CN107674116A - 一种纽莫康定b0的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纽莫康定B0的纯化方法，该方法先从发酵液菌渣中萃取纽莫康定B0粗品，粗品经膜过滤处理后，向过滤液中加入吸附剂以形成吸附有纽莫康定B0的固形物，并对固形物进行CO2超临界流体萃取，再向所得萃取液中加入溶剂析晶，最后以HILIC模式反相硅胶键合填料为固定相，乙醇水溶液为流动相，对晶体进行柱层析分离，收集富含纽莫康定B0的流出液，即得纯品纽莫康定B0；该方法能够很好地实现PB0和PC0的分离，稳定高效地得到纽莫康定B0，其HPLC纯度可达99.4％以上，异构体PC0的HPLC纯度低至0.01‑0.04％，与现有提纯方法相比，本发明具有工艺操作简便，产品品质佳的优势。

Description

一种纽莫康定B0的纯化方法
技术领域
本发明涉及化学领域，尤其涉及一种纽莫康定BO的纯化方法。
背景技术
纽莫康定B0(Pneumocandin B0，简称PB0)是由真菌产生的次级代谢物，是合成抗真菌药物卡泊芬净(Caspofungin)的中间体。卡泊芬净是首个被美国食品与药品管理局批准用于临床的棘球白素B类药物，是一种β-(1，3)-葡聚糖合成酶的非竞争性抑制剂，可影响真菌细胞壁的合成，从而具有抗真菌的活性。
纽莫康定B0由真菌发酵产生，发酵过程中会产生与PB0结构相似的多种产物如纽莫康定A0(简称PA0)，也有PB0的异构体纽莫康定C0(简称PC0)，从发酵液中分离PB0的方法非常复杂。
申请号为201110328804.0的中国专利“一种高纯度肺囊康定B0的制备方法”采用大孔树脂处纯化，再用聚合物微球分离的方式得到了98％以上纯度的纽莫康定B0精粉，但专利没有具体说明HPLC的检测方式是否将PB0的异构体PC0从PB0峰中彻底分离开。
申请号为201210326890.6的中国专利“卡泊芬净前体pnemocandin B0组分的纯化方法”先采用反相硅胶柱分离，再采用正向硅胶柱分离，得到了PB0的HPLC含量大于95％，PC0含量小于1％的产品。
上述两个专利为了分离杂质，且去掉代谢中的色素干扰，都采用了两种以上的层析分离操作，再加上为了避免填料，特别是硅胶键合的正、反相填料被很快的污染，中途添加了很多纯化步骤，这些步骤多次涉及到浓缩操作。而PB0的热稳定性较差，应在不超过50℃条件下浓缩，然而此温度下低浓度含水有机溶剂，如甲醇、乙醇的水溶液的浓缩需要时间较长，长时间浓缩会造成产品质量、收率的降低；且浓缩后析出物为絮状物，离心分离比较困难，生产操作繁琐。此外，正相硅胶分离的溶媒中含有水，多次使用后会由于正相硅胶填料中水分子吸附量的增加导致填料分离效能的降低，分离质量不稳定波动大，操作者需要时常更换填料，对填料进行干燥脱水处理才能再次使用，生产操作非常麻烦。
鉴于此，提供一种操作简便且品质好的PB0纯化方法很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种纽莫康定B0的纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)过滤纽莫康定发酵液，取菌渣，并以醇类溶剂为萃取剂，对所述菌渣进行萃取；所得萃取液经膜过滤法过滤，得过滤液备用；
(2)向所述过滤液中加入吸附剂，使纽莫康定B0富集于所述吸附剂上；
(3)对吸附有纽莫康定B0的吸附剂进行CO2超临界萃取，将所得萃取液进行结晶处理，得到含纽莫康定B0的晶体；
(4)以HILIC模式反相键合硅胶为固定相，乙醇水溶液为流动相，对所述含纽莫康定B0的晶体进行柱层析分离，收集富含纽莫康定B0的流出液，即得。
本发明所述的纽莫康定发酵液采用本领域公知的方法发酵得到，本发明对其发酵方法不做特殊限定，本发明所述的纯化方法适用于从任何纽莫康定发酵液中分离纯化纽莫康定B0产物。
优选地，步骤(1)中所述萃取剂为70-80％的甲醇水溶液或60-70％的乙醇水溶液。
在一种具体的实施方式中，步骤(1)所述的萃取操作为：固液分离所述纽莫康定发酵液，并向所得的发酵菌渣中加入70-80％的甲醇水溶液或60-70％的乙醇水溶液进行萃取，取萃取液即得。
在另一种具体的实施方式中，步骤(1)的萃取操作还包括离心或压滤所得萃取液，并用过滤器过滤以进一步除去较大颗粒杂质的步骤。
本发明采用膜过滤法对发酵萃取液进行浓缩除杂，与传统的减压浓缩操作相比，膜过滤法避免了由于长时间浓缩造成的产品品质和收率降低问题，且膜过滤法能够有效去除部分分子量、分子结构和目标产物纽莫康定B0差异较大的杂质，为后续处理提供良好的基础。
具体而言，所述的膜过滤法选自超滤、纳滤中的一种或多种。本发明优选采用先超滤再纳滤的方式对发酵萃取液进行处理。
在一种优选的实施方式中，所述膜过滤方法为：先采用孔径为4500-5500道尔顿的超滤膜过滤所述萃取液，再采用孔径为900-980道尔顿的纳滤膜过滤。
优选地，步骤(2)中所述吸附剂选自硅藻土、活性氧化铝中的一种或两种，优选吸附剂的粒径为100-150目。进一步优选地，吸附剂的用量为所述过滤液中纽莫康定B0重量的5-6倍。
本发明在进行CO2超临界萃取之前，先将纽莫康定B0吸附于吸附剂上，此种操作有助于增加堆积时的空隙，萃取时有助于溶剂的浸润，能够有效提高萃取效率。
优选地，步骤(2)所述的操作还包括，在加入吸附剂前，除去所述纳滤液中水的步骤，所述步骤具体为：以甲醇或乙醇为置换剂，采用纳滤法置换纳滤液中的水。进一步优选地，置换至所得溶液中甲醇或乙醇的浓度达95％以上，且纽莫康定B0含量为200-250g/L。
其中，所述纳滤法采用孔径为980-900道尔顿的纳滤膜。
由于水和CO2不互溶，过多的水份在超临界萃取中会干扰、阻碍萃取的效果，因此本发明在CO2超临界萃取前，先除去溶液中的水分，以确保萃取效率。同时，体系不含有水分还有助于后期得到干燥的固体，方便物料转移。
本发明最优选地，还包括除去吸附有纽莫康定B0的吸附剂上的溶剂以得到吸附有纽莫康定B0固形物的步骤。该步骤可采用减压浓缩法进行，例如在低于50℃的条件下，减压蒸馏除去溶剂，即得吸附有纽莫康定B0固形物。
除去溶剂能够使得纽莫康定吸附到固定相上，增加了空间空隙，有利于超临界萃取时萃取溶剂的浸润，增强萃取效率。同时，溶剂在超临界萃取中会起到夹带剂的作用，如果不去除溶剂会对超临界萃取的结果进行严重干扰。
其中，步骤(3)CO2超临界流体萃取法对固形物进行萃取，其目的是对产品进行纯化，提高目标产物在溶液中的含量。发明人在对产品进行超临界萃取实验中发现，目标产物和杂质在超临界萃取体系中有特异的选择性，不同的超临界萃取条件下，目标产物的纯化程度存在较大差异。发明人最终确定了采用两次CO2超临界流体萃取法，具体为：以乙醇为夹带剂，先于35-40℃，19-20MPa条件下进行一次萃取，弃去萃出物；然后向一次萃取剩余的固形物中加入夹带剂，于45-50℃，29-30MPa条件下进行二次萃取，得含纽莫康定B0的乙醇萃取液。
优选地，一次萃取中，固形物与夹带剂的质量体积比为100g：100-150mL；二次萃取中，固形物与夹带剂的质量体积比为100g：180-220mL。
两次超临界流体的萃取时间依据具体的处理规模而定，一般而言，以萃取得到的物质中目标产物的收率达到90％以上为终点。
一次萃取能够将大部分的脂溶性色素和小分子杂质除去；二次萃取能够将目标产物和极性较强的杂质以及分子量较大的化合物进行分离。对超临界萃取后的萃取液进行结晶处理，得到的产品粗品外观颜色好，且粗品对后续的柱层析分离中填料的死吸附大幅度减小，大大提高了填料的寿命。同时，超临界流体萃取对热不稳定的产品破坏小，萃取溶剂无毒，环保。
优选地，步骤(3)中，所述结晶以丙酮、乙腈、乙酸乙酯中的一种或多种为析晶剂，即向超临界萃取后所得的萃取液中加入析晶剂，使得晶体析出。
优选地，步骤(4)中流动相为40-50％的乙醇水溶液。
步骤(4)采用的填料(固定相)为HILIC模式的反相硅胶键合填料，相对于一般的C8或C18反相硅胶键合填料而言，其对异构体PC0，相似结构PA0等较难分离的杂质具有非常好的分离效果。同时，相对于正向填料而言，减少了频繁更换填料的操作，降低了成本，简化了操作，有助于生产质量的稳定。
优选地，所述HILIC模式反相键合硅胶填料可采用普通市售产品，本发明优选采用华普新创的X3型号产品。
本发明所述的纯化方法，还包括对步骤(4)中所述的流出液进行后处理以获得纽莫康定B0纯品的步骤，所述后处理具体为：纳滤所述流出液，对所得浓缩液进行冷冻干燥或结晶处理，即得。
其中，所述纳滤采用孔径900-980道尔顿的纳滤膜；所述结晶以乙腈、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种为析晶剂。
作为本发明最佳的技术方案，纽莫康定B0的提纯方法包括如下步骤：
(1)固液分离纽莫康定发酵液，并向所得的发酵菌渣中加入70-80％的甲醇水溶液或60-70％的乙醇水溶液进行萃取，离心或压滤所得萃取液，并用滤芯孔径为0.4-0.5μm的液体过滤器过滤，得提取液；
(2)对所述提取液依次采用孔径4500-5500道尔顿的超滤膜和孔径950-1000道尔顿的纳滤膜进行浓缩，得纳滤液；
(3)以甲醇或乙醇为置换剂，采用孔径为900-980道尔顿的纳滤膜对所述纳滤液进行浓缩，直至浓缩液中甲醇或乙醇浓度达95％以上且纽莫康定B0的浓度为200-250g/L，加入硅藻土和/或活性氧化铝，搅拌均匀后，于≤50℃浓缩至干，得到吸附有纽莫康定B0的固形物；
(4)按所述固形物与夹带剂的质量体积比为100g：100-150mL的比例，向固形物中加入乙醇，于35-40℃，19-20MPa条件下进行一次萃取，弃去萃出物；然后按一次萃取剩余固形物与夹带剂的质量体积比为100g：1 80-220mL的比例，向一次萃取剩余的固形物中加入乙醇，于45-50℃，29-30MPa条件下进行二次萃取，得到含纽莫康定B0的乙醇萃取液；
(5)向所述含纽莫康定B0的乙醇萃取液中加入丙酮或乙腈进行结晶，得到含纽莫康定B0的晶体；
(6)以HILIC模式反相键合硅胶为固定相，40-50％的乙醇水溶液为流动相，对步骤(7)的晶体进行柱层析分离，收集含纽莫康定B0的流出液；
(7)采用孔径为950-1000道尔顿的纳滤膜对所述流出液进行浓缩，向所得浓缩液中加入丙酮或乙腈析晶，经分离、干燥，即得纽莫康定B0纯品。
采用上述任意一种方法对纽莫康定发酵液进行纯化，能够很好地实现PB0和PC0的分离，稳定高效地得到目标产物纽莫康定B0，其HPLC纯度可达99.4％以上，异构体PC0的HPLC纯度低至0.01-0.04％。与现有提纯方法相比，本发明的纯化方法具有工艺操作简便，纯化得到的产品品质佳的优势。
本发明提及到的百分含量如无特殊说明，均指体积百分含量；涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种纽莫康定B0的纯化方法，包括如下步骤：
(1)发酵放罐，对152L发酵液进行固液分离得到含有PB0的菌渣，用甲醇含量为70％的甲醇水溶液450L萃取菌渣，固液分离得到萃取液；再重复萃取2次，合并所有萃取液，然后通过高速管式离心机澄清，澄清液再通过滤芯孔径为0.54um的液体过滤器过滤；
(2)步骤(1)过滤的液体用超滤膜分子量为5000道尔顿的超滤设备过滤，然后用纳滤膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩，以甲醇为置换剂，继续采用980道尔顿的纳滤设备对纳滤液进行处理，使纳滤液中甲醇浓度达95％以上，PB0在纳滤液中的浓度为200g/L停止；经检测，甲醇在溶液中的含量为96.8％，计算得到PB0的纯产品量为68.6g，HPLC反相柱检测PB0纯度为72.1％(PB0和PC0的峰包含在一起)，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为66.1％，异构体PC0纯度7.3％。
(3)向纳滤浓缩液中加入343g硅藻土，混合均匀后在水浴50℃以下减压浓缩到没有明显液体流出，得到443g粉末状固形物；
(4)将粉末状固形物转入超临界萃取机的萃取槽中并密闭，检测完设备后进行两次超临界萃取操作，具体参数如下：
第一次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 532ml
萃取温度 35℃
萃取压力 19MPa
萃取时间 40min
第二次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 886ml
萃取温度 45℃
萃取压力 29MPa
萃取时间 90min
(5)萃取结束后，将收集罐内液体倒出，向其中滴加乙腈结晶，分离晶体干燥，经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为91.4％(PB0和PC0的峰包含在一起)。
(6)用制备柱分离结晶体，填料为华普新创的X3，流动相为40％浓度的乙醇，收集有效组分液；
(7)用膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩有效组分液，结晶、分离、减压干燥得含PB0的精粉43g。经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为99.4％，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为99.6％，异构体PC0纯度为0.04％。
实施例2
一种纽莫康定B0的纯化方法，包括如下步骤：
(1)发酵放罐，对223L发酵液进行固液分离得到含有PB0的菌渣，用甲醇含量为80％的甲醇水溶液500L萃取菌渣，固液分离得到萃取液；再重复萃取2次，合并所有萃取液，然后通过高速管式离心机澄清，澄清液再通过滤芯孔径为0.54um的液体过滤器过滤；
(2)步骤(1)过滤的液体用超滤膜分子量为5000道尔顿的超滤设备过滤，然后用纳滤膜分子量为900道尔顿的纳滤设备浓缩，以甲醇为置换剂，继续采用900道尔顿的纳滤设备对纳滤液进行处理，使纳滤液中甲醇浓度达95％以上，PB0在纳滤液中的浓度为250g/L停止；经检测，甲醇在溶液中的含量为98.2％，计算PB0的纯产品量为73.6g，HPLC反相柱检测PB0纯度为70.3％(PB0和PC0的峰包含在一起)，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为68.6％，异构体PC0纯度6.3％。
(3)向纳滤浓缩液中加入442g的硅藻土，混合均匀后在水浴50℃以下减压浓缩到没有明显液体流出，得到560g粉末状固形物；
(4)将粉末状固形物转入超临界萃取机的萃取槽中并密闭，检测完设备后进行两次超临界萃取操作，具体参数如下：
第一次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 672ml
萃取温度 40℃
萃取压力 20MPa
萃取时间 40min
第二次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 1120ml
萃取温度 50℃
萃取压力 30MPa
萃取时间 90min
(5)萃取结束后，将收集罐内液体倒出，向其中滴加丙酮结晶。分离晶体干燥，经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为92.1％(PB0和PC0的峰包含在一起)。
(6)用制备柱分离结晶体，填料为华普新创的X3，流动相为45％浓度的乙醇，收集有效组分液；
(7)用膜分子量为900道尔顿的纳滤设备浓缩有效组分液，结晶、分离、减压干燥得含PB0的精粉45g。经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为99.5％，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为99.7％，异构体PC0纯度为0.03％。
实施例3
一种纽莫康定B0的纯化方法，包括如下步骤：
(1)发酵放罐，对132L发酵液进行固液分离得到含有PB0的菌渣，用甲醇含量为50％的乙醇水溶液400L萃取菌渣，固液分离得到萃取液；再重复萃取2次，合并所有萃取液，然后通过高速管式离心机澄清，澄清液再通过滤芯孔径为0.54um的液体过滤器过滤；
(2)步骤(1)过滤的液体用超滤膜分子量为5000道尔顿的超滤设备过滤，然后用纳滤膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩，以甲醇为置换剂，继续采用980道尔顿的纳滤设备对纳滤液进行处理，使纳滤液中甲醇浓度达95％以上，PB0在纳滤液中的浓度为221g/L停止；经检测，乙醇在溶液中的含量为97.1％，计算PB0的纯产品量为52.1g，HPLC反相柱检测PB0纯度为74.0％(PB0和PC0的峰是包含在一起的)，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为65.4％，异构体PC0纯度8.6％。
(3)向纳滤浓缩液中加入287g的硅藻土，混合均匀后在水浴50℃以下减压浓缩到没有明显液体流出，得到380g粉末状固形物；
(4)将粉末状固形物转入超零界萃取机的萃取槽中并密闭，检测完设备后进行两次超临界萃取操作，具体参数如下：
第一次萃取条件
第二次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 760ml
萃取温度 45℃
萃取压力 29.5MPa
萃取时间 90min
(5)萃取结束后，将收集罐内液体倒出，向其中滴加乙腈结晶。分离晶体干燥，经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为92.7％(PB0和PC0的峰包含在一起)。
(6)用制备柱分离结晶体，填料为华普新创的X3，流动相为50％浓度的乙醇，收集有效组分液；
(7)用膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩有效组分液，结晶、分离、减压干燥得含PB0的精粉35g。经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为99.4％，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为99.8％，异构体PC0纯度为0.02％。
实施例4
一种纽莫康定B0的纯化方法，包括如下步骤：
(1)发酵放罐，对286L发酵液进行固液分离得到含有PB0的菌渣，用甲醇含量为50％的乙醇水溶液600L萃取菌渣，固液分离得到萃取液；再重复萃取2次，合并所有萃取液，然后通过高速管式离心机澄清，澄清液再通过滤芯孔径为0.54um的液体过滤器过滤；
(2)步骤(1)过滤的液体用超滤膜分子量为5000道尔顿的超滤设备过滤，然后用纳滤膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩，以甲醇为置换剂，继续采用980道尔顿的纳滤设备对纳滤液进行处理，使纳滤液中甲醇浓度达95％以上，PB0在纳滤液中的浓度为238g/L停止；经检测，乙醇在溶液中的含量为98.3％，计算PB0的纯产品量为83.6g，HPLC反相柱检测PB0纯度为71.4％(PB0和PC0的峰包含在一起)，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为61.2％，异构体PC0纯度9.3％。
(3)向纳滤浓缩液中加入468g的硅藻土，混合均匀后在水浴50℃以下减压浓缩到没有明显液体流出，得到590g粉末状固形物；
(4)将粉末状固形物转入超临界萃取机的萃取槽中并密闭，检测完设备后进行两次超临界萃取操作，具体参数如下：
第一次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 708ml
萃取温度 38℃
萃取压力 19.5MPa
萃取时间 40min
第二次萃取条件
参数 数值
萃取剂 CO2气体
夹带剂：无水乙醇 1180ml
萃取温度 50℃
萃取压力 30MPa
萃取时间 90min
(5)萃取结束后，将收集罐内液体倒出，向其中滴加乙腈结晶。分离晶体干燥，经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为93.1％(PB0和PC0的峰包含在一起)。
(6)用制备柱分离结晶体，填料为华普新创的X3，流动相为50％浓度的乙醇，收集有效组分液；
(7)用膜分子量为980道尔顿的纳滤设备浓缩有效组分液，结晶、分离、减压干燥得含PB0的精粉35g。经检测，HPLC反相柱检测PB0纯度为99.6％，HPLC正相硅胶柱检测PB0纯度为99.9％，异构体PC0纯度为0.01％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种纽莫康定B0的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)过滤纽莫康定发酵液，取菌渣，并以醇类溶剂为萃取剂，对所述菌渣进行萃取；所得萃取液经膜过滤法过滤，得过滤液备用；
(2)向所述过滤液中加入吸附剂，使纽莫康定B0富集于所述吸附剂上；
(3)对吸附有纽莫康定B0的吸附剂进行CO2超临界萃取，将所得萃取液进行结晶处理，得到含纽莫康定B0的晶体；
(4)以HILIC模式反相键合硅胶为固定相，乙醇水溶液为流动相，对所述含纽莫康定B0的晶体进行柱层析分离，收集富含纽莫康定B0的流出液，即得。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述醇类溶剂为70-80％的甲醇水溶液或60-70％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述膜过滤法选自超滤、纳滤中的一种或两种；优选地，所述膜过滤法具体为：先采用孔径为4500-5500道尔顿的超滤膜过滤所述萃取液，再采用孔径为900-980道尔顿的纳滤膜过滤。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述吸附剂选自硅藻土、活性氧化铝中的一种或两种；优选地，所述吸附剂的加入量为所述过滤液中纽莫康定B0重量的5-6倍。
5.根据权利要求1或4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，加入吸附剂前，还包括除去所述过滤液中水的步骤，具体为：以甲醇或乙醇为置换剂，采用纳滤法置换过滤液中的水；优选地，置换至所得溶液中甲醇或乙醇浓度达95％以上，纽莫康定B0含量为200-250g/L。
6.根据权利要求1或2或4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，所述CO2超临界萃取的操作为：以乙醇为夹带剂，先于35-40℃，19-20MPa条件下对吸附有纽莫康定B0的吸附剂进行一次萃取，弃去萃出物；然后向一次萃取后剩余的固形物中加入夹带剂，于45-50℃，29-30MPa条件下进行二次萃取，得含纽莫康定B0的乙醇萃取液。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于：一次萃取中，吸附剂与夹带剂的质量体积比为100g：100-150mL；二次萃取中，固形物与夹带剂的质量体积比为100g：180-220mL。
8.根据权利要求1或2或4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，所述结晶以乙腈、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种为析晶剂；和/或，步骤(4)中所述流动相为40-50％的乙醇水溶液。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：还包括对步骤(4)中所述的流出液进行后处理以获得固体纽莫康定B0的步骤，所述后处理具体为：纳滤所述流出液，对所得浓缩液进行冷冻干燥或结晶处理，即得；
优选地，所述纳滤采用孔径900-980道尔顿的纳滤膜；和/或，所述结晶以乙腈、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种为析晶剂。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固液分离纽莫康定发酵液，并向所得的发酵菌渣中加入70-80％的甲醇水溶液或60-70％的乙醇水溶液进行萃取，通过离心或压滤所得萃取液，并用滤芯孔径为0.4-0.5μm的液体过滤器过滤，得提取液；
(2)对所述提取液依次采用孔径4500-5500道尔顿的超滤膜和孔径900-980道尔顿的纳滤膜进行浓缩，得纳滤液；
(3)以甲醇或乙醇为置换剂，采用孔径为900-980道尔顿的纳滤膜对所述纳滤液进行浓缩，直至浓缩液中甲醇或乙醇浓度达95％以上且纽莫康定B0的浓度为200-250g/L，加入硅藻土和/或活性氧化铝，搅拌均匀后，于≤50℃浓缩至干，得到吸附有纽莫康定B0的固形物；
(4)按所述固形物与夹带剂的质量体积比为100g：100-150mL的比例，向固形物中加入乙醇，于35-40℃，19-20MPa条件下进行一次萃取，弃去萃出物；然后按一次萃取剩余固形物与夹带剂的质量体积比为100g：1 80-220mL的比例，向一次萃取剩余的固形物中加入乙醇，于45-50℃，29-30MPa条件下进行二次萃取，得到含纽莫康定B0的乙醇萃取液；
(5)向所述含纽莫康定B0的乙醇萃取液中加入丙酮或乙腈进行结晶，得到含纽莫康定B0的晶体；
(6)以HILIC反相键合硅胶为固定相，40-50％的乙醇水溶液为流动相，对步骤(7)的晶体进行柱层析分离，收集含纽莫康定B0的流出液；
(7)采用孔径为900-980道尔顿的纳滤膜对所述流出液进行浓缩，向所得浓缩液中加入丙酮或乙腈析晶，经分离、干燥，即得纽莫康定B0纯品。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109400680A (zh) * 2018-12-07 2019-03-01 成都雅途生物技术有限公司 一种卡泊芬净前体pneumocandinB0的结晶纯化方法
CN111380974A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种棘白菌素的检测方法
CN112321682A (zh) * 2020-11-24 2021-02-05 苏州纳微科技股份有限公司 一种纽莫康定b0的纯化方法
CN112430256A (zh) * 2020-11-23 2021-03-02 苏州纳微科技股份有限公司 一种阿尼芬净母核的分离纯化方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011019285A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Xellia Pharmaceuticals Aps Separation and/or purification of pneumocandin b0 from c0
CN103936837A (zh) * 2014-02-14 2014-07-23 博瑞生物医药泰兴市有限公司 一种高效提纯纽莫康定b0的方法
CN104250289A (zh) * 2013-06-28 2014-12-31 博瑞生物医药技术(苏州)有限公司 一种纽莫康定b0的分离纯化方法
CN105111286A (zh) * 2015-08-31 2015-12-02 南京工业大学 一种高效制备纽莫康定b0的方法
CN105132501A (zh) * 2015-09-07 2015-12-09 丹东鸭绿江肽宝源生物科技有限公司 一种油菜花粉肽固体提取物的制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011019285A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Xellia Pharmaceuticals Aps Separation and/or purification of pneumocandin b0 from c0
CN102481336A (zh) * 2009-08-14 2012-05-30 克塞里尔制药公司 从棘白菌素c0中分离和/或提纯棘白菌素b0
CN104250289A (zh) * 2013-06-28 2014-12-31 博瑞生物医药技术(苏州)有限公司 一种纽莫康定b0的分离纯化方法
CN103936837A (zh) * 2014-02-14 2014-07-23 博瑞生物医药泰兴市有限公司 一种高效提纯纽莫康定b0的方法
CN105111286A (zh) * 2015-08-31 2015-12-02 南京工业大学 一种高效制备纽莫康定b0的方法
CN105132501A (zh) * 2015-09-07 2015-12-09 丹东鸭绿江肽宝源生物科技有限公司 一种油菜花粉肽固体提取物的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.E. OSAWA ET AL.: "Purification of pneumocandins by preparative silica-gel high-performance liquid chromatography", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
CHRISTOPHER J.WELCH ET AL.: "Preparation and evaluation of novel stationary phases for improved chromatographic purification of pneumocandin B0", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109400680A (zh) * 2018-12-07 2019-03-01 成都雅途生物技术有限公司 一种卡泊芬净前体pneumocandinB0的结晶纯化方法
CN111380974A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种棘白菌素的检测方法
CN112430256A (zh) * 2020-11-23 2021-03-02 苏州纳微科技股份有限公司 一种阿尼芬净母核的分离纯化方法
CN112321682A (zh) * 2020-11-24 2021-02-05 苏州纳微科技股份有限公司 一种纽莫康定b0的纯化方法

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