CN101463064B - 从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法。方法的步骤如下：在无机碱的水溶液中加入积雪草总苷元原料，加热充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入无机酸调节pH值至6～9，冷却、结晶后过滤得结晶物I与滤液，结晶物I真空干燥得积雪草酸产品；滤液中加入无机酸调节pH值至2～4，结晶后过滤得结晶物II，结晶物II自然晾干后用有机溶剂溶解，过C18硅胶柱，并用乙腈-水混合溶剂洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，分别经减压浓缩、真空干燥后得多米诺积雪草酸与羟基积雪草酸产品。该方法产品收率和纯度高，可用作原料药，同时工艺过程较简单、所需投资少、易于实现工业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法。
背景技术
积雪草【Centella asiatica(L.)Urban】为伞形科积雪草属植物，在许多国家和地区传统医药领域中的应用有悠久的历史，我国中医中药对积雪草的内服和外用已有两千年的历史。积雪草味苦、辛，性寒，归肝、脾、肾、胃经。古药典记载主要用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌打损伤等病症。现代药理学研究和应用表明，积雪草可用于治疗抑郁症、皮肤创伤、胃溃疡、传染性肝炎、皮肤病和流行性脑脊髓膜炎等。
积雪草的药理作用同它的化学成分是密不可分的。积雪草的化学成分十分复杂，其主要成分有三萜类、多炔烯烃类、黄酮类和挥发油类等。此外，积雪草中还含有氯原酸、内消旋肌醇、黄酮醇、脂肪酸、天胡荽碱、甾醇、蜡、叶绿素、烃类、木脂素类、糖、鞣质和多元酚类等成分。积雪草的化学成分中，三萜类皂苷及其皂苷元是研究的最早、生物学活性研究较深入的一大类组分，其中积雪草酸、羟基积雪草酸、多米诺积雪草酸等是其重要的活性成分。
积雪草总苷是从积雪草中提取得到的皂苷类物质的总称，主要由三萜苷类物质组成，其主要成分包括积雪草苷(Asiaticoside，CAS No.：16830-15-2，分子式为C48H78O19，分子量为959.12)、羟基积雪草苷(Madecassoside，CAS No.：34540-22-2，分子式为C48H78O20，分子量为975.12)和多米诺积雪草苷(Terminoloside，CAS No.：125265-68-1，分子式为C48H78O20，分子量为975.12)。积雪草总苷元是指上述皂苷类成分的糖苷键断裂后生成的糖苷配基(苷元)，分别是积雪草酸(Asiatic acid，CAS No.：464-92-6，分子式为C30H48O5，分子量为488.70)、羟基积雪草酸(Madecassic acid，CAS No.：18499-41-7，分子式为C30H48O6，分子量为504.70)、多米诺积雪草酸(Terminolic acid，CASNo.：564-13-6，分子式为C30H48O6，分子量为504.70)。羟基积雪草苷也叫积雪草苷A，多米诺苷也叫做积雪草苷B，两者是一对同分异构体，同样羟基积雪草酸和多米诺酸也是一对同分异构体。它们差异只在于其中一个甲基归属不同，且两个不同的归属处于邻位关系，性质差异较小。三种苷元的结构式分别如下：
积雪草酸 羟基积雪草酸 多米诺积雪草酸
专利200810162211.X公开了一种溶剂结晶法制备高纯度积雪草苷的方法，专利200710164473.X公开了一种从积雪草总苷出发同时制备积雪草苷A与积雪草苷B的方法，实现了积雪草苷、羟基积雪草苷、多米诺积雪草苷的分离制备；专利200810163172.5与专利200810163173.X分别公开了碱水解与酸水解积雪草苷制备积雪草酸的方法，专利200810164182.0与专利200810164213.2分别公开了碱水解与酸水解羟基积雪草苷制备羟基积雪草酸的方法。以上6个专利实现了从积雪草总苷出发先分离后水解分别制备积雪草酸、羟基积雪草酸的完整工艺过程。
专利2009100952899与专利200910095290.1中分别公开了碱水解与酸水解积雪草总苷制备积雪草总苷元的方法，本专利从积雪草总苷元出发结合结晶和柱色谱方法同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸、多米诺积雪草酸。本专利与专利200910095289.9与专利200910095290.1结合可以提供一个从积雪草总苷出发先水解后分离制备积雪草酸、羟基积雪草酸、多米诺积雪草酸的全新工艺过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法。
方法的步骤如下：
1)在无机碱的水溶液中加入积雪草总苷元原料，加热至30～60℃充分溶解后过滤得滤液I；
2)滤液I中加入无机酸调节pH值至6～9，冷却至0～25℃结晶后过滤，分别得结晶物I与滤液II，结晶物I经真空干燥后得积雪草酸产品；
3)滤液II中加入无机酸，调节pH值至2～4，结晶后过滤得结晶物II；
4)结晶物II自然晾干后用有机溶剂溶解；
5)C18硅胶采用湿法装柱，柱子的高径比为4～20，用乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；
6)按0.01～0.1g结晶物II/1g C18硅胶的比例上样，乙腈-水混合溶剂以0.5～3床层体积/h的流速洗脱；
7)洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1为多米诺积雪草酸溶液，馏分2为羟基积雪草酸溶液；
8)馏分1、馏分2分别经减压浓缩、真空干燥后得多米诺积雪草酸与羟基积雪草酸产品；
步骤1)中的无机碱为NaOH或KOH，无机碱的浓度为0.01～0.1mol/L，每升无机碱的水溶液中积雪草总苷元的加入量为5～60g；步骤2)与步骤3)中的无机酸为盐酸或硫酸；步骤4)中的有机溶剂为甲醇或乙醇，有机溶剂加入量为0.1～3g结晶物II/10mL有机溶剂；步骤5)与步骤6)中乙腈-水混合溶剂中乙腈的体积百分比为50～70％。
本发明结合结晶和柱色谱技术，提供了一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸、多米诺积雪草酸的方法。该方法产品收率和纯度高(积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸等三种产品质量含量≥95％)，可用作原料药，同时工艺过程较简单、所需投资少、易于实现工业化。
附图说明
附图是从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的工艺流程简图。
具体实施方式
本发明所使用的积雪草总苷元原料采用专利“一种积雪草总苷碱水解制备积雪草总苷元的方法”(吕秀阳，郑兴芳，李音。一种积雪草总苷碱水解制备积雪草总苷元的方法，申请号：200910095289.9申请日：2009年1月8日)中的实施例20(在1L带搅拌和水冷凝管的三口烧瓶中加入0.5mol/LKOH水溶液500mL，放入75℃的恒温水浴中，开搅拌和冷凝水，分3批加入积雪草总苷原料20g(总加料时间为45min)，水解3h；水解液加入硫酸，调节pH值至2～4，沉淀后过滤，得沉淀物，沉淀物晾干后称重得8.3g；收集晾干后的沉淀物加入124.5mL甲醇溶解、活性炭脱色、过滤，滤液加入1992mL水结晶，经过滤后得结晶物，结晶物再经真空干燥后得5.9g积雪草总苷元产品，产品经HPLC分析积雪草总苷元的质量含量90.6％。)的方法制备，重复以上过程16次最终得93g积雪草总苷元，经HPLC分析积雪草总苷元的质量含量为90.5％，其中积雪草酸的质量含量为29.2％，羟基积雪草酸的质量含量为30.6％，多米诺积雪草酸的质量含量为21.5％。
积雪草酸、羟基积雪草酸、多米诺基积雪草酸含量采用高效液相色谱法(HPLC)测定，采用外标法定量。采用Agilent1100液相色谱分析系统，分析条件如下：Eclipse XDB-C18反相柱(Φ4.6mm×250mm，5μm，Agilent)；采用梯度洗脱，流速0.6mL/min；柱温为35℃；检测波长210nm。
表1 HPLC法测定积雪草总苷和积雪草总苷元的流动相梯度
以下用实施例对本发明的工艺方法作进一步的说明。本发明的保护范围不受实施例的限制，本发明的保护范围由权利要求书决定。
实施例1
在500mL烧杯中加入0.1mol/L NaOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料6.0g(60g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至60℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8.5，冷却至25℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.5g，经HPLC检测纯度为85.4％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重4.2g，用14mL甲醇(3g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为16cm的C18层析柱(高径比8，装填C18硅胶量28g，床层体积50mL)采用湿法装柱，用体积浓度为50％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取9mL滤液上样(上样量为0.1g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为50％的乙腈-水混合溶剂以0.4mL/min(0.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.81g，经HPLC检测纯度为96.1％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.2g，经HPLC检测纯度为95.2％。
实施例2
在500mL烧杯中加入0.1mol/L KOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料5.5g(55g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至55℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8.5，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.5g，经HPLC检测纯度为83.8％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.7g，用15mL乙醇(2.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为16cm的C18层析柱(高径比8，装填C18硅胶量28g，床层体积50mL)采用湿法装柱，用体积浓度为55％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取11mL滤液上样(上样量为0.1g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为55％的乙腈-水混合溶剂以0.8mL/min(1床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.80g，经HPLC检测纯度为97.2％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.2g，经HPLC检测纯度为93.2％。
实施例3
在500mL烧杯中加入0.09mol/L NaOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料5.0g(50g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至50℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至9，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为81.2％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.6g，用15mL甲醇(2.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为12cm的C18层析柱(高径比6，装填C18硅胶量21g，床层体积38mL)采用湿法装柱，用体积浓度为55％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取8mL滤液上样(上样量为0.1g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为55％的乙腈-水混合溶剂以0.9mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.63g，经HPLC检测纯度为94.2％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.92g，经HPLC检测纯度为96.7％。
实施例4
在500mL烧杯中加入0.09mol/L KOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料4.5g(45g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至50℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至9，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.99g，经HPLC检测纯度为84.4％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.3g，用13mL乙醇(2.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为12cm的C18层析柱(高径比6，装填C18硅胶量21g，床层体积38mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取8mL滤液上样(上样量为0.09g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以0.9mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.58g，经HPLC检测纯度为93.1％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.86g，经HPLC检测纯度为94.6％。
实施例5
在500mL烧杯中加入0.08mol/LNaOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料4.0g(40g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至45℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至9，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.85g，经HPLC检测纯度为83.4％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.0g，用12mL甲醇(2.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为8cm的C18层析柱(高径比4，装填C18硅胶量14g，床层体积25mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取5mL滤液上样(上样量为0.09g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以0.6mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.34g，经HPLC检测纯度为97.5％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.46g，经HPLC检测纯度为98.3％。
实施例6
在500mL烧杯中加入0.07mol/L KOH水溶液100mL，积雪草总苷元原料3.5g(35g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至40℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8.5，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.88g，经HPLC检测纯度为90.5％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.4g，用12mL乙醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为8cm的C18层析柱(高径比4，装填C18硅胶量14g，床层体积25mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取6mL滤液上样(上样量为0.09g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以0.6mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.43g，经HPLC检测纯度为91.3％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.64g，经HPLC检测纯度为90.2％。
实施例7
在500mL烧杯中加入0.06mol/L NaOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料6.0g(30g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至40℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8.5，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.4g，经HPLC检测纯度为91.9％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重4.3g，用21mL甲醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为12cm的C18层析柱(高径比6，装填C18硅胶量21g，床层体积38mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取8mL滤液上样(上样量为0.08g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以1.3mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.52g，经HPLC检测纯度为94.3％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.76g，经HPLC检测纯度为95.4％。
实施例8
在500mL烧杯中加入0.05mol/L KOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料5.0g(25g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至40℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8.5，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.2g，经HPLC检测纯度为92.1％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.6g，用18mL乙醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为16cm的C18层析柱(高径比8，装填C18硅胶量28g，床层体积50mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取10mL滤液上样(上样量为0.07g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以1.7mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.60g，经HPLC检测纯度为95.2％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.87g，经HPLC检测纯度为96.3％。
实施例9
在500mL烧杯中加入0.04mol/L NaOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料4.0g(20g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为95.2％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.8g，用14mL甲醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为16cm的C18层析柱(高径比8，装填C18硅胶量28g，床层体积50mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取8mL滤液上样(上样量为0.06g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以1.7mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.53g，经HPLC检测纯度为95.9％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.77g，经HPLC检测纯度为96.7％。
实施例10
在500mL烧杯中加入0.03mol/L KOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料3.0g(15g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8，冷却至5℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.80g，经HPLC检测纯度为94.7％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.0g，用14mL乙醇(1.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为16cm的C18层析柱(高径比8，装填C18硅胶量28g，床层体积50mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取9mL滤液上样(上样量为0.05g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以1.7mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.43g，经HPLC检测纯度为95.3％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.67g，经HPLC检测纯度为94.2％。
实施例11
在1L烧杯中加入0.02mol/L NaOH水溶液500mL，积雪草总苷元原料5.0g(10g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8，冷却至10℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.0g，经HPLC检测纯度为96.2％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.8g，用25mL甲醇(1.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为20cm的C18层析柱(高径比10，装填C18硅胶量35g，床层体积63mL)采用湿法装柱，用体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取9mL滤液上样(上样量为0.04g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为60％的乙腈-水混合溶剂以2.1mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.38g，经HPLC检测纯度为97.4％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.57g，经HPLC检测纯度为96.3％。
实施例12
在1L烧杯中加入0.01mol/L KOH水溶液1L，积雪草总苷元原料5.0g(5g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至7.5，冷却至0℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为70.5％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重3.7g，用37mL乙醇(1g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为20cm的C18层析柱(高径比10，装填C18硅胶量35g，床层体积63mL)采用湿法装柱，用体积浓度为65％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取10mL滤液上样(上样量为0.03g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为65％的乙腈-水混合溶剂以2.1mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.18g，经HPLC检测纯度为94.3％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.27g，经HPLC检测纯度为92.1％。
实施例13
在1L烧杯中加入0.01mol/L NaOH水溶液1L，积雪草总苷元原料1.0g(1g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至7，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.08g，经HPLC检测纯度为67.4％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重0.9g，用17mL甲醇(0.5g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为24cm的C18层析柱(高径比12，装填C18硅胶量42g，床层体积75mL)采用湿法装柱，用体积浓度为65％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取17mL滤液上样(上样量为0.02g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为65％的乙腈-水混合溶剂以3.1mL/min(2.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.17g，经HPLC检测纯度为92.2％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.23g，经HPLC检测纯度为96.2％。
实施例14
在1L烧杯中加入0.01mol/L KOH水溶液1L，积雪草总苷元原料0.5g(0.5g积雪草总苷元/1 L无机碱的水溶液)，加热至30℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至6，冷却至25℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.13g，经HPLC检测纯度为60.1％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重0.31g，用35mL乙醇(0.1g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为20cm的C18层析柱(高径比10，装填C18硅胶量35g，床层体积63mL)采用湿法装柱，用体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取35mL滤液上样(上样量为0.01g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂以3.1mL/min(3床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.08g，经HPLC检测纯度为95.5％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品0.11g，经HPLC检测纯度为94.3％。
实施例15
在500mL烧杯中加入0.04mol/L NaOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料4.0g(20g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为94.8％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.7g，用14mL甲醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为28cm的C18层析柱(高径比14，装填C18硅胶量49g，床层体积88mL)采用湿法装柱，用体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取12mL滤液上样(上样量为0.05g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂以2.2mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.74g，经HPLC检测纯度为95.7％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为95.4％。
实施例16
在500mL烧杯中加入0.04mol/L KOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料4.0g(20g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8，冷却至15℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品1.1g，经HPLC检测纯度为93.2％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.7g，用14mL乙醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为32cm的C18层析柱(高径比16，装填C18硅胶量56g，床层体积100mL)采用湿法装柱，用体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取14mL滤液上样(上样量为0.05g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂以2.5mL/min(1.5床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.88g，经HPLC检测纯度为97.2％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.4g，经HPLC检测纯度为96.7％。
实施例17
在500mL烧杯中加入0.04mol/L NaOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料4.0g(20g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入盐酸调节pH值至8，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.98g，经HPLC检测纯度为96.1％，滤液中加入盐酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.8g，用14mL甲醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为36cm的C18层析柱(高径比18，装填C18硅胶量63g，床层体积113mL)采用湿法装柱，用体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取13mL滤液上样(上样量为0.04g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂以3.8mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.78g，经HPLC检测纯度为93.4％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.2g，经HPLC检测纯度为93.2％。
实施例18
在500mL烧杯中加入0.04mol/L KOH水溶液200mL，积雪草总苷元原料4.0g(20g积雪草总苷元/1L无机碱的水溶液)，加热至35℃充分溶解后过滤除去不溶性固形物，加入硫酸调节pH值至8，冷却至20℃结晶后进行过滤；过滤得结晶物I经真空干燥得积雪草酸产品0.91g，经HPLC检测纯度为96.8％，滤液中加入硫酸，调节pH值至2～4结晶后过滤；过滤得结晶物II自然晾干后重2.9g，用14mL乙醇(2g结晶物II/10mL有机溶剂)溶解。
内径为2cm、高度为40cm的C18层析柱(高径比20，装填C18硅胶量70g，床层体积126mL)采用湿法装柱，用体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；取14mL滤液上样(上样量为0.04g结晶物II/1g C18硅胶)，体积浓度为70％的乙腈-水混合溶剂以4.2mL/min(2床层体积/h)的流速洗脱；洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1经减压浓缩、真空干燥得多米诺积雪草酸产品0.84g，经HPLC检测纯度为92.6％；馏分2经减压浓缩、真空干燥得羟基积雪草酸产品1.3g，经HPLC检测纯度为91.9％。
Claims (7)
1.一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于，方法的步骤如下：
1)在无机碱的水溶液中加入积雪草总苷元原料，加热至30～60℃充分溶解后过滤得滤液I；
2)滤液I中加入无机酸调节pH值至6～9，冷却至0～25℃结晶后过滤，分别得结晶物I与滤液II，结晶物I经真空干燥后得积雪草酸产品；
3)滤液II中加入无机酸，调节pH值至2～4，结晶后过滤得结晶物II；
4)结晶物II自然晾干后用有机溶剂溶解；
5)C18硅胶采用湿法装柱，柱子的高径比为4～20，用乙腈-水混合溶剂冲洗柱子；
6)按0.01～0.1g结晶物II/1g C18硅胶的比例上样，乙腈-水混合溶剂以0.5～3床层体积/h的流速洗脱；
7)洗脱液经HPLC分析后合并成两个馏分，馏分1为多米诺积雪草酸溶液，馏分2为羟基积雪草酸溶液；
8)馏分1、馏分2分别经减压浓缩、真空干燥后得多米诺积雪草酸与羟基积雪草酸产品；
步骤5)与步骤6)中乙腈-水混合溶剂中乙腈的体积百分比为50～70％。
2.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤1)中的无机碱为NaOH或KOH。
3.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤1)中的无机碱的浓度为0.01～0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤1)中的每升无机碱的水溶液中积雪草总苷元的加入量为5～60g。
5.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤2)与步骤3)中的无机酸为盐酸或硫酸。
6.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤4)中的有机溶剂为甲醇或乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种从积雪草总苷元出发同时制备积雪草酸、羟基积雪草酸和多米诺积雪草酸的方法，其特征在于步骤4)中的有机溶剂加入量为0.1～3g结晶物II/10mL有机溶剂。
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| 于泉林.积雪草化学成分研究.《中国中药杂志》.2007,第32卷(第12期),1182-1184. * |
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