ES2906158T3

ES2906158T3 - Proceso para convertir ascomicina bruta en pimecrolimus purificado

Info

Publication number: ES2906158T3
Application number: ES18723771T
Authority: ES
Inventors: Borut Gabriel; Alja Kajtna; Anja Lukic; Souza Dominic De; Werner Hasselwander
Original assignee: Meda Pharma GmbH and Co KG; Meda AB
Current assignee: Meda Pharma GmbH and Co KG; Meda AB
Priority date: 2017-05-01
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2022-04-13
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: PL3619215T3; HRP20220203T1; SA519410421B1; PT3619215T; SI3619215T1; US20200079792A1; KR20200006529A; KR102592374B1; US10975097B2; EP3619215B1; CA3060330A1; CN110741006B; EP3619215A1; CL2019003118A1; CN110741006A; WO2018202733A1

Abstract

Un proceso para preparar pimecrolimus purificado, que comprende: a) clorar ascomicina bruta para proporcionar pimecrolimus bruto; en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina; b) purificar el pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para proporcionar pimecrolimus purificado.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para convertir ascomicina bruta en pimecrolimus purificado

Campo técnico

La presente descripción describe un proceso para la producción de 33-epi-cloro-33-desoxiascomicina, también conocido como pimecrolimus (fórmula I):

Antecedentes de la invención

El pimecrolimus (fórmula I) es un compuesto macrólido conocido, descrito en el documento EP 0427680, que tiene propiedades antiinflamatorias, antiproliferativas e inmunosupresoras. El pimecrolimus es útil para el tratamiento de enfermedades inmunomediadas, por ejemplo, el tratamiento y la prevención de enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias e hiperproliferativas, por ejemplo, que incluyen enfermedades de la piel, tales como psoriasis, dermatitis atópica; afecciones del ojo inmunomediadas, tales como enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, que incluyen uveítis, queratoplastia y queratitis crónica; afecciones alérgicas, por ejemplo, conjuntivitis primaveral, afecciones inflamatorias, trasplantes de córnea. Se aprueba como el ingrediente farmacéutico activo en Elidel® para el tratamiento tópico de la dermatitis atópica.

Se sabe que varios procedimientos diferentes, que usan diferentes etapas del proceso, con o sin grupos de protección, producen 33-epicloro-33-desoxiascomicina.

El documento EP 0427680 describe la síntesis de pimecrolimus a partir de ascomicina (fórmula ASC) en 4 etapas químicas con 3 compuestos sililados diferentes como intermediarios. El rendimiento total es del 16 %.

El documento WO2010/134027A describe la síntesis de pimecrolimus a partir de ascomicina en 5 etapas químicas y enzimáticas con 4 compuestos diferentes como intermediarios mediante el uso de reactivos y enzimas como acetato de vinilo, Novozym 435, trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo, 2,6-lutidina, diclorotrifenilfosforano, etc. El rendimiento global es del 30,8 %. La síntesis a través del diacetato de ascomicina necesita 4 etapas químicas y enzimáticas e involucra 3 intermediarios y reactivos cancerígenos y tóxicos tales como tetracloruro de carbono y dimetilaminopiridina. El rendimiento global de aproximadamente el 13,9 % de la teoría es pobre.

El documento WO2006/060614 describe un método para convertir ascomicina en pimecrolimus sin proteger el grupo hidroxi C24 sino por conversión del grupo hidroxi C32 en el grupo saliente trifluorometanosulfonato. Se alcanza una pureza por HPLC del 95,75 % del área.

El documento US2009/0082386 describe un método para purificar la ascomicina y convertir dicha ascomicina purificada en pimecrolimus. La ascomicina se purifica primero mediante cromatografía en columna y luego se somete a múltiples cristalizaciones para purificar el material de partida, a partir del cual se forma el pimecrolimus. El rendimiento global calculado a partir de este proceso es del 17,6 % de la teoría.

El documento WO2005/010015 describe un método para purificar macrólidos mediante el uso de resinas de sorción. A partir de la velocidad de elución y el número de fracciones, se puede calcular que dicha purificación consume mucho tiempo y, por lo tanto, no es aplicable industrialmente.

En el documento WO2006/040111 se describe la síntesis de pimecrolimus por cloración de ascomicina con trifenilfosfina y N-clorosuccinimida (NCS). La mezcla se procesa mediante extracción y cromatografía en gel de sílice, seguido de cristalización en etanol y agua para dar pimecrolimus con una pureza del 98 %. El rendimiento es insatisfactorio ya que la ascomicina como materia prima es muy valiosa. De hecho, debe usarse ascomicina de alta pureza, la que solo se puede obtener mediante extracción compleja a contracorriente como se describió en los documentos CH 692 839, US 6620 325 y US 7 148346. Si está comercialmente disponible, se usa ascomicina de grado técnico económico, el pimecrolimus resultante contiene homólogos de etilo y desmetileno de la ascomicina de grado técnico y otras sustancias relacionadas. Este pimecrolimus de grado técnico no puede usarse como ingrediente farmacéutico.

Además, una pureza del 98 % para una sustancia farmacéuticamente activa tal como pimecrolimus no es un estado de la técnica. Es más habitual una pureza del 99 % o más. Esta alta pureza no se puede lograr con solo purificación cromatográfica en gel de sílice como se describió en el documento WO2006/040111. Para lograr una pureza del 99 %, el pimecrolimus bruto debe procesarse mediante una elaborada extracción a contracorriente como se describió en el documento US 7 148 346 seguido de purificación cromatográfica y cristalización, lo que provoca pérdidas de rendimiento adicionales y costes de fabricación adicionales. Como tal, sigue existiendo una necesidad en la técnica de métodos para preparar pimecrolimus purificado a partir de ascomicina bruta o de calidad técnica, sin una purificación extensiva previa de la ascomicina bruta o de calidad técnica, que genere pimecrolimus purificado.

Resumen

A continuación se presenta un resumen simplificado de uno o más aspectos de la presente descripción para proporcionar una comprensión básica de dichos aspectos. Su propósito es presentar algunos conceptos de uno o más aspectos de forma simplificada como preludio a la descripción más detallada que se presenta más adelante.

En una modalidad, la presente descripción se dirige a un proceso para preparar pimecrolimus purificado, que comprende:

a) clorar ascomicina bruta para proporcionar pimecrolimus bruto; en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epiascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina; y

b) purificar el pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para proporcionar pimecrolimus purificado.

En un aspecto adicional, dicha etapa de cloración incluye clorar la ascomicina bruta con diclorotrifenilfosforano en un solvente orgánico. En otro aspecto adicional, la etapa de cloración incluye generar un agente clorante in situ por reacción de trifenilfosfina con un alcano clorado o N-clorosuccinimida. En un aspecto adicional, el agente clorante es diclorotrifenilfosforano.

En otro aspecto, la ascomicina bruta usada en el proceso contiene no menos del 90 % de ascomicina. En otro aspecto, la ascomicina bruta usada en el proceso contiene hasta 2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, hasta 1,5 % (p/p) de 17-etilascomicina y/o hasta 4 % (p/p) 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina. La descripción también contempla que la ascomicina bruta es una ascomicina de grado técnico como se define en la presente descripción. En un aspecto, la ascomicina bruta no se purifica antes de la etapa de cloración.

En otro aspecto, el pimecrolimus purificado contiene una concentración reducida del epímero C21 de pimecrolimus o uno o más de los homólogos de pimecrolimus, que se diferencian solo por 1 grupo metileno presente en la posición C19, C17, C11 o ausente en la posición C21, con relación al pimecrolimus bruto.

En un aspecto del proceso, la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión genera una fracción diana que contiene pimecrolimus y comprende además la etapa de cristalizar el pimecrolimus en dicha fracción diana para proporcionar pimecrolimus purificado. En un aspecto adicional, la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión incluye las siguientes etapas:

i) purificar pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para dar una fracción principal, en donde dicha fracción principal contiene pimecrolimus;

ii) concentrar y luego diluir la fracción principal;

iii) recircular la fracción principal mediante cromatografía líquida de alta presión; y

iv) repetir opcionalmente las etapas ii) y iii),

para generar la fracción diana que contiene pimecrolimus.

En un aspecto adicional, el pimecrolimus purificado no se somete a más etapas de purificación.

En un aspecto de la invención, la cromatografía líquida de alta presión usa una fase estacionaria seleccionada del grupo que consiste en una sílice alquilada, una diol sílice o una ciano sílice. En otro aspecto, la cromatografía líquida de alta presión usa una fase móvil seleccionada del grupo que consiste en:

un solvente no polar, un solvente prótico polar y un solvente aprótico polar opcional;

uno o más alcanos C⁵- C ⁸ , un éter e isopropanol;

uno o más cicloalcanos C⁵-C⁸, un éter e isopropanol;

uno o más alcanos C⁵-C⁸, un éter y etanol;

uno o más cicloalcanos C⁵-C⁸, un éter y etanol;

heptano 81,1 ± 0,5 % : metil-terc-butiléter 14,4 ± 0,5 % : isopropanol 4,5 (4,2 - 4,9) %;

alcoholes C¹-C³o acetonitrilo, opcionalmente un éter y opcionalmente un ácido; o

agua, un solvente miscible en agua, opcionalmente un éter y opcionalmente un ácido.

En otro aspecto, la etapa de purificación involucra la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión en una fase estacionaria de octadecilsílice con fase móvil de 30 % de agua : 70 % de metanol.

En un aspecto de la invención, el proceso genera pimecrolimus purificado que tiene una pureza superior al 98 %, preferentemente una pureza superior al 99 %, y aún con mayor preferencia una pureza superior al 99,5 %.

Otra modalidad de la invención incluye un proceso para preparar pimecrolimus purificado, que incluye las etapas de:

a) purificar un pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para generar una fracción diana que contenga pimecrolimus, en donde dicho pimecrolimus bruto se prepara mediante cloración de ascomicina bruta, en donde la ascomicina bruta comprende más de 0.2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina, sin purificación adicional de la ascomicina bruta;

b) cristalizar el pimecrolimus en la fracción diana para dar pimecrolimus purificado.

En un aspecto adicional, el pimecrolimus purificado tiene una pureza superior al 98 %, preferentemente una pureza superior al 99 % y aún con mayor preferencia una pureza superior al 99,5 %.

En otro aspecto, la ascomicina bruta usada en el proceso contiene no menos del 90 % de ascomicina. En otro aspecto más, la ascomicina bruta contiene hasta 2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, hasta 1,5 % (p/p) de 17-etilascomicina y/o hasta 4 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina. La descripción también contempla que la ascomicina bruta puede ser una ascomicina de grado técnico como se define en la presente descripción.

En otra modalidad más, la invención incluye un proceso para preparar pimecrolimus purificado, que consiste en las siguientes etapas:

a) cloración de ascomicina bruta, en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina, para dar pimecrolimus bruto;

b) purificar el pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para generar una fracción diana que contiene pimecrolimus; y

c) cristalizar el pimecrolimus en la fracción diana para dar pimecrolimus purificado.

En un aspecto adicional de esta invención, la etapa de purificación b) incluye las siguientes etapas de purificación: i) purificar pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión para dar una fracción principal, en donde dicha fracción principal contiene pimecrolimus;

ii) concentrar y luego diluir la fracción principal;

iv) repetir opcionalmente las etapas ii) y iii),

para generar la fracción diana que contiene pimecrolimus.

Estos y otros aspectos de la invención se comprenderán mejor, tras una revisión de la descripción detallada que sigue a continuación.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación de diagrama de flujo de métodos basados en la técnica para preparar pimecrolimus con los métodos de la presente descripción.

La Figura 2 muestra un ejemplo de un cromatograma de HPLC preparativa obtenido en el Ejemplo 2.

Descripción detallada

Como se usa en la presente descripción, "ascomicina bruta" se define como ascomicina que contiene más de aproximadamente 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de aproximadamente 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de aproximadamente 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina cuando se mide mediante técnicas de ensayo apropiadas (por ejemplo, HPLC).

Como se usa en la presente descripción, "ascomicina de grado técnico" se define como ascomicina bruta que contiene no menos del 90 % de ascomicina cuando se mide mediante técnicas de ensayo apropiadas (por ejemplo, HPLC). La ascomicina de grado técnico puede contener hasta 2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, hasta 1,5 % (p/p) de 17-etilascomicina y hasta 4 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina.

Como se usa en la presente descripción, "ascomicina pura" se define como ascomicina que contiene menos de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no menos del 96 % (p/p) de ascomicina cuando se mide mediante técnicas de ensayo apropiadas.

Como se usa en la presente descripción, "pimecrolimus purificado" se define como pimecrolimus que se ha purificado para efectuar la eliminación de algunas o todas las impurezas, que incluyen, pero sin limitarse a, el epímero de pimecrolimus C21 y los homólogos de pimecrolimus que se diferencian solo por 1 grupo metileno presente en la posición C19, C17, C11 o ausente en la posición C21.

Como se usa en la presente descripción, "pimecrolimus sustancialmente puro" es pimecrolimus que tiene una pureza superior al 98 %, cuando se mide mediante técnicas de ensayo apropiadas.

Como se usa en la presente descripción, "temperatura ambiente" significa aproximadamente 25 °C.

Aunque existen varios procedimientos para la producción o purificación de pimecrolimus descritos en la técnica relacionada, todavía existe la necesidad de un proceso para la producción de pimecrolimus purificado que sea fácil, proporcione un buen rendimiento, sea económico y aplicable industrialmente. La invención en la presente descripción radica en la capacidad de preparar pimecrolimus purificado a partir de una ascomicina bruta, en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina, al tiempo que se reduce el número de etapas necesarias para purificar el pimecrolimus. Esto da como resultado un ingrediente activo de pimecrolimus de alta calidad, menos costoso y más puro.

Sorprendentemente, se descubrió que el pimecrolimus purificado puede prepararse a partir de ascomicina bruta, en donde la ascomicina comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina, mediante la cloración de la ascomicina bruta y luego la purificación del pimecrolimus bruto resultante con cromatografía líquida de alta presión. Por tanto, en un aspecto de la invención se incluye un proceso para preparar pimecrolimus purificado por purificación de un pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión, en donde dicho pimecrolimus bruto se prepara mediante la cloración de ascomicina bruta, en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina sin purificación adicional de la ascomicina bruta. La descripción también contempla que la ascomicina bruta es ascomicina de grado técnico. En algunas modalidades, el pimecrolimus sustancialmente puro resultante de la cromatografía líquida de alta presión puede cristalizarse adicionalmente en una etapa de cristalización.

Sorprendentemente, se descubrió que el epímero C21 y los homólogos de pimecrolimus, que se diferencian solo por 1 grupo metileno presente en la posición C19, C17, C11 o ausente en la posición C21, podían eliminarse mediante HPLC. Hasta ahora, la única posibilidad de eliminar estos homólogos de una mezcla que contiene pimecrolimus, era sintetizar pimecrolimus a partir de ascomicina que se había sometido a extensas etapas de purificación. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un proceso simple para la producción de pimecrolimus puro a partir de ascomicina bruta, en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina sin purificación previa de ascomicina.

En la primera etapa, se hace reaccionar ascomicina de grado técnico desprotegida con un agente clorante apropiado, por ejemplo diclorotrifenilfosforano en un solvente orgánico, opcionalmente en presencia de una base. El agente clorante y opcionalmente la base, opcionalmente cada uno en solvente orgánico, o como tal, se mezclan y la mezcla obtenida se agita a la temperatura apropiada durante un tiempo de reacción suficiente para la reacción.

En una modalidad, el agente clorante es diclorotrifenilfosforano. El agente clorante puede usarse como tal o se puede proporcionar in situ, por ejemplo, por tratamiento de trifenilfosfina con un alcano clorado, por ejemplo alcano C1-C2, tal como CCl4, C2Cl6, preferentemente CCU; o mediante la adición de trifenilfosfina a NCS en un solvente orgánico o mezclas de solventes orgánicos.

En algunas modalidades, los solventes orgánicos o mezclas de solventes orgánicos pueden incluir hidrocarburos, por ejemplo, hidrocarburos aromáticos, por ejemplo, benceno, tolueno; éteres, tales como tetrahidrofurano (THF); nitrilos, por ejemplo acetonitrilo; alcanos clorados, tales como CCU; y mezclas de los solventes anteriores. En una modalidad adicional, la mezcla de reacción se puede diluir con un solvente o solventes adicionales apropiados, que en algunas modalidades pueden usarse para facilitar la agitación.

En una modalidad, el solvente orgánico se selecciona de un grupo que consiste en hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, tolueno), éteres (por ejemplo, tetrahidrofurano), nitrilos (por ejemplo, acetonitrilo) o alcanos halogenados (por ejemplo, alcanos clorados) o mezclas de los mismos (por ejemplo, tolueno y acetonitrilo). Los solventes orgánicos preferidos incluyen un alcano clorado, en caso de usar trifenilfosfina y un alcano halogenado para la preparación de diclorotrifenilfosforano como agente clorante. En caso de usar trifenilfosfina y un alcano clorado como solvente, el alcano clorado puede usarse, en un aspecto, como una fuente de halógeno para la producción de diclorotrifenilfosforano y, en otro aspecto, como solvente orgánico, aunque la adición de solvente orgánico adicional, tal como por ejemplo el citado anteriormente, no se excluye. Se prefiere especialmente para la cloración de ascomicina el uso de trifenilfosfina y NCS en tetrahidrofurano.

Las bases adecuadas son bases orgánicas conocidas por expertos en la técnica, que incluyen pero sin limitarse a, bases que contienen nitrógeno, tales como aminas terciarias o bases heterocíclicas que contienen al menos un átomo de nitrógeno, con mayor preferencia bases heterocíclicas aromáticas, tales como una piridina o un imidazol; con la máxima preferencia 2,4,6-trimetilpiridina (s-colidina).

La relación de ascomicina y agente clorante es adecuadamente al menos una relación equivalente (es decir, al menos 1:1 de ascomicina : agente clorante), y preferentemente se usa un exceso del agente clorante. La relación de ascomicina a agente clorante es adecuadamente de aproximadamente 1:1a aproximadamente 1:5. Por ejemplo, la ascomicina y el agente clorante se usan adecuadamente en una relación de aproximadamente 1:1a aproximadamente 1:3 (es decir, por equivalente de ascomicina, 1 a 3 equivalentes del agente clorante), tal como de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; por ejemplo, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5, preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1,3, por ejemplo una relación de 1:1 a 1:3, tal como de 1:1 a 1:2; por ejemplo, de 1:1 a 1:5, preferentemente de 1:1 a 1:1,3 puede ser apropiado.

El exceso molar inicial preferido de NCS a ascomicina es 0-30 % en moles. Con mayor preferencia, el exceso molar de NCS a ascomicina es 8 % en moles.

La relación de ascomicina y base debe ser al menos una relación equivalente (es decir, al menos 1:1), y preferentemente se usa un exceso de la base. Por ejemplo, la ascomicina y la base pueden usarse en una relación de aproximadamente 1:1a aproximadamente 1:10 (por equivalente de ascomicina, 1 a 10 equivalentes de la base), tal como de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:10, por ejemplo, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:9, preferentemente de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:4, o cualquier relación o subintervalo de enteros intermedios.

El exceso molar inicial preferido de trifenilfosfina a ascomicina es 0 - 30 % en moles. Con mayor preferencia, el exceso molar inicial de trifenilfosfina a ascomicina es 3 % en moles.

En caso de usar trifenilfosfina y un alcano clorado como solvente, el alcano clorado puede usarse en un aspecto como una fuente de halógeno para la producción de diclorotrifenilfosforano y, en otro aspecto, como solvente orgánico, aunque la adición de solvente orgánico adicional, tal como por ejemplo el citado anteriormente, no se excluye.

Las temperaturas de reacción apropiadas incluyen temperaturas de temperatura ambiente a aproximadamente 100 °C, tales como de temperatura ambiente a aproximadamente 90 °C, de temperatura ambiente a aproximadamente 80 °C, o de temperatura ambiente a aproximadamente 70 °C.

En caso de usar un alcano clorado, tal como CCl⁴y trifenilfosfina para la producción del agente clorante, la temperatura preferida para la reacción es la temperatura de reflujo del alcano clorado.

En caso de usar trifenilfosfina y NCS, las temperaturas adecuadas para la reacción incluyen temperaturas de temperatura ambiente a aproximadamente 100 °C. Las temperaturas preferidas para la reacción están entre 25 y 40 °C. Los tiempos de reacción adecuados suficientes para la reacción son de entre 1 y 40 horas. Preferentemente, el tiempo de reacción es de entre 10 y 20 horas. El tiempo de reacción requerido depende de la temperatura elegida, y la optimización del tiempo de reacción está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. El avance de la reacción se puede monitorear mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, cromatografía en capa fina, HPLC y LC, cada uno de ellos acoplado con detección UV. Las longitudes de onda adecuadas para la detección de UV para el monitoreo de la reacción pueden determinarse por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, 254 nm.

Después de un tiempo de reacción suficiente, se procesa el producto de reacción, preferentemente mediante dilución con un solvente inmiscible en agua, tal como ciclohexano, y reacción con una solución ácida acuosa, tal como ácido cítrico. Se usa al menos 1/3 mol de ácido cítrico por mol de base (por ejemplo, s-colidina), preferentemente 1/3 a 1 mol, con mayor preferencia 2/3 mol. La solución ácida acuosa puede contener un solvente miscible en agua, tal como metanol o etanol, preferentemente metanol. Se separan las capas acuosa e inmiscible en agua. La capa inmiscible en agua se puede extraer con agua y opcionalmente con metanol de nuevo.

Después de la extracción, el solvente se evapora de la fase orgánica, mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica para dar un residuo. Posteriormente, se disuelve el residuo en un solvente adecuado. Los solventes adecuados son solventes en los que el pimecrolimus es fácilmente soluble y que pueden eliminarse fácilmente mediante evaporación, tales como acetona, acetonitrilo, acetato de etilo, metanol, etanol, isopropanol, preferentemente acetona.

La solución resultante de pimecrolimus bruto se purifica adicionalmente mediante HPLC. La solución de alimentación se prepara mediante la evaporación del solvente y adición de una mezcla de solventes que es similar a la fase móvil, pero contiene suficientes componentes que son buenos solventes para pimecrolimus, preferentemente isopropanol, metil-terc-butiléter y n-heptano. Si se usa acetonitrilo/agua (por ejemplo, 12 % (p/p) de agua : 88 % de acetonitrilo (p/p)) como fase móvil, por ejemplo, puede usarse la misma mezcla de solventes (12 % (p/p) de agua : 88 % (p/p) acetonitrilo) para la preparación de la solución de alimentación.

Los expertos en la técnica, comprenderán que la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión dará como resultado fracciones de desecho y una fracción principal que contiene pimecrolimus. En algunas modalidades, una fracción principal obtenida mediante cromatografía líquida de alta presión puede purificarse adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta presión al recircular la fracción principal para dar una fracción diana. En algunas modalidades, las fracciones de desecho se eliminan de la fracción principal y se descartan. En algunas modalidades, la fracción diana se obtiene después de tres a seis ciclos de recirculación de este tipo. En una modalidad, se prefieren cuatro ciclos de recirculación. En algunas modalidades, la fracción principal se concentra, se disuelve en un solvente apropiado (por ejemplo, una mezcla de solventes que es similar a la fase móvil, pero contiene suficientes componentes que son buenos solventes para pimecrolimus como se describió anteriormente) y se recircula. La Figura 2 muestra un ejemplo de un cromatograma de una corriente sometida a tal recirculación; después de un primer ciclo de HPLC, la fracción F1 se descarta y la fracción de reciclaje se somete adicionalmente a HPLC; este proceso se repite hasta que se obtiene la fracción diana F2.

En una modalidad de la presente descripción, la purificación por HPLC se realiza mediante el uso de una fase estacionaria que incluye una fase estacionaria de sílice alquilada. La fase estacionaria de sílice alquilada puede ser metil-, butil-, octil-, dodecil- u octadecil sílice. La sílice alquilada se puede seleccionar de sílices alquiladas disponibles comercialmente tales como Daisogel C1-P, Daisogel C4-P, Daisogel C8-P, Daisogel ODS, Phenomenex Luna Prep C18(2), YMC PackODS-AQ 12S11, YMC ODS-AQ (10 pm, 120 A) o Kromasil C18. Las fases móviles adecuadas para su uso con una fase estacionaria de este tipo incluyen agua más alcoholes C¹-C³(por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol) o acetonitrilo, que opcionalmente incluyen además un éter (por ejemplo, metil-terc-butiléter o dietiléter), y/o que opcionalmente incluyen además un ácido, por ejemplo H³PO⁴o TFA. La optimización de éter y/o concentraciones de ácido en la fase móvil, está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

En una modalidad preferida, la purificación por HPLC se realiza mediante el uso de octadecil-sílice como fase estacionaria y como fase móvil agua:metanol o agua:acetonitrilo. Se prefiere especialmente una concentración de acetonitrilo del 84 % (p/p) o superior, tal como, por ejemplo, 12 % (p/p) de agua : 88 % de acetonitrilo (p/p).

Para aumentar la productividad, el pimecrolimus bruto se puede tratar previamente mediante cromatografía con una carga más alta en una columna de octadecilsílice. Este tratamiento separa óxido de trifenilfosfina, ascomicina y 33-epi-cloro-A ²³²⁴ -ascomicina de pimecrolimus.

Las temperaturas preferidas para la cromatografía con metanol: agua son de 35 a 70 °C, preferentemente de 45 a 55 °C, con mayor preferencia de 50 °C.

En otra modalidad de la invención, la HPLC se realiza mediante el uso de un diol-sílice como fase estacionaria. El diolsílice puede ser cualquier diol-sílice, tal como diol-sílices disponibles comercialmente tales como YMC Pack-120-HG, YMC Pack-80-HG y Kromasil 60-10 Diol. Las fases móviles pueden incluir un solvente no polar, por ejemplo, alcanos, cicloalcanos, éter de petróleo; más un solvente prótico polar, por ejemplo, alcoholes, agua; más opcionalmente un solvente aprótico polar, por ejemplo, éteres, preferentemente metil-terc-butiléter; éteres cíclicos, preferentemente THF; ésteres, preferentemente acetato de etilo; solventes halogenados, preferentemente diclorometano. Las fases móviles preferidas son alcanos C⁵-C⁸(por ejemplo, pentano, hexano, heptano u octano) o cicloalcanos (tales como ciclohexano, metilciclohexano, dimetilciclohexano), más un éter tal como metil-terc-butiléter, tetrahidrofurano, más isopropanol o etanol. La optimización de las relaciones de solventes en la fase móvil está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

En una modalidad, la HPLC se realiza mediante el uso de partículas de Kromasil 60 - 10 Diol, poro de 60 A, 10 pm como fase estacionaria y heptano 81,1 ± 0,5 % (p/p ): metil-terc-butiléter 14,4 ± 0,5 % (p /p ): isopropanol (IPA) 4,5 (4,2 - 4,9) % (p/p) como fase móvil; es decir, el isopropanol puede ser 4,2-4,9 % (p/p) de la fase móvil, tal como 4,5 % (p/p).

En otra modalidad, la HPLC se realiza mediante el uso de una fase estacionaria de ciano-sílice. La ciano-sílice puede ser cualquier ciano-sílice, tal como las ciano-sílices disponibles comercialmente, que incluyen Phenomenex Luna CN. Las fases móviles en tal modalidad pueden incluir agua alcoholes C¹-C³(metanol, etanol, propanol, isopropanol). Una fase móvil preferida es agua metanol (35 % (p/p) 65 % (p/p)). Este sistema cromatográfico es capaz de separar formas tautoméricas de pimecrolimus.

Las fracciones principales cromatográficas combinadas se evaporan en un evaporador de capa fina al vacío (a 150 mbar). El residuo se disuelve en acetona. Las fracciones secundarias se combinan y se purifican adicionalmente en una segunda etapa cromatográfica.

El pimecrolimus obtenido se purifica adicionalmente mediante cristalización en solventes adecuados, por ejemplo acetato de etilo ciclohexano/agua, acetona/heptano. Los solventes preferidos son etanol/agua con etapas de evaporación y secado. Cuando se usa etanol/agua para cristalizar, la sustancia se somete primero a intercambio de solvente (es decir, acetona a etanol). Posteriormente, se añade agua a la solución de etanol durante la cristalización y también puede usarse la siembra. El producto resultante tiene una pureza cromatográfica de >99 % (p/p).

Al purificar el producto de pimecrolimus bruto a través de HPLC, se evita la necesidad de extracciones a contracorriente costosas y extensas (tales como las que se describen en la patente de Estados Unidos núm. 7 148 346, que se incorpora en la presente descripción como referencia). Por tanto, en una modalidad, la presente invención incluye un proceso para la preparación de pimecrolimus, en donde el pimecrolimus no se somete a etapas de purificación adicionales más allá de HPLC y cristalización. Esto da como resultado un proceso a escala comercial que puede producir grandes cantidades de pimecrolimus purificado, incluido pimecrolimus sustancialmente puro, con altos rendimientos y con un tratamiento menos extenso.

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que compara el proceso de la presente descripción con procesos conocidos. Como se discutió anteriormente, en la preparación del pimecrolimus bruto, el proceso de la presente invención lleva a cabo la reacción de cloración de una manera similar, pero no se requiere una extracción a contracorriente del material de partida (ascomicina), mientras que sí se requiere en procesos conocidos. En la preparación de la sustancia activa pimecrolimus a partir del pimecrolimus bruto (es decir, la(s) etapa(s) de purificación), no se requiere la "etapa 1" de los procesos conocidos; en su lugar, se usa cromatografía HPLC, que produce pimecrolimus purificado.

Ejemplo 1

Cloración de ascomicina bruta

Se colocan 121 kg (que contienen 116,9 kg 100 % de ascomicina) de ascomicina disponible comercialmente (ensayo > 90 %) en un reactor, se añade tolueno y se destila al vacío para secar la ascomicina azeotrópicamente. El residuo se disuelve en THF, que se destila de nuevo y se sustituye por THF nuevo.

En un reactor diferente se disuelven 40 kg de trifenilfosfina en THF. A esta solución se le añaden 21,3 kg de N-clorosuccinimida en porciones. Esta mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente, luego se añaden lentamente 40 l de colidina con mantenimiento de la temperatura a temperatura ambiente. La solución de ascomicina en THF se bombea y se agita a 39 °C. El lote se analiza para determinar el contenido de ascomicina. Si el contenido de ascomicina es demasiado alto, se añaden cantidades adicionales de trifenilfosfina y NCS y se continúa la agitación.

La mezcla de reacción se enfría a 20 °C. Se suministra ciclohexano y se añade una solución de 40 kg de ácido cítrico en agua y metanol a 20 °C. Las fases se separan. La fase orgánica superior se lava con una mezcla de agua y metanol.

Se repite el lavado. Las fases inferiores se combinan y se vuelven a extraer dos veces con ciclohexano. Las fases orgánicas combinadas se lavan con agua. Luego se evapora el ciclohexano. El residuo espeso se disuelve en acetona. Se evapora el solvente y finalmente se disuelve el residuo en 400 kg de acetona. Esta solución contiene 103 kg (86 % de la teoría) de pimecrolimus, con una pureza cromatográfica de > 70 %, no más del 10 % (p/p) de ascomicina y no más del 20 % (p/p) de 33-epi-cloro -A2324-ascomicina.

Purificación por HPLC

Se evaporan hasta sequedad 57,1 kg de esta solución con un ensayo de 17,52 % (p/p) de pimecrolimus (= 10 kg de pimecrolimus), se disuelven en una mezcla de isopropanol, metil-terc-butiléter y n-heptano para obtener 181 kg de solución de alimentación y se filtra sobre 1,5 kg de gel de sílice. La solución filtrada se usa como alimentación para la purificación cromatográfica en una columna rellenada con partículas de Kromasil 60 - 10 Diol, 60 A de poro, 10 pm como fase estacionaria. La fase móvil usada es 81,1 % (p/p) de heptano, 14,4 % (p/p) de metil-terc-butiléter, 4,5 % (p/p) de isopropanol. Cuando se cambia de solución de alimentación a la fase móvil, sorprendentemente no ocurre ninguna cristalización de pimecrolimus, aunque el pimecrolimus no es soluble en esta mezcla a la concentración de la alimentación.

La separación se sigue con un detector de UV a una longitud de onda de 254 nm y el eluido se separa en fracciones vacías, secundarias y principales, según la señal. Cuando se completa la elución, la columna se regenera con isopropanol puro y el acondicionamiento se realiza con la fase móvil debido al A P elevado en dos porciones.

Las fracciones principales combinadas se evaporan en un evaporador de capa fina al vacío (a 150 mbar). El residuo se disuelve en acetona. Se obtienen 106,8 kg de solución de acetona con una concentración de pimecrolimus del 6,5 % (p/p). Esto equivale a 6,94 kg de pimecrolimus de 10 kg de pimecrolimus en la solución de alimentación bruta, lo que da como resultado un rendimiento de las fracciones principales del 69 % de la teoría.

Las fracciones secundarias se concentran de la misma forma que las fracciones principales. Se obtienen otros 54 kg de solución de acetona que contiene 4,6 % (p/p) de pimecrolimus, que son otros 2,5 kg de pimecrolimus, rendimiento del 25 % de la teoría. Este material se recicla a la etapa de cromatografía para dar fracciones principales que contienen otros 0,65 kg (26 % de la teoría) de pimecrolimus. El rendimiento combinado de pimecrolimus de las fracciones principales es de 7,59 kg (75,9 % de la teoría).

Concentración y cristalización:

El concentrado de las fracciones principales disuelto en acetona que contiene 111,2 kg de pimecrolimus se combina en un recipiente. La solución se filtra y se concentra al vacío. Se añade etanol. La acetona y el etanol se eliminan por destilación al vacío, mientras se añade etanol adicional para mantener constante la concentración. Finalmente, la concentración se ajusta al 25 % (p/p) de pimecrolimus mediante la adición de etanol.

Se prepara una suspensión de pimecrolimus en una mezcla de agua y etanol como suspensión de semillas de cristalización.

La solución de pimecrolimus al 25 % (p/p) en etanol se calienta a la temperatura de reflujo durante 30 min, se enfría a 55 °C y se añade la suspensión de semillas. La mezcla se agita por otros (hasta) 45 min a 55 °C. Se añade agua desmineralizada en 2 h. La mezcla se agita por otros 30 min a 55 °C. La suspensión se enfría a 10 °C y se agita a 10 °C.

Los cristales se filtran a través de un filtro-secador. La torta se lava 3 veces con etanol acuoso al 33 % (p/p). La torta se seca en el filtro-secador a una temperatura de la camisa de 48 °C al vacío hasta que el contenido de agua sea inferior al 0,1 % (p/p), que produce 105,6 kg de pimecrolimus puro (95 % de la teoría).

El rendimiento global calculado para la ascomicina comercial es 86 % x 75,9 % x 95 % = 62 %. El pimecrolimus purificado preparado tiene un ensayo del 100,9 % (p/p) y una pureza cromatográfica del 99,52 % (p/p). Este valor representa el 100 % menos las impurezas totales.

Ejemplo 2

La ascomicina se cloró para dar pimecrolimus bruto como se describió en el Ejemplo 1.

Pretratamiento cromatográfico:

En una columna de 50 mm de diámetro x 250 mm de altura, rellenada con fase estacionaria de sílice C18 (Daiso), se inyectaron 7,4 g de pimecrolimus bruto (ensayo 50,4 % (p/p), que contenía 3,73 g de pimecrolimus 100 % puro) como solución en 12 % (p/p) de agua/88 % de acetonitrilo (p/p). con una concentración de 200 g de pimecrolimus bruto/l (carga alta). El pimecrolimus se eluyó con 12 % (p/p) de agua y 88 % de acetonitrilo (p/p). Las fracciones diana contenían 3,62 g (97 % de la entrada) de pimecrolimus con una pureza cromatográfica del 84 % (p/p).

El solvente se evaporó de las fracciones diana y el residuo se disolvió en una concentración de 70 g/l en el eluyente de 12 % (p/p) de agua/88 % de acetonitrilo (p/p). Esta solución se inyectó en una columna de 50 mm de diámetro x 250 mm de altura, rellenada con fase estacionaria de sílice C18 (Daiso) y se sometió a purificación cromatográfica con recirculación. Eluyente de 12 % de agua (p /p ): 88 % de acetonitrilo (p/p), 4 ciclos de recirculación, como se muestra en la Figura 2.

La fracción diana (como se indica en la Figura 2) contenía 2,97 g (82 % de la entrada) de pimecrolimus con una pureza del 98,43 % (p/p). Esto corresponde a una productividad de 120 g de pimecrolimus bruto por kg de fase estacionaria por día.

La fracción diana se concentró y cristalizó en etanol/agua como se describió en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

Pretratamiento cromatográfico:

En una columna de 50 mm de diámetro x 250 mm de altura, rellenada con fase estacionaria de sílice C18 (Daiso), se inyectaron 7,8 g de pimecrolimus bruto (ensayo 50,3 % (p/p), que contenía 3,92 g de pimecrolimus 100 % puro) como solución en 12 % de agua (p/p ): 88 % de acetonitrilo (p/p) con una concentración de 200 g de pimecrolimus bruto/l. El pimecrolimus se eluyó con 12 % de agua (p /p ): 88 % de acetonitrilo (p/p). Las fracciones diana contenían 3,77 g (96 % de la entrada) de pimecrolimus con una pureza cromatográfica de 81,3 % (p/p).

El solvente se evaporó de las fracciones diana y el residuo se disolvió en una concentración de 65 g/l en el eluyente de 12 % de agua (p /p ): 88 % de acetonitrilo (p/p). Esta solución se inyectó en una columna de 50 mm de diámetro x 250 mm de altura, rellenada con fase estacionaria de sílice C18 (Daiso) y se sometió a purificación cromatográfica con recirculación. Eluyente de 12 % de agua (p /p ): 88 % de acetonitrilo (p/p), 6 ciclos de recirculación.

La fracción diana contenía 2,83 g (75 % de la entrada) de pimecrolimus con una pureza del 98,92 % (p/p). Esto corresponde a una productividad de 200 g de pimecrolimus bruto por kg de fase estacionaria por día. La fracción diana se evaporó hasta sequedad.

El residuo se disolvió en 3 partes de etanol al 94 % (p/p) a 75 °C. La solución se enfrió a 55 °C antes de la siembra: ocurrió la cristalización; se añadieron lentamente 1,5 partes de agua. La solución se enfrió a 10 °C. La mezcla se envejeció durante la noche a 10 °C. El producto se filtró, se lavó con 1 volumen de agua fría y se secó a 50 °C. Se aislaron 2,72 g de pimecrolimus (96 % de la entrada).

El rendimiento total calculado sobre ascomicina comercial es 86 % x 96 % x 75 % x 96 % = 59,4 %.

El pimecrolimus preparado tiene un ensayo de 100,07 % (p/p) y una pureza cromatográfica de 99,71 % del área. Ejemplo 4

Se cromatografió pimecrolimus bruto (ensayo 62,8 % (p/p)) en la fase estacionaria YMC ODS-AQ (10 pm, 120 A). Como fase móvil se usó 70 % de metanol (p/p) 30 % de agua (p/p). La cromatografía se realizó dos veces a 50 °C. La primera ejecución logró una pureza de la fracción diana de 87 % del área. La segunda ejecución, mediante el uso de la fracción diana de la primera como alimentación, logró una pureza de 97 % del área en la fracción principal y el rendimiento de pimecrolimus en esta fracción fue de 63,9 %.

Después de la cristalización en agua con etanol como se describió en los ejemplos anteriores, se pudo lograr una pureza cromatográfica de 99,8 % del área.

Ejemplo 5 (Ejemplo comparativo)

En un ejemplo comparativo mediante el uso de una ascomicina bruta como material de partida, se preparó pimecrolimus mediante el uso de los métodos descritos en los ejemplos 3 y 4 del documento WO2006/040111. Se añadió gota a gota una solución de 1 g de trifenilfosfina en 10 ml de tetrahidrofurano (THF) a 0,51 g de NCS en 12 ml de THF. La mezcla resultante se agitó 0,5 h a temperatura ambiente (22 °C). Luego se añadió 1 ml de piridina, seguido de una solución de 2,45 g de ascomicina técnica seca en 20 ml de THF. La mezcla resultante se agitó durante 1 h a 65 °C. La mezcla se diluyó con tolueno (45 ml), se añadió agua (2 x 40 ml) y las dos fases resultantes se separaron. La capa orgánica se lavó con HCl 1 N (40 ml), agua (40 ml), solución acuosa saturada de cloruro de sodio (40 ml) y se secó con sulfato de sodio (Na2SO4). Se evaporó el solvente de la solución resultante.

El residuo se purificó mediante cromatografía en sílice. Se disolvieron 2,8 g de residuo seco en 6 ml de EtOAc y se añadieron gota a gota 11 ml de heptano lo que dio como resultado 17,5 ml de solución (contenido de EtOAc = 35 % en vol.). Se inyectaron 16,5 ml de esta solución de alimentación en una columna de cromatografía con las siguientes especificaciones:

L = 45 cm

D = 25 mm

V = 220 ml

SF = Silicagel MB 40 - 75 p (preparado en fase móvil)

Fase móvil:

6.5 l de heptano

2.5 l de EtOAc

~ 28 % en vol. de EtOAc

Inyección: 16,5 ml

Temperatura: ambiente

Se reunieron las fracciones de F3 a F8 que contenían pimecrolimus y, después de la evaporación, el residuo seco pesó 0,9 g.

En un reactor de vidrio de 100 ml, el residuo seco (0,9 g) de la cromatografía se disolvió en 6,0 ml de etanol y se añadieron 2,2 ml de agua desmineralizada. La mezcla se agitó a 4 °C. En 5 minutos, se añadieron 0,6 ml de agua desmineralizada y se agitó por otros 30 minutos. Luego se enfrió a 0 °C. Después de 3 horas de agitación, la mezcla estaba turbia pero el producto no cristalizó. Se añadieron 5 ml de agua y se agitó a 0 °C por otras 22 horas. La suspensión se filtró y los cristales se secaron a 40 °C y 100 mbar. Se obtuvieron y analizaron 0,6 g de pimecrolimus cristalino. El análisis dio la siguiente composición:

Como puede verse, el pimecrolimus aislado no es lo suficientemente puro para usarse como ingrediente activo farmacéutico ya que no cumple con las especificaciones requeridas de pureza y potencia.

Todos los reactivos y solventes descritos en la presente descripción son adecuadamente de la pureza o grado especificado, o de cualquier otra manera de grado reactivo o grado analítico, o de hasta la pureza más alta disponible comercialmente o por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Adicionalmente, la palabra "ejemplo" se usa en la presente descripción y significa "que sirve como un ejemplo, caso o ilustración". Cualquier aspecto descrito en la presente descripción como "ejemplo" no debe interpretarse necesariamente como preferido o ventajoso sobre otros aspectos. A menos que se indique específicamente de cualquier otra manera, el término "algunos" se refiere a uno o más. Las combinaciones tales como "al menos uno de A, B o C", "al menos uno de A, B y C" y "A, B, C o cualquiera de sus combinaciones" incluyen cualquier combinación de A, B, y/o C, y pueden incluir múltiplos de A, múltiplos de B o múltiplos de C. Específicamente, combinaciones tales como "al menos uno de A, B o C", "al menos uno de A, B y C" y "A, B, C, o cualquiera de sus combinaciones' pueden ser solo A, solo B, solo C, A y B, A y C, B y C, o A y B y C, donde cualquiera de dichas combinaciones puede contener uno o más miembros de A, B o C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para preparar pimecrolimus purificado, que comprende:

a) clorar ascomicina bruta para proporcionar pimecrolimus bruto;

en donde la ascomicina bruta comprende más de 0,2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 17-etilascomicina, más de 0,1 % (p/p) de 21-epi-ascomicina y 11-etilascomicina y no más del 96 % (p/p) de ascomicina;

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha etapa de cloración comprende clorar la ascomicina bruta con diclorotrifenilfosforano en un solvente orgánico.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, en donde dicha etapa de cloración comprende generar un agente clorante in situ por reacción de trifenilfosfina con un alcano clorado o N-clorosuccinimida.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, en donde dicho agente clorante es diclorotrifenilfosforano.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la ascomicina bruta contiene no menos del 90 % de ascomicina.

6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la ascomicina bruta contiene hasta 2 % (p/p) de 21-desmetilen ascomicina, hasta 1,5 % (p/p) de 17-etilascomicina y/o hasta 4 % (p/p) de 21-epiascomicina y 11-etilascomicina.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la ascomicina bruta no se purifica antes de la etapa de cloración.

8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho pimecrolimus purificado contiene una concentración reducida del epímero de pimecrolimus C21, o uno o más de los homólogos de pimecrolimus, que se diferencian solo por 1 grupo metileno presente en la posición C19, C17, C11 o está ausente en la posición C21, con relación al pimecrolimus bruto.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión genera una fracción diana que contiene pimecrolimus y comprende adicionalmente la etapa de cristalizar el pimecrolimus en dicha fracción diana para proporcionar pimecrolimus purificado.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, en donde la purificación del pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión comprende las etapas de

ii) concentrar y luego diluir la fracción principal;

iv) repetir opcionalmente las etapas ii) y iii),

para generar la fracción diana que contiene pimecrolimus.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el pimecrolimus bruto no se somete a más etapas de purificación.

12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cromatografía líquida de alta presión usa una fase estacionaria seleccionada del grupo que consiste en una sílice alquilada, una diol sílice o una ciano sílice.

13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la cromatografía líquida de alta presión usa una fase móvil seleccionada del grupo que consiste en:

uno o más alcanos C5 — Ce, un éter e isopropanol;

uno o más cicloalcanos C5-C8, un éter e isopropanol;

uno o más alcanos C5 — Ce, un éter y etanol;

uno o más cicloalcanos C⁵— C ⁸ , un éter y etanol;

14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la etapa b) comprende purificar el pimecrolimus bruto mediante cromatografía líquida de alta presión en una fase estacionaria de octadecilsílice con un 30 % de agua : 70 % de metanol.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el pimecrolimus purificado tiene una pureza superior al 98 %, por ejemplo una pureza superior al 99 %, por ejemplo, una pureza superior al 99,5 %.