CN110741006B - 将粗子囊霉素转化为纯化的吡美莫司的方法 - Google Patents

Abstract

本公开是针对将粗子囊霉素转化为纯化的吡美莫司的改进方法。用三苯基膦和N‑氯丁二酰亚胺(NCS)使粗子囊霉素发生氯化，得到粗吡美莫司，然后通过HPLC将其进一步纯化并且随后结晶。本公开的方法能够通过高压液相色谱法去除吡美莫司的近同系物，而无需事先纯化子孢霉素起始物质。这种改进可以使得子囊霉素向吡美莫司的转化在工业上适用并且不太昂贵。

Description

将粗子囊霉素转化为纯化的吡美莫司的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月1日申请的美国临时申请第62/492,394号的优先权，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开描述用于产生33-表氯-33-脱氧子囊霉素(desoxyascomycin)，也称为吡美莫司(pimecrolimus)(式I)的方法：

背景技术

吡美莫司(式I)是EP 0427680中公开的已知大环内酯化合物，其具有抗性、抗增殖性和免疫抑制特性。吡美莫司可用于治疗免疫介导的疾病，例如治疗和预防炎症、自身免疫和过度增殖性疾病，例如包括皮肤病，例如牛皮癣、异位性皮炎；免疫介导的眼部病况，例如自身免疫疾病，例如包括葡萄膜炎、角膜成形术和慢性角膜炎；过敏性病况，例如春季结膜炎、发炎病况、角膜移植。其被批准为

中的活性医药成分，用于局部治疗异位性皮炎。

已知有几种使用不同方法步骤、带有或不带有保护基的不同程序产生33-表氯-33-脱氧子囊霉素。

EP 0427680描述用3种不同的甲硅烷基化的化合物作为中间物在4个化学步骤中由子囊霉素(式ASC)合成吡美莫司的方法。总产率为16％。

WO2010/134027A描述使用试剂和酶(如乙酸乙烯酯，诺维信435(Novozym 435)、叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐、2,6-二甲基吡啶、二氯三苯基膦烷等)在5个化学和酶促步骤中用4种不同的化合物作为中间物由子囊霉素合成吡美莫司。总产率为30.8％。通过二乙酸子囊霉素的合成需要4个化学和酶促步骤，并且涉及3个中间物以及致癌和有毒的试剂，例如四氯化碳和二甲氨基吡啶。理论值的约13.9％的总产率较差。

WO2006/060614描述在不保护C24羟基但将C32羟基转化为离去基三氟甲磺酸盐的情况下将子囊霉素转化为吡美莫司的方法。HPLC纯度达到95.75面积％。

US2009/0082386描述纯化子囊霉素并且将这类纯化的子囊霉素转化为吡美莫司的方法。子囊霉素首先通过柱色谱法纯化，并且然后经历多次结晶，以纯化起始材料，由此形成吡美莫司。由这一方法计算出的总产率为理论值的17.6％。

WO2005/010015描述使用吸附树脂纯化大环内酯的方法。根据洗脱速率和洗脱份数量，可以计算出这类纯化非常耗时，并且因此在工业上不适用。

在WO2006/040111中描述通过用三苯基膦和N-氯丁二酰亚胺(NCS)氯化子囊霉素来合成吡美莫司。通过萃取和硅胶上的色谱处理，然后从乙醇和水中结晶，对混合物进行处理，得到纯度为98％的吡美莫司。由于原材料子囊霉素非常宝贵，因此产率不理想。实际上，必须使用高纯度子囊霉素，其只能通过如CH 692 839、US 6,620,325和US 7,148,346中所述的复杂逆流萃取来获得。如果使用市售廉价的工业级子囊霉素，那么所得吡美莫司含有来自工业级子囊霉素的乙基和脱亚甲基同系物和其它相关物质。这类工业级吡美莫司不能用作医药成分。

此外，例如吡美莫司的医药活性物质的纯度为98％不是目前先进技术。纯度通常为99％或更高。如WO2006/040111中所述，仅通过硅胶上的色谱纯化不能获得这样高的纯度。为了获得99％的纯度，粗吡美莫司必须按照如US 7,148,346中所述，通过精密的逆流萃取法处理，然后进行色谱纯化和结晶，这产生进一步的产率损失和额外的制造成本。因此，本领域中仍然需要从粗子囊霉素或工业级子囊霉素中制备纯化的吡美莫司的方法，而无需事先对粗子囊霉素或工业级子囊霉素进行广泛的纯化，从而产生纯化的吡美莫司。

发明内容

下文呈现本公开的一个或多个方面的简化概述，以便提供对这类方面的基本理解。此概述并非所有所预期方面的广泛综述，并且既不希望指明所有方面的关键或决定性要素，也不希望划定任何或所有方面的范围。其目的是以简化形式来呈现一个或多个方面的一些概念，以作为稍后呈现的更详细描述的序言。

在一个实施例中，本公开是针对一种制备纯化的吡美莫司的方法，其包含：

a)氯化粗子囊霉素以提供粗吡美莫司；和

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司，以提供纯化的吡美莫司。

在另一方面，所述氯化步骤包括在有机溶剂中用二氯三苯基膦烷氯化粗子囊霉素。在又一方面，所述氯化步骤包括由三苯基膦与氯化烷烃或N-氯丁二酰亚胺反应原位产生氯化剂。在另一方面，氯化剂是二氯三苯基膦烷。

在另一方面，所述方法中使用的粗子囊霉素含有不少于90％的子囊霉素。在另一方面，所述方法中使用的粗子囊霉素含有至多2％(w/w)的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5％(w/w)的17-乙基子囊霉素和/或至多4％(w/w)的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素。在一个方面，粗子囊霉素是工业级子囊霉素。在一方面，粗子囊霉素在氯化步骤之前不进行纯化。

在另一方面，纯化的吡美莫司含有降低浓度的吡美莫司的C21差向异构体或一个或多个吡美莫司同系物，其不同之处在于相对于所述粗吡美莫司，仅有1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处。

在所述方法的一个方面，通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司产生含有吡美莫司的目标洗脱份，并且进一步包含使所述目标洗脱份中的吡美莫司结晶的步骤，以提供纯化的吡美莫司。在另一方面，通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司包括以下步骤：

i)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司，得到主要洗脱份，其中所述主要洗脱份含有吡美莫司；

ii)浓缩并且然后稀释所述主要洗脱份；

iii)通过高压液相色谱法再循环所述主要洗脱份；并且

iv)任选地重复步骤ii)和iii)，

以产生含有吡美莫司的所述目标洗脱份。

在另一方面，纯化的吡美莫司不经历进一步的纯化步骤。

在本发明的一个方面，高压液相色谱法使用选自由烷基化二氧化硅、二醇二氧化硅或氰基二氧化硅组成的组的固定相。在另一方面，高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的流动相：

非极性溶剂、极性质子溶剂和任选的极性质子溶剂；

一种或多种C₅-C₈烷烃、醚和异丙醇；

一种或多种C₅-C₈环烷烃、醚和异丙醇；

一种或多种C₅-C₈烷烃、醚和乙醇；

一种或多种C₅-C₈环烷烃、醚和乙醇；

庚烷81.1±0.5％:甲基叔丁基醚14.4±0.5％:异丙醇4.5(4.2-4.9)％；

C₁-C₃醇或乙腈、任选的醚和任选的酸；或者

水、可与水混溶的溶剂、任选的醚和任选的酸。

在另一方面，纯化步骤涉及通过高压液相色谱法在十八烷基二氧化硅固定相上用30％水:70％甲醇流动相纯化所述粗吡美莫司。

在本发明的一方面，所述方法产生纯化的吡美莫司，其纯度大于98％，更优选大于99％，并且还更优选大于99.5％。

本发明的另一个实施例包括用于制备纯化的吡美莫司的方法，其包括以下步骤：

a)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份，其中所述粗吡美莫司通过氯化粗子囊霉素但未进一步纯化所述粗子囊霉素来制备；

b)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司。

在另一方面，纯化的吡美莫司的纯度大于98％，优选大于99％，并且还更优选大于99.5％。

在另一方面，所述方法中使用的粗子囊霉素含有不少于90％的子囊霉素。在另一个方面，粗子囊霉素含有至多2％(w/w)的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5％(w/w)的17-乙基子囊霉素和/或至多4％(w/w)的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素。粗子囊霉素可能是工业级子囊霉素。

在又一个实施例中，本发明包括用于制备纯化的吡美莫司的方法，其由以下步骤组成：

a)氯化粗子囊霉素，得到粗吡美莫司；

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份；和

c)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司。

在本发明的另一方面，纯化步骤b)包括以下纯化步骤：

i)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司，得到主要洗脱份，其中所述主要洗脱份含有吡美莫司；

ii)浓缩并且然后稀释所述主要洗脱份；

iii)通过高压液相色谱法再循环所述主要洗脱份；并且

iv)任选地重复步骤ii)和iii)，

以产生含有吡美莫司的所述目标洗脱份。

在本发明的又一个实施例中，本发明包括用于制备纯化的吡美莫司的方法，所述方法基本上由以下步骤组成：

a)氯化粗子囊霉素，得到粗吡美莫司；

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份；和

c)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司。

在审阅接下来的详细描述之后，本发明的这些和其它方面将变得被更充分理解。

附图说明

图1展示基于领域的制备匹美莫司的方法与本公开的方法的流程图比较。

图2展示实例2中获得的制备型HPLC色谱图的实例。

具体实施方式

下文结合附图阐述的详细描述既定作为对各种配置的描述，并且并不希望表示可实践本文所描述的概念的唯一配置。详细描述出于提供对各种概念的透彻理解的目的而包括特定细节。然而，对于所属领域的技术人员来说将显而易见的是，可在没有这些特定细节的情况下实践这些概念。在一些例子中，以框图形式展示众所周知的部件以免混淆这类概念。

如本文所用，术语“约”被定义为接近于本领域普通技术人员所理解的。在一个非限制性实施例中，术语“约”定义为在10％以内，优选在5％以内，更优选在1％以内，并且最优选在0.5％以内。

如本文所用，“粗子囊霉素”定义为在通过适当的分析技术(例如，HPLC)测量时，含有超过约0.2％(w/w)的21-脱亚甲基子囊霉素、超过约0.1％(w/w)的17-乙基子囊霉素、超过约0.1％(w/w)的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不超过96％(w/w)的子囊霉素的子囊霉素。

如本文所用，“工业级子囊霉素”定义为当通过适当的分析技术(例如HPLC)测量时含有不少于90％的子囊霉素的粗子囊霉素。工业级子囊霉素可能含有至多2％(w/w)的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5％(w/w)的17-乙基子囊霉素和至多4％(w/w)的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素。

如本文所用，“纯子囊霉素”定义为当通过适当的分析技术测量时含有少于0.2％(w/w)的21-脱亚甲基子囊霉素、0.1％(w/w)的17-乙基子囊霉素、0.1％(w/w)的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不低于96％(w/w)的子囊霉素的子囊霉素。

如本文所用，“纯化的吡美莫司”定义为已被纯化以实现去除一些或全部杂质的吡美莫司，包括但不限于吡美莫司的C21差向异构体和吡美莫司的同系物，其不同之处在于，仅有1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处。

如本文所用，当通过适当的分析技术测量时，“实质上纯的吡美莫司”是纯度大于98％的吡美莫司。

如本文所用，“室温”是指约25℃。

尽管在相关技术中公开用于产生或纯化吡美莫司的各种方法，但是仍需要一种容易的、提供良好的产率、低成本并且可工业可用的纯化的吡美莫司的产生方法。本文的发明在于由粗子囊霉素(其可以是工业级子囊霉素)制备纯化的吡美莫司的能力，同时还减少纯化吡美莫司所需的步骤数。这产生高质量、较低成本并且更纯的吡美莫司活性成分。

令人惊讶地发现，可以通过氯化粗子囊霉素，并且然后用高压液相色谱法纯化所得粗吡美莫司来从粗子囊霉素中制备纯化的吡美莫司。因此，本发明的一个方面包括一种通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司来制备纯化的吡美莫司的方法，其中所述粗吡美莫司题通过氯化粗子囊霉素但未进一步纯化粗子囊霉素来制备。在一些实施例中，粗子囊霉素是工业级子囊霉素。在一些实施例中，由高压液相色谱法产生的实质上纯的吡美莫司可以在结晶步骤中进一步结晶。

令人惊讶地发现，不同之处在于仅有1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处的吡美莫司的C21差向异构体和同系物可以通过HPLC消除。迄今为止，从含有吡美莫司的混合物中消除这些同系物的唯一可能性是由经历大量纯化步骤的子囊霉素合成吡美莫司。因此，本申请提供由粗子囊霉素产生纯吡美莫司但未事先纯化子囊霉素的简单方法。

在第一步骤中，使未受保护的工业级子囊霉素与适当的氯化剂(例如二氯三苯基膦烷)在有机溶剂中任选地在碱存在下反应。氯化剂和任选的碱任选地各自在有机溶剂中或按原样混合，并且将所得混合物在适当的温度下搅拌足以反应的反应时间。

在一个实施例中，氯化剂是二氯三苯基膦烷。氯化剂可以按原样使用或可以原位提供，例如通过用氯化烷烃(例如C₁-C₂烷烃，例如CCl₄、C₂Cl₆，优选CCl₄)处理三苯基膦；或在有机溶剂或有机溶剂的混合物中将三苯基膦添加到NCS中。

在一些实施例中，有机溶剂或有机溶剂的混合物可包括：烃，例如芳香族烃，例如苯、甲苯；和醚，例如四氢呋喃(THF)；腈，例如乙腈；氯化烷烃，例如CCl₄；以及上述溶剂的混合物。在另一个实施例中，反应混合物可以用适当的一种或多种额外的溶剂稀释，在一些实施例中可以将其用于促进搅拌。

在一个实施例中，有机溶剂选自由以下组成的组：芳香族烃(例如甲苯)、醚(例如四氢呋喃)、腈(例如乙腈)或卤代烷烃(例如氯化烷烃)或其混合物例如甲苯和乙腈)。在使用三苯基膦的情况下，优选的有机溶剂包括氯化烷烃和卤代烷烃以制备作为氯化剂的二氯三苯基膦烷。在使用三苯基膦和氯化烷烃作为溶剂的情况下，在一个方面，所述氯化烷烃可以用作产生二氯三苯基膦烷的卤素源，并且在另一方面，可以用作有机溶剂，但不排除添加其它有机溶剂，例如以上所列举的有机溶剂。对于氯化子囊霉素，尤其优选在四氢呋喃中使用三苯基膦和NCS。

合适的碱是本领域普通技术人员已知的有机碱，包括但不限于例如含氮碱，例如叔胺或含有至少一个氮原子的杂环碱，更优选地是芳香族杂环碱，例如吡啶或咪唑；最优选为2,4,6-三甲基吡啶(s-可力丁(collidine))。

子囊霉素和氯化剂的比例合适地为至少当量比(即，至少1:1的子囊霉素:氯化剂)，并且优选使用过量的氯化剂。子囊霉素与氯化剂的比例合适地为约1:1到约1:5。举例来说，子囊霉素和氯化剂以约1:1到约1:3(即，每当量子囊霉素1到3当量氯化剂)的比例适当地使用，例如约1:1到约1:2；例如，约1:1到约1:5、优选约1:1到约1:1.3，例如约1:1到1:3的比例，例如1:1到1:2；例如，1:1到1:5、优选1:1到1:1.3可为适当的。

NCS相对于子囊霉素的优选初始摩尔过量为0-30摩尔％。更优选地，NCS相对于子囊霉素的摩尔过量为8摩尔％。

子囊霉素与碱的比例应至少为当量比(即至少1:1)，并且优选使用过量的碱。举例来说，子囊霉素和碱可以约1:1到约1:10的比例(每当量子囊霉素1到10当量碱)使用，例如约1:2到约1:10，例如约1:3到约1:9，优选为约1:2到约1:4，或其之间的任何整数比例或子范围。

三苯基膦相对于子囊霉素的首选初始摩尔过量为0-30摩尔％。更优选地，三苯基膦相对于子囊霉素的初始摩尔过量为3摩尔％。

在使用三苯基膦和氯化烷烃作为溶剂的情况下，在一方面，所述氯化烷烃可以用作产生二氯三苯基膦烷的卤素源，并且另一方面可以用作有机溶剂，但不排除添加其它有机溶剂，例如以上所列举的有机溶剂。

适当的反应温度包括室温到约100℃，例如室温到约90℃、室温到约80℃或室温到约70℃的温度。

在使用氯化烷烃(例如CCl₄)和三苯基膦产生氯化剂的情况下，优选的反应温度是氯化烷烃的回流温度。

在使用三苯基膦和NCS的情况下，合适的反应温度包括室温到约100℃的温度。优选的反应温度在25与40℃之间。足以进行反应的合适的反应时间在1与40小时之间。优选地，反应时间在10与20小时之间。所需的反应时间取决于所选的温度，并且反应时间的最佳化在本领域普通技术人员的知识范围内。可以使用本领域普通技术人员已知的方法监测反应进程，所述方法包括但不限于薄层色谱法、HPLC和LC，其各自与UV检测结合。本领域普通技术人员可以测定用于反应监测的UV检测的合适波长，包括但不限于254nm。

在足够的反应时间之后，优选通过用不可与水混溶的溶剂(例如环己烷)稀释并且与酸水溶液(例如柠檬酸)反应来处理反应产物。使用每摩尔碱(例如，s-可力丁)至少1/3摩尔柠檬酸，优选1/3到1摩尔，更优选2/3摩尔。酸水溶液可以含有可与水混溶的溶剂，例如甲醇或乙醇，优选为甲醇。分离水层和不可与水混溶层。不可与水混溶层可以再次用水和任选的甲醇萃取。

萃取后，使用本领域普通技术人员已知的方法将溶剂从有机相中蒸发，得到残余物。然后将残余物溶解于合适的溶剂中。合适的溶剂是吡美莫司易溶于其中并且可以通过蒸发易于去除的溶剂，例如丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇，优选为丙酮。

所得粗吡美莫司溶液通过HPLC进一步纯化。进料溶液通过蒸发溶剂并且添加类似于流动相但含有足够组分的溶剂混合物来制备，所述组分为对于吡美莫司良好的溶剂，优选为异丙醇、甲基叔丁基醚和正庚烷。举例来说，如果使用乙腈/水(例如12％(w/w)水:88％(w/w)乙腈)作为流动相，那么可使用相同的溶剂混合物(12％(w/w)水:88％(w/w)乙腈)用于制备进料溶液。

本领域普通技术人员将理解，通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司将产生废物洗脱份和含有吡美莫司的主要洗脱份。在一些实施例中，通过高压液相色谱法获得的主要洗脱份可通过高压液相色谱法进一步纯化，通过再循环主要洗脱份以得到目标洗脱份。在一些实施例中，将废物洗脱份从主要洗脱份中去除并且丢弃。在一些实施例中，在三到六次这样的再循环之后获得目标洗脱份。在一个实施例中，四次再循环是优选的。在一些实施例中，将主要洗脱份浓缩，溶解于适当的溶剂(例如，类似于流动相但含有足够组分的溶剂混合物，所述组分为对于如上所述的吡美莫司良好的溶剂)中并且再循环。图2展示经历这类再循环的物流的色谱图的一个实例；在第一次HPLC循环之后，将洗脱份F1丢弃，并且使再循环的洗脱份进一步经历HPLC；重复这一过程，直到获得目标洗脱份F2。

在本公开的一个实施例中，使用包括烷基化二氧化硅固定相的固定相进行HPLC纯化。烷基化二氧化硅固定相可以是甲基、丁基、辛基、十二烷基或十八烷基二氧化硅。烷基化二氧化硅可以选自市售烷基化二氧化硅，例如Daisogel C1-P、Daisogel C4-P、DaisogelC8-P、Daisogel ODS、Phenomenex Luna Prep C18(2)、YMC Pack ODS-AQ 12S11、YMC ODS-AQ(10μm、

)或Kromasil C18。与这类固定相一起使用的合适的流动相包括水加上C₁-C₃醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)或乙腈，任选进一步包括醚(例如，甲基叔丁基醚或二乙醚)和/或任选地进一步包括酸，例如H₃PO₄或TFA。流动相中醚和/或酸浓度的最佳化在本领域普通技术人员的知识范围内。

在一优选实施例中，HPLC纯化使用十八烷基二氧化硅作为固定相并且以水:甲醇或水:乙腈作为流动相来进行。乙腈的浓度特别优选为84％(w/w)或更高，例如12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈。

为了提高产率，粗吡美莫司可以通过色谱法在十八烷基硅胶柱上以更高的负载量进行预处理。这种处理分离三苯基膦氧化物、子囊霉素和33-表氯-Δ^23,24-子囊霉素与吡美莫司。

用甲醇:水进行色谱的优选温度为35到70℃，优选为45到55℃，更优选为50℃。

在本发明的另一个实施例中，使用二醇-二氧化硅作为固定相进行HPLC。二醇-二氧化硅可以是任何二醇-二氧化硅，例如市售二醇-二氧化硅，例如YMC Pack-120-HG、YMCPack-80-HG和Kromasil 60-10Diol。流动相可包括非极性溶剂，例如烷烃、环烷烃、石油醚；加上极性质子溶剂，例如酒精、水；加上任选的极性非质子溶剂，例如醚，优选为甲基叔丁基醚；环醚，优选为THF；酯，优选为乙酸乙酯；卤代溶剂，优选为二氯甲烷。优选的流动相是C₅-C₈烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷或辛烷)或环烷烃(例如环己烷、甲基环己烷、二甲基环己烷)加上醚(例如甲基叔丁基醚)、四氢呋喃加上异丙醇或乙醇。流动相中溶剂比例的最佳化在本领域普通技术人员的知识范围内。

在一个实施例中，HPLC使用Kromasil 60-10Diol、

孔隙、10μm颗粒作为固定相和庚烷81.1±0.5％(w/w):甲基叔丁基醚14.4±0.5％(w/w):异丙醇(IPA)4.5(4.2-4.9)％(w/w)作为流动相进行；即，异丙醇可为4.2-4.9％(w/w)的流动相，例如4.5％(w/w)。

在另一个实施例中，使用氰基二氧化硅固定相进行HPLC。氰基二氧化硅可以是任何氰基二氧化硅，例如市售氰基二氧化硅，包括Phenomenex Luna CN。在这类实施例中，流动相可以包括水+C₁-C₃醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)。优选的流动相是水+甲醇(35％(w/w)+65％(w/w))。这一色谱系统能够分离吡美莫司的互变异构形式。

合并的色谱主要洗脱份在薄层蒸发器上在真空中(在150mbar下)蒸发。将残余物溶解于丙酮中。合并侧洗脱份并且在第二色谱步骤中进一步纯化。

通过从合适的溶剂(例如乙酸乙酯环己烷/水、丙酮/庚烷)中结晶来进一步纯化所得吡美莫司。在蒸发和干燥步骤下，优选的溶剂是乙醇/水。当使用乙醇/水结晶时，首先使物质经历溶剂交换(即，丙酮到为乙醇)。然后在结晶过程中将水添加到乙醇溶液中，并且也可以使用晶种。所得产物的色谱纯度>99％(w/w)。

通过经由HPLC纯化粗吡美莫司产物，避免需要昂贵和大量的逆流萃取(例如在美国专利第7,148,346号中公开的那些，其以引用的方式并入本文中)。因此，在一个实施例中，本发明包括用于制备吡美莫司的方法，其中所述吡美莫司不经历HPLC和结晶以外的进一步纯化步骤。这产生商业规模的方法，所述方法可以高产率和较少的广泛处理产生大量纯化的吡美莫司，包括实质上纯的吡美莫司。

图1展示将本公开的方法与已知方法进行比较的流程图。如上所讨论，在粗吡美莫司的制备中，本发明的方法以类似的方式进行氯化反应，但是在已知方法中，不需要逆流萃取起始材料(子囊霉素)。由粗吡美莫司制备吡美莫司活性物质(即纯化步骤)时，不需要已知方法的“步骤1”；相反，使用HPLC色谱法，得到纯化的吡美莫司。

实例1

粗子囊霉素的氯化

将121kg(含有116.9kg 100％的子囊霉素)市售子囊霉素(分析>90％)置于反应器中，并且加入甲苯并且在真空中蒸馏出，以共沸干燥子囊霉素。将残余物溶解于THF中，将其再次蒸馏出并且用新鲜THF代替。

在另一个反应器中，将40kg三苯基膦溶解于THF中。向这一溶液中逐份加入21.3kg的N-氯丁二酰亚胺。将这一反应混合物在室温下搅拌，然后缓慢加入40L可力丁，将温度保持在室温。泵入THF中的子囊霉素溶液并且在39℃下搅拌。分析所述批次的子囊霉素含量。如果子囊霉素含量太高，那么添加更多量的三苯基膦和NCS，并且继续搅拌。

将反应混合物冷却到20℃。进料环己烷，并且在20℃下添加40kg柠檬酸的水和甲醇溶液。分离各相。上层有机相用水和甲醇的混合物洗涤。重复洗涤。合并下层相，并且用环己烷再萃取两次。合并的有机相用水洗涤。然后蒸发环己烷。将浓稠的残余物溶解于丙酮。蒸发溶剂，并且最终将残余物溶解于400kg丙酮中。这一溶液含有色谱纯度>70％的103kg(理论值的86％)的吡美莫司、不超过10％(w/w)的子孢霉素和不超过20％(w/w)的33-表氯-Δ^23,24-子囊霉素。

HPLC纯化

将57.1kg的分析值为17.52％(w/w)的吡美莫司(＝10kg吡美莫司)的这一溶液蒸发至干，溶解于异丙醇、甲基叔丁基醚和正庚烷的混合物中，得到181kg进料溶液并且经1.5kg硅胶过滤。过滤后的溶液用作色谱纯化的进料，所述色谱柱填充有Kromasil 60-10Diol、

孔、10μm颗粒作为固定相。所用流动相为81.1％(w/w)庚烷、14.4％(w/w)甲基叔丁基醚、4.5％(w/w)异丙醇。当从进料溶液变为流动相时，令人惊讶的是没有吡美莫司的结晶发生，即使吡美莫司在进料浓度下不溶于这一混合物中。

分离之后，使用波长为254nm的UV检测器，并且根据信号将洗脱液分离为空、侧洗脱份和主要洗脱份。洗脱完成时，将柱用纯异丙醇进行再生，并且由于两部分中的高ΔP而用流动相进行调节。

将合并的主要洗脱份在薄层蒸发器中于真空中(150mbar)蒸发。将残余物溶解于丙酮中。得到106.8kg的吡美莫司浓度为6.5％(w/w)的丙酮溶液。这等于粗进料溶液中10kg吡美莫司的6.94kg吡美莫司，其主要洗脱份的产率为理论值的69％。

侧洗脱份以与主要洗脱份相同的方式浓缩。获得另一种含有4.6％(w/w)吡美莫司的54kg丙酮溶液，这是另一2.5kg吡美莫司，理论产率为25％。将这一材料再循环到色谱步骤中，得到的主要洗脱份还含有0.65kg(理论值的26％)吡美莫司。主要洗脱份的吡美莫司的总产量为7.59kg(理论值的75.9％)。

浓缩和结晶：

将溶解于含有111.2kg吡美莫司的丙酮中的主要洗脱份的浓缩物在容器中合并。将溶液过滤并且在真空中浓缩。加入乙醇。在真空中蒸馏出丙酮和乙醇，同时添加乙醇以保持浓度恒定。最后，通过添加乙醇将浓度调节到25％(w/w)吡美莫司。

将吡美莫司在水和乙醇的混合物中的悬浮液制备为结晶种子悬浮液。

将25％(w/w)吡美莫司的乙醇溶液加热到回流温度30分钟，冷却到55℃，并且添加种子悬浮液。将混合物在55℃下再搅拌(至多)45分钟。在2小时内添加去矿物质水。将混合物在55℃下再搅拌30分钟。将悬浮液冷却到10℃并且在10℃下搅拌。

晶体通过过滤干燥器过滤。滤饼用33％(w/w)的乙醇水溶液洗涤3次。将滤饼在过滤器-干燥器中在48℃的夹套温度下在真空中干燥，直到含水量低于0.1％(w/w)，得到105.6kg纯的吡美莫司(理论值的95％)。

对于商业子囊霉素计算的总产率为86％×75.9％×95％＝62％。制备的纯化的吡美莫司的分析值为100.9％(w/w)，并且色谱纯度为99.52％(w/w)。这一值表示100％减去总杂质。

实例2

如实例1所述将子囊霉素氯化为粗吡美莫司。

色谱预处理：

在填充有C18-二氧化硅固定相(Daiso)的50mm直径x 250mm高的色谱柱上，将7.4g粗吡美莫司(分析值为50.4％(w/w)，含有3.73g100％纯吡美莫司)作为溶液注入12％(w/w)水/88％(w/w)乙腈中，其中浓度为200g粗吡美莫司/升(高负荷)。吡美莫司用12％(w/w)水、88％(w/w)乙腈洗脱。在色谱纯度为84％(w/w)下，目标洗脱份含有3.62g(输入的97％)吡美莫司。

从目标洗脱份中蒸发溶剂，并且将残余物以70g/l的浓度溶解于洗脱液12％(w/w)水/88％(w/w)乙腈中。将这一溶液注入50mm直径×250mm高度的填充有C18-二氧化硅固定相(Daiso)的柱中，并且经历再循环色谱纯化。洗脱液12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈，经过4次再循环，如图2所示。

目标洗脱份(如图2所示)含有2.97g(输入的82％)吡美莫司，纯度为98.43％(w/w)。这对应于每天每千克固定相120g吡美莫司的产率。

如实例1中所述浓缩目标洗脱份并且从乙醇/水中结晶。

实例3

如实例1所述将子囊霉素氯化为粗吡美莫司。

色谱预处理：

在填充有C18-二氧化硅固定相(Daiso)的50mm直径x 250mm高的色谱柱上，将7.8g粗吡美莫司(分析值为50.3％(w/w)，含有3.92g100％纯的吡美莫司)作为溶液注入12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈中，其中浓度为200g粗吡美莫司/l。吡美莫司用12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈洗脱。目标洗脱份含有3.77g(输入的96％)吡美莫司，其中色谱纯度为81.3％(w/w)。

从目标洗脱份中蒸发出溶剂，并且将残余物以65g/l的浓度溶解于洗脱液12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈中。将这一溶液注入50mm直径×250mm高度的填充有C18-二氧化硅固定相(Daiso)的柱中，并且经历再循环色谱纯化。洗脱液12％(w/w)的水:88％(w/w)的乙腈，再循环6次。

目标洗脱份含有2.83g(输入的75％)吡美莫司，纯度为98.92％(w/w)。这对应于200g粗吡美莫司/kg固定相/天的产率。将目标洗脱份蒸发至干。

将残余物在75℃下溶解于3份94％(w/w)的乙醇中。在接种之前将溶液冷却到55℃；缓慢加入1.5份水。将溶液冷却到10℃。将混合物在10℃下老化过夜。过滤产物，用1体积的冷水洗涤，并且在50℃下干燥。分离出2.72g吡美莫司(输入的96％)。

以商业子囊霉素计算的总产率为86％×96％×75％×96％＝59.4％。

制备的吡美莫司的分析值为100.07％(w/w)，并且色谱纯度为99.71面积％。

实例4

如实例1所述将子囊霉素氯化为粗吡美莫司。

在固定相YMC ODS-AQ(10μm，

)上对粗吡美莫司(分析值为62.8％(w/w))进行色谱。使用70％(w/w)甲醇+30％(w/w)水作为流动相。色谱在50℃下运行两次。第一次运行实现主要洗脱份的纯度为87面积％。使用第一次的主要洗脱份作为进料的第二次运行在主要洗脱份中获得的纯度为97面积％，并且这一洗脱份中的吡美莫司的产率为63.9％。

如先前实例中所述从乙醇水中结晶后，可实现99.8面积％的色谱纯度。

实例5(比较实例)

在使用粗子囊霉素作为起始材料的比较实例中，吡美莫司使用WO2006/040111的实例3和4中所述的方法制备。将1g三苯基膦在10ml四氢呋喃(THF)中的溶液逐滴添加到12ml THF中的0.51g NCS中。将所得混合物在室温(22℃)下搅拌0.5小时。然后加入1ml吡啶，然后加入2.45g干燥的工业子囊霉素在20ml THF中的溶液。将所得混合物在65℃下搅拌1小时。混合物用甲苯(45ml)稀释，添加水(2×40ml)，并且分离出两相。有机层用1N HCl(40ml)、水(40ml)、饱和氯化钠水溶液(40ml)洗涤，并且用硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。从所得溶液中蒸发溶剂。

残余物通过硅胶色谱法纯化。将2.8g干燥残余物溶解于6ml EtOAc中，并且逐滴添加11ml庚烷，得到17.5ml溶液(EtOAc含量＝35体积％)。将16.5ml的这种进料溶液注入具有以下规格的色谱柱中：

L＝45cm

D＝25mm

V＝220ml

SF＝硅胶MB 40-75μ(在流动相中制备)

流动相：

庚烷6.5L

乙酸乙酯2.5L

约28体积％的EtOAc

注射量：16.5ml

温度：环境温度

将含有吡美莫司的洗脱份F3到F8合并在一起，并且蒸发后，干燥的残余物重0.9g。

在100mL玻璃反应器中，将来自色谱法的干燥残余物(0.9g)溶解于6.0mL乙醇中，并且添加2.2mL去矿物质水。将混合物在4℃下搅拌。在5分钟内，添加0.6mL去矿物质水，并且再搅拌30分钟。然后将其冷却到0℃。搅拌3小时后，混合物混浊，但产物未结晶。加入5mL水，并且在0℃下再搅拌22小时。将悬浮液过滤并且将晶体在40℃和100mbar下干燥。获得并且分析0.6g结晶吡美莫司。分析得出以下组成：

可以看出，分离出的吡美莫司纯度不高，不能用作医药活性成分，因为其不满足纯度和效能所要求的规格。

本文所述的所有试剂和溶剂合适地具有指定的纯度或等级，或具有试剂级或分析级，或具有可商购或通过本领域普通技术人员已知的方法获得的最高纯度。

虽然已结合上文概述的实例方面描述本文所描述的各方面，但无论是否已知或当前未预见到或可能未预见到，各种替代方案、修改、变化、改进和/或实质性等效物至少对于所属领域的一般技术人员来说均可变得显而易见。因此，如上文所阐述的实例方面旨在说明而非限制。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。因此，本公开旨在涵盖所有已知或稍后开发的替代方案、修改、变化、改进和/或实质性等效物。

除非特别陈述，否则以单数形式提到的要素并非打算意指“一个并且仅一个”而是“一个或多个”。本领域普通技术人员已知或稍后已知的贯穿本公开所述的各种方面的要素的所有结构和功能等效物明确地以引用的方式并入本文中。此外，本文中所公开的任何内容都不希望专用于公用。

此外，词语“实例”在本文中用来表示“充当实例、例子或说明”。本文中描述为“实例”的任何方面不一定被理解为比其它方面优选或有利。除非另外特别地陈述，否则术语“一些”指代一个或多个。例如“A、B或C中的至少一者”、“A、B和C中的至少一者”以及“A、B、C或其任何组合”等组合包括A、B和/或C的任何组合，并且可包括A的倍数、B的倍数或C的倍数。具体来说，例如“A、B或C中的至少一者”、“A、B和C中的至少一者”和“A、B、C或其任何组合”等组合可为仅A、仅B、仅C、A和B、A和C、B和C,或A和B和C，其中任何这些组合可含有A、B或C的一个或多个成员。

此外，本申请通篇的所有参考文献，例如专利文件，包括已发布或已授予的专利或等效文件；专利申请公开案；非专利文献文件或其它原始资料；以其全文引用的方式并入本文中，就像通过引用将其单独并入一样。

Claims (24)

1.一种用于制备纯化的吡美莫司的方法，其包含：

a)使粗子囊霉素发生氯化以提供粗吡美莫司；

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司，以提供纯化的吡美莫司，

其中所述粗子囊霉素含有超过0.2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、超过0.1w/w％的17-乙基子囊霉素、超过0.1w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不超过96w/w％的子囊霉素，

其中所述粗子囊霉素含有至多2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5w/w％的17-乙基子囊霉素和/或至多4w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素；

其中所述纯化的吡美莫司含有浓度降低的吡美莫司的C21差向异构体或一种或多种吡美莫司同系物，其不同之处仅仅在于，相对于所述粗吡美莫司，1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处；

其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：十八烷基二氧化硅、Kromasil 60-10Diol。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化步骤包含在有机溶剂中用二氯三苯基膦烷使所述粗子囊霉素发生氯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化步骤包含由三苯基膦与氯化烷烃或N-氯丁二酰亚胺的反应原位产生氯化剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化使用的氯化剂是二氯三苯基膦烷。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗子囊霉素含有不少于90％的子囊霉素。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗子囊霉素在所述氯化步骤之前不进行纯化。

7.根据权利要求1所述的方法，其中通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司产生含有吡美莫司的目标洗脱份，并且进一步包含使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶以提供纯化的吡美莫司的步骤。

8.根据权利要求1所述的方法，其中通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司包含以下步骤

i)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司，得到主要洗脱份，其中所述主要洗脱份含有吡美莫司；

ii)浓缩并且然后稀释所述主要洗脱份；

iii)通过高压液相色谱法再循环所述主要洗脱份；以及

iv)任选地重复步骤ii)和iii)，

以产生含有吡美莫司的目标洗脱份。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗吡美莫司不经受进一步的纯化步骤。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：YMC ODS-AQ、Daiso。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的流动相：

一种或多种C₅-C₈烷烃、醚和异丙醇；

一种或多种C₅-C₈环烷烃、醚和异丙醇；

一种或多种C₅-C₈烷烃、醚和乙醇；

一种或多种C₅-C₈环烷烃、醚和乙醇；

C₁-C₃醇或乙腈、任选的醚和任选的酸；或者

水、可与水混溶的溶剂、任选的醚和任选的酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用由以下组分组成的流动相：

庚烷81.1±0.5％、甲基叔丁基醚14.4±0.5％、异丙醇4.2-4.9％。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用由以下组分组成的流动相：

庚烷81.1±0.5％、甲基叔丁基醚14.4±0.5％、异丙醇4.5％。

14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)包含通过高压液相色谱法在十八烷基二氧化硅固定相上用30％水：70％甲醇流动相纯化所述粗吡美莫司。

15.一种用于制备纯化的吡美莫司的方法，所述方法包含：

a)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份，其中所述粗吡美莫司是通过使粗子囊霉素发生氯化而不进一步纯化所述粗子囊霉素来制备；

b)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司，

其中所述粗子囊霉素含有超过0.2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、超过0.1w/w％的17-乙基子囊霉素、超过0.1w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不超过96w/w％的子囊霉素，

其中所述粗子囊霉素含有至多2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5w/w％的17-乙基子囊霉素和/或至多4w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素，

其中所述纯化的吡美莫司含有浓度降低的吡美莫司的C21差向异构体或一种或多种吡美莫司同系物，其不同之处仅仅在于，相对于所述粗吡美莫司，1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处；

其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：十八烷基二氧化硅、Kromasil 60-10Diol。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：YMC ODS-AQ、Daiso。

17.一种用于制备纯化的吡美莫司的方法，所述方法由以下组成：

a)使粗子囊霉素发生氯化，得到粗吡美莫司；

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份；和

c)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司，

其中所述粗子囊霉素含有超过0.2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、超过0.1w/w％的17-乙基子囊霉素、超过0.1w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不超过96w/w％的子囊霉素，

其中所述粗子囊霉素含有至多2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5w/w％的17-乙基子囊霉素和/或至多4w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素；

其中所述纯化的吡美莫司含有浓度降低的吡美莫司的C21差向异构体或一种或多种吡美莫司同系物，其不同之处仅仅在于，相对于所述粗吡美莫司，1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处；

其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：十八烷基二氧化硅、Kromasil 60-10Diol。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤b)包括

i)通过高压液相色谱法纯化粗吡美莫司，得到主要洗脱份，其中所述主要洗脱份含有吡美莫司；

ii)浓缩并且然后稀释所述主要洗脱份；

iii)通过高压液相色谱法再循环所述主要洗脱份；以及

iv)任选地重复步骤ii)和iii)，

以产生含有吡美莫司的目标洗脱份。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：YMC ODS-AQ、Daiso。

20.一种用于制备纯化的吡美莫司的方法，所述方法主要由以下组成：

a)使粗子囊霉素发生氯化，得到粗吡美莫司；

b)通过高压液相色谱法纯化所述粗吡美莫司以产生含有吡美莫司的目标洗脱份；和

c)使所述目标洗脱份中的所述吡美莫司结晶，得到纯化的吡美莫司，

其中所述粗子囊霉素含有超过0.2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、超过0.1w/w％的17-乙基子囊霉素、超过0.1w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素和不超过96w/w％的子囊霉素，

其中所述粗子囊霉素含有至多2w/w％的21-脱亚甲基子囊霉素、至多1.5w/w％的17-乙基子囊霉素和/或至多4w/w％的21-表子囊霉素和11-乙基子囊霉素；

其中所述纯化的吡美莫司含有浓度降低的吡美莫司的C21差向异构体或一种或多种吡美莫司同系物，其不同之处仅仅在于，相对于所述粗吡美莫司，1个亚甲基存在于位置C19、C17、C11处或不存在于位置C21处；

其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：十八烷基二氧化硅、Kromasil 60-10Diol。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述高压液相色谱法使用选自由以下组成的组的固定相：YMC ODS-AQ、Daiso。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中纯化的吡美莫司的纯度大于98％。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中纯化的吡美莫司的纯度大于99％。

24.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中纯化的吡美莫司的纯度大于99.5％。

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