CN1920550A - 氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量的高效液相色谱法测定方法 - Google Patents

氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量的高效液相色谱法测定方法 Download PDF

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CN1920550A CN 200610041485 CN200610041485A CN1920550A CN 1920550 A CN1920550 A CN 1920550A CN 200610041485 CN200610041485 CN 200610041485 CN 200610041485 A CN200610041485 A CN 200610041485A CN 1920550 A CN1920550 A CN 1920550A
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郭辉
石庆平
崔爱军
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郭辉
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本发明公开了一种氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量的高效液相色谱法测定方法。该方法的色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸二氢铵溶液－甲醇或磷酸二氢铵溶液－乙腈体系；采用紫外检测器，杂质测定检测波长为210－214nm；含量测定检测波长为261nm－265nm；该方法灵敏度高、专属性强，能很好地检测氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量。为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。

Description

氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量的高效液相色谱法测定方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说是采用高效液相色谱法对氯法拉滨原料或其制剂中杂质和含量的检测。
背景技术
本发明中所述氯法拉滨的药品名称为：
通用名：氯法拉滨
其他名：克罗拉滨
英文名：Clofarabine
汉语拼音：Lüfalabin
中文化学名：2-氯-9-(2-去氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃)-9H-嘌呤-6-胺
英文化学名：2-chloro-9-(2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-9H-purin-6-amine
化学结构式：
Figure A20061004148500041
分子式：C10H11ClFN5O3
分子量：303.68
氯法拉滨(clofarabine)属于核苷酸类似物，由美国Genzyme公司研发，2004年12月28日批准用于儿童顽固性或复发性急性淋巴细胞白血病的治疗，其商品名为CLOLAR，本品已被FDA授予罕见药物地位，用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)。本品在2005年1月份已在美国首次上市。氯法拉滨作为目前唯一可以特异性用于儿童白血病的化疗药，治疗白血病总体反应率高，并且很好耐受，没有不可预知的不良反应。既可以静脉给药，也可以口服，本品为十多年来首个获准专门用于儿童的白血病治疗新药。
本品2005年在美国上市，为已在国外上市销售但在国内尚未上市销售的产品，且至2006年8月未检索到有在SFDA申请的厂家及机构。
杂质检查和含量测定是药品质量标准的重要组成部分，对一些特殊杂质的控制，既能保证用药的安全有效，又能考核药物的生产工艺和贮存条件。
高效液相色谱法HPLC是近20年来发展起来的检测新技术，具有分离效果好，灵敏度高，分析速度快等优点，且能与多种类型的检测器联合应用，能满足大多数化合物种类的检测需要。
经过文献查询，目前还没有用高效液相色谱法检测氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量测定的报道。
发明内容
本发明的目的是：为了加强氯法拉滨原料或其制剂的质量控制，提供一种灵敏度高、分析速度快、准确度高的氯法拉滨原料或其制剂中杂质和含量的高效液相色谱法检测方法。
具体的技术解决方案如下。
1、氯法拉滨原料或其制剂中杂质的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其检测器为紫外检测器；色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸盐溶液—甲醇和磷酸盐溶液—乙腈体系；检测波长为210-214nm；理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5。
具体操作步骤如下：
A、取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.1～100mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含0.1～100ug的对照溶液；所述流动相为磷酸盐溶液—甲醇或乙腈的混合溶液体系；
B、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸盐溶液(以磷酸调pH至3.0)和甲醇或乙腈的混合溶液体系为流动相，0.01mol/L磷酸盐溶液和甲醇或乙腈的混合比为5-95∶95-5，检测波长为210nm-214nm，理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
C、取对照溶液5-50ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；
D、再取上述供试品溶液和对照溶液各5-50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2-5倍；按自身对照法或峰面积归一化法计算杂质。
2、氯法拉滨原料或其制剂含量的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其检测器为紫外检测器；色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸盐溶液-甲醇和磷酸盐溶液-乙腈体系；检测波长为261nm-265nm；理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5。
具体操作步骤如下：
A、取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.05～50mg氯法拉滨的供试品溶液和对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸盐溶液和甲醇或乙腈按5-95∶95-5混合的溶液；
B、按照高效液相色谱法进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸盐溶液(以磷酸调pH至3.0)和甲醇为流动相，0.01mol/L磷酸盐溶液和甲醇的混合比为5-95∶95-5，检测波长为261nm-265nm，理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；
C、取上述供试品溶液和对照溶液各5-50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
附图说明
图1氯法拉滨杂质检测对照溶液HPLC图谱，
图2氯法拉滨杂质检测样品溶液HPLC图谱，
图3氯法拉滨含量测定样品溶液HPLC图谱。
本发明方法的建立过程是这样的：
1、仪器与试剂
仪器：岛津SPD-10Avp检测器，岛津LC-10ATvp泵及浙江大学N2000色谱工作站。
      FA1104型电子天平
      PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器有限公司)
      色谱柱：Discovery C18柱，规格250×4.6mm，粒度5um
试剂：甲醇为MR、乙腈为MR、磷酸二氢铵为AR试剂；蒸馏水自制。
2、杂质检测方法的建立
(1)波长的选择
取氯法拉滨样品及各中间体适量，加流动相使溶解，并稀释成约10μg/ml，在200～400nm范围内对本品进行扫描，由扫描结果可见，本品在212nm及263nm波长处有最大吸收，结合中间体的扫描图谱，我们选择使用212nm波长作为本品杂质检测的波长。
(2)流动相的选择
以甲醇-水为基本配比，调节甲醇与水的比例使得主峰保留时间适中，再通过加入适当的缓冲盐调节峰形，使得到理想状态。
                             流动相的选择
  溶液配比   系统评价
  甲醇-水(50∶50)甲醇-水(40∶60)甲醇-水(30∶70)0.01mol/L磷酸二氢铵(pH5.0)-甲醇(70∶30)0.01mol/L磷酸二氢铵(pH4.0)-甲醇(70∶30)0.01mol/L磷酸二氢铵(pH3.0)-甲醇(70∶30)   保留时间较短，峰型较差保留时间较短，峰型较差保留时间适宜，峰型较差保留时间适宜，峰型较差保留时间适宜，峰型较差保留时间适宜，峰型好
由上表结果可见，以各pH值的磷酸二氢铵溶液和甲醇(70∶30)作为流动相，考察谱峰的分离情况。在流动相组分为0.01mol/L磷酸二氢铵(pH3.0)-甲醇(70∶30)时，主峰保留时间适宜，峰形好。故选择0.01mol/L磷酸二氢铵(pH3.0)-甲醇(70∶30)作为本品杂质检测的流动相。
(3)分离度试验
取氯法拉滨合成过程中的中间体以及异构体α、β(即氯法拉滨样品)，加流动相溶解并稀释，制成一定浓度的溶液，作为样品溶液。分别取上述溶液适量混合，摇匀后取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，考察其分离度。结果中间体及异构体α、β(氯法拉滨)的分离度符合要求。
(4)系统适应性及专属性试验
①破坏性试验
分别称取氯法拉滨样品约10mg或其制剂适量(约含氯法拉滨10mg)，分别置100ml量瓶中，按下述各条件配制供试品。
未破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，常温避光放置4小时备用；
酸破坏：加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，混匀后常温避光放置4小时，4小时后加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用；
碱破坏：加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，混匀后常温避光放置4小时，4小时后加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用；
光照破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，置强光下(4500Lx)照射4小时，备用；
高温破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，置沸水浴中加热4小时，4小时后放冷，加流动相至刻度，摇匀，备用；
氧化破坏：加30％双氧水2ml，混匀后常温遮光放置4小时，4小时后加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
分别取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，与未破坏样品比较，结果在破坏条件下氯法拉滨峰和各杂质峰能够很好的分离，说明在选定色谱条件下可以检测出可能存在的杂质。
②检测限、定量限的测定
取对照品适量，用流动相逐级稀释后进行测定，按10∶1信噪比作为定量限，结果为10ng；按3∶1信噪比为检测限，结果为3ng。
3、含量测定方法的建立
(1)含量测定标准曲线的绘制
精密称取对照品约25mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1、3、5、7、10ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别取20μl进样，记录色谱图。以进样量(W)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，计算回归方程。
结果表明：进样量在0.197～1.974μg范围内，氯法拉滨色谱峰面积与其进样量成良好线性关系。
                氯法拉滨含量测定标准曲线
  ml   进样量(μg)   峰面积(A)   线性关系
  1357   0.1970.5920.9871.382   330398.344975416.8751726262.7502361279.500   Y＝1.7389×106X-23495r＝0.9996
    10     1.974     3413382.500
(2)进样精密度
取标准曲线项下中间浓度(5ml)溶液，连续进样5次，记录色谱图，考察进样精密度。
                                   氯法拉滨进样精密度试验结果
编号     1     2     3     4     5
峰面积     1748157.875     1748399.750  1755651.250  1744357.125  1742400.375
均值(SD，RSD)     A均＝1747793.275，SD＝4541.784，RSD＝0.26％
由结果可见，相对标准偏差小于2.0％，表明进样精密度良好。
(3)理论板数的测定
取标准曲线项下中间浓度(5ml)溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察其理论板数，经测定，理论板数为n＝7775.606。
(4)重复性试验
精密称取氯法拉滨样品约25mg或其制剂适量(约含氯法拉滨25mg)各六份，照含量测定项下的方法测定上述样品的含量，分别计算RSD值，考察重复性。
结果表明，原料和制剂重复性试验RSD均小于2.0％，重复性符合规定。
(5)中间精密度试验
按照含量测定项下的方法，在不同日期内，不同的试验人员，使用相同一批的氯法拉滨样品或其制剂，在不同的仪器上测定其含量，分别计算RSD值，考察其中间精密度情况。
结果表明，原料和制剂中间精密度试验RSD均小于2.0％，中间精密度良好。
(6)制剂回收率试验
称取氯法拉滨原料，按处方量的80％、100％、120％投料，制备含主药为80％、100％、120％的制剂，分别取各处方项下制剂，照含量测定项下的方法，测定主药氯法拉滨的含量。
结果表明，回收率为99.5％，相对标准偏差小于2.0％，制剂准确性试验良好。
通过上述方法的建立过程，本品的有关物质检查采用HPLC法，通过中间体测定及破坏性试验，结果表明本品的中间体及破坏后的降解产物峰可被检出，并与主峰有较好的分离度。根据本品检查结果，并结合生产实际情况，确定本品有关物质总量应小于1.0％，单个杂质量应小于0.5％。另外通过高效液相色谱法对本品含量测定结果表明，回收率为99.5％，相对标准偏差小于2.0％，证明本法可作为本品含量测定方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
按以下检测方法对氯法拉滨原料或其制剂各三批进行了杂质的检测：
实施例1
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.1mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含0.1ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0检测波长210nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液50ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积总和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表1，图1、图2。
                          表1氯法拉滨原料或其制剂杂质检测结果
  原料(％)   制剂(％)
批号 实施例   单个最大杂质 α体 总杂质 批号 实施例   单个最大杂质 总杂质
20050215   实施例1实施例4   0.080.06   0.050.04   0.130.11 20050423   实施例1实施例4   0.080.05   0.160.17
20050310   实施例1实施例4   0.080.09   0.040.06   0.170.16 20050426   实施例1实施例4   0.080.08   0.160.18
20050325   实施例1实施例4   0.080.07   0.060.04   0.180.16 20050429   实施例1实施例4   0.07008   0.160.17
实施例2
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含10mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含10ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长212nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表2，图1、图2。
                          表2氯法拉滨原料或其制剂杂质检测结果
  原料(％)   制剂(％)
批号 实施例   单个最大杂质 α体 总杂质 批号 实施例   单个最大杂质 总杂质
20050215   实施例2实施例5   0.060.05   0.040.06   0.150.13 20050423   实施例2实施例5   0.070.08   0.190.18
20050310   实施例2实施例5   0.070.08   0.050.07   0.150.17 20050426   实施例2实施例5   0.060.09   0.170.20
20050325   实施例2实施例5   0.060.05   0.080.09   0.190.18 20050429   实施例2实施例5   0.080.06   0.190.21
实施例3
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含100mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含100ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按90∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)-甲醇按70∶30为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长214nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液5ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表3，图1、图2。
                             表3氯法拉滨原料或其制剂杂质检测结果
  原料(％)   制剂(％)
批号 实施例   单个最大杂质 α体 总杂质 批号 实施例   单个最大杂质 总杂质
20050215   实施例3实施例6   0.090.07   0.060.05   0.150.17 20050423   实施例3实施例6   0.060.07   0.190.18
20050310   实施例3实施例6   0.080.07   0.050.07   0.180.15 20050426   实施例3实施例6   0.090.08   0.190.17
20050325   实施例3实施例6   0.090.08   0.050.06   0.190.14 20050429   实施例3实施例6   0.090.08   0.180.19
实施例4
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.1mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含0.1ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)和乙腈按85∶15的混合溶液。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长210nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液50ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积总和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表1，图1、图2。
实施例5
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含10mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含10ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按60∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按60∶10的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长212nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表2，图1、图2。
实施例6
取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含100mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含100ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按90∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按90∶40的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0检测波长214nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取对照溶液5ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；再取上述供试品溶液和对照溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质及氯法拉滨旋光异构体(α体)峰面积均小于对照溶液主峰面积的二分之一。结果见表3，图1、图2。
按以下检测方法对氯法拉滨原料或其制剂各三批进行含量测定：
实施例7：
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含0.05mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长261nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表4，图3。
               表4氯法拉滨原料或其制剂含量检测结果
  原料(％)   制剂(％)
  实施例   20050215   20050310   20050325   实施例   20050423   20050426   20050429
  实施例7   99.87   99.95   99.78   实施例7   99.34   100.2   101.2
  实施例10   99.91   99.93   99.64   实施例10   99.45   100.6   100.9
实施例8
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含10mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶10的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长263nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表5。
                            表5氯法拉滨原料或其制剂含量检测结果
  原料(％)   制剂(％)
  实施例   20050215   20050310   20050325   实施例   20050423   20050426   20050429
  实施例8   100.2   99.65   99.86   实施例8   99.45   100.5   101.1
  实施例11   99.98   99.76   99.83   实施例11   99.67   100.3   100.4
实施例9
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含50mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按90∶430的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长265nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表6，图3。
表6氯法拉滨原料或其制剂含量检测结果
  原料(％)   制剂(％)
  实施例   20050215   20050310   20050325   实施例   20050423   20050426   20050429
  实施例9   99.96   99.87   99.95   实施例9   99.46   100.7   101.9
  实施例12   99.92   99.98   99.88   实施例12   99.78   100.4   101.5
实施例10：
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含0.05mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长261nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表4，图3。
实施例11
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含10mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按60∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按60∶10的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长263nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表5，图3。
实施例12
取氯法拉滨原料或其制剂以及原料经精制而得的对照品，加流动相制成每1ml中含50mg氯法拉滨的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按90∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版II部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按90∶40的混合溶液为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0，检测波长265nm，理论板数以氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表6，图3。
上述方法方便快捷，能够准确测定氯法拉滨原料或其制剂的杂质和含量。但本发明专利的保护内容并不仅仅局限于上述具体实施实例中所阐述的方法，任何在本发明所述方法的基础上所做的改进及提高均属于本发明专利的保护内容。

Claims (6)

1、氯法拉滨原料或其制剂中杂质的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其特征在于其检测器为紫外检测器；色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈；检测波长为210-214nm；理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
具体操作步骤如下：
A、取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.1～100mg氯法拉滨的供试品溶液和每1ml中含0.1～100ug的对照溶液；所述流动相为磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈的混合溶液；
B、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸盐溶液和甲醇或乙腈的混合溶液体系为流动相，0.01mol/L磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈的混合比为60-90∶40-10，检测波长为210nm-214nm，理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000，氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
C、取对照溶液5-50ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～25％；
D、再取上述供试品溶液和对照溶液各5-50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2-5倍；按自身对照法或峰面积归一化法计算杂质。
2、氯法拉滨原料或其制剂含量的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其特征在于：其检测器为紫外检测器；色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈；检测波长为261nm-265nm；理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；氯法拉滨峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
具体操作步骤如下：
A、取氯法拉滨原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.05～50mg氯法拉滨的供试品溶液和对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈按5-95∶95-5混合的溶液；
B、按照高效液相色谱法进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸盐溶液和甲醇为流动相，0.01mol/L磷酸盐溶液-甲醇或磷酸盐溶液-乙腈的混合比为60-90∶40-10，检测波长为261nm-265nm，理论板数按氯法拉滨峰计算应不低于3000；
C、取上述供试品溶液和对照溶液各5-50ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3、根据权利要求1所述的氯法拉滨原料或其制剂中杂质的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
4、根据权利要求1所述的氯法拉滨原料或其制剂中杂质的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
5、根据权利要求2所述的氯法拉滨原料或其制剂含量的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
6、根据权利要求2所述的氯法拉滨原料或其制剂含量的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
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CN101206201B (zh) * 2006-12-19 2012-01-25 北京德众万全药物技术开发有限公司 一种氯法拉滨及其对映异构体的分离测定方法

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