CN1932505A - 依普利酮原料或其制剂中杂质和含量的高效液相色谱法检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种依普利酮原料或其制剂的杂质和含量的高效液相色谱法测定方法。该方法的色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用磷酸二氢铵溶液－甲醇或磷酸二氢铵溶液－乙腈的混合溶液；采用紫外检测器，杂质测定检测波长为244nm；含量测定检测波长为244nm；该方法灵敏度高、专属性强，能很好地检测依普利酮原料或其制剂的杂质和含量。为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及药品的检测方法，具体地说是采用高效液相色谱法对依普利酮原料或其制剂中的杂质和含量的检测。
背景技术
本发明中所述依普利酮的药品名称为：
通用名：依普利酮
英文名：Eplerenone
汉语拼音：Yipulitong
化学名称：9α，11-环氧-7α-(甲氧酰基)-3-氧-17α-孕甾-4-烯-21，17-羰内酯
结构式：
分子式：C24H30O6
分子量：414.49
近年来高血压病的发病率逐年上升，欧美一些国家约为20％。高血压是冠心病、脑猝、心力衰竭、肾衰竭最主要的发病因素，并且其与糖、脂代谢紊乱密切相关。依普利酮可降低高血压人群的血压水平，可有效地控制心、脑血管病的发生率。
高血压病的治疗药物随着对高血压病认识的深入而不断发展，现在已形成6大类：利尿药、β-受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、α-受体阻滞剂和血管紧张素受体抑制剂。如何选择和合理应用降压药物，近几年有较大进展。
醛固酮可不依赖于A-T二和升高的血压而独立地在高血压和其他心血管疾病中引起损害。作为一个非选择性的醛固酮受体阻断剂，螺内酯可以有效地抑制醛固酮的这些不利作用，但同时也具有许多不良反应，如男性乳腺发育、阳痿和女性月经紊乱等。依普利酮对醛固酮受体具有选择性，对雄激素和孕激素受体亲和力低。
高血压在大多数国家中是一个重要的健康问题，它牵涉到20％的成年人。1991年普查显示，我国高血压患病率已达11.26％，较1979-1980年10年间增高25％，即90年代初，我国已有高血压患者9500万。据1996年调查，这种升高的势头仍在持续。目前统计资料显示，我国现有的高血压患者已达1.2亿，每年新增300万以上。1998年我国脑血管病居城市居民死亡原因第二位，在农村居首位。按年死亡率每10万人口分别为138和113，全国每年死亡超过100万，存活的患者500-600万，其中75％以上留有不同程度的残废，造成个人、家庭、社会的沉重负担。国内外大量研究已证明，高血压是脑猝中的主要危险因素。80年代以来，高血压病及由其引起的一系列心血管疾病已引起人们的高度重视，开发、研制各种新型降压药已成为国内外许多机构的主要课题。目前全球市场上已有100多种降压药，新的药物仍在不断开发。当前抗高血压药物仍主要需要解决下面三个问题：一是效果，包括降压、稳定血压和保护靶器官少受损伤；二是病人的依从性，包括使用方便、不良反应少、病人的生活质量不受影响；三是经济问题，要求抗高血压的治疗使病人和社会均能承受。
上世纪80年代问世的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和90年代出现的沙坦类药物是目前使用较广泛的两类抗高血压药物。它们主要作用于肾素—血管紧张素—醛固酮系统中的血管紧张素的生成和作用的发挥，发挥抗高血压作用。但是，目前的研究发现血浆中醛固酮与高血压后期的器官损伤有着密切的关系，即使在醛固酮的水平在正常范围内也是如此。因此，抑制醛固酮在体内在生物学活性对于提高高血压病人的生活质量和生存期都有着重要意义。依普利酮的发明对于达到这一目的起到了很好的开端。
依普利酮是一种口服高选择性醛固酮受体拮抗剂，通过竞争性抑制醛固酮与盐皮质激素受体结合，拮抗醛固酮与上皮(如肾脏)和非上皮(如心脏、血管和脑)组织中的盐皮质激素受体结合。醛固酮通过与盐皮质激素受体的结合诱导肾脏对钠离子的重吸性以及还有其它可能的机制升高血压。因此依普利酮的主要药效表现为减少Na+及液体潴留而降低血压。依普利酮在体外与受体(雄激素受体、黄体酮受体、糖皮质激素受体)的结合活性较螺内酯弱。该品对其它受体基本无影响。
依普利酮对轻到中度高血压具有良好的疗效，病人的耐受性好。在2003年，美国FDA又批准了依普利酮治疗急性心肌梗死后充血性心力衰竭的新适应症，临床研究证实依普利酮对于改善急性心肌梗死后左心室收缩功能异常(心脏射血分数≤40％)和有充血性心力衰竭临床依据的稳定病人的生存率有着很好作用。
发明内容
本发明的目的是，为了保证依普利酮原料或其制剂中的杂质和含量测定的检测水平，加强依普利酮原料或其制剂的质量控制，提供一种灵敏度高、分析速度快、准确度高的依普利酮原料或制剂中杂质和有效成份的高效液相色谱法检测方法。
实现上述目的的具体测试方法如下：
依普利酮原料或其制剂的杂质的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，具体操作步骤如下
A、取依普利酮原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.05～20mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含0.5～200ug的对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液；
B、色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)和乙腈为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合比为65∶35，检测器为紫外检测器；检测波长为244nm，理论板数按依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
C、取对照溶液5～100ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～20％；
D、再取上述供试品溶液和对照溶液各5～100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2～5倍；按自身对照法计算杂质。
依普利酮原料或制剂的含量的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，具体操作步骤如下
A、取依普利酮原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.025～10mg依普利酮的供试品溶液和对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和和乙腈按65∶35的混合溶液；
B、按照高效液相色谱法进行检测，色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)和乙腈为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合比为65∶35，检测器为紫外检测器；检测波长为244nm，理论板数按依普利酮峰计算不低于3000；
C、取上述供试品溶液和对照溶液各5～100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，记录色谱图；按外标法以依普利酮峰面积计算本品的含量。
所述流动相为甲醇和0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)的混合溶液，混合比为40∶60。
所述流动相为甲醇和0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)的混合溶液，混合比为40∶60。
本发明测试方法的建立过程是这样的。
1、仪器与试剂
仪器：岛津SPD-10Avp检测器，岛津LC-10ATvp泵及浙江大学N2000色谱工作站。
FA1104型电子天平
PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器有限公司)
色谱柱：Discovery C18柱，规格250×4.6mm，粒度5um
试剂：乙腈为MR、磷酸二氢铵为AR试剂；蒸馏水自制。
2、有关物质检测方法的建立
(1)波长的选择
取依普利酮样品及各中间体适量，加流动相使溶解，并稀释成约10μg/ml，在200～400nm范围内对本品进行扫描，由扫描结果可见，本品在244nm波长处有最大吸收，结合中间体的扫描图谱，我们选择使用244nm波长作为本品有关物质检测的波长。
(2)流动相的选择
以乙腈-水为基本配比，调节乙腈与水的比例使得主峰保留时间适中，再通过加入适当的缓冲盐调节峰形，使得到理想状态。
流动相的选择
| 溶液配比 | 系统评价 |
| 乙腈-水(50∶50)乙腈-水(40∶60)乙腈-水(35∶65)0.03mol/L磷酸二氢铵-乙腈(35∶65)0.02mol/L磷酸二氢铵-乙腈(35∶65)0.01mol/L磷酸二氢铵-乙腈(35∶65) | 保留时间较短，峰型较差保留时间较短，峰型较差保留时间适宜，峰型较差保留时间适宜，峰型好保留时间适宜，峰型好保留时间适宜，峰型好 |
由上表结果可见，以乙腈和各浓度的磷酸二氢铵溶液(35∶65)作为流动相，保留时间和峰型均较好，因缓冲盐浓度高对色谱柱损伤较大，故选择乙腈-0.01mol/L磷酸二氢铵(35∶65)作为本品有关物质检测的流动相。
(3)分离度试验
取依普利酮合成过程中的中间体及依普利酮样品，加流动相溶解并稀释，制成一定浓度的溶液，作为样品溶液。分别取上述各溶液进样，考察各自的保留时间。再分别取上述溶液适量混合，摇匀后取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，考察其分离度。结果中间体及依普利酮的分离度符合要求
(4)系统适应性及专属性试验
①破坏性试验
分别取依普利酮样品约10mg及其制剂适量(约含依普利酮10mg)，分别置100ml量瓶中，按下述各条件配制供试品。
未破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，常温避光放置4小时备用；
酸破坏：加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，混匀后常温避光放置4小时，4小时后加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用；
碱破坏：加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，混匀后常温避光放置4小时，4小时后加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用；
光照破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，置强光下(4500Lx)照射4小时，备用；
高温破坏：加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，置沸水浴中加热4小时，4小时后放冷，加流动相至刻度，摇匀，备用；
氧化破坏：加30％双氧水2ml，混匀后常温遮光放置4小时，4小时后加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
分别取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，与未破坏样品比较，结果在破坏条件下依普利酮峰和各有关物质峰能够很好的分离，说明在选定色谱条件下可以检测出可能存在的有关物质。
②检测限、定量限的测定
取对照品适量，用流动相逐级稀释后进行测定，按10∶1信噪比作为定量限，结果为10ng；按3∶1信噪比为检测限，结果为3ng。
3、含量测定方法的建立
(1)含量测定标准曲线的绘制
取对照品约25mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取1、3、5、7、10ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别取20μl进样。记录色谱图，以进样浓度(C)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，计算回归方程。
结果表明：浓度在10.2～102.2μg/ml范围内，依普利酮色谱峰面积与其浓度成良好线性关系。
依普利酮含量测定标准曲线
| ml | 浓度(μg/ml) | 峰面积(A) | 线性关系 |
| 135710 | 10.2030.6551.1071.55102.20 | 197562.297554645.875936167.6881299442.881883740.38 | A＝18329X+297.58r＝0.9998 |
(3)进样精密度
取标准曲线项下中间浓度(5ml)溶液，连续进样5次，记录色谱图，考察进样精密度。
依普利酮进样精密度试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 峰面积均值(SD，RSD) | 934040.625 | 932580.000 | 931698.688 | 928633.500 | 931537.500 |
| A均＝931698.063±1980.07 RSD＝0.21％ | |||||
由结果可见，RSD小于2.0％，表明进样精密度良好。
(4)理论板数的测定
取标准曲线项下中间浓度(5ml)溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察其理论板数，经测定，理论板数为n＝3168.620。
(5)重复性试验
精密取依普利酮样品约25mg及其制剂适量(约含依普利酮25mg)各六份，照含量测定项下的方法测定上述样品的含量，分别计算RSD值，考察重复性。
结果表明，原料和制剂重复性试验相对标准偏差均小于2.0％，重复性符合规定。
(6)中间精密度试验
按照含量测定项下的方法，在不同日期内，不同的试验人员，使用相同一批的依普利酮样品及其制剂，在不同的仪器上测定其含量，分别计算相对标准偏差值，考察其中间精密度情况。
结果表明，原料和制剂中间精密度试验相对标准偏差均小于2.0％，中间精密度良好。
(7)制剂回收率试验
称取依普利酮原料，按处方量的80％、100％、120％投料，制备含主药为80％、100％、120％的制剂，分别取各处方项下制剂，照含量测定项下的方法，测定主药依普利酮的含量。
结果表明，回收率为98.7％，相对标准偏差小于2.0％，制剂准确性试验良好。
通过上述方法的建立过程，本品的有关物质检查采用HPLC法，通过中间体测定及破坏性试验，结果表明本品的中间体及破坏后的降解产物峰可被检出，并与主峰有较好的分离度。根据本品检查结果，并结合生产实际情况，确定本品有关物质总量应小于1.0％，单个杂质量应小于0.5％。另外通过高效液相色谱法对本品含量测定结果表明，回收率为98.7％，相对标准偏差小于2.0％，证明本法可作为本品含量测定方法。
附图说明
图1依普利酮杂质检测对照溶液HPLC图谱，
图2依普利酮杂质检测样品溶液HPLC图谱，
图3依普利酮含量测定样品溶液HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
按以下检测方法对依普利酮原料或其制剂各三批中杂质进行测定：
实施例1：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含0.5ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取对照溶液100ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％。
再取上述供试品溶液和对照溶液各100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一。见表1，图1，图2。
表1依普利酮原料或其制剂杂质检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 | 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 |
| 20050311 | 实施例1实施例4 | 0.480.46 | 0.830.81 | 20050508 | 实施例1实施例4 | 0.480.45 | 0.860.87 |
| 20050401 | 实施例1实施例4 | 0.480.49 | 0.870.86 | 20050509 | 实施例1实施例4 | 0.480.48 | 0.860.88 |
| 20050422 | 实施例1实施例4 | 0.480.47 | 0.880.86 | 20050510 | 实施例1实施例4 | 0.470.48 | 0.860.87 |
实施例2：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.1mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含1ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取对照液20ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％；
再取上述供试品溶液和对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一。见表2，图1，图2。
表2依普利酮原料或其制剂杂质检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 | 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 |
| 20050311 | 实施例2实施例5 | 0.440.46 | 0.840.86 | 20050508 | 实施例2实施例5 | 0.470.48 | 0.890.88 |
| 20050401 | 实施例2实施例5 | 0.420.43 | 0.850.87 | 20050509 | 实施例2实施例5 | 0.460.49 | 0.870.80 |
| 20050422 | 实施例2实施例5 | 0.420.43 | 0.890.88 | 20050510 | 实施例2实施例5 | 0.480.46 | 0.890.81 |
实施例3：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含20mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含200ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算应不低于3000，依普利酮峰与各杂质峰的分离度应符合规定
取对照液5ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％；
再取上述供试品溶液和对照溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一，见表3，图1，图2。
表3依普利酮原料或其制剂杂质检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 | 批号 | 实施例 | 单个最大杂质 | 总杂质 |
| 20050311 | 实施例3实施例6 | 0.490.47 | 0.850.87 | 20050508 | 实施例3实施例6 | 0.460.47 | 0.890.88 |
| 20050401 | 实施例3实施例6 | 0.480.47 | 0.880.85 | 20050509 | 实施例3实施例6 | 0.490.48 | 0.890.87 |
| 20050422 | 实施例3实施例6 | 0.490.48 | 0.890.84 | 20050510 | 实施例3实施例6 | 0.490.48 | 0.880.89 |
实施例4：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含0.5ug的对照溶液。流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇(60∶40)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取对照溶液100ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％。
再取上述供试品溶液和对照溶液各100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一。见表1，图1，图2。
实施例5：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含0.1mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含1ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇(60∶40)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取对照液20ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％；
再取上述供试品溶液和对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一。见表2，图1，图2。
实施例6：
取依普利酮原料或其制剂，加流动相制成每1ml中含20mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含200ug的对照溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇(60∶40)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算应不低于3000，依普利酮峰与各杂质峰的分离度应符合规定
取对照液5ul注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10～20％；
再取上述供试品溶液和对照溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍；供试品如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和。各杂质峰面积之和不大于对照溶液主峰面积，单个最大杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的二分之一，见表3，图1，图2。
按以下检测方法对依普利酮原料或其制剂各三批中含量进行测定：
实施例7：
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含0.025mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表4。
表4依普利酮原料或其制剂含量检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 实施例 | 20050311 | 20050401 | 20050422 | 实施例 | 20050508 | 20050509 | 20050510 |
| 实施例7 | 99.84 | 99.91 | 99.88 | 实施例7 | 99.64 | 100.1 | 100.5 |
| 实施例10 | 99.90 | 99.94 | 99.94 | 实施例10 | 99.55 | 100.4 | 100.2 |
实施例8：
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表5。
表5依普利酮原料或其制剂含量检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 实施例 | 20050311 | 20050401 | 20050422 | 实施例 | 20050508 | 20050509 | 20050510 |
| 实施例8 | 99.78 | 99.65 | 99.98 | 实施例8 | 99.46 | 100.6 | 100.6 |
| 实施例11 | 99.65 | 99.83 | 99.84 | 实施例11 | 99.49 | 100.9 | 100.4 |
实施例9
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含10mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-乙腈(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表6。
表6依普利酮原料或其制剂含量检测结果
| 原料(％) | 制剂(％) | ||||||
| 实施例 | 20050311 | 20050401 | 20050422 | 实施例 | 20050508 | 20050509 | 20050510 |
| 实施例9 | 99.73 | 99.64 | 99.75 | 实施例9 | 99.84 | 99.92 | 100.9 |
| 实施例12 | 99.85 | 99.73 | 99.84 | 实施例12 | 99.93 | 99.67 | 99.89 |
实施例10：
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含0.025mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液。流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(60∶40)为流动相，检测波长244mm，理论板数以依普利酮峰计算应不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表4。
实施例11：
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含0.05mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(60∶40)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表5。
实施例12
取依普利酮原料或其制剂以及对照品，加流动相制成每1ml中含10mg依普利酮的供试品溶液和对照品溶液；流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和甲醇按60∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液以磷酸调pH至3.0。
按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)试验，以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(65∶35)为流动相，检测波长244nm，理论板数以依普利酮峰计算应不低于3000，依普利酮峰与各有关物质峰的分离度应符合规定。
取上述供试品溶液和对照品溶液各5ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算本品的含量。结果见表6。
上述方法方便快捷，能够准确测定依普利酮原料或其制剂的杂质和含量。但本发明专利的保护内容并不仅仅局限于上述具体实施实例中所阐述的方法，任何在本发明所述方法的基础上所做的改进及提高均属于本发明专利的保护内容。
Claims (4)
1、依普利酮原料或其制剂的杂质的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其特征在于：具体操作步骤如下
A、取依普利酮原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.05～20mg依普利酮的供试品溶液和每1ml中含0.5～200ug的对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈按65∶35的混合溶液；
B、色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)和乙腈为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合比为65∶35，检测器为紫外检测器；检测波长为2.44nm，理论板数按依普利酮峰计算不低于3000，依普利酮峰与各杂质峰的分离度大于1.5；
C、取对照溶液5～100ul注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为记录仪满量程的10～20％；
D、再取上述供试品溶液和对照溶液各5～100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2～5倍；按自身对照法计算杂质。
2、依普利酮原料或制剂的含量的高效液相色谱法检测方法，包括配制供试品溶液，按照高效液相色谱法进行检测，其特征在于：具体操作步骤如下
A、取依普利酮原料或其制剂，加流动相分别制成每1ml中含0.025～10mg依普利酮的供试品溶液和对照溶液；所述流动相为0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和和乙腈按65∶35的混合溶液；
B、按照高效液相色谱法进行检测，色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)和乙腈为流动相，0.01mol/L磷酸二氢铵溶液和乙腈的混合比为65∶35，检测器为紫外检测器；检测波长为244nm，理论板数按依普利酮峰计算不低于3000；
C、取上述供试品溶液和对照溶液各5～100ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，记录色谱图；按外标法以依普利酮峰面积计算本品的含量。
3、根据权利要求1所述的依普利酮原料或制剂中杂质的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为甲醇和0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)的混合溶液，混合比为40∶60。
4、根据权利要求2所述的依普利酮原料或制剂含量的高效液相色谱法检测方法，其特征在于：所述流动相为甲醇和0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(以磷酸调pH至3.0)的混合溶液，混合比为40∶60。
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