으로 구성되는 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법을 포함한다:
a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계;
b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계; 및
c) 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계.
본 발명의 이들 및 다른 견지는 다음의 상세한 설명의 검토에 의해 보다 완전하게 이해될 것이다.
도 1은 피메크롤리무스를 제조하는 당해 분야에 기초한 방법을 본 개시사항의 방법과 비교한 플로우 챠트를 도시한다.
도 2는 실시예 2에서 수득된 정제용 HPLC 크로마토그램(preparative HPLC chromatogram)의 예를 도시한다.
첨부된 도면과 관련하여 아래에 설명된 상세한 설명은 다양한 구성의 설명으로서 의도되며 본원에 기술된 개념이 실시될 수 있는 유일한 구성을 제시하는 것으로 의도되지 않는다. 상세한 설명은 다양한 개념의 철저한 이해의 제공을 목적으로 하는 특정한 세부 사항을 포함한다. 그러나, 이들 개념은 이들 특정한 세부 사항 없이도 실시될 수 있다는 것이 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 경우에는, 이러한 개념의 모호함을 방지하기 위해 잘 알려진 구성 요소를 블록 다이어그램으로 도시한다.
본원에 사용될 때, 용어, "약"은 당해 분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 근사하게 정의된다. 비-제한적인 일 구현예에서, 용어 "약"은 10% 이내, 바람직하게는 5% 이내, 보다 바람직하게는 1% 이내, 그리고 가장 바람직하게는 0.5% 이내로 정의된다.
본원에 사용될 때, "조질의 아스코마이신"은 적절한 어세이(assay) 기술(예, HPLC)에 의해 측정될 때, 약 0.2% (w/w) 초과의 21-데스메틸렌 아스코마이신, 약 0.1% (w/w) 초과의 17-에틸아스코마이신, 약 0.1% (w/w) 초과의 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신 및 96% (w/w) 이하의 아스코마이신을 함유하는 아스코마이신으로 정의된다.
본원에 사용될 때, "기술-등급의 아스코마이신"은 적절한 어세이 기술(예, HPLC)에 의해 측정될 때, 90% 이상의 아스코마이신을 함유하는 조질의 아스코마이신으로 정의된다. 기술-등급의 아스코마이신은 최대 2% (w/w) 21-데스메틸렌 아스코마이신, 최대 1.5% (w/w) 17-에틸아스코마이신 및 최대 4% (w/w) 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신을 함유할 수 있다.
본원에 사용될 때, "순수한 아스코마이신"은 적절한 어세이 기술에 의해 측정될 때, 0.2% (w/w) 미만의 21-데스메틸렌 아스코마이신, 0.1% (w/w) 17-에틸아스코마이신, 0.1% (w/w) 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신 및 96% (w/w) 이상의 아스코마이신을 함유하는 아스코마이신으로 정의된다.
본원에 사용될 때, "정제된 피메크롤리무스"는 위치 C19, C17, C11에 존재하거나 또는 C21위치에서 존재하지 않는 1개의 메틸렌기만 다른, 피메크롤리무스의 동족체 및 피메크롤리무스의 C21 에피머를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 일부 또는 모든 불순물의 제거에 영향을 미치도록 정제된 피메크롤리무스로 정의된다.
본원에 사용될 때, "실질적으로 순수한 피메크롤리무스"는 적절한 어세이 기술에 의해 측정될 때, 98% 초과의 순수한 피메크롤리무스이다.
본원에 사용될 때, "실온"은 약 25℃를 의미한다.
관련 기술에 개시된 피메크롤리무스의 생산 또는 정제를 위한 다양한 절차가 있지만, 쉽고, 우수한 수율을 제공하며, 저렴하고 산업적으로 적용가능한 정제된 피메크롤리무스의 생산 방법이 여전히 필요하다. 본 발명은 조질의 아스코마이신(기술-등급의 아스코마이신일 수 있음)으로부터 정제된 피메크롤리무스를 제조하는 동시에 피메크롤리무스를 정제하는데 필요한 단계의 수를 또한 감소시킬 수 있다. 이는 고품질의 저렴하고 보다 순수한 피메크롤리무스 활성 성분을 초래한다.
놀랍게도 정제된 피메크롤리무스는 조질의 아스코마이신을 염소화한 후, 결과물인 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피로 정제함으로써 조질의 아스코마이신으로부터 제조될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 일 견지에서, 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제함으로써 정제된 피메크롤리무스를 제조하는 방법을 포함하고, 상기 조질의 피메크롤리무스는 조질의 아스코마이신의 추가 정제없이 조질의 아스코마이신의 염소화에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 조질의 아스코마이신은 기술-등급의 아스코마이신이다. 일부 구현예에서, 고압 액체 크로마토그래피에 의한 결과물인 실질적으로 순수한 피메크롤리무스는 결정화 단계에서 추가로 결정화될 수 있다.
놀랍게도 위치 C19, C17, C11에 존재하거나 위치 C21에 존재하지 않는 1 개의 메틸렌기만 다른, 피메크롤리무스의 동족체 및 C21 에피머가 HPLC에 의해 제거될 수 있다는 것이 발견되었다. 지금까지, 피메크롤리무스를 함유하는 혼합물에서 이들 동족체를 제거할 수 있는 유일한 가능성은 광범위한 정제하는 단계를 거친 아스코마이신으로부터 피메크롤리무스를 합성하는 것이었다. 따라서, 본 출원은 아스코마이신의 사전 정제없이 조질의 아스코마이신으로부터 순수한 피메크롤리무스를 생산하는 단순한 방법을 제공한다.
제1 단계에서, 보호되지 않은 기술-등급의 아스코마이신은 선택적으로 염기의 존재하에, 유기 용매 중에서 적절한 염소화제, 예를 들어 디클로로트리페닐포스포란과 반응한다. 염소화제 및 선택적으로 염기는 선택적으로 유기 용매 중에서 각각 또는 일반적인 바와 같이 혼합되고, 수득된 혼합물은 반응에 충분한 반응 시간 동안 적절한 온도에서 교반된다.
일 구현예에서, 염소화제는 디클로로트리페닐포스포란이다. 염소화제는 일반적인 바와 같이 사용될 수 있거나 또는 예를 들어 트리페닐포스핀을 염소화 알칸, 예를 들어 C1-C2 알칸, 예컨대 CCl4, C2Cl6, 바람직하게는 CCl4로 처리하거나; 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물에서 트리페닐포스핀을 NCS에 첨가함으로써, 원 위치(in situ)에 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물은 탄화수소, 예를 들어 방향족 탄화수소, 예를 들어 벤젠, 톨루엔; 에테르 예컨대, 테트라하이드로푸란(THF); 니트릴, 예를 들어 아세토니트릴; 염소화 알칸, 예컨대 CCl4; 및 상기한 용매의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 반응 혼합물은 적절한 추가의 용매 또는 용매들로 희석될 수 있으며, 이는 일부 구현예에서 교반을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 유기 용매는 방향족 탄화수소(예, 톨루엔), 에테르(예, 테트라하이드로푸란), 니트릴(예, 아세토니트릴), 또는 할로겐화 알칸(예, 염소화 알칸) 또는 이들의 혼합물(예, 톨루엔 및 아세토니트릴)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 디클로로트리페닐포스포란의 제조를 위해 트리페닐포스핀 및 할로겐화 알칸을 염소화제로 사용하는 경우에, 바람직한 유기 용매는 염소화 알칸을 포함한다. 트리페닐포스핀 및 염소화 알칸을 용매로서 사용하는 경우에, 일 견지에서, 염소화 알칸이 디클로로트리페닐포스포란의 생산에 할로겐 공급원으로서, 그리고 다른 견지에서 유기 용매로서 사용될 수 있지만, 추가의 유기 용매, 예를 들어 예컨대 상기한 바와 같은 용매의 첨가가 제외되는 것은 아니다. 아스코마이신의 염소화에 특히 바람직한 것은 테트라하이드로푸란 중의 NCS 및 트리페닐포스핀의 사용이다.
적절한 염기는 예를 들어 질소 함유 염기, 예컨대 3급 아민 또는 적어도 하나의 질소 원자를 함유하는 헤테로사이클릭 염기, 보다 바람직하게는 방향족 헤테로사이클릭 염기, 예컨대 피리딘 또는 이미다졸; 가장 바람직하게는 2,4,6-트리메틸피리딘(s-콜리딘)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야의 기술자에게 공지된 유기 염기이다.
아스코마이신과 염소화제의 비는 적합하게는 적어도 등가비(equivalent ratio)(즉, 적어도 1:1의 아스코마이신:염소화제)이며, 바람직하게는 과량의 염소화제가 사용된다. 아스코마이신 대 염소화제의 비는 적합하게는 약 1:1 내지 약 1:5이다. 예를 들어, 아스코마이신과 염소화제는 약 1:1 내지 약 1:3의 비(즉, 아스코마이신 당량 당, 1 내지 3 당량의 염소화제), 예컨대 약 1:1 내지 약 1:2; 예를 들어, 약 1:1 내지 약 1:5, 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1:1.3, 예를 들어 1:1 내지 1:3의 비, 예컨대 1:1 내지 1:2; 예를 들어, 1:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:1 내지 1:1.3의 비로 사용될 수 있다.
아스코마이신에 대한 NCS의 바람직한 초기 몰 과량은 0 - 30 몰%이다. 보다 바람직하게는, 아스코마이신에 대한 NCS의 몰 과량은 8 몰%이다.
아스코마이신과 염기의 비는 적어도 등가비(즉, 적어도 1:1)이어야 하고, 바람직하게는 과량의 염기가 사용된다. 예를 들어, 아스코마이신과 염기는 약 1:1 내지 약 1:10의 비(아스코마이신 당량 당, 1 내지 10 당량의 염기), 예컨대 약 1:2 내지 약 1:10, 예를 들어 약 1:3 내지 약 1:9, 바람직하게는 약 1:2 내지 약 1:4, 또는 이들 사이의 임의의 정수비 또는 하위 범위로 사용될 수 있다.
아스코마이신에 대한 트리페닐포스핀의 바람직한 초기 몰 과량은 0-30 몰%이다. 보다 바람직하게는, 아스코마이신에 대한 트리페닐포스핀의 초기 몰 과량은 3 몰%이다.
트리페닐포스핀 및 염소화 알칸을 용매로서 사용하는 경우에, 염소화 알칸은 일 견지에서는 디클로로트리페닐포스포란의 제조에 대한 할로겐 공급원으로서, 그리고 다른 견지에서는 유기 용매로서 사용될 수 있지만, 추가의 유기 용매, 예를 들어, 예컨대 상기 언급된 것과 같은 용매의 첨가가 배제되지 않는다.
적절한 반응 온도는 실온 내지 약 100℃, 예컨대 실온 내지 약 90℃, 실온 내지 약 80℃, 또는 실온 내지 약 70℃의 온도를 포함한다.
염소화제의 제조를 위해 CCl4와 같은 염소화 알칸, 및 트리페닐포스핀을 사용하는 경우에, 바람직한 반응 온도는 염소화 알칸의 환류 온도이다.
트리페닐포스핀 및 NCS를 사용하는 경우에, 적합한 반응 온도는 실온 내지 약 100℃의 온도를 포함한다. 바람직한 반응 온도는 25 내지 40℃이다. 반응에 충분한 적합한 반응 시간은 1 내지 40시간이다. 바람직하게는, 반응 시간은 10 내지 20시간이다. 요구되는 반응 시간은 선택된 온도에 의존하고, 반응 시간의 최적화는 당해 분야의 기술자의 지식 내에 있다. 반응 진행은 각각 UV 검출과 결합된 박층 크로마토그래피, HPLC 및 LC를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 반응 모니터링을 위한 UV 검출에 적합한 파장은 당해 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있으며, 254 nm를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
충분한 반응 시간 후, 반응 생성물은 바람직하게는 수-불혼화성 용매, 예컨대 사이클로헥산으로의 희석 및 수성 산 용액, 예컨대 시트르산과의 반응에 의해 워크 업(work up)된다. 염기(예, s-콜리딘) 몰 당 적어도 1/3 몰의 시트르산이 사용되며, 바람직하게는 1/3 내지 1 몰, 보다 바람직하게는 2/3 몰이 사용된다. 산 수용액은 수-혼화성 용매, 예컨대 메탄올 또는 에탄올, 바람직하게는 메탄올을 함유할 수 있다. 수성 및 수-불혼화성 층이 분리된다. 수-불혼화성 층은 물 및 선택적으로 메탄올로 다시 추출될 수 있다.
추출 후, 용매를 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 유기상으로부터 증발시켜서, 잔류물을 수득한다. 그 후, 잔류물을 적합한 용매에 용해시킨다. 적합한 용매는 피메크롤리무스가 쉽게 용해되고, 증발에 의해 쉽게 제거될 수 있는 용매, 예컨대 아세톤, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 아이소프로판올, 바람직하게는 아세톤이다.
결과물인 조질의 피메크롤리무스의 용액은 HPLC에 의해 추가로 정제된다. 공급물 용액은 용매를 증발시키고 이동상과 유사하지만 피메크롤리무스에 대한 우수한 용매, 바람직하게는 아이소프로판올, 메틸-tert-부틸에테르 및 n-헵탄인 성분을 충분히 함유하는 용매 혼합물을 첨가함으로써 제조된다. 아세토니트릴/물(예, 12% (w/w) 물:88% (w/w) 아세토니트릴)이 이동상으로 사용되면, 예를 들어 동일한 용매 혼합물(12% (w/w) 물:88% (w/w) 아세토니트릴)이 공급물 용액의 제조에 사용될 수 있다.
당해 분야의 기술자는 고압 액체 크로마토그래피를 통한 조질의 피메크롤리무스의 정제가 폐기물 분획 및 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 초래할 것임을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 고압 액체 크로마토그래피를 통해 수득된 메인 분획은 목표 분획을 제공하도록 상기 메인 분획을 재순환시킴으로써 고압 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 폐기물 분획은 메인 분획으로부터 제거되어 폐기된다. 일부 구현예에서, 목표 분획은 3 내지 6회의 이러한 재순환 사이클 후에 수득된다. 일 구현예에서, 4회의 재순환 사이클이 바람직하다. 일부 구현예에서, 메인 분획은 농축되고, 적절한 용매(예, 상기 기술된 바와 같이 이동상과 유사하지만 피메크롤리무스에 대한 우수한 용매인 성분을 충분히 함유하는 용매 혼합물)에 용해되고 재순환된다. 도 2는 이러한 재순환되는 스트림의 크로마토그램의 예를 도시한다; 제1 HPLC 사이클 후, 분획 F1이 폐기되고, 재순환 분획에 추가로 HPLC이 행하여지고; 이 공정은 목표 분획 F2가 얻어질 때까지 반복된다.
본 개시사항의 일 구현예에서, HPLC 정제는 알킬화 실리카 정지상을 포함하는 정지상을 사용하여 수행된다. 알킬화 실리카 정지상은 메틸-, 부틸-, 옥틸-, 도데실-, 또는 옥타데실 실리카일 수 있다. 알킬화 실리카는 Daisogel C1-P, Daisogel C4-P, Daisogel C8-P, Daisogel ODS, Phenomenex Luna Prep C18(2), YMC Pack ODS-AQ 12S11, YMC ODS-AQ(10 μm, 120 Å) 또는 Kromasil C18과 같은 상업적으로 이용가능한 알킬화 실리카로부터 선택될 수 있다. 이러한 정지상과 함께 사용하기에 적합한 이동상은 물 플러스 C1-C3 알코올(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올) 또는 아세토니트릴을 포함하고, 선택적으로 에테르(예, 메틸-tert-부틸에테르 또는 디에틸에테르)를 추가로 포함하고, 및/또는 선택적으로 산, 예를 들어 H3PO4 또는 TFA를 추가로 포함한다. 이동상에서 에테르 및/또는 산 농도의 최적화는 당해 분야의 기술자의 지식 범위 내에 있다.
바람직한 구현예에서, HPLC 정제는 옥타데실-실리카를 정지상으로 그리고 이동상으로 물:메탄올 또는 물:아세토니트릴을 사용하여 수행된다. 84% (w/w) 이상의 아세토니트릴의 농도, 예컨대, 예를 들어, 12% (w/w) 물:88% (w/w) 아세토니트릴이 특히 바람직하다.
생산성을 증가시키기 위해, 조질의 피메크롤리무스는 옥타데실 실리카 컬럼에서 높은 적재(loading)로 크로마토그래피에 의해 전처리될 수 있다. 이 처리는 트리페닐포스핀 옥사이드, 아스코마이신 및 33-에피-클로로-Δ23 ,24-아스코마이신을 피메크롤리무스로부터 분리한다.
메탄올:물을 이용한 크로마토그래피에 대한 바람직한 온도는 35 내지 70℃, 바람직하게는 45 내지 55℃, 보다 바람직하게는 50℃이다.
본 발명의 다른 구현예에서, HPLC는 디올-실리카를 정지상으로 사용하여 수행된다. 디올-실리카는 YMC Pack-120-HG, YMC Pack-80-HG 및 Kromasil 60-10 Diol과 같은 상업적으로 이용가능한 디올-실리카와 같은 임의의 디올-실리카일 수 있다. 이동상은 비극성 용매, 예를 들어 알칸, 사이클로알칸, 페트로에테르(petrolether); 플러스 극성 양성자성 용매, 예를 들어 알코올, 물; 플러스 선택적으로 극성 비양성자성 용매, 예를 들어 에테르, 바람직하게는 메틸-tert-부틸에테르; 사이클릭 에테르, 바람직하게는 THF; 에스테르, 바람직하게는 에틸 아세테이트; 할로겐화 용매, 바람직하게는 디클로로메탄을 포함할 수 있다. 바람직한 이동상은 C5-C8 알칸(예, 펜탄, 헥산, 헵탄 또는 옥탄) 또는 사이클로알칸(예컨대 사이클로헥산, 메틸사이클로헥산, 디메틸사이클로헥산), 플러스 에테르, 예컨대 메틸-tert-부틸에테르, 테트라하이드로푸란, 플러스 아이소프로판올 또는 에탄올이다. 이동상에서 용매 비율의 최적화는 당해 분야의 기술자의 지식 내에 있다.
일 구현예에서, HPLC는 Kromasil 60-10 Diol, 60Å 공극, 10μm 입자를 정지상으로서 그리고 헵탄 81.1 ± 0.5% (w/w):메틸-tert-부틸에테르 14.4 ± 0.5% (w/w):아이소프로판올(IPA) 4.5 (4.2-4.9)% (w/w)를 이동상으로 사용하여 수행된다; 즉, 아이소프로판올은 이동상의 4.2-4.9% (w/w), 예컨대 4.5% (w/w)일 수 있다.
다른 구현예에서, HPLC는 시아노-실리카 정지상을 사용하여 수행된다. 시아노-실리카는 Phenomenex Luna CN을 포함하여 상업적으로 이용가능한 시아노-실리카와 같은 임의의 시아노-실리카일 수 있다. 이러한 구현예에서 이동상은 물 + C1-C3 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올)을 포함할 수 있다. 바람직한 이동상은 물 + 메탄올(35% (w/w) + 65% (w/w))이다. 이 크로마토그래피 시스템은 피메크롤리무스의 호변 이성질체를 분리할 수 있다.
합한 크로마토그래피 메인 분획을 진공에서(150 mbar에서) 박층 증발기 상에서 증발된다. 잔류물을 아세톤에 용해시킨다. 사이드 분획을 합하고 제2 크로마토그래피 단계에서 추가로 정제한다.
얻어진 피메크롤리무스는 적합한 용매, 예를 들어 에틸 아세테이트 사이클로헥산/물, 아세톤/헵탄으로부터 결정화에 의해 추가로 정제된다. 바람직한 용매는 증발 및 건조 단계를 갖는 에탄올/물이다. 에탄올/물을 사용하여 결정화하는 경우, 물질은 먼저 용매 교환(즉, 아세톤에서 에탄올로)된다. 그 후, 결정화 동안 물을 에탄올 용액에 첨가하고, 시딩(seeding)이 또한 사용될 수 있다. 결과물인 생성물의 크로마토그래피 순도는 > 99% (w/w)이다.
HPLC를 통해 조질의 피메크롤리무스 생성물을 정제함으로써, 고가이고 광범위한 역류 추출(예컨대, 본원에 참고로 편입된 미국 특허 제7,148,346호에 개시된 것)에 대한 필요성이 방지된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 피메크롤리무스에 HPLC 및 결정화 이상의 추가 정제 단계가 행하여지지 않는 피메크롤리무스의 제조 방법을 포함한다. 이로 인해 실질적으로 순수한 피메크롤리무스를 포함하여 다량의 정제된 피메크롤리무스를 높은 수율로 그리고 덜 광범위한 워크업으로 제조할 수 있는, 상업적-규모의 공정이 초래된다.
도 1은 본 개시사항의 방법을 공지된 방법과 비교하는 플로우 챠트를 도시한다. 상기한 바와 같이, 조질의 피메크롤리무스의 제조에서, 본 발명의 방법은 유사한 방식으로 염소화 반응을 수행하지만, 공지된 방법에서는 필요로 하는, 출발 물질(아스코마이신)의 역류 추출을 필요로 하지 않는다. 조질의 피메크롤리무스로부터 피메크롤리무스 활성 물질의 제조(즉, 정제 단계(들))에서, 공지된 방법의 "단계 1"을 필요로 하지 않는다; 대신에, HPLC 크로마토그래피를 사용하여 정제된 피메크롤리무스를 수득한다.
실시예 1
조질의 아스코마이신의 염소화
상업적으로 이용가능한 121 kg(116.9 kg 100%, 아스코마이신 함유)의 아스코마이신(어세이 > 90%)을 반응기에 넣고, 톨루엔을 첨가하고 진공에서 증류 제거하여 아스코마이신을 공비적으로 건조한다. 잔류물을 THF에 용해시키고, THF 는 다시 증류 제거되고, 새로운 THF로 치환된다.
다른 반응기에서 40 kg의 트리페닐포스핀을 THF에 용해한다. 이 용액에 21.3 kg의 N-클로로숙신이미드가 분획으로 첨가된다. 이 반응 혼합물을 실온에서 교반한 다음, 온도를 실온으로 유지하면서 40 L의 콜리딘을 천천히 첨가한다. THF 중의 아스코마이신 용액을 펌핑하고 39℃에서 교반한다. 배치는 아스코마이신 함량에 대해 분석된다. 아스코마이신 함량이 너무 높으면, 추가 량의 트리페닐포스핀 및 NCS가 첨가되고 교반이 계속된다.
반응 혼합물을 20℃로 냉각한다. 사이클로헥산을 공급하고, 메탄올 및 물 중의 40 kg의 시트르산의 용액을 20℃에서 첨가한다. 상(phases)이 분리된다. 상부 유기상을 물과 메탄올의 혼합물로 세척한다. 세척을 반복한다. 하부 상을 합하고 사이클로헥산으로 2회 재-추출한다. 합한 유기상을 물로 세척한다. 그 후, 사이클로헥산을 증발시킨다. 두꺼운 잔류물을 아세톤에 용해시킨다. 용매를 증발시키고 잔류물을 마지막으로 400 kg의 아세톤에 용해시킨다. 이 용액은 > 70%의 크로마토그래피 순도를 갖는 103 kg(이론치의 86%)의 피메크롤리무스, 10% (w/w) 이하의 아스코마이신, 및 20% (w/w) 이하의 33-에피-클로로-Δ23 ,24-아스코마이신을 함유한다.
HPLC 정제
17.52% (w/w) 피메크롤리무스(= 10 kg 피메크롤리무스)의 어세이를 갖는 이 용액 57.1 kg을 건조되도록 증발시키고, 아이소프로판올, 메틸-tert-부틸에테르 및 n-헵탄의 혼합물에 용해시켜서 181 kg의 공급물 용액을 수득하고, 1.5 kg의 실리카 겔 상에서 여과한다. 여과된 용액은 정지상으로 Kromasil 60-10 Diol, 60 Å 공극, 10 μm 입자가 충전된 컬럼상에서 크로마토그래피 정제를 위한 공급물로서 사용된다. 사용된 이동상은 81.1% (w/w) 헵탄, 14.4% (w/w) 메틸-tert-부틸에테르, 4.5% (w/w) 아이소프로판올이다. 공급물 용액에서 이동상으로 변경할 때, 피메크롤리무스가 공급물 농도에서 이 혼합물에 용해되지 않더라도, 놀랍게도 피메크롤리무스의 결정화가 발생하지 않는다.
분리 후 254 nm의 파장에서 UV 검출기를 사용하여 용리액을 신호에 기초하여 빈(empty), 사이드 및 메인 분획으로 분리한다. 용리가 완료되면, 컬럼을 순수한 아이소프로판올로 재생하고, 두 부분에서의 높은 ΔP로 인해 이동상으로 컨디셔닝이 수행된다.
합한 메인 분획을 진공에서(150 mbar에서) 박층 증발기에서 증발시킨다. 잔류물을 아세톤에 용해시킨다. 피메크롤리무스 농도 6.5% (w/w)의 106.8 kg의 아세톤 용액이 얻어진다. 이는 조질의 공급물 용액 중의 10 kg의 피메크롤리무스로 부터의 6.94 kg의 피메크롤리무스와 같으며, 이론치의 69%의 메인 분획으로부터의 수율을 초래한다.
사이드 분획은 메인 분획과 동일한 방식으로 농축된다. 4.6% (w/w) 피메크롤리무스를 함유하는 다른 54 kg의 아세톤 용액이 수득되고, 이는 추가의 2.5 kg의 피메크롤리무스이며, 이론치의 25% 수율이다. 이 물질을 크로마토그래피 단계로 재순환시켜서 추가의 0.65 kg(이론치의 26%)의 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 수득한다. 메인 분획으로부터의 피메크롤리무스의 합한 수율은 7.59 kg(이론치의 75.9%)이다.
농축 및 결정화
111.2 kg의 피메크롤리무스를 함유하는 아세톤에 용해된 메인 분획의 농축물을 용기에서 합한다. 용액을 진공에서 여과하고 농축한다. 에탄올이 첨가된다. 아세톤 및 에탄올을 진공에서 증류 제거하면서, 추가의 에탄올을 첨가하여 농도를 일정하게 유지한다. 마지막으로, 에탄올을 첨가하여 농도를 25% (w/w) 피메크롤리무스로 조정한다.
물과 에탄올의 혼합물 중의 피메크롤리무스의 서스펜션은 결정화 시드 서스펜션으로 제조된다.
에탄올 중의 25% (w/w) 피메크롤리무스 용액을 30분 동안 환류 온도로 가열하고, 55℃로 냉각하고, 시드 서스펜션을 첨가한다. 혼합물을 55℃에서 추가로 (최고) 45분 동안 교반한다. 탈염수를 2시간 내에 첨가한다. 혼합물을 55℃에서 추가로 30분 동안 교반한다. 서스펜션을 10℃로 냉각하고 10℃에서 교반한다.
결정을 필터-건조기를 통해 여과한다. 케이크를 33% (w/w) 수성 에탄올로 3회 세척한다. 케이크를 수분 함량이 0.1% (w/w) 미만이 될 때까지 진공에서 48℃ 재킷 온도에서 필터-건조기에서 건조하여 105.6 kg의 순수한 피메크롤리무스(이론치의 95%)를 수득한다.
상업용 아스코마이신에 대해 계산된 전체 수율은 86% x 75.9% x 95% = 62%이다. 제조된 정제된 피메크롤리무스는 100.9% (w/w)의 어세이 및 99.52% (w/w)의 크로마토그래피 순도를 갖는다. 이 값은 100% 마이너스 총 불순물을 나타낸다.
실시예 2
아스코마이신을 실시예 1에 기술된 바와 같이 조질의 피메크롤리무스로 염소화하였다.
크로마토그래피 전처리
C18-실리카 정지상(Daiso)으로 충전된 직경 50 mm x 높이 250 mm의 컬럼에서, 7.4 g의 조질의 피메크롤리무스(3.73 g의 100% 순수한 피메크롤리무스를 함유, 어세이 50.4% (w/w))를 용액으로 12% (w/w) 물/88% (w/w) 아세토니트릴에 200 g의 조질의 피메크롤리무스/L(고 적재(load))의 농도로 주입하였다. 피메크롤리무스를 12% (w/w) 물 88% (w/w) 아세토니트릴로 용리하였다. 목표 분획은 3.62 g(유입의 97%)의 피메크롤리무스를 84% (w/w)의 크로마토그래피 순도로 함유하였다.
용매를 목표 분획으로부터 증발시키고, 잔류물을 용리액 12% (w/w) 물/88% (w/w) 아세토니트릴에 70 g/l의 농도로 용해시켰다. 이 용액을 C18-실리카 정지상(Daiso)으로 충전된 직경 50 mm x 높이 250 mm의 컬럼에 주입하고, 재순환으로 크로마토그래피 정제를 행하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 용리액 12% (w/w) 물 : 88% (w/w) 아세토니트릴, 4회의 재순환 사이클.
목표 분획(도 2에 나타낸 바와 같음)은 2.97 g(유입의 82%)의 피메크롤리무스를 98.43% (w/w)의 순도로 함유하였다. 이는 일(day) 당 고정상 kg 당 120 g의 조질의 피메크롤리무스의 생산성에 해당한다.
목표 분획을 실시예 1에 기술된 바와 같이 에탄올/물로부터 농축하고 결정화하였다.
실시예 3
아스코마이신을 실시예 1에 기술된 바와 같이 조질의 피메크롤리무스로 염소화하였다.
크로마토그래피 전처리
C18-실리카 정지상(Daiso)으로 충전된 직경 50 mm x 높이 250 mm의 컬럼에서, 7.8 g의 조질의 피메크롤리무스(3.92 g의 100% 순수한 피메크롤리무스를 함유, 어세이 50.3% (w/w))를 용액으로 12% (w/w) 물: 88% (w/w) 아세토니트릴에 200 g의 조질의 피메크롤리무스/l의 농도로 주입하였다. 피메크롤리무스를 12% (w/w) 물:88% (w/w) 아세토니트릴로 용리하였다. 목표 분획은 3.77 g(유입의 96%)의 피메크롤리무스를 81.3% (w/w)의 크로마토그래피 순도로 함유하였다.
용매를 목표 분획으로부터 증발시키고, 잔류물을 용리액 12% (w/w) 물/88% (w/w) 아세토니트릴에 65 g/l의 농도로 용해시켰다. 이 용액을 C18-실리카 정지상(Daiso)으로 충전된 직경 50 mm x 높이 250 mm의 컬럼에 주입하고, 재순환으로 크로마토그래피 정제를 행하였다. 용리액 12% (w/w) 물:88% (w/w) 아세토니트릴, 6회 재순환 사이클.
목표 분획은 2.83 g(유입의 75%)의 피메크롤리무스를 98.92% (w/w)의 순도로 함유하였다. 이는 200 g의 조질의 피메크롤리무스/고정상 kg/일(day)의 생산성에 해당한다. 목표 분획을 증발시켜서 건조하였다.
잔류물을 75℃에서 3 부의 에탄올 94% (w/w)에 용해시켰다. 시딩 전에 용액을 55℃로 냉각하였고; 결정화가 발생하였고; 1.5 부의 물을 천천히 첨가하였다. 용액을 10℃로 냉각하였다. 혼합물을 밤새 10℃에서 숙성시켰다. 생성물을 여과하고, 1 부피의 냉수로 세척하고, 50℃에서 건조시켰다. 2.72 g 의 피메크롤리무스(유입의 96%)가 분리되었다.
상업용 아스코마이신에 대해 계산된 전체 수율은 86% x 96% x 75% x 96% = 59.4%이다.
제조된 피메크롤리무스는 100.07% (w/w)의 어세이 및 99.71 면적%의 크로마토그래피 순도를 갖는다.
실시예 4
아스코마이신을 실시예 1에 기술된 바와 같이 조질의 피메크롤리무스로 염소화하였다.
조질의 피메크롤리무스(어세이 62.8% (w/w))를 정지상 YMC ODS-AQ (10μm, 120 Å)에서 크로마토그래피하였다. 이동상으로 70% (w/w) 메탄올 + 30% (w/w) 물이 사용되었다. 크로마토그래피를 50℃에서 2회 실행하였다. 제1 실행은 87 면적%의 메인 분획의 순도를 달성했다. 공급물로서 제1 실행의 메인 분획을 사용한 제2 실행은 메인 분획에서 97 면적%의 순도를 달성하였으며, 이 분획에서 피메크롤리무스의 수율은 63.9%였다.
이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 에탄올 물로부터 결정화 한 후, 99.8 면적%의 크로마토그래피 순도를 달성할 수 있었다.
실시예 5( 비교예 )
조질의 아스코마이신을 출발 물질로서 사용한 비교예에서, 피메크롤리무스는 WO 2006/040111의 실시예 3 및 4에 기술된 방법을 사용하여 제조하였다. 10 ml의 테트라하이드로푸란(THF) 중의 1 g의 트리페닐포스핀의 용액을 12 ml의 THF 중의 0.51 g의 NCS에 적가하였다. 결과물인 혼합물을 0.5시간 동안 실온(22℃)에서 교반하였다. 그 후, 1 ml의 피리딘을 첨가한 후, 20 ml의 THF 중의 2.45 g의 기술용 건조 아스코마이신의 용액을 첨가하였다. 결과물인 혼합물을 1시간 동안 65℃에서 교반하였다. 혼합물을 톨루엔(45 ml)으로 희석하고, 물을 첨가하고(2 x 40 ml), 결과물인 두 상을 분리하였다. 유기층을 1 N HCl(40 ml), 물(40 ml), 포화 염화나트륨 수용액(40 ml)으로 세척하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 건조시켰다. 용매를 결과물인 용액으로부터 증발시켰다.
잔류물을 실리카 겔에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2.8 g의 건조 잔류물을 6 ml의 EtOAc에 용해하고, 11 ml의 헵탄을 적가하여 17.5 ml의 용액(EtOAc의 함량 = 35 부피%)을 생성하였다. 16.5 ml 의 이 공급물 용액을 다음 사양의 크로마토그래피 컬럼에 주입하였다:
L = 45 cm
D = 25 mm
V = 220 ml
SF = 실리카겔 MB 40-75 μ(이동상으로 준비)
이동상:
헵탄 6.5 L
EtOAc 2.5 L
~ 28 부피% EtOAc
주입: 16.5 ml
온도: 주변
피메크롤리무스를 함유하는 분획 F3 내지 F8을 함께 모으고 증발시킨 후 건조 잔류물은 0.9 g로 칭량되었다.
100 mL의 유리 반응기에서, 크로마토그래피로부터의 건조 잔류물(0.9 g)을 6.0 mL의 에탄올에 용해시키고 2.2 mL의 탈염수를 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 교반하였다. 5분 내에, 0.6 mL의 탈염수를 첨가하고 추가로 30 분 동안 교반하였다. 그 후, 0℃로 냉각시켰다. 3시간의 교반 후, 혼합물은 탁하지만 생성물은 결정화되지 않았다. 5 mL의 물을 첨가하고 0℃에서 추가로 22시간 동안 교반하였다. 서스펜션을 여과하고 결정을 40℃ 및 100 mbar에서 건조시켰다. 0.6 g의 결정질 피메크롤리무스를 수득하였고 분석하였다. 분석은 다음과 같은 조성을 제공한다:
Figure pct00003
알 수 있는 바와 같이, 분리된 피메크롤리무스는 순도 및 효능에 대한 요구되는 사양을 충족시키지 않기 때문에 약학적 활성 성분으로서 사용되기에 충분히 순수하지 않다.
본원에 기술된 모든 시약 및 용매는 특정된 순도 또는 등급, 또는 달리 시약 등급 또는 분석 등급, 또는 상업적으로 또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 이용 가능한 최고의 순도에 적합하다.
본원에 기술된 견지는 상기 개략적인 예시적인 견지와 관련하여 기술되었지만, 공지되거나 현재 예상되지 않거나 예상되지 않을 수 있는, 다양한 대안, 수정, 변형, 개선 및/또는 실질적인 등가물이 당해 분야의 기술자에게 명백해 질 수 있다. 따라서, 상기한 바와 같은 예시적인 견지는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 의도된다. 본 개시사항의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 그러므로, 본 개시사항은 모든 공지된 또는 나중에- 개발된 대안, 수정, 변형, 개선 및/또는 실질적인 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
단수의 요소에 대한 언급은 특별히 언급되지 않는 한 "하나 및 단지 하나"가 아니라 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있거나 나중에 공지될 이 개시사항의 전반에 걸쳐 기술된 다양한 견지의 요소에 대한 모든 구조적 및 기능적 등가물은 본원에 명백히 참고로 포함된다. 더욱이, 본원에 개시된 것은 대중에게 헌정하는 것으로 의도된 것이 아니다.
또한, 단어 "예(example)"는 본원에서 "예, 실례 또는 예시로서의 제공"을 의미하는 것으로 사용된다. "예"로 본원에 기술된 임의의 견지는 다른 견지에 비하여 바람직하거나 이로운 것으로 해석될 필요는 없다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "일부"는 하나 이상을 지칭한다. "A, B 또는 C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 적어도 하나" 및 "A, B, C 또는 이들의 임의의 조합"과 같은 조합은 A, B 및/또는 C의 임의의 조합을 포함하고, A의 배수, B의 배수 또는 C의 배수를 포함할 수 있다. 구체적으로, "A, B 또는 C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 적어도 하나", 및 "A, B, C 또는 이들의 임의의 조합"은 A 만, B 만, C 만, A와 B, A와 C, B와 C, 또는 A와 B와 C일 수 있고, 임의의 이러한 조합은 A, B, 또는 C의 하나 이상의 구성원 또는 구성원들을 함유할 수 있다.
더욱이, 본 출원 전반에 걸친 모든 참고 문헌, 예를 들어, 발행 또는 등록 허여된 특허 또는 등가물을 포함하는 특허 문서; 특허 출원 공보; 및 비-특허 문헌 문서 또는 다른 출처 자료는, 참고로서 개별적으로 편입된 것처럼, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

Claims (27)

  1. a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계;
    b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
    를 포함하는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염소화하는 단계는 상기 조질의 아스코마이신을 유기 용매 중에서 디클로로트리페닐포스포란으로 염소화하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 염소화하는 단계는 트리페닐포스핀과 염소화 알칸 또는 N-클로로숙신이미드의 반응으로부터 원위치에서 염소화제를 발생시키는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염소화제는 디클로로트리페닐포스포란인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 90% 이상의 아스코마이신을 함유하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 최대 2% (w/w)의 21-데스메틸렌 아스코마이신, 최대 1.5% (w/w)의 17-에틸아스코마이신, 및/또는 최대 4% (w/w)의 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신을 함유하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 기술-등급의 아스코마이신인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 상기 염소화하는 단계 전에 정제되지 않는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는, 상기 조질의 피메크롤리무스에 비하여 위치 C19, C17, C11에 존재하거나 위치 C21에 존재하지 않는 1 개의 메틸렌기만 다른, 피메크롤리무스의 하나 이상의 동족체, 또는 피메크롤리무스의 C21 에피머를 감소된 농도로 함유하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계는 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하고, 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계는
    i) 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 제공하는 단계;
    ii) 상기 메인 분획을 농축한 후, 희석하는 단계;
    iii) 상기 메인 분획을 고압 액체 크로마토그래피를 통해 재순환시키는 단계; 및
    iv) 선택적으로 단계 ii) 및 iii)을 반복하는 단계
    를 포함하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 피메크롤리무스에 추가의 정제 단계를 수행하지 않는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고압 액체 크로마토그래피는 알킬화 실리카, 디올 실리카 또는 시아노 실리카로 구성되는 군으로부터 선택된 정지상을 사용하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고압 액체 크로마토그래피는
    비극성 용매, 극성 양성자성 용매 및 선택적인 극성 비양성자성 용매;
    하나 이상의 C5-C8 알칸, 에테르 및 아이소프로판올;
    하나 이상의 C5-C8 사이클로알칸, 에테르 및 아이소프로판올;
    하나 이상의 C5-C8 알칸, 에테르 및 에탄올;
    하나 이상의 C5-C8 사이클로알칸, 에테르 및 에탄올;
    헵탄 81.1 ± 0.5%:메틸-tert-부틸에테르 14.4 ± 0.5%:아이소프로판올 4.5 (4.2-4.9)%;
    C1-C3 알코올 또는 아세토니트릴, 선택적으로 에테르, 및 선택적으로 산; 또는
    물, 수 혼화성 용매, 선택적으로 에테르 및 선택적으로 산
    으로 구성되는 군으로부터 선택된 이동상을 사용하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 상기 조질의 피메크롤리무스를 30% 물:70% 메탄올 이동상을 사용하여 옥타데실실리카 정지상에서의 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 98% 초과의 순수한 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 99% 초과의 순수한 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 99.5% 초과의 순수한 것인, 방법.
  19. a) 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계로서, 상기 조질의 피메크롤리무스는 조질의 아스코마이신의 추가 정제없이 조질의 아스코마이신의 염소화에 의해 제조되는 단계;
    b) 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
    를 포함하는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 99% 초과의 순수한 것인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 정제된 피메크롤리무스는 순도 99.5% 초과의 순수한 것인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 90% 이상의 아스코마이신을 함유하는, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 최대 2% (w/w)의 21-데스메틸렌 아스코마이신, 최대 1.5% (w/w)의 17-에틸아스코마이신, 및/또는 최대 4% (w/w)의 21-에피-아스코마이신 및 11-에틸아스코마이신을 함유하는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조질의 아스코마이신은 기술-등급의 아스코마이신인, 방법.
  25. a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계;
    b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계; 및
    c) 상기 목표 분획 중의 상기 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
    로 구성되는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 b)는
    i) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 메인 분획을 제공하는 단계;
    ii) 상기 메인 분획을 농축한 후, 희석하는 단계;
    iii) 상기 메인 분획을 고압 액체 크로마토그래피를 통해 재순환시키는 단계; 및
    iv) 선택적으로 단계 ii) 및 iii)을 반복하는 단계
    를 포함하여 피메크롤리무스를 함유하는 상기 목표 분획을 생성하는, 방법.
  27. a) 조질의 아스코마이신을 염소화하여 조질의 피메크롤리무스를 제공하는 단계;
    b) 상기 조질의 피메크롤리무스를 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제하여 피메크롤리무스를 함유하는 목표 분획을 생성하는 단계; 및
    c) 상기 목표 분획 중의 피메크롤리무스를 결정화하여 정제된 피메크롤리무스를 제공하는 단계
    로 필수적으로 구성되는, 정제된 피메크롤리무스의 제조 방법.
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