CN106525993A - 一种用液相色谱法分离测定依普利酮中间体有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属分析化学领域，本发明公开了一种用液相色谱法分离测定依普利酮中间体11α,17β‑二羟基‑3‑氧代孕甾‑4‑烯‑7α‑羧酸甲酯‑21‑羧酸‑γ‑内酯及其有关物质的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的有机相‑缓冲盐溶液为流动相，可以定量测定依普利酮中间体及其有关物质的含量，从而有效控制依普利酮中间体的质量，减少副反应的发生和杂质的生成，实现依普利酮的质量可控。本发明方法专属性强，准确度高，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱法分离测定依普利酮中间体及其有关物质的方法。
背景技术
依普利酮的化学名为9,11α-Epoxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone，分子式为C24H30O6。依普利酮是一种选择性醛固酮受体拮抗药，用于治疗高血压和其他心血管疾病，对血管紧张素转换酶抑制药和血管紧张素II受体抑制药作用不佳的低肾素水平的原发性高血压患者，有良好降压效果。此外，依普利酮还可以显著减轻肾小球的超滤作用，从而减轻高血压患者的白蛋白尿，对合并糖尿病的高血压患者有明显的肾脏保护作用。依普利酮中间体的化学名为11α,17β-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α-羧酸甲酯-21-羧酸-γ-内酯，分子式为C24H32O6，结构式为：
。
在合成依普利酮的过程中，需要控制一些重要中间体的纯度，以减少副反应的发生和杂质的生成，从而提高产物收率和纯度。对于依普利酮中间体11α,17β-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α-羧酸甲酯-21-羧酸-γ-内酯需要控制的有关物质有2个，分别是11α，17β-二羟基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸-γ-内酯（有关物质1），5β-氰基-11α，17β-二羟基-3，5’-氧代-4，7-次甲基孕甾-21-羧酸-γ-内酯（有关物质2），结构式分别为：
。
依普利酮中间体中的杂质去除不完全，将会引起副反应的发生和杂质的生成，最终影响药物纯度和质量。因此，实现依普利酮中间体及其有关物质的分离，在依普利酮的生产及其质量控制方面具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析依普利酮中间体化学纯度以及分离其有关物质的方法，从而实现依普利酮中间体与其有关物质的分离和测定，保证依普利酮中间体的纯度，实现依普利酮的质量可控。
本发明所述的用液相色谱法分析依普利酮中间体化学纯度以及分离其有关物质的方法，是采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的有机相-缓冲盐溶液为流动相。
上述所说的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱选自YMC、Alltima和Welch等品牌。
上述所说的有机相选自以下化合物中的一种或几种：甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等，优选乙腈和甲醇的混合溶液，比例优选乙腈：甲醇-3：2。
上述所说的方法，其流动相有机相-缓冲盐溶液采用等度洗脱。
上述所说的方法中，缓冲盐溶液选自磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、高氯酸盐，优选乙酸盐。
其中缓冲盐溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选浓度为0.01mol/L。
本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现：
1) 取依普利酮中间体样品适量，用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含依普利酮0.1～1.5mg的样品溶液。
2) 设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，流动相流速优选为1.0mL/min，检测波长为205～300nm，优选240nm检测依普利酮中间体及其未知杂质，优选210nm检测有关物质2，优选280nm检测有关物质1，柱温箱温度为10～50℃，柱温箱温度最佳为40℃。
3) 取1)的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成依普利酮中间体与其有关物质的分离测定。其中：
高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10ASvp柱温箱，LCsolution工作站
色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）
流动相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸铵缓冲液-24：16：60
流速：1.0mL/min
检测波长：210nm、240nm、280nm
进样体积：20μL
本发明采用C18（YMC，150×4.6 mm，3μm），能够有效的分离依普利酮中间体及其有关物质。本发明解决了依普利酮中间体及其有关物质的分离测定问题，从而减少了副反应的发生和杂质的生成，提高了终产品的收率和纯度，保证了依普利酮的质量可控。
附图说明
图1为实施例1时依普利酮中间体及其有关物质240nm波长下HPLC图；
图2为实施例1时依普利酮中间体及其有关物质210nm波长下HPLC图；
图3为实施例1时依普利酮中间体及其有关物质280nm波长下HPLC图；
图4为实施例2时依普利酮中间体及其有关物质240nm波长下HPLC图；
图5为实施例2时依普利酮中间体及其有关物质210nm波长下HPLC图；
图6为实施例2时依普利酮中间体及其有关物质280nm波长下HPLC图；
图7为实施例2时依普利酮中间体240nm波长下HPLC图；
图8为实施例2时空白溶剂240nm波长下HPLC图；
图9为实施例2时空白溶剂210nm波长下HPLC图；
图10为实施例2时空白溶剂280nm波长下HPLC图。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。
实施例1
仪器与条件：
高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT， CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；
色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；
流动相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸铵缓冲液-20：20：60；
流速：1.0mL/min；
检测波长：210nm、240nm、280nm；
进样体积：20μL；
柱温：40℃。
实验步骤：
取依普利酮中间体及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含依普利酮中间体及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1~3，图1中保留时间为20.460min的色谱峰为依普利酮中间体，其余色谱峰为依普利酮中间体各有关物质的色谱峰；图2中保留时间为9.304min的色谱峰为依普利酮中间体有关物质2，保留时间为20.460min的色谱峰为依普利酮中间体，保留时间为30.649min的色谱峰为依普利酮中间体有关物质1；图3中保留时间为30.638min的色谱峰为依普利酮中间体有关物质1，保留时间为20.459min的色谱峰为依普利酮中间体。
实施例2
仪器与条件：
高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT， CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；
色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；
流动相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸铵缓冲液-24：16：60；
流速：1.0mL/min；
检测波长：210nm、240nm、280nm；
进样体积：20μL；
柱温：40℃。
实验步骤：
取依普利酮中间体及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含依普利酮中间体及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图4~10，图4中保留时间为17.265min的色谱峰为依普利酮中间体，其余色谱峰为依普利酮中间体各有关物质的色谱峰；图5中保留时间为8.248min的色谱峰为依普利酮中间体有关物质2，保留时间为17.265min的色谱峰为依普利酮中间体；图6中保留时间为25.822min的色谱峰为依普利酮中间体有关物质1，保留时间为17.265min的色谱峰为依普利酮中间体；图7中保留时间为17.082min的色谱峰为依普利酮中间体；图8~10分别为空白溶剂在240nm、210nm和280nm波长下的色谱图。由图可以看出，在该色谱条件下依普利酮中间体与其有关物质可以完全分离，符合中国药典的要求。
对上述依普利酮中间体及其有关物质分析方法的以下项目进行了验证：
系统适用性试验
根据上述实施例2确定的色谱条件，分别用依普利酮中间体和各有关物质的混合溶液来分析此色谱条件是否符合要求。由图4-6可见此条件下各个有关物质与主峰之间分离度符合要求，峰纯度和单点阀值均符合要求。
溶液稳定性
将依普利酮中间体与其各有关物质的混合溶液，分别于0、2、4、6、8、12小时进样，考察样品定量测定时溶液的稳定性，由结果可见，本溶液在12小时内稳定；
。
耐用性
为了进一步验证方法的稳定性，我们将流速、柱温和色谱柱品牌这些条件进行相应的微调，以考察色谱条件的耐用性。
结果表明，流速变化在±0.2ml/min范围内，柱温变化在±5℃范围内，峰型没有变化，仅保留时间有相应的前移和后移。色谱柱的耐用性考察中，更换为Alltima和Welch色谱柱后，各物质保留时间和分离度无明显变化，各物质峰纯度和分离度均符合要求。
Claims (10)
1.一种液相色谱法分离测定依普利酮中间体有关物质的方法，其特征在于：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的有机相-缓冲盐溶液为流动相。
2.根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱选自 YMC、Alltima和Welch等品牌。
3.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的有机相选自以下化合物中的一种或几种：甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等。
4.根据权利要求3所述的分离测定方法，所说的有机相优选乙腈和甲醇的混合溶液，比例优选乙腈：甲醇-3：2。
5.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液选自以下缓冲盐：磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、高氯酸盐等。
6.根据权利要求5所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液中所含缓冲盐的浓度优选0.01mol/L。
7.根据权利要求5所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液优选乙酸盐。
8.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1）取依普利酮中间体样品适量，分别用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含依普利酮中间体及其有关物质0.1～1.5mg的样品溶液；
2）设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为205～300nm，柱温箱温度为10～50℃；
3）取1）的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成依普利酮中间体及其有关物质的分离测定。
9.根据权利要求7所述的分离测定方法，缓冲盐优选乙酸铵。
10.根据权利要求8所述的分离测定方法，步骤2）所说的流动相流速优选1.0mL/min，优选240nm检测依普利酮中间体及其未知杂质，优选210nm检测有关物质2，优选280nm检测有关物质1。
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| CN105753930A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-13 | 北京万全德众医药生物技术有限公司 | 依普利酮的一种合成方法 |
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